Summary
Denne protokollen tillater differensiering av humane pluripotente celler i intestinale organoider. Protokollen etterligner normal menneskelig utvikling ved å differensiere celler til en populasjon av definitiv endoderm, baktarmendoderm og deretter tarmepitel. Dette gjør protokollen egnet for å studere både tarmutvikling og sykdomsmodelleringsapplikasjoner.
Abstract
hiPSC-avledede intestinale organoider er epitelstrukturer som selvmonterer fra differensierte celler til komplekse 3D-strukturer, representative for det humane tarmepitelet, der de viser krypt / villus-lignende strukturer. Her beskriver vi genereringen av hiPSC-avledede intestinale organoider ved trinnvis differensiering av hiPSCs til definitiv endoderm, som deretter posterioriseres for å danne baktarmepitel før det overføres til 3D-kulturforhold. 3D-kulturmiljøet består av ekstracellulær matrise (ECM) (f.eks. Matrigel eller annen kompatibel ECM) supplert med SB202190, A83-01, Gastrin, Noggin, EGF, R-spondin-1 og CHIR99021. Organoider gjennomgår passasje hver 7. dag, hvor de blir mekanisk forstyrret før overføring til fersk ekstracellulær matrise og får lov til å ekspandere. QPCR og immunocytokjemi bekrefter at hiPSC-avledede intestinale organoider inneholder modne tarmepitelcelletyper, inkludert begerceller, Paneth-celler og enterocytter. I tillegg viser organoider tegn på polarisering ved ekspresjon av villin lokalisert på den apikale overflaten av epitelceller.
De resulterende organoider kan brukes til å modellere menneskelig tarmutvikling, samt mange menneskelige tarmsykdommer, inkludert inflammatorisk tarmsykdom. For å modellere tarmbetennelse kan organoider bli utsatt for inflammatoriske mediatorer som TNF-α, TGF-β og bakteriell LPS. Organoider utsatt for proinflammatoriske cytokiner viser en inflammatorisk og fibrotisk fenotype som respons. Parring av sunne versus hiPSCs avledet fra pasienter med IBD kan være nyttig for å forstå mekanismer som driver IBD. Dette kan avsløre nye terapeutiske mål og nye biomarkører for å bistå i tidlig sykdomsdiagnose.
Introduction
Egenskapene til pluripotente stamceller (PSC), som selvfornyelse og evnen til å differensiere til hvilken som helst celletype i menneskekroppen, gjør dem til verdifulle verktøy i studiet av utvikling, sykdomspatologi og narkotikatesting1. Humaninduserte pluripotente stamceller (hiPSC) er spesielt nyttige for sykdomsmodelleringsstudier, da de kan utledes fra pasienter, og direkte fange genomet som er ansvarlig for sykdommen fenotype 2,3. Slike hissc kan differensieres til celletypen som er berørt av den genetiske defekten, noe som muliggjør nøye undersøkelse av molekylær mekanisme for sykdommen4.
Differensieringsprotokoller for humane PSC-er tar sikte på å lede differensiering av celler via de viktigste utviklingsstadiene ved aktivering eller inhibering av spesifikke signalveier som styrer avstamningsforpliktelse og spesifikasjon. Vedlikehold av hiPSC i pluripotent tilstand krever moderate nivåer av Activin A (Act-A) signalering, mens en høy dose Act-A i 3 dager forplikter hiPSC til en definitiv endoderm (DE) skjebne 5,6. Act-A og Wnt veier direkte fremre-posterior identitet av DE. Signalering av Act-A induserer foregut (FG) markører som HHEX, HNF4a og GATA4, mens blokkering av ekspresjon av baktarm (HG) gener som CDX2. Wnt-signalering induserer posteriorisering av DE, som deretter vedtar en HG-genuttrykksprofil 7,8. Når HG-celleidentitet er etablert, kan differensiering flyttes fra 2D til 3D og rettes mot dannelsen av intestinale organoider.
Intestinale organoider dyrkes vanligvis i en 3D ekstracellulær matrise (f.eks. Matrigel eller andre kompatible ECM) basert kultursystem9, bestående av laminin, kollagen IV og entaktin og beriket med vekstfaktorer som EGF, FGF, PDGF og IGF-1 for å bidra til å støtte overlevelse og spredning. Organoidene dyrkes i et definert medium som inneholder Gastrin, Noggin og CHIR for å stimulere og støtte intestinal stamcellevekst og spredning under langsiktig kultur.
Etter at tarmepitelceller er innebygd i den ekstracellulære matrisen, begynner tarmkrypter å danne og utvide seg og til slutt danne sfæroider. Disse modnes til organoide strukturer som etterligner fysiologisk funksjon av tarmepitelet. Organoider kan typisk dyrkes i mer enn 1 år uten betydelig tap av funksjonelle og genuttrykksprofiler. Passaging er nødvendig på ukentlig basis ved hjelp av enzymatisk fordøyelse av organoider i mindre fragmenter som deretter selvmonteres til komplette organoider.
Etablerte organoide linjer kan brukes som en pålitelig modell av mange lidelser knyttet til tarmen, inkludert Crohns sykdom, ulcerøs kolitt og kolorektal kreft 10,11,12,13. Dette er en foretrukket modell for dyreceller, da de uttrykker menneskelige gener knyttet til disse forstyrrelsene og reagerer på ytre stimuli som ligner mer på det som forekommer i humant vev in vivo.
Protocol
MERK: Alt vevskulturarbeid som er beskrevet nedenfor, skal gjøres i en klasse II laminær strømningshette.
1. Human indusert pluripotent stamcelle (hiPSCs) differensiering til baktarmen endoderm
- For å belegge en cellekulturflaske med ekstracellulær matrise, må du først beregne mengden av matrisen som trengs. Her er et eksempel på en 12-brønns plate som er belagt med Matrigel. Beregn den nødvendige mengden ekstracellulær matrise for å belegge en 12-brønnplate. Bruk følgende formel:
MERK: Frakkcellekulturretter med ekstracellulær matrise etter eget valg. Hvis du bruker Matrigel, bruk en konsentrasjon på 0,035 mg / cm2 24 timer før såing for differensiering. Kontroller batchkonsentrasjonen av ekstracellulær matrise på produktarket og klargjør mindre alikoter før eksperimenter i henhold til produsentens instruksjoner. - Fortynn den nødvendige mengden ekstracellulær matriks i kalde DMEM-medier ved hjelp av en p1000-pipette.
- Bland godt med en 5 ml stripette.
- Tilsett 500μL fortynnet matriks til hver brønnplate. Rist platen forsiktig for å fordele den fortynnede ekstracellulære matriksen jevnt og inkuber i minimum 12 timer ved 37 °C.
- Før såing celler til platen, vask hver brønn med 500 μL PBS for å fjerne overflødig ekstracellulær matrise. Dette vil forhindre celleavløsning under differensieringen.
- La den siste vasken stå i brønnene til den er klar til frø for å forhindre tørking av ekstracellulær matriks.
- For å frø for hiPSCs differensiering mot definitiv endoderm (DE) eller baktarm (HG), ta en kolbe med hissc dyrket i et vedlikeholdsmedium av valg (f.eks: essensielle 8 medier) og aspirer media. (Her frø vi celler ved 25.000 celler/cm2).
MERK: Såtetthet er avgjørende for vellykket differensiering og må optimaliseres for hver enkelt hiPSC-cellelinje. - Vask cellene i kolben med 5 ml PBS. Aspirer PBS.
- Tilsett 2,5 ml celledissosiasjonsløsning (f.eks. TrypLE) og la den stå ved RT i 4 minutter. Aspirer celledissosiasjonsløsningen og bank forsiktig på kolben for å løsne cellene.
- Vask kolben med 5 ml DMEM-medier oppvarmet til 37 °C og samle alle cellene i et 15 ml rør.
- Ta 10 μL resuspendert celleoppløsning og mål celletettheten med et hemocytometer.
- Ta nok av cellesuspensjonen til å samle 1,05 x 106 celler og sett i et 15 ml rør.
- Spinn ved 160 x g i 3 minutter. Mens cellene blir sentrifugert, aspirerer PBS fra den ekstracellulære matriksen belagt 12 brønnplate.
- Etter sentrifugering aspireres supernatanten og cellepelleten resuspenderes i 12 ml vedlikeholdsmedier med ROCK-hemmer (10 μM).
- Bruk en p1000-pipette til å tilsette 1 ml cellesuspensjon til hver brønn på 12-brønnplaten. Resuspendere cellene godt for å sikre lik fordeling mellom brønnene.
- Rist platen forsiktig for å fordele cellene i brønnene på platen, men unngå virvling av mediet, da det vil konsentrere cellene i midten av brønnene.
- Plasser i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator.
- Bytt medier til kun vedlikeholdsmedier (f.eks. essensielle 8 medier) (ingen ROCK-hemmer) 24 timer etter såing.
- For å begynne differensiering til DE, klargjør endoderm basalmedier i henhold til tabell 1.
MERK: Ved starten av differensieringscellene skal være mellom 60-80% samløp. - Klargjør 12 ml DE-medier ved å tilsette Activin A (100 ng/ml) og Wnt3 (50 ng/ml) til endoderm basalmediet.
- Varm opp mediet til 37 °C.
- Aspirate media fra hver brønn i vevskulturplaten eller kolben.
- Start DE-differensieringen ved å tilsette 1 ml DE-medier til hver brønn på 12-brønnplaten.
- Ved 24 timer etter start av DE-differensiering (D1 DE), tilbered ferske DE-medier og utfør medieendring.
- Gjenta trinn 1,24 ved 48 timer (D2 DE). Hvis mye celledød er tilstede på dette stadiet, vask alle brønner med 500 μL PBS før medieendring.
MERK: For å bekrefte vellykket endodermdifferensiering, utfør flowcytometri for å vurdere ekspresjon av SOX17. Vi forventer normalt at >80% av cellene vil være SOX17-positive ved D3 DE. Hvis ekspresjon av SOX17 er suboptimal, bør cellesåingstettheten optimaliseres, så vel som konsentrasjoner av Act-A. - Start HG differensiering på dette punktet, dvs. 72 t etter start av DE differensiering. Klargjør 12 ml HG-medier ved å tilsette CHIR99021 (3 μM) og RA (1 μM) til endoderm basalmedier (tabell 1).
MERK: Ved D3 DE skal cellen ha dannet et jevnt monolag. Optimal DE-differensiering er avgjørende for videre stadier av differensiering. - Aspirere DE media.
- Start HG-differensiering ved å tilsette 1 ml HG-medier til hver brønn på 12-brønnplaten.
- Fortsett differensieringen i 4 dager med daglige medieendringer.
MERK: For å bestemme suksessen til DE posteriorization, utfør flowcytometri for å vurdere ekspresjon av CDX2. Ved D4 av HG-differensiering forventer vi normalt at >80% av cellene skal være CDX2-positive. Hvis posteriorisering er suboptimal, bør konsentrasjonen av CHIR99021 optimaliseres. - For å samle en prøve for RNA-ekstraksjon, aspirer differensieringsmedier og vask brønnen med 500 ul PBS.
- Aspirer PBS og tilsett et passende volum cellelysebuffer fra et RNA-ekstraksjonssett.
- Bruk en p1000 pipette, skrap bunnen av brønnen for å sikre lysis av alle cellene.
- Aspirer cellelysatet og sett i et rent rør.
- Fortsett til RNA-ekstraksjon eller frys lysatet ved -20 ° C til det er klart for RNA-ekstraksjon.
- For immunfarging, aspirat differensieringsmedier og vask brønner med 500 μL PBS.
- Aspirer PBS og tilsett 500 μL 4% PFA.
MERK: PFA er giftig. Bruk egnet PPE og følg lokale laboratorieprosedyrer for PFA-avhending. - Inkuber ved 4 °C i 20 minutter.
- Fjern PFA og vask brønnene med 500 μL PBS tre ganger.
- La den siste PBS-vasken stå på cellene til den er klar til å utføre immunfarging.
2. Passasje av tarmorganoider
- Klargjør intestinale basalmedier i henhold til tabell 2.
- For å overføre fra 2D til 3D-cellekultur, bruk en 6-brønnplate for å generere DE-celler fra hiPSCS. Løsne monolaget av celler danner 6-celleplaten ved hjelp av en 5 ml stripette.
- Samle celler i et 15 ml sentrifugerør, før sentrifugering ved 400 x g i 1 min for å produsere en cellepellet.
- Resuspender cellepelleten i intestinale vekstmedier som inneholder vekstfaktorer: SB202190 (10 μM), A83-01 (500 nM), Gastrin (10 nM), Noggin (100 ng / μL), EGF (500 ng / μL), R-Spondin1 (100 ng / ml), CHIR99021 (6 μM), ROCK-hemmer (10 μM).
- Legg til passende volum ekstracellulær matriks avhengig av antall brønner som blir belagt i. Dette kan beregnes ved hjelp av ligningene nedenfor.
[1] Totalt volum av ekstracellulær matrise/media (μL) = 30 μL * antall brønner med 48-brønns plate
[2] Nødvendig volum av ekstracellulær matrise (μL) = Svar fra [1] * 2/3
[3] Nødvendig medievolum (μL) = Svar fra [1] * 1/3 - Tilsett 30 μL cellesuspensjon til midten av hver brønn på en 48-brønnplate.
- Inkuber platen i en 37 ° C inkubator i minst 5 minutter for å la den ekstracellulære matriksen stivne.
- Når de ekstracellulære matrikskuplene har satt, tilsett 300 μL intestinal vekstmedium som inneholder alle vekstfaktorer til hver brønn.
- Sett platen tilbake til en 37 °C inkubator med 5% CO2.
MERK: Hvis ingen organoider kan observeres etter 48 timer og / eller det er signifikant celledød, kan det hende at ROCKi- og NOGGIN-konsentrasjoner må optimaliseres. - For å passere organoider, observer cellene under et lysmikroskop for å vurdere tetthet og størrelse på organoider og avgjøre om de trenger passasje.
- Bytt ut cellekulturmedier med iskald PBS.
MERK: Organoidkulturer må splittes omtrent hver 5-7 dager. Passaging av intestinale organoidkulturer er nødvendig når det er en opphopning av celleavfall tydelig i organoid lumen og en av det omkringliggende intestinale vekstmediet. - Mekanisk løsne organoider og ekstracellulær matrikssfære fra platen ved hjelp av en skrapebevegelse med en 5 ml stripette.
- Samle organoider fra hver brønn inn i et 15 ml sentrifugerør.
- Sentrifuge organoid suspensjon ved 400 x g i 1 min for å pelletere organoider. Aspirer supernatanten til den når toppen av cellepelleten, vær forsiktig når du har nådd det synlige ekstracellulære matrikslaget.
- Oppløs pelleten på nytt i 15 ml iskald PBS.
MERK: Dette trinnet tjener til å vaske eventuell gjenværende ekstracellulær matriks som ikke ble fjernet i det første spinnet. - Sentrifuge ved 400 x g i 1 min. Aspirer mediet til pelleten, som inneholder organoider.
- Resuspender i 1 ml iskald PBS. Bruk en p200-pipette til å forstyrre de intakte organoidene manuelt ved å pipettere opp og ned flere ganger.
MERK: Observer størrelsen på organoider ved hjelp av lysmikroskop for å avgjøre om de må dissosieres ytterligere. - Tilsett 9 ml medier uten vekstfaktorer.
- Sentrifuge ved 400 x g i 1 min. Aspirer supernatanten til organoider pellet.
- Beregn den nødvendige mengden ekstracellulær matrise og media ved hjelp av ligningene nedenfor:
[1] Totalt volum av ekstracellulær matrise/media (μL) = 30 μL * antall brønner med 48-brønns plate
[2] Nødvendig volum av ekstracellulær matrise (μL) = Svar fra [1] * 2/3
[3] Nødvendig medievolum (μL) = Svar fra [1] * 1/3 - Resuspender den organoide pelleten i det beregnede volumet av tarmmedier med vekstfaktorer (inkludert Noggin &; ROCK-hemmer).
- Tilsett det nødvendige volumet av ekstracellulær matrise i denne cellesuspensjonen og resuspender for å sikre jevn fordeling av organoider.
- Pipette 30 μL av denne suspensjonen inn i midten av hver brønn på en 48 brønnplate (forvarmet i en 37 ° C inkubator).
- Sett platen tilbake i en 37 °C inkubator i 5 minutter til den ekstracellulære matriksen har stivnet.
- Klargjør tarmmedier med vekstfaktorer (+ ROCK-hemmer) (ca. 17 ml per 48 brønnplate).
- Tilsett 300 μL til hver brønn.
- Inkuber ved 37 °C ved 5 % CO2.
- Etter passering, aspirer media for tarmorganoider og erstatt med friske tarmmedier med vekstfaktorer (uten Noggin &; ROCK-hemmer) hver 2-4 dager.
MERK: Hvis det etter 48 timer ikke kan observeres organoider og/eller det er signifikant celledød, kan det hende at ROCKi- og NOGGIN-konsentrasjonene må optimaliseres.
MERK: Intestinale organoider reagerer på en rekke inflammatoriske mediatorer in vivo. TNFα er et cellesignalprotein involvert i flere inflammatoriske prosesser. - For å utløse en inflammatorisk respons i intestinale organoider, klargjør TNFα i en konsentrasjon på 40 ng/ml kun i basalmedier.
- Aspiratmedier fra 48 brønnplater.
- Tilsett 300 mikrol preparaterte basalmedier inneholdende 40 ng/ml TNFα.
- Inkuber platen ved 37 °C i 48 timer for å gjenskape et pro-inflammatorisk miljø.
MERK: Intestinale organoider reagerer på en rekke inflammatoriske mediatorer in vivo. TNFα er et cellesignalprotein involvert i flere inflammatoriske prosesser. - Kast eventuelle gjenværende celler ved aspirasjon i en vakuumfelle som inneholder 5% Trigene.
Representative Results
Et skjema over differensieringsprotokollen er vist i figur 1A. På dag 1 i protokollen skal hiPSCene være kompakte og danne små kolonier med total samløp ca. 50-60%. 24 timer etter induksjon av differensiering mot DE begynner celler å migrere bort fra stamcellekoloniene for å danne et monolag av celler. Dette fortsetter de neste 3 dagene og skal danne et komplett monolag på D3 av DE-differensiering (figur 1). Genuttrykk bør overvåkes i løpet av differensiering med pluripotensmarkører (OCT4, NANOG, SOX2) høyt uttrykt på D0 og raskt nedregulert under DE-differensiering. Under DE-differensiering skal T-uttrykk toppe seg på D1, etterfulgt av EOMES og MIXL på D2. På D2 DE skal gener (SOX17, FOXA2, GATA4, CXCR4) begynne å uttrykkes og nå en topp ved D3 (figur 2 og figur 3). Celler skal være et monolag av DE D3 og kan deretter posterioriseres til baktarmendoderm. Under posterioriseringshendelsen vil 3D-strukturer begynne å danne seg så tidlig som D2. Noen ganger vil de imidlertid bare begynne å vises på D4 eller ikke i det hele tatt; Dette sier ikke alltid noe om cellene vil gå videre og danne tarmorganoider (figur 1). Under HG-spesifikasjonen bør CDX2- og HNF4a-uttrykk induseres og øke over tid (figur 3).
Etter overføring av 2D-ark med celler til ekstracellulær matrise, vil klumper av 2D-celler bli observert de første 24 timene. Etter 48 timer skal ark med celler begynne å automatisk organisere seg i mer komprimerte 3D sfæroidstrukturer som i utgangspunktet er små (figur 4A), og deretter gradvis øke i størrelse og kompleksitet over 7-10 dager med kultur (figur 4B &; figur 4C). Organoider bør ikke passeres før de har oppnådd en klar organoid/sfæroid morfologi med tydelig epitel med lumen vendt mot midten av organoid/sfæroid (figur 4D). På dette stadiet kan immuncytokjemi brukes til å bekrefte ekspresjon av tarmmarkører som villin og CDX2 (figur 5). Ikke alle klumper av 2D-celler vil utvikle seg til organoider, og det vil være noen forurensende døde celler i den ekstracellulære matrisen. Disse døde arkene av celler bør ignoreres til de overlevende cellene har dannet store organoider og er klare til å passere.
For å modellere betennelse kan TNFα tilsettes vevskulturmediet i 24-48 timer. Etter inkubering med proinflammatoriske molekyler høstes organoider ved hjelp av samme teknikk som brukes til isolering og passering, og lyseres deretter ved hjelp av en cellebufferkompatibel applikasjon som QPCR eller vestlig blotting. Hvis kortere eksponering er nødvendig, bør organoider først fjernes fra den ekstracellulære matriksen og eksponeres for TNFα i suspensjon ved hjelp av et 1,5 ml rør. Behandling av intestinale organoider med TNFα i 48 timer induserer typisk ekspresjon av proinflammatoriske markører (TNFα, IL1B, IL8, IL23) mens de påvirker ekspresjonen av tarmepitelmarkører (LGR5, VIL) negativt (figur 6).
| Endoderm basale medier | 50 ml | |
| RPMI 1640 | 48,5 ml | |
| B27 Tillegg | 1 ml | |
| 1% NEAA | 0,5 ml | |
Tabell 1: Sammensetning av endodermale basalmedier for endodermdifferensiering.
| Intestinale basalmedier | 50 ml | |
| Avansert DMEM/F12 | 46,5 ml | |
| HEPES Buffer | 0,5 ml | |
| GlutaMAX | 0,5 ml | |
| Nikotinamid | 0,5 ml | |
| N2 Tillegg | 0,5 ml | |
| B27 Tillegg | 1,0 ml | |
| Penn/streptokokker | 0,5 ml | |
Tabell 2: Sammensetning av intestinale basalmedier for kultur av intestinale organoider
Figur 1: Morfologiske forandringer under differensiering av hiPSC via definitiv endoderm til baktarmslinjen.
(A) Skjematisk oversikt over intestinal differensieringsprotokoll. Denne cellelinjen av hiPSC danner løse kolonier av små celler med et høyt kjerne-til-cytoplasma-forhold. Etter hvert som differensieringen fortsetter, gjennomgår cellene endringer i samsvar med overgangen fra epitel til mesenkymal fenotype og ved DE D3 danner et jevnt monolag. Når passende signaler er levert, forlenges DE-celler og danner et tettere pakket monolag med 3D-sfæroider som vises så snart HD D3, men dette er avhengig av cellelinjen som brukes og er ikke et krav for overgang til 3D-kultur (B). Skala bar: 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Differensiering av hiPSCs til HG endoderm induserer ekspresjon av endodermale gener.
Immunfarging av hiPSC differensierende til definitiv endoderm viser endringer i ekspresjon av TF på proteinnivå. Pluripotensmarkører (NANOG og OCT4) nedreguleres av DE D3 (A). Ekspresjon av mesendodermmarkør BRA(T) er tilstede ved D1 i protokollen (B) og DE-spesifikke TFer SOX17 og FOXA2 vises på D2 (B &; C). Skala bar: 200 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Genuttrykk endres ved qPCR under hiPSC-differensiering til baktarmendoderm (HG).
Gener assosiert med pluripotens er nedregulert (OCT4, NANOG, SOX2) etterfulgt av forbigående ekspresjon av mesendodermgener (T, EOMES, MIXL1), og til slutt ekspresjon av DE-gener (SOX17, FOXA2, CXCR4) og baktarmgener (CDX2, GATA4, HNF4a). Data presentert som gjennomsnitt ±SD. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: HG endoderm selvmonterer for å danne 3D intestinale organoider i 3D ekstracellulær matrikskultur.
HG-endoderm overføres til en egnet 3D ekstracellulær matrikskultur og danner i utgangspunktet små faste klumper av celler (A). Klumper av HG-endoderm utvider seg over 7-10 dager med kultur (B) og blir deretter asymmetriske og begynner å danne et mer komplekst epitel (C), noe som til slutt gir opphav til organoider med klar epitelmorfologi og en luminal overflate vendt mot midten av organoid (D). Skala barer = 50 μm Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Etablerte hiPSC-deriverte intestinale organoider uttrykker tarmmarkører.
Immuncytokjemi som viser uttrykk for CDX2 og Villin. Skalastenger = 100 μm Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Effekt av TNFα på inflammatorisk profil & tarmcelleekspresjon av friske tarmorganoider.
Inflammasjonsprofil av friske organoider i tykktarmen etter 48 timers behandling med TNFα (40 ng/ml). Ekspresjon av proinflammatoriske markører (TNFα, IL-8 &; IL-23) øker etter eksponering for TNFα, samtidig som ekspresjon av tarmepitelmarkører (LGR5, VIL) nedreguleres. Statistiske analyser ble utført med tosidig student t-test. Data uttrykkes som gjennomsnitt ± SD for hver gruppe. * P < .01; **P < .001; P < .0001. (n=3). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Her beskriver vi en protokoll for differensiering av humane pluripotente celler til humane tarmorganoider. Vi demonstrerer deres bruk for å studere betennelse; Dette kan imidlertid brukes i ulike sammenhenger, og kombinert med CRISPR / Cas9 genredigeringstilnærminger14, på hvilken som helst genetisk bakgrunn. Når de er differensiert, etter den naturlige utviklingsdifferensieringssekvensen av definitiv endoderm, baktarmendoderm og deretter tarmepitel, kan de resulterende organoider kontinuerlig dyrkes og passeres i mer enn 12 måneder.
Et kritisk aspekt ved denne protokollen er den første pletteringstettheten av udifferensierte stamceller før endodermdifferensiering. Hvis dette ikke er optimalisert tilstrekkelig, vil celler sannsynligvis dø under det første DE-differensieringstrinnet (hvis cellene er for sparsomme) eller redusere effektiviteten av DE-differensieringen (hvis cellene er for tette). Den riktige starttettheten må optimaliseres for cellelinjen som brukes, og riktig tetthet skal generere et monolag innen slutten av DE D3. Flowcytometri bør brukes for å bestemme effektiviteten av DE-spesifikasjonen, og vi ser typisk >80 % av cellene positive for SOX17 og/eller CXCR4. Når antall SOX17-positive celler er mindre enn 60%, påvirkes effektiviteten av HG-mønstre, noe som resulterer i at færre organoider dannes når de overføres til den ekstracellulære matrisen. Dette vil til slutt føre til at de resulterende organoidkulturene mislykkes. For å avgjøre om mønstre DE til HG har vært vellykket, vurderer vi antall CDX2-positive celler ved flowcytometri og forventer vanligvis å se >80% positive celler. Igjen, hvis antall CDX2-positive celler faller under 50%, vil dette ha en negativ effekt på antall intestinale organoider som genereres når de overføres til 3D ekstracellulær matrikskultur.
Etter overføring av 2D monolayers til 3D-kultur, bør små kompakte kuler vises 24-48 timer etter overføring. Store ark med døde celler kan vises avhengig av differensieringseffektiviteten for cellelinjen som brukes. I stedet for umiddelbart å passere kulturer for å fjerne disse ruskene, lar vi organoidene danne og utvikle sin mer komplekse, foldede struktur. Venter 7-10 dager før du prøver den første passeringen sikrer at tilstrekkelig delende celler er til stede for å generere mange nye intestinale organoider. Eventuelle rusk som fortsatt er tilstede i kulturen, kan lett fjernes under passeringsprosessen ved sakte å spinne de dissosierte organoid / ruskblandingene i et rør med tilstrekkelig hastighet til å pelletere organoidene, men la arket av celler flyte i media. Media og cellulært rusk kan da aspireres slik at bare pelleten av organoider forblir.
Begrensningen av denne tilnærmingen er at hiPSC-avledede celletyper ikke ofte er fullt modne når det gjelder genuttrykk og funksjonelle profiler. For å avgjøre om hiPSC-avledet tarmvev er egnet for spesifikke anvendelser, bør organoidene karakteriseres for forskjellige celletyper, inkludert enterocytter (VIL), enteroendokrine celler (neurog3), begerceller (MUC2), forbigående amplifiserende celler (CD133), panethceller (FZD5) og LGR5+ stamceller (LGR5) for å bestemme organoid cellulær sammensetning.
Samlet sett er den største fordelen med denne protokollen over mange andre organoiddifferensieringsprotokoller at denne kulturplattformen er svært kostnadseffektiv på grunn av erstatning av flere rekombinante proteiner og betingede mediepreparater med små molekyler15,16. Differensieringen til HG er veldig enkel og rask og kan brukes på både humane embryonale og induserte pluripotente stamceller med identiske utfall. Når det følges nøye, og optimalisert for cellelinjene som brukes, gir det en relativt enkel modellplattform fri for forurensende mesenkymale celler som deretter kan brukes til å studere tarmepitel i en rekke sammenhenger, inkludert betennelse, vertspatogeninteraksjoner7. Modellering av tarmfibrose kan undersøkes ved å gi profibrotiske stimuli og deretter vurdere ekspresjon av ekstracellulære matriksproteiner som kollagen, laminin og fibronektin ved QPCR, western blot og ELISA. Ved å bruke CRISPR / Cas9-genredigeringsteknikker på udifferensierte stamcellelinjer før differensiering, kan man lage genknockout eller proteinoveruttrykksorganoider som kan brukes til å lage sykdomsspesifikke organoider og mer komplekse sykdomsmodeller 14,17,18.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
NH er finansiert av MRC (MR / S009930 / 1) og Wellcome Trust (204267 / Z / 16 / Z), PD er finansiert av MRC PhD DTP, KLF er finansiert av BBSRC iCASE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A83-01 | Tocris | 2939 | |
| Activin A | R&D | 338-AC | |
| Advanced DMEM/F12 (1X) | Life Technologies | 12654-010 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504044 | |
| CHIR99021 | Sigma | SML1046-5MG | |
| Epidermal Growth Factor | R&D Systems | 236-EG-01M | |
| Gastrin | Sigma Aldrich | G9145 | |
| GlutaMAX (100X) | Life Technologies | 15630-056 | |
| Growth Factor reduced Matrigel | BD | ||
| HEPES Buffer solution (1M) | Life Technologies | 15630-080 | |
| N2 Supplement (100X) | Gibco | 17502-048 | |
| N-acetyl-cysteine | Sigma Aldrich | A7250 | |
| Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636 | |
| Noggin | R&D Systems | 6057-NG | |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
| Paraformaldehyde | VWR | 9713.5 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-094 | |
| Retinoic Acid | Sigma | 302-79-4 | |
| ROCK inhibitor | Tocris | 1254/1 | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | Tocris | 1254 | |
| RPMI | Sigma | R8758-500ml | |
| R-Spondin-1 | Peprotech | 120-38 | |
| SB202190 | Tocris | 1264 | |
| TrypLe Express | Gibco | 12604-021 | |
| Wnt 3a | R&D | 5036-WN |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Rashid, S. T., et al. Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells. Journal of Clinical Investigation. 120, 3127-3136 (2010).
- Vallier, L., Alexander, M., Pedersen, R. A. Activin/Nodal and FGF pathways cooperate to maintain pluripotency of human embryonic stem cells. Journal of Cell Science. 118, 4495-4509 (2005).
- Jaremko, K. L., Marikawa, Y. Regulation of developmental competence and commitment towards the definitive endoderm lineage in human embryonic stem cells. Stem Cell Research. 10, 489-502 (2013).
- Forbester, J. L., et al. Interaction of Salmonella enterica Serovar Typhimurium with Intestinal Organoids Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells. Infection and Immunity. 83, 2926-2934 (2015).
- Hannan, N. R., et al. Generation of multipotent foregut stem cells from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 1, 293-306 (2013).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- de Souza, H. S., Fiocchi, C. Immunopathogenesis of IBD: current state of the art. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 13, 13-27 (2016).
- Tripathi, K., Feuerstein, J. D. New developments in ulcerative colitis: latest evidence on management, treatment, and maintenance. Drugs in Context. 8, 212572 (2019).
- Ganesh, K., et al. A rectal cancer organoid platform to study individual responses to chemoradiation. Nature Medicine. 25, 1607-1614 (2019).
- Fair, K. L., Colquhoun, J., Hannan, N. R. F. Intestinal organoids for modelling intestinal development and disease. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373, (2018).
- Cuevas-Ocaña, S., Yang, J. Y., Aushev, M., Schlossmacher, G., Bear, C. E., Hannan, N. R. F., Perkins, N. D., Rossant, J., Wong, A. P., Gray, M. A. A Cell- Based Optimised Approach for Rapid and Efficient Gene Editing of Human Pluripotent Stem Cells. Int. J. Mol. Sci. 24, 10266 (2023).
- Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470, 105-109 (2011).
- Sato, T., et al. Long-term Expansion of Epithelial Organoids From Human Colon, Adenoma, Adenocarcinoma, and Barrett's Epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
- Giacalone, J. C., et al. CRISPR-Cas9-Based Genome Editing of Human Induced Pluripotent Stem Cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 44, 1-22 (2018).
- Bruntraeger, M., Byrne, M., Long, K., Bassett, A. R. CRISPR Gene Editing: Methods and Protocols. Luo, Y. , Springer. New York. 153-183 (2019).
