Summary
الهدف من البروتوكول هو مقارنة ظروف طلاء المصفوفة خارج الخلية (ECM) المختلفة لتقييم كيفية تأثير الطلاء التفاضلي على معدل نمو الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs). على وجه الخصوص ، نهدف إلى تهيئة الظروف للحصول على النمو الأمثل لثقافات iPSC.
Abstract
تركز هذه الدراسة على فهم كيف يمكن أن تؤثر زراعة iPSCs على ركائز طلاء ECM المختلفة على التقاء الخلايا. تم إنشاء بروتوكول لتقييم التقاء iPSC في الوقت الفعلي دون الحاجة إلى عد الخلايا في تعليق خلية واحدة لتجنب أي اضطراب في النمو. تم استخدام نظام تحليل الصور عالي المحتوى لتقييم التقاء iPCS على 4 ECMs مختلفة بمرور الوقت بطريقة آلية. تم استخدام إعدادات تحليل مختلفة لتقييم التقاء الخلايا من iPSCs الملتصقة ولم يلاحظ سوى اختلاف طفيف (في 24 و 48 ساعة مع laminin) سواء تم تطبيق قناع 60 أو 80 أو 100٪. نظهر أيضا أن laminin يؤدي إلى أفضل التقاء مقارنة ب Matrigel و vitronectin و fibronectin.
Introduction
يتم الحصول على الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) من الخلايا الجسدية ويمكن تمييزها إلى أنواع مختلفة من الخلايا. غالبا ما يتم استخدامها كنظام لنمذجة التسبب في المرض أو إجراء فحص المخدرات ، كما أنها توفر إمكانية استخدامها في سياق الطب الشخصي. نظرا لأن iPSCs لديها إمكانات كبيرة ، فمن المهم توصيفها بالكامل لاستخدامها كنظام نموذجي موثوق. لقد أظهرنا سابقا أهمية زراعة iPSCs في بيئة نقص الأكسجين حيث تعتمد هذه الخلايا على تحلل السكر ويمكن أن تتسبب البيئة الهوائية في اختلال الأكسدةوالاختزال 1. كما أن iPSCs معرضة أيضا لظروف الاستزراع الأخرى ، لا سيما البيئة خارج الخلية. يعد تحسين ظروف الاستزراع قضية رئيسية للحفاظ على صحتهم وتكاثرهم. ستؤدي ثقافة iPSC الصحية إلى خلايا متمايزة صحية تكون عموما نقطة النهاية للنموذج المستخدم لفهم السمات الجزيئية والخلوية والوظيفية لاضطرابات بشرية أو عمليات خلوية محددة.
في هذه الدراسة ، تم استخدام بروتوكول بسيط لاختبار التقاء iPSCs باستخدام ظروف طلاء مختلفة في آبار منفصلة. تتطلب iPSCs طبقة مغذية من الخلايا الليفية الجنينية للفئران (MEF) من أجل الالتصاق بشكل صحيح ، لكن التعايش بين iPSCs و MEF يجعل من الصعب إجراء تحليل مثل الحمض النووي الريبي أو استخراج البروتين نظرا لوجود مجموعتين من الخلايا. من أجل تجنب طبقة التغذية ، تم استخدام بروتينات مختلفة تنتمي إلى المصفوفة خارج الخلية (ECM) لإعادة إنشاء مكانة الخلية الطبيعية والحصول على ثقافة iPSC خالية من التغذية. على وجه الخصوص ، Matrigel عبارة عن مستحضر غشاء قاعدي قابل للذوبان مستخرج من ساركوما الماوس Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) ، والتي يتم تخصيبها في بروتينات مصفوفة خارج الخلية (أي laminin ، الكولاجين IV ، بروتيوغليكان كبريتات الهيباران ، entactin / nidogen ، وعوامل النمو)2,3. شروط الطلاء الأخرى المستخدمة هي بدلا من ذلك البروتينات المنقاة ذات الصلة المعروفة في بناء ECMs: من المعروف أن laminin-521 تفرزه الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) في كتلة الخلايا الداخلية للجنين وهي واحدة من أكثر اللامينين شيوعا في الجسم بعد الولادة4،5،6،7،8،9 ، 10,11; vitronectin عبارة عن مصفوفة زراعة خلايا خالية من xeno معروفة بدعم نمو وتمايز hPSC12،13،14،15،16 ؛ الفبرونيكتين هو بروتين ECM مهم لتطور الفقاريات وربط وصيانة الخلايا الجذعية الجنينية في حالة متعددة القدرات17،18،19،20،21،22،23،24،25. نظرا لتوفر ظروف طلاء مختلفة ، فإننا نقارنها من حيث تأثيرها على التقاء iPSCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. طلاء 96 لوحة بئر
ملاحظة: تم اختبار طلاءات مختلفة في نفس اللوحة ولكن في آبار منفصلة (انظر الملف التكميلي).
- تمييع Matrigel 1: 100 في DMEM. أضف 100 ميكرولتر لكل بئر إلى 96 لوحة بئر واحتضانها لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بإزالة المحلول وغسل الآبار ب 100 ميكرولتر من DMEM مرتين.
- تمييع laminin (20 ميكروغرام / مل ، LN-521) في PBS (مع الكالسيوم والمغنيسيوم). أضف 100 ميكرولتر إلى البئر واحتضنها عند 4 درجات مئوية طوال الليل. في اليوم التالي ، قم بإجراء غسلتين باستخدام DMEM قبل بذر الخلايا.
- تمييع فيترونيكتين (10 ميكروغرام / مل) في عازلة التخفيف. أضف 100 ميكرولتر لكل بئر إلى لوحة البئر 96 واحتضانها لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. اغسل الآبار باستخدام PBS (بدون الكالسيوم والمغنيسيوم) قبل طلاء الخلايا.
- تمييع HU-Fibronectin (30 ميكروغرام / مل) في ddH2O. أضف 100 ميكرولتر إلى الآبار واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة. بعد ذلك ، اغسل الآبار بالوسط قبل بذر الخلايا.
2. صيانة iPSCs في الثقافة
ملاحظة: تم شراء iPSCs تجاريا. تم اشتقاق iPSCs من الخلايا الليفية البشرية السليمة وإعادة برمجتها باستخدام تقنية episomal.
- من الفريزر -80 درجة مئوية أو النيتروجين السائل ، قم بإذابة iPSCs المحفوظة بالتبريد في حمام مائي 37 درجة مئوية. نظف القارورة التي تحتوي على الخلايا بنسبة 70٪ من الإيثانول قبل نقلها إلى خزانة السلامة البيولوجية.
- أضف معلق الخلية إلى 5 مل من وسائط زراعة الخلايا الدافئة مسبقا (على سبيل المثال ، mTeSR1) قطرة قطرة باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر في أنبوب مخروطي معقم سعة 15 مل.
- الطرد المركزي للخلايا في 304 × ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
- قم بإزالة الوسائط وأعد تعليق حبيبات الخلية في 4 مل من وسط زراعة الخلية.
- قم بصفيحة معلق الخلية في بئرين من 6 ألواح بئر (105 iPSCs لكل طبق زراعة خلوي مكون من 6 آبار) ، حيث تم طلاء الخلايا الليفية الجنينية للفأر (MEFs) سابقا. بذور MEFs قبل يومين من طلاء iPSCs بكثافة 2.4 × 104 / سم2 في DMEM (تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني ، 1٪ L- جلوتامين و 1٪ بنسلين - ستربتومايسين).
- بعد البذر ، استكمل وسائط الخلية ب 10 ميكرومتر من مثبط ROCK Y-27632.
- قم بتنمية iPSCs على MEFs لأول 4-5 أسابيع ثم في حالة خالية من التغذية (حالة خالية من MEF) ، باستخدام أحد الطلاء محل الاهتمام (انظر الخطوة 1 والجدول 1) في mTeSR1.
- عندما تكون iPSCs متقاربة بنسبة 70-80٪ ، قم بمرور 1: 4 باستخدام معالجة EDTA 0.5 mM لمدة 3-5 دقائق في RT. أضف 1 مل من 0.5 mM EDTA للوحة 6 آبار (أو كميات متناسبة لأنواع أخرى من الألواح). انقله إلى آبار جديدة في ظروف خالية من التغذية واحتضانه عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 ، 20٪ O2.
- قم بتغيير الوسائط باستخدام mTeSR1 الجديد كل يوم وقم بتقسيم الخلايا كل يومين.
3. توصيف التقاء الخلايا
- استخدم 96 لوحة بئر للتجارب.
- قم بزرع 10000 خلية لكل بئر بعد شهر واحد على الأقل من الزراعة في حالة خالية من التغذية للتأكد من عدم مرور MEFs. استخدم شرائح العد التي تستخدم لمرة واحدة لعد الخلايا باستخدام المجهر الضوئي.
- إجراء التجارب في ثلاث نسخ. لذلك ، اختبر كل حالة بذر في ثلاثة آبار.
- قم بإجراء الحصول الآلي على الصور من اليوم 1 التالي للبذر باستخدام مقياس خلوي في وضع المجال الساطع. قم بإجراء الحصول الآلي على الصور كل 24 ساعة لمدة 5 أيام. للحصول على معلومات مفصلة حول المعلمات التجريبية ، راجع الملف التكميلي.
- استخدم التباين التلقائي والتعرض التلقائي لتصور الخلايا بشكل أفضل.
- اضبط إعداد التحليل (انظر الملف التكميلي) لتحليل التقاء لتطبيق قناع بنسبة 60٪ و 80٪ و 100٪ لكل بئر ، من أجل تقييم التغييرات في التركيز بسبب انكسار الضوء على حدود الآبار. استخدم إعداد تحليل القناع المختلف المذكور أعلاه لتحليل التقاء الخلية في كل نقطة زمنية.
4. التحليلات الإحصائية
- الإبلاغ عن النتائج الكمية كوسيلة ± الخطأ المعياري للمتوسط (SEM).
- لمقارنة الاختلافات الإجمالية لظروف الطلاء المختلفة ، احصل على البيانات باستخدام نفس العينات وقم بإجراء اختبار t للعينة المزدوجة للطالب. تعتبر قيم P الأقل من 0.05 ذات دلالة إحصائية ، وجميع قيم p المبلغ عنها ذات وجهين.
5. توصيف الخيوط الدقيقة الهيكلية الخلوية
- قم بإصلاح الخلايا التي تحتوي على 4٪ بارافورمالدهيد (4٪ PFA) في PBS لمدة 10 دقائق في RT ، متبوعا بغسلتين في PBS (إجمالي 10 دقائق).
- أضف 100 ميكرولتر من محلول الحجب (المكون من 5٪ BSA ، 0.1٪ Triton في PBS) إلى كل بئر لمدة 1 ساعة في RT.
- قم بإزالة محلول الحجب واغسل العينات مرتين باستخدام PBS لمدة 10 دقائق.
- أضف 100 ميكرولتر من محلول العمل المتقارن phalloidin-conjugate لكل عينة واحتضان لمدة 1 ساعة في RT.
- اغسل الخلايا مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني (10 دقائق في RT).
- نوى البقع مع Hoechst 33342 مخففة 1: 10000 في PBS لمدة 10 دقائق في RT.
- قم بإزالة محلول Hoechst واغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS لمدة 10 دقائق في كل مرة.
- اغسل العينة ب H2O واتركها تجف تحت غطاء كيميائي.
- أضف 100 ميكرولتر من وسائط التركيب (أي PBS: الجلسرين ، 1: 1) لتغطية الخلايا والحفاظ على مضان العينات.
- راقب الخلية عند Ex / Em 493/517 نانومتر على مجهر متحد البؤر للمسح بالليزر مزود بمصدر ليزر الضوء الأبيض (WLL) وليزر 405 نانومتر. احصل على صور متحدة البؤر متسلسلة باستخدام هدف الغمر بالزيت HC PLAPO 40x. استخدم نفس طاقة الليزر ، ومقسمات الشعاع ، وإعدادات المرشح ، وأقطار الثقب ، ووضع المسح لجميع العينات التي تم فحصها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في هذه الدراسة ، قمنا بالتحقيق في التقاء iPSCs عند زراعتها في ظروف طلاء مختلفة. باستخدام مقياس الخلايا ، تمكنا من الحصول على نتائج مفيدة بسهولة في ثلاث نسخ في 5 أيام. نظرا لأن iPSCs بالكاد تلتصق بالأوعية البلاستيكية والطلاء ضروري لدعم انتشارها ، فقد قررنا مراقبة التقاء iPSCs البشرية لأنها تدل على صحة ثقافة الخلية وقد تنعكس على إمكانات تمايزها. بعد التوسع في المختبر ، قمنا بزرع iPSCs على ركائز ECM مختلفة وقمنا بتحليل الخلايا من خلال مراقبة صور العينة التي تم الحصول عليها في المجال الساطع واستخدام تلطيخ phalloidin (يستخدم لتلطيخ خيوط الأكتين ، المعروف أيضا باسم F-actin) من أجل فهم التصاقها بالأوعية (الشكل 1). في الواقع ، يسمح تلطيخ phalloidin بتصور درجة التصاق الخلية بسطح الوعاء وبالتالي بالطلاء المحدد المستخدم للسفينة. أظهرت الخلايا الملتصقة بالطلاء خيوط دقيقة هيكلية خلوية واضحة للعيان بدلا من خيوط دقيقة منهارة. توثق مراقبة الحقل الساطع مع تلطيخ phalloidin مستوى جيدا من التصاق iPSCs بالسطح المطلي.
للتحقيق في التقاء ، قمنا بزرع iPSCs مع Matrigel و LN-521 و vitronectin و Hu-fibronectin في ثلاث نسخ ، وأجرينا التجربة ثلاث مرات. من أجل تجنب انكسار الضوء بسبب حافة البئر ، قمنا بتطبيق ثلاثة أنواع من إعداد التحليل بقناع 60 و 80 و 100٪ ، ولاحظنا أنها متشابهة في التقاط الخلايا وتجنب الخلفية (الشكل 2). تظهر النتائج التي تم الحصول عليها أن iPSCs المصنفة على LN-521 تظهر معدلا مرتفعا من تكاثر الخلايا بطريقة خطية خلال الوقت ، ومقارنتها بالطلاءات الأخرى وأن هذه الاختلافات ذات دلالة إحصائية (العلامات النجمية في الشكل 3A-C). تظهر الخلايا المصنفة على Matrigel أو Vitronectin أو Hu-Fibronectin معدل تكاثر خطي في أول 96 ساعة ولكنها تظهر أيضا منحدرا متزايدا لمنحنى التقاء في آخر 24 ساعة (بشكل مستقل عن القناع المستخدم ، 60٪ أو 80٪ أو 100٪ ، الشكل 3A-C). نظرا لأن الاختلاف الأولي عند 24 ساعة للطلاءات المختلفة يمكن أن يكون بسبب الاختلافات في ارتباط الخلية ، فقد تم تطبيع نمو الخلايا إلى 24 ساعة للنقاط الزمنية اللاحقة (من 48 إلى 120 ساعة) (الشكل 3D-F). تظهر الرسوم البيانية التي تم الحصول عليها باستخدام قناع 60 و 80 و 100٪ أنه لا توجد اختلافات من حيث التقاء الطلاءات المختلفة وأن الاختلافات التي لوحظت مع LN-521 ترجع على الأرجح إلى زيادة قدرة iPSCs على الالتصاق بهذا الطلاء عند مروره.
الشكل 1. صور المجال الساطع التمثيلية وتلطيخ Phalloidin ل iPSCs المصنفة على طلاءات ECM مختلفة بعد 3 أيام. تظهر صور المجال الساطع أن الخلايا تتمتع بصحة جيدة على الطلاء المستخدم وأنها متصلة جيدا بالأوعية كما هو موثق بواسطة تلطيخ القضيب تظهر خيوط دقيقة هيكلية خلوية واضحة للعيان. شريط المقياس: 25 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2. صور تمثيلية للمجال الساطع تظهر ثلاثة تحليلات مختلفة لإعداد الأقنعة المستخدمة لإجراء تحليلات التقاء. تم الحصول على الفسيفساء باستخدام مقياس خلوي باستخدام صور المجال الساطع (16 صورة / بئر من لوحة بئر 96). باللون الأخضر ، يعرض تجزئة التحليل بوضوح القناع المختلف المطبق (60 ، 80 100٪) لتجنب أو تضمين الحافة المستديرة للبئر. شريط المقياس: 500 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3. تحليل التقاء الخلايا ل iPSCs المصنفة على أوعية مغلفة بشكل مختلف. رسم بياني يمثل التقاء الخلايا ل iPSCs المصنفة على أوعية مغلفة بشكل مختلف. تم تحليل البيانات بعد الحصول عليها باستخدام البرنامج المناسب باستخدام قناع (A) 60٪ (B) 80٪ (C) 100٪ لمدة 5 أيام (120 ساعة). يظهر تطبيع التقاء النقاط الزمنية من 48 ساعة إلى 120 ساعة إلى النقطة الزمنية الأولى (24 ساعة) في (D ، E ، F). تم الحصول على البيانات من ثلاث تجارب مستقلة. يتم تمثيل البيانات كمتوسط ± SEM. n = 3 * p<0.05. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
| مركب طلاء | التركيز الأولي | التركيز النهائي |
| HU-فيبرونيكتين | 1 ملغم / مل | 10 ميكروغرام/سم2 |
| لامينين 521 | 100 ميكروغرام / مل | 20 ميكروغرام / مل |
| ماتريجيل | * | 0.111111111 |
| فيترونيكتين XF | 250 ميكروغرام / مل | 10 ميكروغرام / مل |
الجدول 1. قائمة مركبات الطلاء المستخدمة لتحليل التقاء. يتم الإبلاغ عن الاسم والتركيز الأولي والنهائي للطلاءات المختلفة المستخدمة. * التركيز الأولي ل Matrigel متغير ، اعتمادا على الدفعة.
ملف تكميلي. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
إن استخدام iPSCs لنمذجة الأمراض وفحص الأدوية في المستقبل جنبا إلى جنب مع تطبيقها المحتمل في الطب الدقيق يجعلها تقنية ذات أهمية كبيرة ولهذا السبب نعتقد أنه من الضروري أن نفهم بوضوح حالة الزراعة في المختبر التي تشبه بشكل أفضل الحالة الفسيولوجية للخلايا الجذعية الجنينية. في هذا السياق ، اختبرنا طلاءات ECM مختلفة باستخدام iPSCs من النوع البري من أجل فهم الظروف التي تسمح للخلايا بالبقاء في حالة صحية وغير متمايزة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن النقطة الحرجة هي زراعة iPSCs في المكونات xenogenic من MEFs و Matrigel التي قد تفسر التباين التجريبي بين ثلاثة تويدات وهذا يعيق القدرة على إجراء الدراسات الميكانيكية26.
في هذه الدراسة ، اختبرنا التقاء iPSCs على ركائز خالية من xenogeneic (على سبيل المثال ، LN-521 ، Vitronectin ، Hu-Fibronectin) باستخدام مقياس خلوي لمحلل الصور عالي المحتوى. يرجع سبب استخدام نظام تحليل الصور الآلي إلى حقيقة أن عد الخلايا ، باستخدام طريقة استبعاد Trypan blue ، سيتطلب إجراء تعليق خلية واحدة وهذا غير موصى به عند معالجة iPSCs حيث يجب نشرها في مجموعات الخلايا لتجنب موت الخلايا. تسمح لنا البيانات التي تم الحصول عليها من خلال تحليل الصور عالي المحتوى بمتابعة التقاء الخلايا دون إزعاج الخلايا حيث يتم تصويرها ببساطة كل يوم لمدة 5 أيام. يمكن اعتبار هذه التقنية طريقة اختيار لتوصيف خطوط iPSC ويمكن تضمينها لأداء لوحات مراقبة الجودة ل iPSCs البشرية. بينما استخدمنا حزمة برامج تجارية ، يمكن استخدام المنهجية الموضحة هنا بنجاح عن طريق منصات تحليل الصور المكافئة عالية المحتوى / عالية الإنتاجية وحزم البرامج التحليلية المماثلة. تظهر البيانات التي تم الحصول عليها أن iPSCs المصنفة على LN-521 تقدم التقاء خطي خلال 5 أيام في الثقافة دون تقسيم الخلايا ، وبالتالي فهي أفضل ركيزة خالية من الجينات الأجنبية تم اختبارها في هذه الدراسة. أحد قيود هذا البروتوكول هو أن النتائج التي تم الحصول عليها تحتاج إلى تطبيع إلى النقطة الزمنية الأولى من أجل النظر في الاختلافات في ارتباط iPSC بركائز مختلفة. ومن المثير للاهتمام ، أن البيانات التي تم الحصول عليها مدفوعة على الأرجح بزيادة معدل ارتباط الخلايا من iPSCs إلى LN-521. في الواقع ، عند تطبيع النتائج لأول نقطة ، لا يلاحظ أي فرق بين الركائز المختلفة.
بناء على النتائج التي تم الحصول عليها من الدراسة ، سيكون من المثير للاهتمام فهم بيولوجيا الخلايا الجذعية متعددة القدرات بشكل أفضل من حيث معرفة مستقبلات سطح الخلية الرئيسية التي تتوسط اتصالات الخلية ECM والتي قد تكون مسؤولة عن الحفاظ على قدرتها على التجديد الذاتي بدلا من التمايز التلقائي إلى أنواع معينة من الخلايا. ومن المثير للاهتمام ، أن هناك دراسات تظهر أن مرونة المصفوفة لسطح الثقافة أثرت على التمايز نحو أنواع مختلفة من الخلايا ، وربما يعتمد هذا على تفاعلات الخلية ECM التي نشطت بعض مسارات إشارات الخلايا داخل الخلايا ذات الصلة بالتمايز المحدد لنوع الخلية27. بالإضافة إلى ذلك ، استكشف Vigilante et al.28 المساهمة الجينية في التغيرات في سلوك iPSC ، من خلال الجمع بين الأساليب الحسابية والتعبير الجيني ومجموعات بيانات بيولوجيا الخلية. وبالتالي ، فإن عمل Vigilante et al.28 هو تقدم كبير في محاولة تعيين التباين الجيني لتباين النمط الظاهري. قد تؤدي هذه الدراسات إلى تطوير منهجيات موحدة لاستخدامها في إجراء تجارب iPSCs في ضوء استخدامها المحتمل في المستقبل في العيادات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم الدراسة بمنح من مؤسسة بامبينو جيسو و Ricerca Corrente (وزارة الصحة الإيطالية) إلى C.C. نود أن نشكر الدكتور إنريكو بيرتيني (قسم علم الأعصاب ، وحدة الأمراض العصبية العضلية والتنكسية العصبية ، مختبر الطب الجزيئي ، مستشفى بامبينو جيسو لأبحاث الأطفال) ، الدكتورة ستيفانيا بيتريني (المرفق الأساسي للفحص المجهري البؤري ، مختبرات الأبحاث ، مستشفى بامبينو جيسو لأبحاث الأطفال) ، جوليا بيريكولي (قسم أمراض الدم والأورام والعلاج الجيني والخلوي ، مستشفى أبحاث الأطفال بامبينو جيسو) وروبرتا فيريتي (قسم أمراض الدم والأورام والعلاج الجيني والخلوي ، مستشفى أبحاث الأطفال بامبينو جيسو) للمناقشات العلمية والمساعدة الفنية. حصلت ماريا فينشي على "زمالة الأطفال المصابين بالسرطان في المملكة المتحدة".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, Sterile | Corning | 4488 | Tool |
| 15 mL high-clarity polypropylene (PP) conical centrifuge tubes | Falcon | 352097 | Tool |
| 1x PBS (With Ca2+; Mg2+) | Thermofisher | 14040133 | Medium |
| 1x PBS (without Ca2+; Mg2+) | Euroclone | ECB4004L | Medium |
| 5 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, Sterile | Corning | 4487 | Tool |
| Cell culture microplate, 96 WELL, PS, F-Bottom | Greiner Bio One | 655090 | Support |
| Cell culture plate, 6 well | Costar | 3516 | Support |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium- high glucose) | Sigma | D5671 | Medium |
| EDTA | Sigma | ED4SS-500g | Reagent |
| Epi Episomal iPSC Reprogramming Kit | Invitrogen | A15960 | Reagent |
| FAST - READ 102 | Biosigma | BVS100 | Tool |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270106 | Medium |
| Fibronectin | Merck | FC010 | Coating |
| Glycerol | Sigma | G5516 | Reagent |
| H2O | MILLIQ | ||
| Hoechst | Thermofisher | 33342 | Reagent |
| Laminin 521 | Stem Cell Technologies | 77003 | Coating |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | LS25030081 | Reagent |
| Matrigel | Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | 354277 | Coating |
| Mouse embryonic fibroblasts (MEF) | Life Technologies | A24903 | Coating |
| MTESR1 Medium | Stem Cell Technologies | 85851 | Medium |
| MTESR1 Supplement | Stem Cell Technologies | 85852 | Medium |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | Reagent |
| Phalloidin | Sigma | P1951 | Reagent |
| Vitronectin | Stem Cell Technologies | 7180 | Coating |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | Reagent |
References
- Masotti, A., et al. Aged iPSCs display an uncommon mitochondrial appearance and fail to undergo in vitro neurogenesis. Aging (Albany NY). 6 (12), 1094-1108 (2014).
- Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).
- Kleinman, H. K., et al. Isolation and characterization of type IV procollagen, laminin, and heparan sulfate proteoglycan from the EHS sarcoma. Biochemistry. 21 (24), 6188-6193 (1982).
- Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nature Communications. 5, 3195 (2014).
- Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521 based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nature Protocols. 9 (10), 2354-2368 (2014).
- Laperle, A., et al. α-5 Laminin Synthesized by Human Pluripotent Stem Cells Promotes Self-Renewal. Stem Cell Reports. 5 (2), 195-206 (2015).
- Albalushi, H., et al. Laminin 521 stabilizes the pluripotency expression pattern of human embryonic stem cells initially derived on feeder cells. Stem Cell International. 2018, 7127042 (2018).
- Zhang, D., et al. Niche-derived laminin-511 promotes midbrain dopaminergic neuron survival and differentiation through YAP. Science Signaling. 10 (493), (2017).
- Lu, H. F., et al. A defined xeno-free and feeder-free culture system for the derivation, expansion and direct differentiation of transgene-free patient-specific induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (9), 2816-2826 (2015).
- Miyazaki, T., Nakatsuji, N., Suemori, H. Optimization of slow cooling cryopreservation for human pluripotent stem cells. Genesis. 52 (1), 49-55 (2014).
- Bergström, R., Ström, S., Holm, F., Feki, A., Hovatta, O. Xeno-free culture of human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 767, 125-136 (2011).
- Braam, S. R., et al. Recombinant vitronectin is a functionally defined substrate that supports human embryonic stem cell self-renewal via alphavbeta5 integrin. Stem Cells. 26 (9), 2257-2265 (2008).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2008).
- Li, J., et al. Impact of vitronectin concentration and surface properties on the stable propagation of human embryonic stem cells. Biointerphases. 5 (3), 132-142 (2010).
- Prowse, A. B., et al. Long-term culture of human embryonic stem cells on recombinant vitronectin in ascorbate free media. Biomaterials. 31 (32), 8281-8288 (2010).
- Rowland, T. J., et al. Roles of integrins in human induced pluripotent stem cell growth on Matrigel and vitronectin. Stem Cells and Development. 19 (8), 1231-1240 (2010).
- Ruoslahti, E., Engvall, E., Hayman, E. G., Spiro, R. G. Comparative studies on amniotic fluid and plasma fibronectins. Biochemistry. 193 (1), 295-299 (1981).
- Ni, H., Li, A., Simonsen, N., Wilkins, J. A. Integrin activation by dithiothreitol or Mn2+ induces a ligand-occupied conformation and exposure of a novel NH2-terminal regulatory site on the beta1 integrin chain. Biological Chemistry. 273 (14), 7981-7987 (1998).
- Seltana, A., Basora, N., Beaulieu, J. F. Intestinal epithelial wound healing assay in an epithelial-mesenchymal co-culture system. Wound Repair & Regeneration. 18 (1), 114-122 (2010).
- Amit, M., Shariki, C., Margulets, V., Itskovitz-Eldor, J. Feeder layer-and serum-free culture of human embryonic stem cells. Biology of Reproduction. 70 (3), 837-845 (2004).
- Vaheri, A., Mosher, D. F. High molecular weight, cell surface-associated glyco-protein (fibronectin) lost in malignant transformation. Biochimica et Biophysica Acta. 516 (1), 1-25 (1978).
- Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. Fibronectin fibrillogenesis, a cell-mediated matrix assembly process. Matrix Biology. 24 (6), 389-399 (2005).
- Polyak, K., Weinberg, R. A. Transitions between epithelial and mesenchymal states: acquisition of malignant and stem cell traits. Nature Reviews Cancer. 9 (4), 265-273 (2009).
- Kadler, K. E., Hill, A., Canty-Laird, E. G. Collagen fibrillogenesis: fibronectin, integrins, and minor collagens as organizers and nucleators. Current Opinion in Cell Biology. 20 (5), 495-501 (2008).
- Hunt, G. C., Schwarzbauer, J. E. Tightening the connections between cadherins and fibronectin matrix. Developmental Cell. 16 (3), 327-328 (2009).
- Villa-Diaz, L. G., Ross, A. M., Lahann, J., Krebsbach, P. H. Concise review: The evolution of human pluripotent stem cell culture: from feeder cells to synthetic coatings. Stem Cells. 31 (1), 1-7 (2013).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Vigilante, A., et al. Identifying Extrinsic versus Intrinsic Drivers of Variation in Cell Behavior in Human iPSC Lines from Healthy Donors. Cell Reports. 26 (8), 2078-2087 (2019).
