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Biology

विकास और रोग मॉडलिंग अनुप्रयोगों के लिए hiPSC व्युत्पन्न आंतों Organoids की पीढ़ी

Published: March 8, 2024 doi: 10.3791/61199
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1
1Biodiscovery Institute, Translational Medical Sciences, School of Medicine, University of Nottingham
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल आंतों के ऑर्गेनोइड में मानव प्लुरिपोटेंट कोशिकाओं के भेदभाव के लिए अनुमति देता है। प्रोटोकॉल निश्चित endoderm की आबादी में कोशिकाओं को विभेदित द्वारा सामान्य मानव विकास की नकल, hindgut endoderm और फिर आंतों उपकला. यह प्रोटोकॉल दोनों आंतों के विकास के साथ ही रोग मॉडलिंग अनुप्रयोगों का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त बनाता है.

Abstract

hiPSC-व्युत्पन्न आंतों के ऑर्गेनोइड उपकला संरचनाएं हैं जो विभेदित कोशिकाओं से जटिल 3 डी संरचनाओं में स्वयं-इकट्ठा होती हैं, मानव आंतों के उपकला के प्रतिनिधि, जिसमें वे क्रिप्ट / विलस जैसी संरचनाओं का प्रदर्शन करते हैं। यहां, हम निश्चित एंडोडर्म में एचआईपीएससी के चरणबद्ध भेदभाव द्वारा hiPSC-व्युत्पन्न आंतों के ऑर्गेनोइड की पीढ़ी का वर्णन करते हैं, जिसे तब 3D संस्कृति स्थितियों में स्थानांतरित करने से पहले हिंदगट एपिथेलियम बनाने के लिए पीछे रखा जाता है। 3 डी संस्कृति पर्यावरण बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) (जैसे, मैट्रिगेल या अन्य संगत ईसीएम) SB202190, ए 83-01, गैस्ट्रिन, नोगिन, ईजीएफ, आर-स्पोंडिन -1 और CHIR99021 के साथ पूरक होते हैं। ऑर्गेनोइड हर 7 दिनों में पासिंग से गुजरते हैं, जहां उन्हें ताजा बाह्य मैट्रिक्स में स्थानांतरित करने से पहले यंत्रवत् रूप से बाधित किया जाता है और विस्तार करने की अनुमति दी जाती है। क्यूपीसीआर और इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री पुष्टि करते हैं कि एचआईपीएससी-व्युत्पन्न आंतों के ऑर्गेनोइड में परिपक्व आंतों के उपकला सेल प्रकार होते हैं जिनमें गॉब्लेट कोशिकाएं, पैनेथ कोशिकाएं और एंटरोसाइट्स शामिल हैं। इसके अतिरिक्त, ऑर्गेनोइड उपकला कोशिकाओं की शिखर सतह पर स्थानीयकृत विलिन की अभिव्यक्ति द्वारा ध्रुवीकरण के प्रमाण दिखाते हैं।

परिणामी ऑर्गेनोइड का उपयोग मानव आंतों के विकास के साथ-साथ सूजन आंत्र रोग सहित कई मानव आंतों के रोगों को मॉडल करने के लिए किया जा सकता है। आंतों की सूजन को मॉडल करने के लिए, ऑर्गेनोइड को टीएनएफ-α, टीजीएफ -β और बैक्टीरियल एलपीएस जैसे भड़काऊ मध्यस्थों के संपर्क में लाया जा सकता है। प्रिनफ्लेमेटरी साइटोकिन्स के संपर्क में आने वाले ऑर्गेनोइड प्रतिक्रिया में एक भड़काऊ और फाइब्रोटिक फेनोटाइप प्रदर्शित करते हैं। आईबीडी के रोगियों से प्राप्त स्वस्थ बनाम एचआईपीएससी की जोड़ी आईबीडी ड्राइविंग तंत्र को समझने में उपयोगी हो सकती है। यह प्रारंभिक रोग निदान में सहायता के लिए उपन्यास चिकित्सीय लक्ष्यों और उपन्यास बायोमार्कर को प्रकट कर सकता है।

Introduction

प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (पीएससी) के गुण, जैसे आत्म-नवीकरण और मानव शरीर के किसी भी सेल प्रकार में अंतर करने की क्षमता, उन्हें विकास, रोग विकृति और दवा परीक्षणके अध्ययन में मूल्यवान उपकरण बनाती है। मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (hiPSC) रोग मॉडलिंग अध्ययन के लिए विशेष रूप से उपयोगी होते हैं क्योंकि उन्हें रोगियों से प्राप्त किया जा सकता है, सीधे रोग फेनोटाइप 2,3 के लिए जिम्मेदार जीनोम पर कब्जा कर सकते हैं। इस तरह के hiPSCs रोग 4 के आणविक तंत्र की सावधानीपूर्वक परीक्षा की अनुमति आनुवंशिक दोष से प्रभावित सेल प्रकार के लिए विभेदित किया जा सकताहै.

मानव पीएससी के लिए भेदभाव प्रोटोकॉल का उद्देश्य वंश प्रतिबद्धता और विनिर्देश को नियंत्रित करने वाले विशिष्ट सिग्नलिंग मार्गों के सक्रियण या निषेध द्वारा मुख्य विकास चरणों के माध्यम से कोशिकाओं के भेदभाव को निर्देशित करना है। एक pluripotent राज्य में hiPSC के रखरखाव Activin एक (अधिनियम-ए) संकेत के मध्यम स्तर की आवश्यकता है, जबकि अधिनियम एक के लिए एक उच्च खुराक 3 दिनों एक निश्चित endoderm करने के लिए hiPSC प्रतिबद्ध (DE) भाग्य 5,6. अधिनियम-ए और डब्ल्यूएनटी मार्ग डीई की पूर्वकाल-पश्च पहचान को निर्देशित करते हैं। एक्ट-ए द्वारा सिग्नलिंग HHEX, HNF4α और GATA4 जैसे फोरगट (FG) मार्करों को प्रेरित करता है, जबकि CDX2 जैसे हिंदगट (HG) जीन की अभिव्यक्ति को अवरुद्ध करता है। Wnt सिग्नलिंग DE के पोस्टीरियोराइजेशन को प्रेरित करता है, जो तब एक HG जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल 7,8 को अपनाता है। एक बार एचजी सेल पहचान स्थापित हो जाने के बाद, भेदभाव को 2 डी से 3 डी तक ले जाया जा सकता है और आंतों के ऑर्गेनोइड के गठन की ओर निर्देशित किया जा सकता है।

आंतों के ऑर्गेनोइड आमतौर पर एक 3 डी बाह्य मैट्रिक्स (जैसे, मैट्रिगेल या अन्य संगत ईसीएम) आधारित संस्कृति प्रणाली9 में सुसंस्कृत होते हैं, जिसमें लैमिनिन, कोलेजन IV और एंटेक्टिन शामिल होते हैं और ईजीएफ, एफजीएफ, पीडीजीएफ और आईजीएफ -1 जैसे विकास कारकों से समृद्ध होते हैं ताकि समर्थन अस्तित्व और प्रसार में योगदान दिया जा सके। ऑर्गेनोइड को गैस्ट्रिन, नोगिन और सीएचआईआर युक्त परिभाषित माध्यम में सुसंस्कृत किया जाता है ताकि दीर्घकालिक संस्कृति के दौरान आंतों के स्टेम सेल के विकास और प्रसार को उत्तेजित और समर्थन किया जा सके।

आंतों के उपकला कोशिकाओं को बाह्य मैट्रिक्स में एम्बेडेड होने के बाद, आंतों के क्रिप्ट बनने लगते हैं और अंततः स्फेरॉइड बनाने का विस्तार करते हैं। ये ऑर्गेनॉइड संरचनाओं में परिपक्व होते हैं जो आंतों के उपकला के शारीरिक कामकाज की नकल करते हैं। ऑर्गेनोइड को आमतौर पर कार्यात्मक और जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल के महत्वपूर्ण नुकसान के बिना 1 वर्ष से अधिक समय तक सुसंस्कृत किया जा सकता है। ऑर्गेनोइड के एंजाइमेटिक पाचन का उपयोग करके साप्ताहिक आधार पर पासिंग की आवश्यकता होती है, छोटे टुकड़ों में जो तब पूर्ण ऑर्गेनोइड में स्वयं-पुन: इकट्ठा होते हैं।

स्थापित ऑर्गेनॉइड लाइनों का उपयोग आंत से जुड़े कई विकारों के एक विश्वसनीय मॉडल के रूप में किया जा सकता है, जिसमें क्रोहन रोग, अल्सरेटिव कोलाइटिस और कोलोरेक्टल कैंसर10,11,12,13शामिल हैं। यह पशु कोशिकाओं के लिए एक पसंदीदा मॉडल है क्योंकि वे इन विकारों से जुड़े मानव जीन को व्यक्त करते हैं और बाहरी उत्तेजनाओं का अधिक बारीकी से जवाब देते हैं जो विवो में मानव ऊतक में होता है।

Protocol

नोट: नीचे विस्तृत सभी टिशू कल्चर कार्य एक कक्षा द्वितीय लामिना का प्रवाह हुड में किया जाना चाहिए।

1. मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (hiPSCs) हिंदगट एंडोडर्म के लिए भेदभाव

  1. बाह्य मैट्रिक्स के साथ एक सेल संस्कृति फ्लास्क कोट करने के लिए, पहले मैट्रिक्स की जरूरत की मात्रा की गणना. यहाँ एक 12 अच्छी तरह से थाली Matrigel के साथ लेपित किया जा रहा का एक उदाहरण है. एक 12 अच्छी तरह से थाली कोट करने के लिए बाह्य मैट्रिक्स की आवश्यक राशि की गणना. निम्न सूत्र का उपयोग करें:
    Equation 1
    नोट: पसंद के बाह्य मैट्रिक्स के साथ कोट सेल संस्कृति व्यंजन। यदि मैट्रिगेल का उपयोग कर रहे हैं, तो भेदभाव के लिए बोने से पहले 0.035 मिलीग्राम/सेमी2 24 घंटे की एकाग्रता का उपयोग करें। उत्पाद शीट पर बाह्य मैट्रिक्स के बैच एकाग्रता की जाँच करें और निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्रयोगों से पहले छोटे aliquots तैयार.
  2. एक p1000 विंदुक का उपयोग ठंड DMEM मीडिया में बाह्य मैट्रिक्स की आवश्यक राशि पतला.
  3. 5 एमएल स्ट्रिपेट का उपयोग करके अच्छी तरह मिलाएं।
  4. प्रत्येक अच्छी तरह से प्लेट में पतला मैट्रिक्स के 500μL जोड़ें। प्लेट को धीरे से हिलाएं ताकि पतला बाह्य मैट्रिक्स को समान रूप से वितरित किया जा सके और 37 डिग्री सेल्सियस पर न्यूनतम 12 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया जा सके।
  5. थाली में कोशिकाओं को बोने से पहले, अतिरिक्त बाह्य मैट्रिक्स को हटाने के लिए पीबीएस के 500 माइक्रोन के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से धो लें। यह भेदभाव के दौरान सेल टुकड़ी को रोक देगा।
  6. बाह्य मैट्रिक्स के सूखने को रोकने के लिए बीज के लिए तैयार होने तक कुओं में अंतिम धोने को छोड़ दें।
  7. निश्चित endoderm की ओर hiPSCs भेदभाव के लिए बीज करने के लिए (DE) या hindgut (HG), पसंद के एक रखरखाव मीडिया में सुसंस्कृत hiPSCs के एक फ्लास्क ले लो (जैसे: आवश्यक 8 मीडिया) और मीडिया महाप्राण. (यहां, हम 25,000 कोशिकाओं /
    नोट: सीडिंग घनत्व सफल भेदभाव के लिए महत्वपूर्ण है और प्रत्येक व्यक्ति hiPSC सेल लाइन के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए.
  8. पीबीएस के 5 एमएल के साथ फ्लास्क में कोशिकाओं को धो लें। पीबीएस महाप्राण।
  9. सेल पृथक्करण समाधान (जैसे, TrypLE) के 2.5 एमएल जोड़ें और 4 मिनट के लिए आरटी पर छोड़ दें। सेल पृथक्करण समाधान महाप्राण और कोशिकाओं को अलग करने के लिए धीरे फ्लास्क नल.
  10. फ्लास्क को डीएमईएम मीडिया के 5 एमएल के साथ 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें और सभी कोशिकाओं को 15 एमएल ट्यूब में इकट्ठा करें।
  11. resuspended सेल समाधान के 10 माइक्रोन लें और एक हेमोसाइटोमीटर के साथ सेल घनत्व को मापें।
  12. 1.05 x 106 कोशिकाओं को इकट्ठा करने और 15 एमएल ट्यूब में जगह देने के लिए सेल निलंबन का पर्याप्त लें।
  13. 3 मिनट के लिए 160 x ग्राम पर स्पिन. जबकि कोशिकाओं centrifuged किया जा रहा है, बाह्य मैट्रिक्स लेपित 12 अच्छी तरह से प्लेट लेपित से एस्पिरेट पीबीएस.
  14. centrifugation के बाद, सतह पर तैरनेवाला महाप्राण और रॉक अवरोध करनेवाला (10 माइक्रोन) के साथ रखरखाव मीडिया के 12 एमएल में सेल गोली resuspended है.
  15. एक p1000 विंदुक का प्रयोग, 12 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए सेल निलंबन के 1 एमएल जोड़ें. कुओं के बीच समान वितरण सुनिश्चित करने के लिए कोशिकाओं को अच्छी तरह से निलंबित करें।
  16. थाली के कुओं के भीतर कोशिकाओं को वितरित करने के लिए धीरे थाली हिला, लेकिन मीडिया के घूमता से बचने के रूप में यह कुओं के बीच में कोशिकाओं ध्यान केंद्रित होगा.
  17. एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में रखें।
  18. रखरखाव मीडिया (जैसे, आवश्यक 8 मीडिया) केवल (कोई रॉक अवरोधक) 24 घंटे पोस्ट सीडिंग के लिए मीडिया बदलें।
  19. डीई के लिए भेदभाव शुरू करने के लिए, तालिका 1 के अनुसार endoderm बेसल मीडिया तैयार.
    नोट: भेदभाव कोशिकाओं की शुरुआत में 60-80% संगम के बीच होना चाहिए।
  20. एंडोडर्म बेसल मीडिया में एक्टिविन ए (100 एनजी/एमएल) और डब्ल्यूएनटी3 (50 एनजी/एमएल) जोड़कर डीई मीडिया के 12 एमएल तैयार करें।
  21. मीडिया को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
  22. टिशू कल्चर प्लेट या फ्लास्क के प्रत्येक कुएं से एस्पिरेट मीडिया।
  23. 12 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए डीई मीडिया के 1 एमएल जोड़कर डीई भेदभाव शुरू करो.
  24. DE भेदभाव (D1 DE) शुरू करने के बाद 24 घंटे में, ताजा DE मीडिया तैयार करें और मीडिया परिवर्तन करें।
  25. 48 घंटे (D2 DE) पर चरण 1.24 दोहराएं। यदि इस स्तर पर बहुत अधिक कोशिका मृत्यु मौजूद है, तो मीडिया परिवर्तन से पहले पीबीएस के 500 माइक्रोन के साथ सभी कुओं को धो लें।
    नोट: सफल एंडोडर्म भेदभाव की पुष्टि करने के लिए, SOX17की अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री करें। हम आम तौर पर उम्मीद करते हैं कि >80% कोशिकाएं D3 DE द्वारा SOX17 सकारात्मक होंगी। यदि SOX17 की अभिव्यक्ति उप-इष्टतम सेल सीडिंग घनत्व को अधिनियम-ए की सांद्रता के साथ-साथ अनुकूलित किया जाना चाहिए।
  26. इस बिंदु पर एचजी भेदभाव शुरू करें, यानी डीई भेदभाव की शुरुआत के 72 घंटे बाद। एंडोडर्म बेसल मीडिया(तालिका 1)में CHIR99021 (3 माइक्रोन) और आरए (1 माइक्रोन) जोड़कर एचजी मीडिया के 12 एमएल तैयार करें।
    नोट: डी 3 डीई पर सेल को एक समान मोनोलेयर का गठन करना चाहिए था। भेदभाव के आगे के चरणों के लिए इष्टतम डीई भेदभाव महत्वपूर्ण है।
  27. महाप्राण DE मीडिया।
  28. 12 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से एचजी मीडिया के 1 एमएल जोड़कर एचजी भेदभाव शुरू करें।
  29. दैनिक मीडिया परिवर्तनों के साथ 4 दिनों के लिए भेदभाव जारी रखें।
    नोट: डीई पोस्टीरियोराइजेशन की सफलता निर्धारित करने के लिए, सीडीएक्स 2 की अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री करें। एचजी भेदभाव के डी 4 द्वारा हम आम तौर पर >80% कोशिकाओं को सीडीएक्स 2 सकारात्मक होने की उम्मीद करते हैं। यदि पोस्टीओराइजेशन उप-इष्टतम है, तो CHIR99021 की एकाग्रता को अनुकूलित किया जाना चाहिए।
  30. शाही सेना निष्कर्षण के लिए एक नमूना इकट्ठा करने के लिए, महाप्राण भेदभाव मीडिया और पीबीएस के 500 उल के साथ अच्छी तरह से धो लें.
  31. पीबीएस को महाप्राण करें और आरएनए निष्कर्षण किट से सेल लाइसिस बफर की उपयुक्त मात्रा जोड़ें।
  32. एक p1000 विंदुक का प्रयोग, सभी कोशिकाओं के lysis सुनिश्चित करने के लिए अच्छी तरह से के नीचे परिमार्जन.
  33. सेल lysate महाप्राण और एक साफ ट्यूब में जगह.
  34. आरएनए निष्कर्षण के लिए आगे बढ़ें या आरएनए निष्कर्षण के लिए तैयार होने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर लाइसेट को फ्रीज करें।
  35. इम्यूनोस्टेनिंग के लिए, एस्पिरेट भेदभाव मीडिया और पीबीएस के 500 माइक्रोन के साथ कुओं को धोएं।
  36. पीबीएस Aspirate और 4% पीएफए के 500 माइक्रोन जोड़ें.
    नोट: पीएफए विषाक्त है। उपयुक्त पीपीई का उपयोग करें और पीएफए निपटान के लिए स्थानीय प्रयोगशाला प्रक्रियाओं का पालन करें।
  37. 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
  38. पीएफए निकालें और तीन बार पीबीएस के 500 माइक्रोन के साथ कुओं को धो लें।
  39. इम्यूनोस्टेनिंग करने के लिए तैयार होने तक कोशिकाओं पर अंतिम पीबीएस धोने को छोड़ दें।

2. आंतों के ऑर्गेनोइड का गुजरना

  1. तालिका 2 के अनुसार आंतों के बेसल मीडिया तैयार करें।
  2. 2 डी से 3 डी सेल संस्कृति में स्थानांतरित करने के लिए, एचआईपीएससी के रूप में डीई कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए एक 6 अच्छी तरह से प्लेट का उपयोग करें। कोशिकाओं के मोनोलेयर को अलग करें 5 एमएल स्ट्रिपेट का उपयोग करके 6 सेल प्लेट बनाएं।
  3. एक सेल गोली का उत्पादन करने के लिए 1 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र करने से पहले, एक 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में कोशिकाओं लीजिए.
  4. SB202190 (10 माइक्रोन), ए 83-01 (500 एनएम), गैस्ट्रिन (10 एनएम), नोगिन (100 एनजी / माइक्रोन), ईजीएफ (500 एनजी / माइक्रोन), आर-स्पोंडिन 1 (100 एनजी / एमएल), CHIR99021 (6 माइक्रोन), रॉक अवरोधक (10 माइक्रोन)।
  5. कुओं में चढ़ाया जा रहा की संख्या पर निर्भर बाह्य मैट्रिक्स की उचित मात्रा जोड़ें. इसकी गणना नीचे दिए गए समीकरणों का उपयोग करके की जा सकती है।
    [1] बाह्य मैट्रिक्स/मीडिया (μL) की कुल मात्रा = 30 μL * 48-अच्छी प्लेट के कुओं की संख्या
    [2] बाह्य मैट्रिक्स (μL) की आवश्यक मात्रा = [1] * 2/3 से उत्तर
    [3] मीडिया की आवश्यक मात्रा (μL) = उत्तर [1] * 1/3
  6. एक 48 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से के केंद्र के लिए सेल निलंबन के 30 माइक्रोन जोड़ें.
  7. बाह्य मैट्रिक्स सेट करने के लिए अनुमति देने के लिए 5 मिनट की एक न्यूनतम के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में थाली सेते हैं.
  8. एक बार बाह्य मैट्रिक्स गुंबदों सेट किया है, आंतों के विकास मीडिया के 300 माइक्रोन प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए सभी विकास कारकों युक्त जोड़ें.
  9. प्लेट को 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में लौटाएं।
    नोट: यदि 48 घंटे के बाद कोई ऑर्गेनोइड नहीं देखा जा सकता है और/या महत्वपूर्ण कोशिका मृत्यु है तो रॉकी और नोगिन सांद्रता को अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है।
  10. ऑर्गेनोइड को पारित करने के लिए, ऑर्गेनोइड के घनत्व और आकार का आकलन करने के लिए एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं का निरीक्षण करें और यह निर्धारित करें कि उन्हें पासिंग की आवश्यकता है या नहीं।
  11. सेल कल्चर मीडिया को बर्फ के ठंडे पीबीएस से बदलें।
    नोट: ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों को लगभग हर 5-7 दिनों में विभाजन की आवश्यकता होगी। आंतों के ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों के पासिंग की आवश्यकता होती है जब ऑर्गेनॉइड लुमेन के भीतर सेल मलबे का संचय होता है और आसपास के आंतों के विकास माध्यम का पीलापन होता है।
  12. यंत्रवत् एक 5 एमएल स्ट्रिपेट के साथ एक स्क्रैपिंग गति का उपयोग करके प्लेट से ऑर्गेनोइड और बाह्य मैट्रिक्स क्षेत्र को अलग करें।
  13. प्रत्येक कुएं से ऑर्गेनोइड को 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में इकट्ठा करें।
  14. ऑर्गेनोइड को गोली देने के लिए 1 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र ऑर्गेनॉइड निलंबन। सेल गोली के शीर्ष तक पहुँचने तक सतह पर तैरनेवाला महाप्राण, दृश्यमान बाह्य मैट्रिक्स परत तक पहुँचने के बाद सावधान किया जा रहा है.
  15. बर्फ ठंड पीबीएस के 15 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें।
    नोट: यह कदम किसी भी शेष बाह्य मैट्रिक्स को धोने के लिए कार्य करता है जिसे प्रारंभिक स्पिन में हटाया नहीं गया था।
  16. 1 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र। गोली तक मीडिया महाप्राण, organoids युक्त.
  17. बर्फ ठंड पीबीएस के 1 एमएल में फिर से निलंबित। एक p200 विंदुक का प्रयोग, मैन्युअल रूप से ऊपर और नीचे कई बार pipetting द्वारा बरकरार organoids बाधित.
    नोट: प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करके ऑर्गेनोइड के आकार का निरीक्षण करें ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि उन्हें और अलग करने की आवश्यकता है या नहीं।
  18. विकास कारकों के बिना मीडिया के 9 एमएल जोड़ें।
  19. 1 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र। ऑर्गेनोइड गोली तक सतह पर तैरनेवाला महाप्राण।
  20. नीचे दिए गए समीकरणों का उपयोग करके बाह्य मैट्रिक्स और मीडिया की आवश्यक मात्रा की गणना करें:
    [1] बाह्य मैट्रिक्स/मीडिया (μL) की कुल मात्रा = 30 μL * 48-अच्छी प्लेट के कुओं की संख्या
    [2] बाह्य मैट्रिक्स (μL) की आवश्यक मात्रा = [1] * 2/3 से उत्तर
    [3] मीडिया की आवश्यक मात्रा (μL) = उत्तर [1] * 1/3
  21. विकास कारकों (नोगिन और रॉक अवरोधक सहित) के साथ आंतों के मीडिया की गणना की मात्रा में ऑर्गेनॉइड गोली को फिर से निलंबित करें।
  22. इस सेल निलंबन में बाह्य मैट्रिक्स की आवश्यक मात्रा जोड़ें और ऑर्गेनोइड के समान वितरण को सुनिश्चित करने के लिए फिर से निलंबित करें।
  23. एक 48 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं के केंद्र में इस निलंबन के पिपेट 30 माइक्रोन (अधिमानतः एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में पूर्व गर्म).
  24. थाली को 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में लौटाएं जब तक कि बाह्य मैट्रिक्स सेट न हो जाए।
  25. विकास कारकों (+ रॉक अवरोधक) (लगभग 17 एमएल प्रति 48 अच्छी तरह से प्लेट) के साथ आंतों मीडिया तैयार करें।
  26. प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 300 माइक्रोन जोड़ें.
  27. 5% सीओ2 पर 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  28. पासिंग के बाद, आंतों के ऑर्गेनोइड के लिए मीडिया को एस्पिरेट करें और हर 2-4 दिनों में विकास कारकों (नोगिन और रॉक अवरोधक के बिना) के साथ ताजा आंतों के मीडिया के साथ बदलें।
    नोट: यदि 48 घंटों के बाद कोई ऑर्गेनोइड नहीं देखा जा सकता है और/या महत्वपूर्ण कोशिका मृत्यु है तो रॉकी और नोगिन सांद्रता को अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है।
    नोट: आंतों के ऑर्गेनोइड विवो में भड़काऊ मध्यस्थों की एक श्रृंखला का जवाब देते हैं। TNFα एक सेल सिग्नलिंग प्रोटीन है जो कई भड़काऊ प्रक्रियाओं में शामिल है।
  29. आंतों के ऑर्गेनोइड में एक भड़काऊ प्रतिक्रिया को ट्रिगर करने के लिए, केवल बेसल मीडिया में 40 एनजी/एमएल की एकाग्रता पर टीएनएफα तैयार करें।
  30. 48 अच्छी तरह से प्लेट से एस्पिरेट मीडिया।
  31. 40 एनजी/एमएल TNFα युक्त तैयार बेसल मीडिया के 300 माइक्रोन जोड़ें।
  32. समर्थक भड़काऊ वातावरण को दोहराने के लिए 48 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट सेते हैं।
    नोट: आंतों के ऑर्गेनोइड विवो में भड़काऊ मध्यस्थों की एक श्रृंखला का जवाब देते हैं। TNFα एक सेल सिग्नलिंग प्रोटीन है जो कई भड़काऊ प्रक्रियाओं में शामिल है।
  33. 5% ट्राइजीन युक्त वैक्यूम जाल में आकांक्षा द्वारा किसी भी शेष कोशिकाओं का निपटान।

Representative Results

भेदभाव प्रोटोकॉल का एक योजनाबद्ध चित्रा 1 ए में दिखाया गया है. प्रोटोकॉल के दिन 1 पर, hiPSCs कॉम्पैक्ट और लगभग 50-60% कुल संगम के साथ छोटे कॉलोनियों के गठन होना चाहिए। डीई कोशिकाओं के प्रति भेदभाव के प्रेरण के 24 घंटे बाद कोशिकाओं का एक मोनोलेयर बनाने के लिए स्टेम सेल कालोनियों से दूर पलायन करना शुरू कर देते हैं। यह निम्नलिखित 3 दिनों में जारी है और डीई भेदभाव (चित्रा 1) के डी 3 पर एक पूर्ण मोनोलेयर बनाना चाहिए। जीन अभिव्यक्ति pluripotency मार्करों (OCT4, NANOG, SOX2) अत्यधिक D0 पर व्यक्त और तेजी से डीई भेदभाव के दौरान downregulated के साथ भेदभाव के पाठ्यक्रम पर नजर रखी जानी चाहिए. DE भेदभाव के दौरान T अभिव्यक्ति D1 पर चरम पर होनी चाहिए, इसके बाद D2 पर EOMES और MIXL होनी चाहिए। D2 DE जीन (SOX17, FOXA2, GATA4, CXCR4) पर व्यक्त किया जाना शुरू हो जाना चाहिए और D3 (चित्रा 2 और चित्रा 3) पर चोटी होनी चाहिए। कोशिकाओं को डीई डी 3 द्वारा एक मोनोलेयर होना चाहिए और फिर हिंडगट एंडोडर्म में पीछे की ओर बढ़ाया जा सकता है। पोस्टीरियोराइजेशन इवेंट के दौरान 3D संरचनाएं D2 की शुरुआत में बनना शुरू हो जाएंगी। हालांकि, कभी-कभी वे केवल D4 पर दिखाई देने लगेंगे या बिल्कुल नहीं; यह हमेशा इस बात का संकेत नहीं है कि कोशिकाएं आगे बढ़ेंगी या नहीं और आंतों के ऑर्गेनॉइड बनाएंगी (चित्र 1)। एचजी विनिर्देश के दौरान सीडीएक्स 2 और एचएनएफ 4 ए अभिव्यक्ति को प्रेरित किया जाना चाहिए और समय के साथ बढ़ना चाहिए (चित्रा 3)।

बाह्य मैट्रिक्स में कोशिकाओं की 2 डी शीट के हस्तांतरण के बाद, पहले 24 घंटे के लिए 2 डी कोशिकाओं के गुच्छों को देखा जाएगा। कोशिकाओं के 48 एच शीट्स के बाद ऑटो को अधिक कॉम्पैक्ट 3 डी स्फेरॉइड संरचनाओं में व्यवस्थित करना शुरू करना चाहिए जो शुरू में छोटे (चित्रा 4ए) हैं, फिर धीरे-धीरे संस्कृति के 7-10 दिनों में आकार और जटिलता में वृद्धि (चित्रा 4बी & चित्रा 4सी)। ऑर्गेनोइड को तब तक पारित नहीं किया जाना चाहिए जब तक कि वे स्पष्ट उपकला के साथ एक स्पष्ट ऑर्गेनॉइड/स्फेरॉइड आकारिकी प्राप्त न कर लें, जिसमें लुमेन ऑर्गेनॉइड/स्फेरॉइड(चित्रा 4डी)के केंद्र की ओर सामना कर रहा हो। इस स्तर पर इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री का उपयोग आंतों के मार्करों जैसे कि विलिन और सीडीएक्स2(चित्रा 5)की अभिव्यक्ति की पुष्टि करने के लिए किया जा सकता है। 2 डी कोशिकाओं के सभी गुच्छे ऑर्गेनोइड में विकसित नहीं होंगे और बाह्य मैट्रिक्स के भीतर कुछ दूषित मृत कोशिकाएं होंगी। कोशिकाओं की इन मृत चादरों को तब तक नजरअंदाज किया जाना चाहिए जब तक कि जीवित कोशिकाओं ने बड़े ऑर्गेनोइड का गठन नहीं किया है और गुजरने के लिए तैयार हैं।

सूजन को मॉडल करने के लिए, TNFα को 24-48 घंटे के लिए टिशू कल्चर माध्यम में जोड़ा जा सकता है। भड़काऊ अणुओं के साथ इनक्यूबेशन के बाद, ऑर्गेनोइड को उनके अलगाव और पासिंग के लिए उपयोग की जाने वाली एक ही तकनीक का उपयोग करके काटा जाता है और फिर क्यूपीसीआर या वेस्टर्न ब्लॉटिंग जैसे सेल बफर संगत एप्लिकेशन का उपयोग करके लाइस्ड किया जाता है। यदि छोटे एक्सपोज़र की आवश्यकता होती है, तो ऑर्गेनोइड को पहले बाह्य मैट्रिक्स से हटा दिया जाना चाहिए और 1.5 एमएल ट्यूब का उपयोग करके निलंबन में TNFα के संपर्क में आना चाहिए। 48 घंटे के लिए TNFα के साथ आंतों के ऑर्गेनोइड का उपचार आमतौर पर आंतों के उपकला मार्करों (LGR5, VIL)(चित्रा 6)की अभिव्यक्ति को नकारात्मक रूप से प्रभावित करते हुए प्रो-इंफ्लेमेटरी मार्करों (TNFα, IL1B, IL8, IL23) की अभिव्यक्ति को प्रेरित करता है।

Endoderm बेसल मीडिया 50 एमएल
आरपीएमआई 1640 48.5 एमएल
B27 अनुपूरक 1 एमएल
1% एनईएए 0.5 एमएल

तालिका 1: एंडोडर्म भेदभाव के लिए एंडोडर्मल बेसल मीडिया की संरचना।

आंतों बेसल मीडिया 50 एमएल
उन्नत DMEM/F12 46.5 एमएल
HEPES बफर 0.5 एमएल
ग्लूटामैक्स 0.5 एमएल
निकोटिनामाइड 0.5 एमएल
N2 अनुपूरक 0.5 एमएल
B27 अनुपूरक 1.0 एमएल
पेन/स्ट्रेप 0.5 एमएल

तालिका 2: आंतों के ऑर्गेनोइड की संस्कृति के लिए आंतों के बेसल मीडिया की संरचना

Figure 1
चित्रा 1: हिंडगट वंश के लिए निश्चित एंडोडर्म के माध्यम से एचआईपीएससी के भेदभाव के दौरान रूपात्मक परिवर्तन।
(ए) आंतों के भेदभाव प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध अवलोकन। एचआईपीएससी की यह सेल लाइन साइटोप्लाज्म अनुपात के लिए एक उच्च नाभिक के साथ छोटी कोशिकाओं की ढीली कालोनियां बनाती है। जैसे-जैसे विभेदन आगे बढ़ता है, कोशिकाएं उपकला से मेसेनकाइमल फेनोटाइप में संक्रमण के अनुरूप परिवर्तनों से गुजरती हैं और डीई डी 3 द्वारा एक समान मोनोलेयर बनाती हैं। एक बार उपयुक्त संकेत वितरित कर रहे हैं, डीई कोशिकाओं लम्बी और 3 डी spheroids के रूप में जल्द ही के रूप में जल्द ही दिखाई देने के साथ एक अधिक घनी पैक monolayer फार्म लेकिन इस सेल लाइन इस्तेमाल किया पर निर्भर है और 3 डी संस्कृति (बी) के लिए संक्रमण के लिए एक आवश्यकता नहीं है. स्केल बार: 100 माइक्रोन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: एचजी एंडोडर्म के लिए एचआईपीएससी का भेदभाव एंडोडर्मल जीन की अभिव्यक्ति को प्रेरित करता है।
निश्चित endoderm के लिए भेद hiPSC की immunostaining प्रोटीन स्तर पर TFs की अभिव्यक्ति में परिवर्तन से पता चलता है. प्लुरिपोटेंसी मार्कर (NANOG और OCT4) DE D3 (A) द्वारा डाउनरेगुलेट किए जाते हैं। मेसेंडोडर्म मार्कर बीआरए (टी) की अभिव्यक्ति प्रोटोकॉल (बी) के डी 1 में मौजूद है और डीई विशिष्ट टीएफ एसओएक्स 17 और फॉक्सए 2 डी 2 (बी एंड सी) पर दिखाई देते हैं। स्केल बार: 200 मिमी। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: हिंडगट एंडोडर्म (एचजी) के लिए एचआईपीएससी भेदभाव के दौरान क्यूपीसीआर द्वारा जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन।
प्लुरिपोटेंसी से जुड़े जीन को डाउनरेगुलेटेड (OCT4, NANOG, SOX2) के बाद मेसेंडोडर्म जीन (T, EOMES, MIXL1) की क्षणिक अभिव्यक्ति और अंत में DE जीन (SOX17, FOXA2, CXCR4) और हिंदगट जीन (CDX2, GATA4, HNF4a) की अभिव्यक्ति होती है। डेटा माध्य ±एसडी. के रूप में प्रस्तुत किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: एचजी एंडोडर्म 3 डी बाह्य मैट्रिक्स संस्कृति में 3 डी आंतों के ऑर्गेनोइड बनाने के लिए स्वयं-इकट्ठा होता है।
एचजी एंडोडर्म को एक उपयुक्त 3 डी बाह्य मैट्रिक्स संस्कृति में स्थानांतरित किया जाता है और शुरू में कोशिकाओं (ए) के छोटे ठोस गुच्छे बनाता है। एचजी एंडोडर्म के गुच्छे संस्कृति (बी) के 7-10 दिनों में विस्तार करते हैं और फिर विषम हो जाते हैं और एक अधिक जटिल उपकला (सी) बनाने लगते हैं, अंततः स्पष्ट उपकला आकृति विज्ञान और ऑर्गेनॉइड (डी) के केंद्र की ओर एक ल्यूमिनल सतह के साथ ऑर्गेनोइड को जन्म देते हैं। स्केल सलाखों = 50 माइक्रोन कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: स्थापित एचआईपीएससी-व्युत्पन्न आंतों के ऑर्गेनोइड आंतों के मार्करों को व्यक्त करते हैं।
"इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री" सीडीएक्स 2 और विलिन की अभिव्यक्ति दिखा रहा है। स्केल सलाखों = 100 माइक्रोन कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: भड़काऊ प्रोफ़ाइल पर TNFα का प्रभाव & स्वस्थ आंतों के ऑर्गेनोइड की आंतों की कोशिका अभिव्यक्ति।
TNFα (40 ng/mL) के साथ 48 घंटे के उपचार के बाद स्वस्थ कॉलोनिक ऑर्गेनोइड की भड़काऊ प्रोफ़ाइल। प्रो-इंफ्लेमेटरी मार्करों (TNFα, IL-8 और IL-23) की अभिव्यक्ति TNFα के संपर्क में आने के बाद बढ़ जाती है, जबकि एक ही समय में आंतों के उपकला मार्करों (LGR5, VIL) की अभिव्यक्ति को डाउनरेगुलेट किया जाता है। सांख्यिकीय विश्लेषण दो तरफा छात्र के टी-टेस्ट द्वारा किया गया था। डेटा को प्रत्येक समूह के एसडी ± मतलब के रूप में व्यक्त किया जाता है। *पी < .01; **पी < .001; पी < .0001। (एन = 3)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

यहां, हम मानव आंतों के ऑर्गेनोइड में मानव प्लुरिपोटेंट कोशिकाओं के भेदभाव के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। हम सूजन का अध्ययन करने के लिए उनके उपयोग का प्रदर्शन करते हैं; हालांकि, इसे विभिन्न संदर्भों पर लागू किया जा सकता है, और किसी भी आनुवंशिक पृष्ठभूमि पर सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9 जीन संपादन दृष्टिकोण14 के साथ युग्मित किया जा सकता है। एक बार विभेदित होने के बाद, निश्चित एंडोडर्म, हिंदगट एंडोडर्म और फिर आंतों के उपकला के प्राकृतिक विकासात्मक भेदभाव अनुक्रम के बाद, परिणामी ऑर्गेनोइड को लगातार सुसंस्कृत किया जा सकता है और 12 महीने से अधिक समय तक पारित किया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण पहलू endoderm भेदभाव से पहले undifferentiated स्टेम कोशिकाओं के प्रारंभिक चढ़ाना घनत्व है. यदि यह पर्याप्त रूप से अनुकूलित नहीं है, तो कोशिकाएं प्रारंभिक डीई भेदभाव चरण (यदि कोशिकाएं बहुत विरल हैं) के दौरान मर जाएंगी या डीई भेदभाव की दक्षता को कम कर देंगी (यदि कोशिकाएं बहुत घनी हैं)। सही प्रारंभिक घनत्व को सेल लाइन के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता है, और सही घनत्व को डीई डी 3 के अंत तक एक मोनोलेयर उत्पन्न करना चाहिए। डीई विनिर्देश की दक्षता निर्धारित करने के लिए फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग किया जाना चाहिए और हम आम तौर पर एसओएक्स 17 और / या सीएक्ससीआर 4 के लिए सकारात्मक कोशिकाओं का > 80% देखते हैं। जब SOX17 सकारात्मक कोशिकाओं की संख्या 60% से कम होती है, तो HG पैटर्निंग की दक्षता प्रभावित होती है, जिसके परिणामस्वरूप बाह्य मैट्रिक्स में स्थानांतरित होने पर कम ऑर्गेनोइड बनते हैं। यह अंततः परिणामी ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों को विफल करने का कारण बनेगा। यह निर्धारित करने के लिए कि क्या डीई से एचजी पैटर्निंग सफल रही है, हम प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा सीडीएक्स 2 सकारात्मक कोशिकाओं की संख्या का आकलन करते हैं और आमतौर पर > 80% सकारात्मक कोशिकाओं को देखने की उम्मीद करते हैं। फिर, यदि सीडीएक्स 2 सकारात्मक कोशिकाओं की संख्या 50% से कम हो जाती है, तो इसका आंतों के ऑर्गेनोइड की संख्या पर प्रतिकूल प्रभाव पड़ेगा जो 3 डी बाह्य मैट्रिक्स संस्कृति में स्थानांतरित होने पर उत्पन्न होते हैं।

3 डी संस्कृति में 2 डी मोनोलेयर के हस्तांतरण के बाद, छोटे कॉम्पैक्ट गोले हस्तांतरण के बाद 24-48 घंटे दिखाई देने चाहिए। उपयोग की जाने वाली सेल लाइन के लिए भेदभाव दक्षता के आधार पर मृत कोशिकाओं की बड़ी चादरें दिखाई दे सकती हैं। इन मलबे को हटाने के लिए संस्कृतियों को तुरंत पारित करने के बजाय, हम ऑर्गेनोइड को पूरी तरह से बनाने और उनकी अधिक जटिल, मुड़ी हुई संरचना को विकसित करने की अनुमति देते हैं। पहले गुजरने का प्रयास करने से पहले 7-10 दिनों तक प्रतीक्षा करना यह सुनिश्चित करता है कि कई नए आंतों के ऑर्गेनोइड उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त विभाजन कोशिकाएं मौजूद हैं। संस्कृति में अभी भी मौजूद किसी भी मलबे को आसानी से पासिंग प्रक्रिया के दौरान आसानी से हटाया जा सकता है, धीरे-धीरे ऑर्गेनोइड को गोली मारने के लिए पर्याप्त गति के साथ एक ट्यूब में अलग-अलग ऑर्गेनॉइड / मलबे के मिश्रण को कताई करके लेकिन मीडिया में तैरती कोशिकाओं की शीट छोड़ दें। मीडिया और सेलुलर मलबे को तब महाप्राण किया जा सकता है ताकि केवल ऑर्गेनोइड की गोली बनी रहे।

इस दृष्टिकोण की सीमा यह है कि hiPSC-व्युत्पन्न सेल प्रकार अक्सर जीन अभिव्यक्ति और कार्यात्मक प्रोफाइल के संदर्भ में पूरी तरह से परिपक्व नहीं होते हैं। यह निर्धारित करने के लिए कि क्या hiPSC-व्युत्पन्न आंतों के ऊतक विशिष्ट अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त है, ऑर्गेनोइड को एंटरोसाइट्स (VIL), एंटरोएंडोक्राइन कोशिकाओं (न्यूरोग 3), गॉब्लेट कोशिकाओं (MUC2), क्षणिक प्रवर्धक कोशिकाओं (CD133), पैनथ कोशिकाओं (FZD5) और LGR5+ स्टेम सेल (LGR5) सहित विभिन्न सेल प्रकारों के लिए विशेषता होनी चाहिए।

कुल मिलाकर, कई अन्य organoid भेदभाव प्रोटोकॉल पर इस प्रोटोकॉल का प्रमुख लाभ यह है कि इस संस्कृति मंच कई पुनः संयोजक प्रोटीन और छोटे अणुओं15,16 के साथ वातानुकूलित मीडिया तैयारी के प्रतिस्थापन के कारण बहुत लागत प्रभावी है. एचजी में भेदभाव बहुत सरल और तेज है और समान परिणामों के साथ मानव भ्रूण और प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं दोनों पर लागू किया जा सकता है। जब सख्ती से पीछा किया, और सेल लाइनों का इस्तेमाल किया जा रहा है के लिए अनुकूलित यह एक अपेक्षाकृत सरल मॉडल मंच दूषित मेसेनकाइमल कोशिकाओं है कि तब सूजन, मेजबान रोगज़नक़बातचीत 7 सहित संदर्भ की एक किस्म में आंतों के उपकला का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है से मुक्त प्रदान करता है. आंतों फाइब्रोसिस मॉडलिंग प्रो-फाइब्रोटिक उत्तेजनाओं प्रदान करके और फिर क्यूपीसीआर, पश्चिमी धब्बा और एलिसा द्वारा कोलेजन, लेमिनिन और फाइब्रोनेक्टिन जैसे बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन की अभिव्यक्ति का आकलन करके जांच की जा सकती है। भेदभाव से पहले उदासीन स्टेम सेल लाइनों पर सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9 जीन संपादन तकनीकों का उपयोग जीन नॉकआउट या प्रोटीन ओवरएक्सप्रेशन ऑर्गेनोइड के निर्माण की अनुमति देता है जिसका उपयोग रोग विशिष्ट ऑर्गेनोइड और अधिक जटिल रोग मॉडल 14,17,18 बनाने के लिए किया जा सकता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

NH को MRC (MR/S009930/1) और वेलकम ट्रस्ट (204267/Z/16/Z) द्वारा वित्त पोषित किया जाता है, PD को MRC PhD DTP द्वारा वित्त पोषित किया जाता है, KLF को BBSRC iCASE द्वारा वित्त पोषित किया जाता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A83-01 Tocris 2939
Activin A R&D 338-AC
Advanced DMEM/F12 (1X) Life Technologies 12654-010
B27 supplement Gibco 17504044
CHIR99021 Sigma SML1046-5MG
Epidermal Growth Factor R&D Systems 236-EG-01M
Gastrin Sigma Aldrich G9145
GlutaMAX (100X) Life Technologies 15630-056
Growth Factor reduced Matrigel BD
HEPES Buffer solution (1M) Life Technologies 15630-080
N2 Supplement (100X) Gibco 17502-048
N-acetyl-cysteine Sigma Aldrich A7250
Nicotinamide Sigma Aldrich N0636
Noggin R&D Systems 6057-NG
Non-essential amino acids Gibco 11140-050
Paraformaldehyde VWR 9713.5
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140122
Phosphate Buffered Saline Gibco 14190-094
Retinoic Acid Sigma 302-79-4
ROCK inhibitor Tocris 1254/1
ROCK inhibitor Y-27632 Tocris 1254
RPMI Sigma R8758-500ml
R-Spondin-1 Peprotech 120-38
SB202190 Tocris 1264
TrypLe Express Gibco 12604-021
Wnt 3a R&D 5036-WN

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References

  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  2. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
  3. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  4. Rashid, S. T., et al. Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells. Journal of Clinical Investigation. 120, 3127-3136 (2010).
  5. Vallier, L., Alexander, M., Pedersen, R. A. Activin/Nodal and FGF pathways cooperate to maintain pluripotency of human embryonic stem cells. Journal of Cell Science. 118, 4495-4509 (2005).
  6. Jaremko, K. L., Marikawa, Y. Regulation of developmental competence and commitment towards the definitive endoderm lineage in human embryonic stem cells. Stem Cell Research. 10, 489-502 (2013).
  7. Forbester, J. L., et al. Interaction of Salmonella enterica Serovar Typhimurium with Intestinal Organoids Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells. Infection and Immunity. 83, 2926-2934 (2015).
  8. Hannan, N. R., et al. Generation of multipotent foregut stem cells from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 1, 293-306 (2013).
  9. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
  10. de Souza, H. S., Fiocchi, C. Immunopathogenesis of IBD: current state of the art. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 13, 13-27 (2016).
  11. Tripathi, K., Feuerstein, J. D. New developments in ulcerative colitis: latest evidence on management, treatment, and maintenance. Drugs in Context. 8, 212572 (2019).
  12. Ganesh, K., et al. A rectal cancer organoid platform to study individual responses to chemoradiation. Nature Medicine. 25, 1607-1614 (2019).
  13. Fair, K. L., Colquhoun, J., Hannan, N. R. F. Intestinal organoids for modelling intestinal development and disease. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373, (2018).
  14. Cuevas-Ocaña, S., Yang, J. Y., Aushev, M., Schlossmacher, G., Bear, C. E., Hannan, N. R. F., Perkins, N. D., Rossant, J., Wong, A. P., Gray, M. A. A Cell- Based Optimised Approach for Rapid and Efficient Gene Editing of Human Pluripotent Stem Cells. Int. J. Mol. Sci. 24, 10266 (2023).
  15. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470, 105-109 (2011).
  16. Sato, T., et al. Long-term Expansion of Epithelial Organoids From Human Colon, Adenoma, Adenocarcinoma, and Barrett's Epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
  17. Giacalone, J. C., et al. CRISPR-Cas9-Based Genome Editing of Human Induced Pluripotent Stem Cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 44, 1-22 (2018).
  18. Bruntraeger, M., Byrne, M., Long, K., Bassett, A. R. CRISPR Gene Editing: Methods and Protocols. Luo, Y. , Springer. New York. 153-183 (2019).

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Durczak, P. M., Fair, K. L., Jinks, N., Cuevas Ocaña, S., Sainz Zuñiga, C. B., Hannan, N. R. F. Generation of hiPSC-Derived Intestinal Organoids for Developmental and Disease Modelling Applications. J. Vis. Exp. (205), e61199, doi:10.3791/61199 (2024).

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