Summary
该协议允许将人类多能细胞分化为肠道类器官。该协议通过将细胞分化为确定的内胚层，后肠内胚层和肠上皮细胞群来模拟正常的人类发育。这使得该协议适用于研究肠道发育和疾病建模应用。
Abstract
hiPSC 衍生的肠道类器官是上皮结构，可从分化的细胞自组装成复杂的 3D 结构，代表人类肠上皮，其中它们表现出隐窝/绒毛样结构。在这里，我们描述了通过将 hiPSC 逐步分化为最终内胚层来生成 hiPSC 衍生的肠道类器官，然后在转移到 3D 培养条件之前将其后部化以形成后肠上皮。3D 培养环境由补充有 SB202190、A83-01、Gastrin、Noggin、EGF、R-spondin-1 和 CHIR99021 的细胞外基质 （ECM）（例如 Matrigel 或其他相容的 ECM）组成。类器官每 7 天进行一次传代，在转移到新鲜的细胞外基质并使其扩增之前，它们被机械破坏。QPCR和免疫细胞化学证实，hiPSC来源的肠道类器官含有成熟的肠上皮细胞类型，包括杯状细胞、潘氏细胞和肠细胞。此外，类器官通过表达位于上皮细胞顶端表面的绒毛显示出极化的证据。
由此产生的类器官可用于模拟人类肠道发育以及包括炎症性肠病在内的多种人类肠道疾病。为了模拟肠道炎症，类器官可以暴露于炎症介质，如TNF-α、TGF-β和细菌LPS。暴露于促炎细胞因子的类器官表现出炎症和纤维化表型作为反应。将源自 IBD 患者的健康 PSC 与 hiPSC 配对可能有助于了解驱动 IBD 的机制。这可能会揭示新的治疗靶点和新的生物标志物，以帮助早期疾病诊断。
Introduction
多能干细胞 （PSC） 的特性，例如自我更新和分化为人体任何细胞类型的能力，使其成为发育、疾病病理学和药物测试研究的宝贵工具1.人类诱导多能干细胞 （hiPSC） 对于疾病建模研究特别有用，因为它们可以来源于患者，直接捕获导致疾病表型 2,3 的基因组。这种 hiPSC 可以分化为受遗传缺陷影响的细胞类型，从而可以仔细检查疾病的分子机制4。
人 PSC 的分化方案旨在通过激活或抑制控制谱系承诺和规范的特定信号通路来指导细胞在主要发育阶段的分化。将 hiPSC 维持在多能状态需要中等水平的激活素 A （Act-A） 信号转导，而高剂量的 Act-A 持续 3 天可使 hiPSC 达到最终的内胚层 （DE） 命运 5,6。Act-A 和 Wnt 通路直接 DE 的前后身份。Act-A 的信号转导诱导前肠 （FG） 标志物，如 HHEX、HNF4α 和 GATA4，同时阻断后肠 （HG） 基因（如 CDX2）的表达。Wnt 信号转导诱导 DE 的后置化，然后采用 HG 基因表达谱 7,8。一旦确定了HG细胞身份，就可以将分化从2D转移到3D，并引导到肠道类器官的形成。
肠道类器官通常在基于 3D 细胞外基质（例如，Matrigel 或其他相容的 ECM）的培养系统9 中培养，该系统由层粘连蛋白、胶原蛋白 IV 和肌动蛋白组成，并富含生长因子，如 EGF、FGF、PDGF 和 IGF-1，有助于支持存活和增殖。类器官在含有 Gastrin、Noggin 和 CHIR 的特定培养基中培养，以在长期培养过程中刺激和支持肠道干细胞的生长和增殖。
肠上皮细胞嵌入细胞外基质后，肠隐窝开始形成并扩大，最终形成球状体。这些成熟为模拟肠上皮生理功能的类器官结构。类器官通常可以培养 1 年以上，而不会显着损失功能和基因表达谱。每周需要传代，使用酶消化将类器官消化成更小的片段，然后自我重组成完整的类器官。
已建立的类器官系可用作与肠道相关的多种疾病的可靠模型，包括克罗恩病、溃疡性结肠炎和结直肠癌10、11、12、13。这是动物细胞的首选模型，因为它们表达与这些疾病相关的人类基因，并且对外部刺激的反应更接近于体内人体组织中发生的刺激。
Protocol
注意：下面详述的所有组织培养工作都应在 II 类层流罩中完成。
1. 人类诱导多能干细胞（hiPSCs）分化到后肠内胚层
- 要用细胞外基质包被细胞培养瓶，首先计算所需基质的量。这是用 Matrigel 包被的 12 孔板的示例。计算包被12孔板所需的细胞外基质量。使用以下公式：
注意：用选择的细胞外基质包被细胞培养皿。如果使用基质凝胶，则在接种前24小时使用0.035mg / cm2 的浓度进行分化。检查产品表上细胞外基质的批次浓度，并根据制造商的说明在实验前制备较小的等分试样。 - 使用p1000移液管在冷DMEM培养基中稀释所需量的细胞外基质。
- 使用 5 mL 条带充分混合。
- 向每个孔板中加入 500μL 稀释的基质。轻轻摇动板以均匀分布稀释的细胞外基质，并在37°C下孵育至少12小时。
- 在将细胞接种到板中之前，用 500 μL PBS 洗涤每个孔以除去多余的细胞外基质。这将防止分化过程中的细胞脱离。
- 将最后一次洗涤留在孔中，直到准备好播种，以防止细胞外基质干燥。
- 为了使 hiPSCs 分化为确定性内胚层 （DE） 或后肠 （HG），取一瓶在所选维持培养基（例如：必需 8 培养基）中培养的 hiPSC 并吸出培养基。（在这里，我们以 25,000 个细胞/cm2 的速率接种细胞）。
注：接种密度对于成功分化至关重要，需要针对每个单独的 hiPSC 细胞系进行优化。 - 用 5 mL PBS 洗涤培养瓶中的细胞。吸出 PBS。
- 加入 2.5 mL 细胞解离溶液（例如 TrypLE）并在室温下放置 4 分钟。吸出细胞解离溶液并轻轻敲击烧瓶以分离细胞。
- 用加热至37°C的5mLDMEM培养基洗涤烧瓶，并将所有细胞收集到15mL管中。
- 取 10 μL 重悬细胞溶液，用血细胞计数器测量细胞密度。
- 取足够的细胞悬液以收集 1.05 x 106 个细胞，并放入 15 mL 试管中。
- 以 160 x g 旋转 3 分钟。在离心细胞时，从包被的 12 孔板的细胞外基质中吸出 PBS。
- 离心后，吸出上清液并将细胞沉淀重悬于含有ROCK抑制剂（10μM）的12mL维持培养基中。
- 使用 p1000 移液管，向 12 孔板的每个孔中加入 1 mL 细胞悬液。将细胞重悬，以确保孔之间的均匀分布。
- 轻轻摇晃板以将细胞分布在板的孔内，但避免介质旋转，因为它会将细胞集中在孔的中间。
- 置于37°C，5%CO2 培养箱中。
- 接种后 24 小时仅将培养基更换为维持培养基（例如，必需的 8 种培养基）（无 ROCK 抑制剂）。
- 要开始分化为DE，请根据 表1制备内胚层基础培养基。
注意：在分化开始时，细胞应在 60-80% 汇合之间。 - 通过向内胚层基础培养基中加入激活素 A （100 ng/mL） 和 Wnt3 （50 ng/mL） 来制备 12 mL DE 培养基。
- 将培养基加热至37°C。
- 从组织培养板或烧瓶的每个孔中吸出培养基。
- 通过向 12 孔板的每个孔中加入 1 mL DE 培养基来开始 DE 分化。
- 在开始DE分化（D1 DE）后24小时，制备新鲜的DE培养基并进行培养基更换。
- 在48小时（D2 DE）重复步骤1.24。如果在此阶段存在大量细胞死亡，请在更换培养基之前用 500 μL PBS 洗涤所有孔。
注意：为了确认成功的内胚层分化，进行流式细胞术以评估 SOX17 的表达。我们通常预计 >80% 的细胞在 D3 DE 时呈 SOX17 阳性。如果 SOX17 的表达不理想，则应优化细胞接种密度以及 Act-A 的浓度。 - 此时开始 HG 分化，即 DE 分化开始后 72 小时。通过向内胚层基础培养基中加入CHIR99021（3μM）和RA（1μM）来制备12mL的HG培养基（表1）。
注意：在 D3 DE 处，电池应该形成均匀的单层。最佳的DE分化对于进一步的分化阶段至关重要。 - 吸出 DE 培养基。
- 通过向 12 孔板的每个孔中加入 1 mL HG 培养基来开始 HG 分化。
- 通过每天更换培养基继续分化 4 天。
注意：为了确定 DE 后置化的成功，请进行流式细胞术以评估 CDX2 的表达。通过HG分化的D4，我们通常期望>80%的细胞为CDX2阳性。如果后验化效果不佳，则应优化CHIR99021浓度。 - 为了收集用于RNA提取的样品，吸出分化培养基并用500ul的PBS洗涤孔。
- 吸出PBS，并从RNA提取试剂盒中加入适当体积的细胞裂解缓冲液。
- 使用p1000移液管，刮擦孔的底部以确保所有细胞的裂解。
- 吸出细胞裂解物并置于干净的试管中。
- 进行RNA提取或将裂解物冷冻在-20°C，直到准备好进行RNA提取。
- 对于免疫染色，吸出分化培养基并用 500 μL PBS 洗涤孔。
- 吸出 PBS 并加入 500 μL 4% PFA。
注意：PFA 是有毒的。使用适当的个人防护装备，并遵循当地实验室程序进行PFA处置。 - 在4°C孵育20分钟。
- 除去PFA并用500μLPBS洗涤孔三次。
- 将最后一次PBS洗涤液留在细胞上，直到准备好进行免疫染色。
2.肠道类器官的传代
- 根据表2制备肠道基础培养基。
- 要从 2D 细胞培养转移到 3D 细胞培养，请使用 6 孔板生成形成 hiPSCS 的 DE 细胞。使用 5 mL 条带分离单层细胞形成 6 细胞板。
- 将细胞收集到15mL离心管中，然后以400× g 离心1分钟以产生细胞沉淀。
- 将细胞沉淀重悬于含有生长因子的肠道生长培养基中：SB202190（10μM），A83-01（500nM），胃泌素（10nM），Noggin（100ng / μL），EGF（500ng / μL），R-Spondin1（100ng / mL），CHIR99021（6μM），ROCK抑制剂（10μM）。
- 根据被接种的孔数添加适当体积的细胞外基质。这可以使用下面的公式计算。
[1] 细胞外基质/培养基的总体积 （μL） = 30 μL * 48 孔板的孔数
[2] 所需细胞外基质体积 （μL） = [1] * 2/3 的答案
[3] 所需培养基体积 （μL） = [1] * 1/3 的答案 - 向 48 孔板的每个孔的中心加入 30 μL 细胞悬液。
- 将板在37°C培养箱中孵育至少5分钟，以使细胞外基质凝固。
- 细胞外基质圆顶凝固后，向每个孔中加入 300 μL 含有所有生长因子的肠道生长培养基。
- 将板放回含有5%CO2的37°C培养箱中。
注意：如果 48 小时后无法观察到类器官和/或有显着的细胞死亡，则可能需要优化 ROCKi 和 NOGGIN 浓度。 - 为了传代类器官，在光学显微镜下观察细胞，以评估类器官的密度和大小，并确定它们是否需要传代。
- 用冰冷的PBS代替细胞培养基。
注意：类器官培养物大约需要每 5-7 天分裂一次。一旦类器官腔内有明显的细胞碎片堆积并且周围的肠道生长培养基变黄，就需要对肠道类器官培养物进行传代。 - 使用5 mL条带的刮擦运动，将类器官和细胞外基质球从板上机械分离。
- 将每个孔中的类器官收集到 15 mL 离心管中。
- 以400× g 离心类器官悬浮液1分钟以沉淀类器官。吸出上清液直到到达细胞沉淀的顶部，当到达可见的细胞外基质层时要小心。
- 将沉淀重悬于 15 mL 冰冷的 PBS 中。
注意：此步骤用于洗涤在初始离心中未去除的任何剩余细胞外基质。 - 以400× g 离心1分钟。吸出培养基，直到含有类器官的沉淀。
- 重悬于 1 mL 冰冷的 PBS 中。使用 p200 移液器，通过上下移液数次来手动破坏完整的类器官。
注意：使用光学显微镜观察类器官的大小，以确定它们是否需要进一步解离。 - 加入 9 mL 不含生长因子的培养基。
- 以400× g 离心1分钟。吸出上清液，直到类器官沉淀。
- 使用以下公式计算所需的细胞外基质和培养基量：
[1] 细胞外基质/培养基的总体积 （μL） = 30 μL * 48 孔板的孔数
[2] 所需细胞外基质体积 （μL） = [1] * 2/3 的答案
[3] 所需培养基体积 （μL） = [1] * 1/3 的答案 - 将类器官沉淀重悬于具有生长因子（包括Noggin和ROCK抑制剂）的计算体积的肠道培养基中。
- 将所需体积的细胞外基质添加到该细胞悬液中并重悬，以确保类器官均匀分布。
- 将30μL该悬浮液移液到48孔板的每个孔的中心（最好在37°C培养箱中预热）。
- 将板放回37°C培养箱5分钟，直到细胞外基质凝固。
- 用生长因子（+ ROCK抑制剂）制备肠道培养基（每48孔板约17mL）。
- 向每个孔中加入 300 μL。
- 在37°C下以5%CO2孵育。
- 传代后，吸出肠道类器官的培养基，每2-4天用含有生长因子（不含Noggin和ROCK抑制剂）的新鲜肠道培养基代替。
注意：如果 48 小时后无法观察到类器官和/或有显着的细胞死亡，则可能需要优化 ROCKi 和 NOGGIN 浓度。
注意：肠道类器官对体内的一系列炎症介质有反应。TNFα 是一种参与多种炎症过程的细胞信号蛋白。 - 为了触发肠道类器官的炎症反应，仅在基础培养基中制备浓度为 40 ng/mL 的 TNFα。
- 从 48 孔板中吸出培养基。
- 加入 300 μL 制备的含有 40 ng/mL TNFα 的基础培养基。
- 将板在37°C孵育48小时以复制促炎环境。
注意：肠道类器官对体内的一系列炎症介质有反应。TNFα 是一种参与多种炎症过程的细胞信号蛋白。 - 通过抽吸将任何剩余的细胞处理到含有 5% Trigene 的真空阱中。
Representative Results
分化方案示意图如 图1A所示。在方案的第 1 天，hiPSC 应紧凑并形成总汇合度约为 50-60% 的小菌落。诱导分化后 24 小时，DE 细胞开始从干细胞集落迁移，形成单层细胞。这在接下来的 3 天内持续，并且应该在 DE 分化的 D3 上形成完整的单层（图 1）。在分化过程中，应使用多能性标志物（OCT4、NANOG、SOX2）监测基因表达，这些标志物在 D0 上高度表达，并在 DE 分化过程中迅速下调。在 DE 分化过程中，T 表达应在 D1 达到峰值，其次是在 D2 达到 EOMES 和 MIXL。在 D2 上，DE 基因（SOX17、FOXA2、GATA4、CXCR4）应开始表达并在 D3 处达到峰值（图 2 和 图 3）。细胞应该是 DE D3 的单层，然后可以后部化为后肠内胚层。在后验化事件期间，3D 结构将早在 D2 开始形成。但是，有时它们只会在 D4 开始出现或根本不出现;这并不总是表明细胞是否会继续并形成肠道类器官（图1）。在HG规范期间，应诱导CDX2和HNF4a表达并随着时间的推移而增加（图3）。
将 2D 细胞片转移到细胞外基质后，将在前 24 小时内观察到 2D 细胞团块。48小时后，细胞片应开始自动组织成更紧凑的3D球状体结构，这些结构最初很小（图4A），然后在培养的7-10天内逐渐增加大小和复杂性（图4B 和 图4C）。类器官在获得清晰的类器官/球状体形态和明显的上皮细胞并且管腔朝向类器官/球状体的中心之前不应传代（图4D）。在这个阶段，免疫细胞化学可用于确认肠道标志物（如绒毛和CDX2）的表达（图5）。并非所有的2D细胞团块都会发育成类器官，细胞外基质中会有一些污染性死细胞。这些死细胞片应被忽略，直到存活的细胞形成大类器官并准备好传代。
为了模拟炎症，可以将TNFα添加到组织培养基中24-48小时。在与促炎分子孵育后，使用用于分离和传代的相同技术收获类器官，然后使用与细胞缓冲液兼容的应用（如QPCR或蛋白质印迹）进行裂解。如果需要较短的暴露时间，应首先从细胞外基质中取出类器官，并使用 1.5 mL 试管暴露于悬浮液中的 TNFα。用TNFα处理肠道类器官48小时通常诱导促炎标志物（TNFα，IL1B，IL8，IL23）的表达，同时对肠上皮标志物（LGR5，VIL）的表达产生负面影响（图6）。
| 内胚层基底培养基 | 50毫升 | |
| RPMI 1640 系列 | 48.5毫升 | |
| B27 补充剂 | 1毫升 | |
| 1% NEAA | 0.5毫升 | |
表1：用于内胚层分化的内胚层基础培养基的组成。
| 肠基础培养基 | 50毫升 | |
| 高级 DMEM/F12 | 46.5毫升 | |
| HEPES缓冲液 | 0.5毫升 | |
| 谷氨酸 | 0.5毫升 | |
| 烟 酰 胺 | 0.5毫升 | |
| N2 补充剂 | 0.5毫升 | |
| B27 补充剂 | 1.0毫升 | |
| 笔/链球菌 | 0.5毫升 | |
表2：用于肠道类器官培养的肠道基础培养基的组成
图 1：hiPSC 通过确定性内胚层分化到后肠谱系期间的形态变化。
（A）肠道分化方案示意图概述。这种 hiPSC 细胞系形成具有高细胞核与细胞质比的小细胞的松散菌落。随着分化的进行，细胞发生的变化与从上皮到间充质表型的转变一致，并通过 DE D3 形成均匀的单层。一旦传递了适当的信号，DE 细胞就会伸长并形成更致密的单层，其中 3D 球体在 HD D3 后立即出现，但这取决于所使用的细胞系，并且不是过渡到 3D 培养的必要条件 （B）。比例尺：100μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：hiPSC 分化为 HG 内胚层诱导内胚层基因的表达。
分化为确定性内胚层的 hiPSC 免疫染色显示 TFs 在蛋白质水平上的表达发生变化。多能性标志物（NANOG 和 OCT4）被 DE D3 下调 （A）。中胚层标志物 BRA（T） 的表达存在于方案 （B） 的 D1 处，DE 特异性 TF SOX17 和 FOXA2 出现在 D2 （B & C） 上。比例尺：200毫米。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：hiPSC 分化为后肠内胚层 （HG） 期间通过 qPCR 进行的基因表达变化。
与多能性相关的基因下调（OCT4、NANOG、SOX2），随后是中胚层基因（T、EOMES、MIXL1）的瞬时表达，最后是DE基因（SOX17、FOXA2、CXCR4）和后肠基因（CDX2、GATA4、HNF4a）的表达。数据以平均值±SD表示。 请点击这里查看此图的较大版本。
图 4：HG 内胚层在 3D 细胞外基质培养中自组装形成 3D 肠道类器官。
HG 内胚层被转移到合适的 3D 细胞外基质培养物中，最初形成小的固体细胞团 （A）。HG 内胚层团块在培养 7-10 天后扩增 （B），然后变得不对称并开始形成更复杂的上皮 （C），最终产生具有清晰上皮形态的类器官和管腔表面朝向类器官的中心 （D）。比例尺 = 50 μm 请点击这里查看此图的较大版本.
图 5：已建立的 hiPSC 衍生的肠道类器官表达肠道标志物。
免疫细胞化学显示 CDX2 和 Villin 的表达。比例尺 = 100 μm 请点击这里查看此图的较大版本.
图6：TNFα对健康肠道类器官的炎症谱和肠道细胞表达的影响。
用 TNFα （40 ng/mL） 治疗 48 小时后健康结肠类器官的炎症特征。促炎标志物（TNFα，IL-8和IL-23）的表达在暴露于TNFα后增加，同时肠上皮标志物（LGR5，VIL）的表达下调。采用双侧学生t检验进行统计分析。数据表示为每组的平均值±标准差。*P < .01;**P < .001;P < .0001。（n=3）。 请点击这里查看此图的较大版本.
Discussion
在这里，我们描述了将人类多能细胞分化为人类肠道类器官的方案。我们证明了它们用于研究炎症;然而，这可以应用于各种环境，并与CRISPR / Cas9基因编辑方法14相结合，适用于任何遗传背景。一旦分化，按照确定性内胚层、后肠内胚层和肠上皮的自然发育分化序列，所得类器官可以连续培养和传代超过 12 个月。
该协议的一个关键方面是内胚层分化之前未分化干细胞的初始铺板密度。如果这没有得到充分优化，细胞可能会在最初的DE分化步骤中死亡（如果细胞太稀疏）或降低DE分化的效率（如果细胞太密集）。正确的起始密度需要针对所使用的细胞系进行优化，正确的密度应在 DE D3 结束时生成单层。应使用流式细胞术来确定 DE 规格的效率，我们通常会看到 >80% 的细胞对 SOX17 和/或 CXCR4 呈阳性。当 SOX17 阳性细胞数量少于 60% 时，HG 图案化的效率受到影响，这导致转移到细胞外基质时形成的类器官较少。这最终将导致所得的类器官培养失败。为了确定 DE 到 HG 的模式化是否成功，我们通过流式细胞术评估 CDX2 阳性细胞的数量，通常期望看到 >80% 的阳性细胞。同样，如果 CDX2 阳性细胞的数量低于 50%，这将对转移到 3D 细胞外基质培养时产生的肠道类器官的数量产生不利影响。
将 2D 单层转移到 3D 培养物中后，转印后 24-48 小时应出现小的致密球体。根据所用细胞系的分化效率，可能会出现大片死细胞。我们不是立即传代培养物以去除这些碎片，而是让类器官完全形成并发展其更复杂的折叠结构。等待 7-10 天后再尝试第一次通过，确保存在足够的分裂细胞来产生许多新的肠道类器官。在传代过程中，通过以足够的速度缓慢旋转分离的类器官/碎片混合物，可以很容易地去除培养物中仍然存在的任何碎片，以沉淀类器官，但使细胞片漂浮在培养基中。然后可以吸出培养基和细胞碎片，以便只留下类器官颗粒。
这种方法的局限性在于，hiPSC衍生的细胞类型在基因表达和功能谱方面通常不完全成熟。为了确定 hiPSC 来源的肠道组织是否适合特定应用，应表征不同细胞类型的类器官，包括肠细胞 （VIL）、肠内分泌细胞 （neurog3）、杯状细胞 （MUC2）、瞬时扩增细胞 （CD133）、潘氏细胞 （FZD5） 和 LGR5+ 干细胞 （LGR5），以确定类器官细胞组成。
总体而言，与许多其他类器官分化方案相比，该方案的主要优势在于，由于用小分子替换了几种重组蛋白和条件培养基制备物，因此该培养平台非常具有成本效益15,16。分化为HG非常简单和快速，可以应用于人类胚胎和诱导多能干细胞，具有相同的结果。当严格跟踪并针对正在使用的细胞系进行优化时，它提供了一个相对简单的模型平台，没有污染间充质细胞，然后可以应用于研究各种情况下的肠上皮，包括炎症、宿主病原体相互作用7.通过提供促纤维化刺激，然后通过QPCR、蛋白质印迹和ELISA评估胶原蛋白、层粘连蛋白和纤连蛋白等细胞外基质蛋白的表达，可以研究肠道纤维化建模。在分化之前对未分化的干细胞系使用 CRISPR/Cas9 基因编辑技术可以创建基因敲除或蛋白质过表达类器官，这些类器官可用于创建疾病特异性类器官和更复杂的疾病模型 14,17,18。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
NH 由 MRC （MR/S009930/1） 和 Wellcome Trust （204267/Z/16/Z） 资助，PD 由 MRC PhD DTP 资助，KLF 由 BBSRC iCASE 资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A83-01 | Tocris | 2939 | |
| Activin A | R&D | 338-AC | |
| Advanced DMEM/F12 (1X) | Life Technologies | 12654-010 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504044 | |
| CHIR99021 | Sigma | SML1046-5MG | |
| Epidermal Growth Factor | R&D Systems | 236-EG-01M | |
| Gastrin | Sigma Aldrich | G9145 | |
| GlutaMAX (100X) | Life Technologies | 15630-056 | |
| Growth Factor reduced Matrigel | BD | ||
| HEPES Buffer solution (1M) | Life Technologies | 15630-080 | |
| N2 Supplement (100X) | Gibco | 17502-048 | |
| N-acetyl-cysteine | Sigma Aldrich | A7250 | |
| Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636 | |
| Noggin | R&D Systems | 6057-NG | |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
| Paraformaldehyde | VWR | 9713.5 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-094 | |
| Retinoic Acid | Sigma | 302-79-4 | |
| ROCK inhibitor | Tocris | 1254/1 | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | Tocris | 1254 | |
| RPMI | Sigma | R8758-500ml | |
| R-Spondin-1 | Peprotech | 120-38 | |
| SB202190 | Tocris | 1264 | |
| TrypLe Express | Gibco | 12604-021 | |
| Wnt 3a | R&D | 5036-WN |
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