Summary
Detta protokoll möjliggör differentiering av humana pluripotenta celler till tarmorganoider. Protokollet efterliknar normal mänsklig utveckling genom att differentiera celler till en population av definitiv endoderm, baktarmsendoderm och sedan tarmepitel. Detta gör protokollet lämpligt för att studera både tarmutveckling och sjukdomsmodelleringstillämpningar.
Abstract
hiPSC-härledda tarmorganoider är epitelstrukturer som självorganiserar sig från differentierade celler till komplexa 3D-strukturer, representativa för det mänskliga tarmepitelet, där de uppvisar krypta/villusliknande strukturer. Här beskriver vi genereringen av hiPSC-härledda tarmorganoider genom den stegvisa differentieringen av hiPSCs till definitiv endoderm, som sedan posterioriseras för att bilda baktarmsepitel innan den överförs till 3D-odlingsförhållanden. 3D-odlingsmiljön består av extracellulär matris (ECM) (t.ex. Matrigel eller annan kompatibel ECM) kompletterad med SB202190, A83-01, Gastrin, Noggin, EGF, R-spondin-1 och CHIR99021. Organoider genomgår passering var 7:e dag, där de störs mekaniskt innan de överförs till färsk extracellulär matris och tillåts expandera. QPCR och immunocytokemi bekräftar att hiPSC-härledda tarmorganoider innehåller mogna tarmepitelcelltyper inklusive bägarceller, Paneth-celler och enterocyter. Dessutom visar organoider tecken på polarisering genom uttryck av villin lokaliserad på epitelcellernas apikala yta.
De resulterande organoiderna kan användas för att modellera mänsklig tarmutveckling såväl som många mänskliga tarmsjukdomar inklusive inflammatorisk tarmsjukdom. För att modellera tarminflammation kan organoider utsättas för inflammatoriska mediatorer som TNF-α, TGF-β och bakteriell LPS. Organoider som exponerats för proinflammatoriska cytokiner uppvisar en inflammatorisk och fibrotisk fenotyp som svar. Att para ihop friska kontra hiPSCs som härrör från patienter med IBD kan vara användbart för att förstå mekanismer som driver IBD. Detta kan avslöja nya terapeutiska mål och nya biomarkörer för att hjälpa till med tidig sjukdomsdiagnos.
Introduction
Egenskaperna hos pluripotenta stamceller (PSC), såsom självförnyelse och förmågan att differentiera till vilken celltyp som helst i människokroppen, gör dem till värdefulla verktyg i studiet av utveckling, sjukdomspatologi och läkemedelstestning1. Humana inducerade pluripotenta stamceller (hiPSC) är särskilt användbara för sjukdomsmodelleringsstudier eftersom de kan härledas från patienter och direkt fånga genomet som är ansvarigt för sjukdomens fenotyp 2,3. Sådana hiPSCs kan differentieras till den celltyp som påverkas av den genetiska defekten, vilket möjliggör noggrann undersökningav sjukdomens molekylära mekanism.
Differentieringsprotokoll för humana PSC:er syftar till att styra differentieringen av celler via de viktigaste utvecklingsstadierna genom aktivering eller hämning av specifika signalvägar som styr härstamningsåtagande och specifikation. Upprätthållande av hiPSC i ett pluripotent tillstånd kräver måttliga nivåer av Activin A (Act-A)-signalering, medan en hög dos av Act-A i 3 dagar binder hiPSC till ett definitivt endoderm (DE) öde 5,6. Act-A- och Wnt-vägar styr den främre-bakre identiteten hos DE. Signalering med Act-A inducerar markörer för framtarmen (FG) som HHEX, HNF4α och GATA4, samtidigt som uttrycket av grovtarmsgener (HG) som CDX2 blockeras. Wnt-signalering inducerar posteriorisering av DE, som sedan antar en HG-genuttrycksprofil 7,8. När HG-cellens identitet har fastställts kan differentieringen flyttas från 2D till 3D och riktas mot bildandet av tarmorganoider.
Tarmorganoider odlas vanligtvis i ett 3D-extracellulärt matrissystem (t.ex. Matrigel eller andra kompatibla ECM) baserat på odlingssystem9, bestående av laminin, kollagen IV och entaktin och berikat med tillväxtfaktorer som EGF, FGF, PDGF och IGF-1 för att bidra till överlevnad och spridning. Organoiderna odlas i ett definierat medium som innehåller Gastrin, Noggin och CHIR för att stimulera och stödja tarmstamcellstillväxt och proliferation under långtidsodling.
Efter att tarmepitelceller har bäddats in i den extracellulära matrisen börjar tarmkryptor bildas och expandera och bildar så småningom sfäroider. Dessa mognar till organoidstrukturer som efterliknar fysiologisk funktion av tarmepitel. Organoider kan vanligtvis odlas i mer än 1 år utan betydande förlust av funktionella och genuttrycksprofiler. Passage krävs varje vecka med hjälp av enzymatisk nedbrytning av organoiderna i mindre fragment som sedan självsätter ihop till kompletta organoider.
Etablerade organoidlinjer kan användas som en tillförlitlig modell av många sjukdomar kopplade till tarmen, inklusive Crohns sjukdom, ulcerös kolit och kolorektal cancer 10,11,12,13. Detta är en modell som föredras framför djurceller eftersom de uttrycker mänskliga gener som är kopplade till dessa sjukdomar och reagerar på yttre stimuli som mer liknar det som förekommer i mänsklig vävnad in vivo.
Protocol
OBS: Allt vävnadsodlingsarbete som beskrivs nedan bör utföras i en klass II-huva med laminärt flöde.
1. Differentiering av humana inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) till endoderm i baktarmen
- För att belägga en cellodlingskolv med extracellulär matris, beräkna först mängden matris som behövs. Här är ett exempel på en 12-hålsplatta som beläggs med Matrigel. Beräkna den mängd extracellulär matris som krävs för att belägga en 12-hålsplatta. Använd följande formel:
OBS: Bestryk cellodlingsskålar med valfri extracellulär matris. Om du använder Matrigel, använd en koncentration på 0,035 mg/cm2 24 timmar före sådd för differentiering. Kontrollera satskoncentrationen av extracellulär matris på produktbladet och förbered mindre alikvoter före försöken enligt tillverkarens instruktioner. - Späd ut erforderlig mängd extracellulär matris i kalla DMEM-medier med hjälp av en p1000-pipett.
- Blanda väl med en 5 ml stripette.
- Tillsätt 500 μL utspädd matris till varje brunnsplatta. Skaka plattan försiktigt för att jämnt fördela den utspädda extracellulära matrisen och inkubera i minst 12 timmar vid 37 °C.
- Innan du planterar celler på plattan, tvätta varje brunn med 500 μL PBS för att avlägsna överflödig extracellulär matris. Detta kommer att förhindra cellavlossning under differentieringen.
- Låt den sista tvätten ligga i brunnarna tills den är redo att fröas för att förhindra uttorkning av extracellulär matris.
- För att så för hiPSCs-differentiering mot definitiv endoderm (DE) eller baktarm (HG), ta en kolv med hiPSCs odlade i ett valfritt underhållsmedium (t.ex. essentiellt 8-medium) och aspirera mediet. (Här fröar vi celler vid 25 000 celler/cm2).
OBS: Såddtäthet är avgörande för framgångsrik differentiering och måste optimeras för varje enskild hiPSC-cellinje. - Tvätta cellerna i kolven med 5 ml PBS. Aspirera PBS.
- Tillsätt 2,5 ml celldissociationslösning (t.ex. TrypLE) och låt stå vid RT i 4 minuter. Aspirera celldissociationslösningen och knacka försiktigt på kolven för att lossa cellerna.
- Tvätta kolven med 5 ml DMEM-medium som värmts upp till 37 °C och samla upp alla celler i ett 15 ml rör.
- Ta 10 μl återsuspenderad celllösning och mät celltätheten med en hemocytometer.
- Ta tillräckligt med cellsuspensionen för att samla upp 1,05 x 106 celler och placera i ett 15 ml rör.
- Centrifugera i 160 x g i 3 min. Medan cellerna centrifugeras, aspirera PBS från den extracellulära matrisbelagda 12-brunnsplattan.
- Efter centrifugeringen aspirerar supernatanten och återsuspenderar cellpelleten i 12 ml underhållsmedium med ROCK-hämmare (10 μM).
- Använd en p1000-pipett och tillsätt 1 ml cellsuspension till varje brunn på 12-hålsplattan. Återsuspendera cellbrunnen för att säkerställa jämn fördelning mellan brunnarna.
- Skaka plattan försiktigt för att fördela cellerna i plattans brunnar men undvik virvel av mediet eftersom det kommer att koncentrera cellerna i mitten av brunnarna.
- Placera i en inkubator för 37 °C, 5 % CO2 .
- Byt endast material till underhållsmedia (t.ex. essentiellt 8-medium) (ingen ROCK-hämmare) 24 timmar efter sådd.
- För att påbörja differentieringen till DE, bered endoderm basala medier enligt tabell 1.
OBS: I början av differentieringen bör cellerna vara mellan 60-80% sammanflöde. - Bered 12 ml DE-media genom att tillsätta Activin A (100 ng/ml) och Wnt3 (50 ng/ml) till endodermets basala media.
- Värm upp materialet till 37 °C.
- Aspirera medier från varje brunn på vävnadsodlingsplattan eller kolven.
- Starta DE-differentieringen genom att tillsätta 1 ml DE-media till varje brunn på 12-hålsplattan.
- 24 timmar efter att DE-differentieringen (D1 DE) har påbörjats, förbered nytt DE-material och utför mediebytet.
- Upprepa steg 1.24 vid 48 h (D2 DE). Om mycket celldöd förekommer i detta skede, tvätta alla brunnar med 500 μL PBS innan mediebyte.
OBS: För att bekräfta framgångsrik endodermdifferentiering, utför flödescytometri för att bedöma uttrycket av SOX17. Vi förväntar oss normalt att >80 % av cellerna ska vara SOX17-positiva vid D3 DE. Om uttrycket av SOX17 är suboptimalt bör cellsåddstätheten optimeras, liksom koncentrationerna av Act-A. - Starta HG-differentieringen vid denna tidpunkt, dvs. 72 timmar efter det att DE-differentieringen har påbörjats. Bered 12 ml HG-media genom att tillsätta CHIR99021 (3 μM) och RA (1 μM) till endoderm basala medier (tabell 1).
OBS: Vid D3 DE bör cellen ha bildat ett enhetligt monolager. Optimal DE-differentiering är avgörande för ytterligare stadier av differentiering. - Aspirera DE-media.
- Starta HG-differentiering genom att tillsätta 1 ml HG-media till varje brunn på 12-hålsplattan.
- Fortsätt differentieringen i 4 dagar med dagliga mediebyten.
OBS: För att bestämma framgången för DE-posteriorisering, utför flödescytometri för att bedöma uttrycket av CDX2. Vid D4 av HG-differentiering förväntar vi oss normalt att >80 % av cellerna är CDX2-positiva. Om posterioriseringen är suboptimal bör koncentrationen av CHIR99021 optimeras. - För att samla in ett prov för RNA-extraktion, aspirera differentieringsmedia och tvätta brunnen med 500 ul PBS.
- Aspirera PBS och tillsätt en lämplig volym celllysbuffert från ett RNA-extraktionskit.
- Använd en p1000-pipett och skrapa botten av brunnen för att säkerställa lys av alla celler.
- Aspirera celllysatet och placera det i ett rent rör.
- Fortsätt med RNA-extraktion eller frys lysatet vid -20 °C tills det är klart för RNA-extraktion.
- För immunfärgning, aspirera differentieringsmedia och tvätta brunnar med 500 μL PBS.
- Aspirera PBS och tillsätt 500 μL 4 % PFA.
OBS: PFA är giftigt. Använd lämplig personlig skyddsutrustning och följ lokala laboratorieprocedurer för bortskaffande av PFA. - Inkubera vid 4 °C i 20 min.
- Ta bort PFA och tvätta brunnarna med 500 μL PBS tre gånger.
- Låt den sista PBS-tvätten sitta kvar på cellerna tills du är redo att utföra immunfärgning.
2. Passaging av tarmorganoider
- Bered intestinala basala medier enligt tabell 2.
- För att överföra från 2D till 3D cellkultur, använd en 6-brunnsplatta för att generera DE-celler från hiPSCS. Lossa monolagret av celler från 6-cellsplattan med en 5 ml stripette.
- Samla cellerna i ett 15 ml centrifugrör innan du centrifugerar vid 400 x g i 1 minut för att producera en cellpellet.
- Återsuspendera cellpelleten i intestinala tillväxtmedier innehållande tillväxtfaktorer: SB202190 (10 μM), A83-01 (500 nM), Gastrin (10 nM), Noggin (100 ng/μL), EGF (500 ng/μL), R-Spondin1 (100 ng/ml), CHIR99021 (6 μM), ROCK-hämmare (10 μM).
- Tillsätt lämplig volym av extracellulär matris beroende på antalet brunnar som pläteras i. Detta kan beräknas med hjälp av ekvationerna nedan.
[1] Total volym extracellulär matris/media (μL) = 30 μL * antal brunnar med 48-hålsplatta
[2] Erforderlig volym extracellulär matris (μL) = Svar från [1] * 2/3
[3] Erforderlig medievolym (μL) = Svar från [1] * 1/3 - Tillsätt 30 μl cellsuspension i mitten av varje brunn på en platta med 48 hål.
- Inkubera plattan i en inkubator vid 37 °C i minst 5 minuter så att den extracellulära matrisen stelnar.
- När de extracellulära matrixkupolerna har stelnat, tillsätt 300 μL intestinala tillväxtmedier som innehåller alla tillväxtfaktorer till varje brunn.
- Sätt tillbaka plattan i en 37 °C inkubator med 5 % CO2 .
OBS: Om inga organoider kan observeras efter 48 timmar och/eller det finns betydande celldöd kan ROCKi- och NOGGIN-koncentrationerna behöva optimeras. - För att passera organoiderna, observera cellerna under ett ljusmikroskop för att bedöma densitet och storlek på organoider och avgöra om de behöver passera.
- Byt ut cellodlingsmedia mot iskall PBS.
OBS: Organoidkulturer kommer att behöva delas ungefär var 5-7:e dag. Passage av tarmorganoidkulturer krävs när det finns en ansamling av cellskräp som är uppenbar i organoidlumen och en gulfärgning av det omgivande tarmtillväxtmediet. - Lossa organoider och extracellulär matrissfär mekaniskt från plattan med hjälp av en skraprörelse med en 5 ml stripett.
- Samla organoiderna från varje brunn i ett 15 ml centrifugrör.
- Centrifugera organoidsuspensionen vid 400 x g i 1 minut för att pelletera organoiderna. Aspirera supernatanten tills den når toppen av cellpelleten, var försiktig när du har nått det synliga extracellulära matrisskiktet.
- Återsuspendera pelleten i 15 ml iskall PBS.
OBS: Detta steg tjänar till att tvätta eventuell kvarvarande extracellulär matris som inte togs bort i den första centrifugeringen. - Centrifugera vid 400 x g i 1 min. Aspirera mediet tills pelleten, som innehåller organoiderna.
- Återsuspendera i 1 ml iskall PBS. Använd en p200-pipett och stör manuellt de intakta organoiderna genom att pipettera upp och ner flera gånger.
OBS: Observera storleken på organoiderna med hjälp av ljusmikroskop för att avgöra om de behöver dissocieras ytterligare. - Tillsätt 9 ml media utan tillväxtfaktorer.
- Centrifugera vid 400 x g i 1 min. Aspirera supernatanten tills organoiderna pellet.
- Beräkna erforderlig mängd extracellulär matris och media med hjälp av ekvationerna nedan:
[1] Total volym extracellulär matris/media (μL) = 30 μL * antal brunnar med 48-hålsplatta
[2] Erforderlig volym extracellulär matris (μL) = Svar från [1] * 2/3
[3] Erforderlig medievolym (μL) = Svar från [1] * 1/3 - Återsuspendera organoidpelleten i den beräknade volymen av tarmmedia med tillväxtfaktorer (inklusive Noggin & ROCK-hämmare).
- Tillsätt erforderlig volym extracellulär matris till denna cellsuspension och återsuspendera för att säkerställa jämn fördelning av organoider.
- Pipettera 30 μl av denna suspension i mitten av varje brunn på en platta med 48 brunnar (helst förvärmd i en inkubator med 37 °C).
- Sätt tillbaka plattan i en 37 °C inkubator i 5 minuter tills den extracellulära matrisen har stelnat.
- Bered tarmmedia med tillväxtfaktorer (+ ROCK-hämmare) (cirka 17 ml per 48-brunnsplatta).
- Tillsätt 300 μL till varje brunn.
- Inkubera vid 37 °C vid 5 % CO2 .
- Efter passaging, aspirera mediet för tarmorganoiderna och ersätt med färskt tarmmedia med tillväxtfaktorer (utan Noggin & ROCK-hämmare) var 2-4:e dag.
OBS: Om inga organoider kan observeras efter 48 timmar och/eller det finns betydande celldöd kan ROCKi- och NOGGIN-koncentrationerna behöva optimeras.
OBS: Tarmorganoider svarar på en rad inflammatoriska mediatorer in vivo. TNFα är ett cellsignalprotein som är involverat i flera inflammatoriska processer. - För att utlösa ett inflammatoriskt svar i tarmorganoider, bered TNFα i en koncentration av 40 ng/ml endast i basala medier.
- Aspiratmedia från 48-hålsplatta.
- Tillsätt 300 μl preparerat basalmedium som innehåller 40 ng/ml TNFα.
- Inkubera plattan vid 37 °C i 48 timmar för att efterlikna en proinflammatorisk miljö.
OBS: Tarmorganoider svarar på en rad inflammatoriska mediatorer in vivo. TNFα är ett cellsignalprotein som är involverat i flera inflammatoriska processer. - Kassera eventuella kvarvarande celler genom aspiration i en vakuumfälla som innehåller 5 % Trigene.
Representative Results
En schematisk bild av differentieringsprotokollet visas i figur 1A. På dag 1 av protokollet bör hiPSCs vara kompakta och bilda små kolonier med ett totalt sammanflöde på cirka 50-60 %. 24 timmar efter induktion av differentiering mot DE-celler börjar migrera bort från stamcellskolonierna för att bilda ett monolager av celler. Detta fortsätter under de följande 3 dagarna och bör bilda ett komplett monolager på D3 av DE-differentiering (figur 1). Genuttrycket bör övervakas under differentieringen med pluripotensmarkörer (OCT4, NANOG, SOX2) som uttrycks starkt på D0 och snabbt nedregleras under DE-differentiering. Under DE-differentiering bör T-uttrycket nå sin topp på D1, följt av EOMES och MIXL på D2. På D2 bör DE-gener (SOX17, FOXA2, GATA4, CXCR4) börja uttryckas och nå sin topp vid D3 (Figur 2 och Figur 3). Cellerna ska vara ett monolager av DE D3 och kan sedan posterioriseras till baktarmens endoderm. Under posterioriseringshändelsen kommer 3D-strukturer att börja bildas så tidigt som D2. Men ibland kommer de bara att börja dyka upp vid D4 eller inte alls; Detta är inte alltid en indikation på om cellerna kommer att fortsätta och bilda tarmorganoider (Figur 1). Under HG-specifikationen bör CDX2- och HNF4a-uttryck induceras och öka med tiden (figur 3).
Efter överföring av 2D-ark av celler till extracellulär matris kommer klumpar av 2D-celler att observeras under de första 24 timmarna. Efter 48 timmar bör cellark börja autoorganisera sig till mer komprimerade 3D-sfäroidstrukturer som initialt är små (Figur 4A) och sedan gradvis öka i storlek och komplexitet under 7-10 dagars odling (Figur 4B och Figur 4C). Organoider bör inte passera förrän de har uppnått en tydlig organoid/sfäroidmorfologi med tydligt epitel med lumen vänd mot organoidens/sfäroidens centrum (figur 4D). I detta skede kan immunocytokemi användas för att bekräfta uttryck av tarmmarkörer som villin och CDX2 (Figur 5). Inte alla klumpar av 2D-celler kommer att utvecklas till organoider och det kommer att finnas några kontaminerande döda celler i den extracellulära matrisen. Dessa döda cellark bör ignoreras tills de överlevande cellerna har bildat stora organoider och är redo för passering.
För att modellera inflammation kan TNFα tillsättas till vävnadsodlingsmediet i 24-48 timmar. Efter inkubation med proinflammatoriska molekyler skördas organoider med samma teknik som används för deras isolering och passering och lyseras sedan med hjälp av en cellbuffertkompatibel applikation såsom QPCR eller western blotting. Om kortare exponeringar krävs bör organoider först avlägsnas från den extracellulära matrisen och exponeras för TNFα i suspension med hjälp av ett 1,5 ml rör. Behandling av tarmorganoider med TNFα i 48 timmar inducerar vanligtvis uttryck av proinflammatoriska markörer (TNFα, IL1B, IL8, IL23) medan uttrycket av tarmepitelmarkörer påverkas negativt (LGR5, VIL) (Figur 6).
| Endoderm basala medier | 50 ml | |
| RPMI 1640 | 48,5 ml | |
| B27 Tillägg | 1 ml | |
| 1% NEAA | 0,5 ml | |
Tabell 1: Sammansättning av endodermala basala medier för endodermdifferentiering.
| Tarmens basala medier | 50 ml | |
| Avancerad DMEM/F12 | 46,5 ml | |
| HEPES-buffert | 0,5 ml | |
| GlutaMAX | 0,5 ml | |
| Nikotinamid | 0,5 ml | |
| N2 Tillägg | 0,5 ml | |
| B27 Tillägg | 1,0 ml | |
| Penna/streptokocker | 0,5 ml | |
Tabell 2: Sammansättning av intestinala basala medier för odling av intestinala organoider
Figur 1: Morfologiska förändringar under differentiering av hiPSC via definitiv endoderm till baktarmslinjen.
(A) Schematisk översikt över tarmdifferentieringsprotokollet. Denna cellinje av hiPSC bildar lösa kolonier av små celler med ett högt förhållande mellan kärna och cytoplasma. När differentieringen fortskrider genomgår cellerna förändringar som överensstämmer med övergången från epitelial till den mesenkymala fenotypen och bildar genom DE D3 ett enhetligt monolager. När lämpliga signaler har levererats förlängs DE-cellerna och bildar ett tätare packat monolager med 3D-sfäroider som uppträder så snart som HD D3, men detta är beroende av vilken cellinje som används och är inte ett krav för övergång till 3D-odling (B). Skalstapel: 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Differentiering av hiPSCs till HG-endoderm inducerar uttryck av endodermala gener.
Immunfärgning av hiPSC som differentierar till definitiv endoderm visar förändringar i uttrycket av TF på proteinnivå. Pluripotensmarkörer (NANOG och OCT4) nedregleras av DE D3 (A). Uttryck av mesendodermmarkören BRA(T) förekommer vid D1 i protokollet (B) och DE-specifika TF SOX17 och FOXA2 förekommer på D2 (B & C). Skalstreck: 200 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Genuttrycksförändringar med qPCR under hiPSC-differentiering till baktarmsendoderm (HG).
Gener associerade med pluripotens är nedreglerade (OCT4, NANOG, SOX2) följt av övergående uttryck av mesendodermgener (T, EOMES, MIXL1) och slutligen uttryck av DE-gener (SOX17, FOXA2, CXCR4) och grovtarmsgener (CDX2, GATA4, HNF4a). Data presenteras som medelvärde ±SD. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: HG-endoderm självorganiserar sig för att bilda 3D-tarmorganoider i 3D extracellulär matriskultur.
HG-endoderm överförs till en lämplig 3D-extracellulär matriskultur och bildar initialt små fasta klumpar av celler (A). Klumpar av HG-endoderm expanderar under 7-10 dagars odling (B) och blir sedan asymmetriska och börjar bilda ett mer komplext epitel (C), vilket så småningom ger upphov till organoider med tydlig epitelmorfologi och en luminal yta vänd mot organoidens centrum (D). Skalstreck = 50 μm Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Etablerade hiPSC-härledda tarmorganoider uttrycker tarmmarkörer.
Immunocytokemi som visar uttryck av CDX2 och Villin. Skalstaplar = 100 μm Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Effekt av TNFα på den inflammatoriska profilen och tarmcellsuttrycket hos friska tarmorganoider.
Inflammatorisk profil hos friska kolonorganoider efter 48 timmars behandling med TNFα (40 ng/ml). Uttrycket av proinflammatoriska markörer (TNFα, IL-8 och IL-23) ökar efter exponering för TNFα, samtidigt som uttrycket av tarmepitelmarkörer (LGR5, VIL) nedregleras. Statistiska analyser utfördes med tvåsidigt studentens t-test. Data uttrycks som medelvärde ± SD för varje grupp. *P < .01; **P < .001; P < .0001. (n=3). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
Här beskriver vi ett protokoll för differentiering av humana pluripotenta celler till humana tarmorganoider. Vi demonstrerar deras användning för att studera inflammation; Detta kan dock tillämpas i olika sammanhang, och i kombination med CRISPR/Cas9-genredigeringsmetoder14, på vilken genetisk bakgrund som helst. När de väl har differentierats, efter den naturliga utvecklingsdifferentieringssekvensen av definitiv endoderm, endoderm i baktarmen och sedan tarmepitel, kan de resulterande organoiderna kontinuerligt odlas och passera i mer än 12 månader.
En kritisk aspekt av detta protokoll är den initiala pläteringstätheten av odifferentierade stamceller före endodermdifferentiering. Om detta inte optimeras tillräckligt kommer cellerna sannolikt att dö under det initiala DE-differentieringssteget (om cellerna är för glesa) eller minska effektiviteten av DE-differentieringen (om cellerna är för täta). Den korrekta startdensiteten måste optimeras för den cellinje som används, och den korrekta densiteten bör generera ett monolager i slutet av DE D3. Flödescytometri bör användas för att bestämma effektiviteten av DE-specifikationen och vi ser vanligtvis >80 % av cellerna positiva för SOX17 och/eller CXCR4. När antalet SOX17-positiva celler är mindre än 60 % påverkas effektiviteten av HG-mönstring, vilket resulterar i att färre organoider bildas när de överförs till den extracellulära matrisen. Detta kommer i slutändan att leda till att de resulterande organoidkulturerna misslyckas. För att avgöra om mönstring av DE till HG har varit framgångsrikt, bedömer vi antalet CDX2-positiva celler genom flödescytometri och förväntar oss vanligtvis att se >80 % positiva celler. Återigen, om antalet CDX2-positiva celler sjunker under 50 % kommer detta att ha en negativ effekt på antalet tarmorganoider som genereras när de överförs till 3D extracellulär matriskultur.
Efter överföring av 2D-monolager till 3D-kultur bör små kompakta sfärer framträda 24-48 timmar efter överföringen. Stora ark av döda celler kan uppstå beroende på differentieringseffektiviteten för den cellinje som används. Istället för att omedelbart passera kulturer för att ta bort dessa skräp, låter vi organoiderna fullt ut bildas och utveckla sin mer komplexa, veckade struktur. Att vänta 7-10 dagar innan du försöker den första passagen säkerställer att tillräckligt med delande celler finns för att generera många nya tarmorganoider. Eventuellt skräp som fortfarande finns kvar i kulturen kan enkelt avlägsnas under passageprocessen genom att långsamt snurra de dissocierade organoid/skräpblandningarna i ett rör med tillräcklig hastighet för att pelletera organoiderna men lämna cellark flytande i mediet. Media och cellulärt skräp kan sedan aspireras så att endast pelleten av organoider återstår.
Begränsningen med detta tillvägagångssätt är att hiPSC-härledda celltyper ofta inte är fullt mogna när det gäller genuttryck och funktionella profiler. För att avgöra om hiPSC-härledd tarmvävnad är lämplig för specifika applikationer bör organoiderna karakteriseras för olika celltyper inklusive enterocyter (VIL), enteroendokrina celler (neurog3), bägarceller (MUC2), transienta amplifierande celler (CD133), panethceller (FZD5) och LGR5+ stamceller (LGR5) för att bestämma organoidens cellulära sammansättning.
Sammantaget är den stora fördelen med detta protokoll jämfört med många andra organoiddifferentieringsprotokoll att denna odlingsplattform är mycket kostnadseffektiv på grund av ersättning av flera rekombinanta proteiner och konditionerade mediapreparat med små molekyler15,16. Differentieringen till HG är mycket enkel och snabb och kan tillämpas på både humana embryonala och inducerade pluripotenta stamceller med identiska resultat. När den följs noggrant och optimeras för de cellinjer som används ger den en relativt enkel modellplattform fri från kontaminerande mesenkymala celler som sedan kan användas för att studera tarmepitel i en mängd olika sammanhang, inklusive inflammation, värdpatogeninteraktioner7. Modellering av tarmfibros kan undersökas genom att tillhandahålla pro-fibrotiska stimuli och sedan bedöma uttrycket av extracellulära matrixproteiner såsom kollagen, laminin och fibronektin med QPCR, western blot och ELISA. Genom att använda CRISPR/Cas9-genredigeringstekniker på odifferentierade stamcellslinjer före differentiering kan man skapa genknockout eller organoider för proteinöveruttryck som kan användas för att skapa sjukdomsspecifika organoider och mer komplexa sjukdomsmodeller 14,17,18.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
NH finansieras av MRC (MR/S009930/1) och Wellcome Trust (204267/Z/16/Z), PD finansieras av MRC PhD DTP, KLF finansieras av BBSRC iCASE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A83-01 | Tocris | 2939 | |
| Activin A | R&D | 338-AC | |
| Advanced DMEM/F12 (1X) | Life Technologies | 12654-010 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504044 | |
| CHIR99021 | Sigma | SML1046-5MG | |
| Epidermal Growth Factor | R&D Systems | 236-EG-01M | |
| Gastrin | Sigma Aldrich | G9145 | |
| GlutaMAX (100X) | Life Technologies | 15630-056 | |
| Growth Factor reduced Matrigel | BD | ||
| HEPES Buffer solution (1M) | Life Technologies | 15630-080 | |
| N2 Supplement (100X) | Gibco | 17502-048 | |
| N-acetyl-cysteine | Sigma Aldrich | A7250 | |
| Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636 | |
| Noggin | R&D Systems | 6057-NG | |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
| Paraformaldehyde | VWR | 9713.5 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-094 | |
| Retinoic Acid | Sigma | 302-79-4 | |
| ROCK inhibitor | Tocris | 1254/1 | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | Tocris | 1254 | |
| RPMI | Sigma | R8758-500ml | |
| R-Spondin-1 | Peprotech | 120-38 | |
| SB202190 | Tocris | 1264 | |
| TrypLe Express | Gibco | 12604-021 | |
| Wnt 3a | R&D | 5036-WN |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Rashid, S. T., et al. Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells. Journal of Clinical Investigation. 120, 3127-3136 (2010).
- Vallier, L., Alexander, M., Pedersen, R. A. Activin/Nodal and FGF pathways cooperate to maintain pluripotency of human embryonic stem cells. Journal of Cell Science. 118, 4495-4509 (2005).
- Jaremko, K. L., Marikawa, Y. Regulation of developmental competence and commitment towards the definitive endoderm lineage in human embryonic stem cells. Stem Cell Research. 10, 489-502 (2013).
- Forbester, J. L., et al. Interaction of Salmonella enterica Serovar Typhimurium with Intestinal Organoids Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells. Infection and Immunity. 83, 2926-2934 (2015).
- Hannan, N. R., et al. Generation of multipotent foregut stem cells from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 1, 293-306 (2013).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- de Souza, H. S., Fiocchi, C. Immunopathogenesis of IBD: current state of the art. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 13, 13-27 (2016).
- Tripathi, K., Feuerstein, J. D. New developments in ulcerative colitis: latest evidence on management, treatment, and maintenance. Drugs in Context. 8, 212572 (2019).
- Ganesh, K., et al. A rectal cancer organoid platform to study individual responses to chemoradiation. Nature Medicine. 25, 1607-1614 (2019).
- Fair, K. L., Colquhoun, J., Hannan, N. R. F. Intestinal organoids for modelling intestinal development and disease. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373, (2018).
- Cuevas-Ocaña, S., Yang, J. Y., Aushev, M., Schlossmacher, G., Bear, C. E., Hannan, N. R. F., Perkins, N. D., Rossant, J., Wong, A. P., Gray, M. A. A Cell- Based Optimised Approach for Rapid and Efficient Gene Editing of Human Pluripotent Stem Cells. Int. J. Mol. Sci. 24, 10266 (2023).
- Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470, 105-109 (2011).
- Sato, T., et al. Long-term Expansion of Epithelial Organoids From Human Colon, Adenoma, Adenocarcinoma, and Barrett's Epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
- Giacalone, J. C., et al. CRISPR-Cas9-Based Genome Editing of Human Induced Pluripotent Stem Cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 44, 1-22 (2018).
- Bruntraeger, M., Byrne, M., Long, K., Bassett, A. R. CRISPR Gene Editing: Methods and Protocols. Luo, Y. , Springer. New York. 153-183 (2019).
