Summary
Protokolün amacı, diferansiyel kaplamanın indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin (iPSC'ler) büyüme hızını nasıl etkilediğini değerlendirmek için farklı hücre dışı matris (ECM) kaplama koşullarını karşılaştırmaktır. Özellikle, iPSC kültürlerinin optimum büyümesini sağlamak için koşullar oluşturmayı amaçlıyoruz.
Abstract
Bu çalışma, farklı ECM kaplama substratları üzerinde büyüyen iPSC'lerin hücre birleşmesini nasıl etkileyebileceğini anlamaya odaklanmaktadır. Herhangi bir büyüme bozulmasını önlemek için tek hücre süspansiyonundaki hücreleri saymaya gerek kalmadan iPSC birleşmesini gerçek zamanlı olarak değerlendirmek için bir protokol oluşturulmuştur. Zaman içinde 4 farklı ECM'de iPCS birleşimini otomatik bir şekilde değerlendirmek için yüksek içerikli bir görüntü analiz sistemi kullanılmıştır. Yapışkan iPSC'lerin hücre birleşimini değerlendirmek için farklı analiz ayarları kullanılmış ve %60, 80 veya 100 maske uygulanıp uygulanmadığına dair sadece küçük bir fark (laminin ile 24 ve 48 saatte) gözlenmiştir. Ayrıca lamininin Matrigel, vitronektin ve fibronektin ile karşılaştırıldığında en iyi birleşmeye yol açtığını gösteriyoruz.
Introduction
İndüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC'ler) somatik hücrelerden elde edilir ve farklı hücre tiplerine ayrılabilir. Genellikle hastalık patogenezini modellemek veya ilaç taraması yapmak için bir sistem olarak kullanılırlar ve ayrıca kişiselleştirilmiş tıp bağlamında kullanılma potansiyeli sunarlar. iPSC'ler büyük bir potansiyele sahip olduklarından, güvenilir bir model sistemi olarak kullanılmak üzere onları tam olarak karakterize etmek önemlidir. Daha önce hipoksik bir ortamda iPSC'lerin yetiştirilmesinin önemini göstermiştik, çünkü bu hücreler glikolize dayanır ve aerobik bir ortam redoks dengesizliğine neden olabilir1. iPSC'ler ayrıca diğer kültür koşullarına, özellikle de hücre dışı ortama karşı savunmasızdır. Kültür koşullarının optimizasyonu, onları sağlıklı ve çoğalır tutmak için kilit bir konudur. Sağlıklı bir iPSC kültürü, genellikle belirli insan bozukluklarının veya hücresel süreçlerin moleküler, hücresel ve fonksiyonel özelliklerini anlamak için kullanılan modelin son noktası olan sağlıklı farklılaşmış hücrelere yol açacaktır.
Bu çalışmada, ayrı kuyucuklarda farklı kaplama koşulları kullanarak iPSC'lerin birleşmesini test etmek için basit bir protokol kullanılmıştır. iPSC'ler, düzgün bir şekilde bağlanması için bir murin embriyonik fibroblast (MEF) besleyici tabakasına ihtiyaç duyar, ancak iPSC'lerin ve MEF'in bir arada bulunması, iki hücre popülasyonu bulunduğundan RNA veya protein ekstraksiyonu gibi analizlerin yapılmasını zorlaştırır. Besleyici tabakadan kaçınmak için, doğal hücre nişini yeniden oluşturmak ve besleyicisiz iPSC kültürüne sahip olmak için hücre dışı matrise (ECM) ait farklı proteinler kullanılmıştır. Özellikle, Matrigel, hücre dışı matriks proteinleri (yani laminin, kollajen IV, heparan sülfat proteoglikanlar, entactin / nidogen ve büyüme faktörleri) ile zenginleştirilmiş Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) fare sarkomundan ekstrakte edilen çözünür bir bazal membran preparatıdır 2,3. Kullanılan diğer kaplama koşulları, ECM'lerin yapımında bilinen alakası olan saflaştırılmış proteinlerdir: laminin-521'in, embriyonun iç hücre kütlesindeki insan pluripotent kök hücreleri (hPSC'ler) tarafından salgılandığı bilinmektedir ve doğumdan sonra vücuttaki en yaygın lamininlerden biridir 4,5,6,7,8,9, 10,11; vitronektin, hPSC 12,13,14,15,16'nın büyümesini ve farklılaşmasını desteklediği bilinen kseno içermeyen bir hücre kültürü matrisidir; fibronektin, omurgalı gelişimi ve embriyonik kök hücrelerin pluripotent bir durumda bağlanması ve bakımı için önemli bir ECM proteinidir 17,18,19,20,21,22,23,24,25. Farklı kaplama koşulları mevcut olduğundan, bunları iPSC'lerin birleşmesi üzerindeki etkileri açısından karşılaştırıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 96 kuyu plakalarının kaplanması
NOT: Farklı kaplamalar aynı plakada ancak ayrı kuyucuklarda test edilmiştir ( Ek Dosyaya bakınız).
- DMEM'de Matrigel 1:100'ü seyreltin. 96 kuyucuk plakasına kuyu başına 100 μL ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat kuluçkaya yatırın. Bunu takiben, çözeltiyi çıkarın ve kuyucukları iki kez 100 μL DMEM ile yıkayın.
- PBS'de laminini (20 μg / mL, LN-521) seyreltin (kalsiyum ve magnezyum ile). Kuyuya 100 μL ekleyin ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin. Ertesi gün, hücreleri tohumlamadan önce DMEM ile iki yıkama yapın.
- Vitronektini (10 μg/mL) seyreltme tamponunda seyreltin. 96 kuyucuklu plakaya kuyu başına 100 μL ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat kuluçkaya yatırın. Hücreleri kaplamadan önce kuyucukları PBS (kalsiyum ve magnezyum olmadan) ile yıkayın.
- HU-Fibronektini (30 μg / mL) ddH2O'da seyreltin Kuyucuklara 100 μL ekleyin ve oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin. Bunu takiben, hücreleri tohumlamadan önce kuyucukları ortamla yıkayın.
2. Kültürde iPSC'lerin bakımı
NOT: iPSC'ler ticari olarak satın alınmıştır. iPSC'ler sağlıklı insan fibroblastlarından türetildi ve epizomal teknoloji kullanılarak yeniden programlandı.
- -80 °C dondurucudan veya sıvı azottan, kriyokorunmuş iPSC'leri 37 °C'lik bir su banyosunda çözün. Hücreleri içeren şişeyi biyolojik güvenlik kabinine taşımadan önce% 70 etanol ile temizleyin.
- Hücre süspansiyonunu, 15 mL'lik steril konik bir tüp içinde 1000 μL'lik bir pipetle 5 mL'lik önceden ısıtılmış hücre kültürü ortamına (örneğin, mTeSR1) damla damla ekleyin.
- Hücreleri oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca 304 x g'de santrifüj yapın.
- Medyayı çıkarın ve hücre peletini 4 mL hücre kültürü ortamında yeniden askıya alın.
- Hücre süspansiyonunu, fare embriyonik fibroblastlarının (MEF'ler) daha önce kaplandığı 6 kuyucuklu hücre kültürü kabı başına 10 5 iPSC) iki kuyucuğuna (6 kuyucuklu hücre kültürü kabı başına 105 iPSC) yerleştirin. DMEM'de 2.4 x 104/cm2 yoğunlukta iPSC'lerin kaplanmasından iki gün önce tohum MEF'leri (% 10 Fetal Sığır Serumu,% 1 L-glutamin ve% 1 Penisilin-Streptomisin içerir).
- Tohumlamadan sonra, hücre ortamını 10 μM ROCK inhibitörü Y-27632 ile destekleyin.
- iPSC'leri ilk 4-5 hafta boyunca MEF'lerde ve daha sonra mTeSR1'deki ilgili kaplamalardan birini (bkz. adım 1 ve Tablo 1) kullanarak besleyicisiz durumda (MEF içermeyen koşul) büyütün.
- iPSC'ler% 70-80 birleştiğinde, RT'de 3-5 dakika boyunca 0,5 mM EDTA işlemi kullanarak 1:4 geçiş. 6 kuyucuklu bir plaka için 1 mL 0,5 mM EDTA ekleyin (veya diğer plaka türleri için orantılı miktarlar). Besleyicisiz koşullarda yeni kuyulara aktarın ve 37 °C, %5 CO2, %20 O2'de inkübeedin.
- Medyayı her gün taze mTeSR1 ile değiştirin ve hücreleri her 2 günde bir bölün.
3. Hücre birleşmesinin karakterizasyonu
- Deneyler için 96 kuyu plakası kullanın.
- MEF'lerin geçmediğinden emin olmak için besleyicisiz durumda en az 1 aylık kültürlemenin ardından kuyu başına 10.000 hücre tohumlayın. Optik mikroskopla hücreleri saymak için tek kullanımlık sayma slaytları kullanın.
- Deneyleri üçlü olarak gerçekleştirin. Bu nedenle, her tohumlama durumunu üç kuyucukta test edin.
- Parlak alan modunda bir sitometre kullanarak tohumlamayı takip eden 1. günden itibaren otomatik görüntü alma işlemini gerçekleştirin. 5 gün boyunca her 24 saatte bir otomatik görüntü alma işlemi gerçekleştirin. Deneysel parametreler hakkında ayrıntılı bilgi için, Ek Dosya'ya bakın.
- Hücreleri daha iyi görselleştirmek için otomatik kontrast ve otomatik pozlamayı kullanın.
- Kuyuların sınırındaki ışık kırılması nedeniyle odaktaki değişiklikleri değerlendirmek için kuyu başına %60, %80 ve %100'lük bir maske uygulamak üzere birleşim analizi için analiz ayarını (Ek Dosya'ya bakın) ayarlayın. Her zaman noktasında hücre birleşmesini analiz etmek için yukarıda belirtilen farklı maske analizi ayarını kullanın.
4. İstatistiksel analizler
- Kantitatif sonuçları, ortalamanın standart hatası (SEM) ± ortalamalar olarak raporlayın.
- Farklı kaplama koşullarının genel farklılıklarını karşılaştırmak için, aynı numuneleri kullanarak veri elde edin ve Öğrencinin çift numune t-testini gerçekleştirin. 0.05'ten küçük P değerleri istatistiksel olarak anlamlı kabul edilir ve bildirilen tüm p değerleri iki taraflıdır.
5. Sitoiskelet mikrofilamentlerinin karakterizasyonu
- RT'de 10 dakika boyunca PBS'de% 4 paraformaldehit (% 4 PFA) içeren hücreleri sabitleyin, ardından PBS'de iki yıkama (toplam 10 dakika).
- RT'de 1 saat boyunca her bir kuyucuğa 100 μL blokaj çözeltisi (PBS'de %5 BSA, %0,1 Triton'dan oluşur) ekleyin.
- Bloke edici çözeltiyi çıkarın ve numuneleri PBS ile 10 dakika boyunca iki kez yıkayın.
- Örnek başına 100 μL falloidin-konjugat çalışma çözeltisi ekleyin ve RT'de 1 saat inkübe edin.
- PBS ile hücreleri iki kez yıkayın (RT'de 10 dakika).
- Hoechst 33342'li leke çekirdekleri, RT'de 10 dakika boyunca PBS'de 1:10000 seyreltildi.
- Hoechst çözeltisini çıkarın ve hücreleri her seferinde 10 dakika boyunca PBS ile iki kez yıkayın.
- NumuneyiH2O ile yıkayın ve kimyasal bir başlık altında kurumaya bırakın.
- Hücreleri örtmek ve numunelerin floresansını korumak için 100 μL montaj ortamı (yani PBS: gliserol, 1: 1) ekleyin.
- Ex/Em 493/517 nm'deki hücreyi, beyaz ışık lazer (WLL) kaynağı ve 405 nm diyot lazer ile donatılmış lazer taramalı bir konfokal mikroskopta gözlemleyin. HC PLAPO 40x yağa daldırma hedefi kullanarak sıralı konfokal görüntüler elde edin. İncelenen tüm numuneler için aynı lazer gücünü, ışın ayırıcıları, filtre ayarlarını, iğne deliği çaplarını ve tarama modunu kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu çalışmada, iPSC'lerin farklı kaplama koşullarında yetiştirildiğinde birleşimini araştırdık. Bir sitometre kullanarak, 5 gün içinde üçlü olarak kolayca bilgilendirici sonuçlar elde edebildik. iPSC'ler plastik kaplara neredeyse hiç yapışmadığından ve çoğalmalarını desteklemek için bir kaplama gerektiğinden, hücre kültürünün sağlığının bir göstergesi olduğu ve farklılaşma potansiyellerini yansıtabileceği için insan iPSC'lerinin birleşmesini izlemeye karar verdik. İn vitro genişlemeden sonra, iPSC'leri farklı ECM substratlarına tohumladık ve parlak alanda elde edilen örnek görüntülerin gözlemlenmesiyle ve damarlara yapışmalarını anlamak için falloidin boyama (F-aktin olarak da bilinen aktin filamentlerinin boyanmasında kullanılır) kullanarak hücreleri analiz ettik (Şekil 1). Aslında, falloidin boyama, damarın yüzeyine ve dolayısıyla damar için kullanılan spesifik kaplamaya hücre yapışma derecesinin görselleştirilmesini sağlar. Kaplamaya yapışan hücreler, çökmüş mikrofilamentler yerine açıkça görülebilen sitoiskelet mikrofilamentleri gösterdi. Parlak alanın falloidin boyama ile birlikte gözlemlenmesi, iPSC'lerin kaplanmış yüzeye iyi bir yapışma seviyesini belgelemektedir.
Birleşmeyi araştırmak için, iPSC'leri Matrigel, LN-521, vitronektin ve Hu-fibronektin ile üçlü olarak tohumladık ve deneyi üç kez gerçekleştirdik. Kuyunun kenarından kaynaklanan ışık kırılmasını önlemek için,% 60, 80 ve 100'lük bir maske ile üç tip analiz ayarı uyguladık ve hücrelerin toplanmasında ve arka plandan kaçınılmasında benzer olduklarını gözlemledik (Şekil 2). Elde edilen sonuçlar, LN-521 üzerine tohumlanan iPSC'lerin, diğer kaplamalarla karşılaştırıldığında, zaman içinde doğrusal bir şekilde yüksek oranda hücre proliferasyonu gösterdiğini ve bu farklılıkların istatistiksel olarak anlamlı olduğunu göstermektedir ( Şekil 3A-C'deki yıldız işaretleri). Matrigel, Vitronektin veya Hu-Fibronektin üzerine ekilen hücreler ilk 96 saatte doğrusal bir proliferasyon oranı gösterirler, ancak aynı zamanda son 24 saat içinde birleşim eğrisinin artmış bir eğimini de gösterirler (kullanılan maskeden bağımsız olarak,% 60,% 80 veya% 100, Şekil 3A-C). Farklı kaplamalar için 24 saatteki ilk fark, hücre bağlantısındaki farklılıklardan kaynaklanabileceğinden, hücre büyümesi daha sonraki zaman noktaları için (48 ila 120 saat) 24 saate normalleştirilmiştir (Şekil 3D-F). % 60, 80 ve 100 maskesi kullanılarak elde edilen grafikler, farklı kaplamalar arasında birleşme açısından hiçbir fark olmadığını ve LN-521 ile gözlemlenen farklılıkların büyük olasılıkla iPSC'lerin geçtiğinde bu kaplamaya yapışma yeteneğinin artmasından kaynaklandığını göstermektedir.
Şekil 1. Temsili parlak alan görüntüleri ve iPSC'lerin falloidin boyaması, 3 gün sonra farklı ECM kaplamalara ekilir. Kullanılan kaplama üzerinde hücrelerin sağlıklı olduğunu ve açıkça görülebilen sitoiskelet mikrofilamentlerini gösteren falloidin boyama ile belgelendiği gibi damarlara iyi tutturulduğunu gösteren parlak alan görüntüleri. Ölçek çubuğu: 25 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2. Birleşim analizleri yapmak için kullanılan maskeler için üç farklı analiz ayarını gösteren temsili parlak alan görüntüleri. Parlak alan görüntüleri kullanılarak bir sitometre ile elde edilen mozaik (96 kuyu plakasından 16 görüntü / kuyu). Yeşil renkte, analiz segmentasyonu, kuyunun yuvarlak kenarını önlemek veya dahil etmek için uygulanan farklı maskeyi (% 60, 80 100) açıkça gösterir. Ölçek çubuğu: 500 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3. Farklı kaplanmış kaplara tohumlanan iPSC'lerin hücre birleşme analizi. Farklı kaplanmış kaplara tohumlanmış iPSC'lerin hücre birleşimini temsil eden grafik. Veriler elde edildikten sonra uygun yazılım ile 5 gün (120 saat) boyunca (A) %60 maske (B) %80 (C) %100 kullanılarak analiz edilmiştir. 48 saat ila 120 saatlik zaman noktalarının ilk zaman noktasına (24 saat) birleşmesinin normalleşmesi (D, E, F) içinde gösterilmiştir. Veriler üç bağımsız deneyden elde edilmiştir. Veriler ortalama SEM ± olarak gösterilmiştir. n= 3 * p<0.05. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Kaplama bileşiği | Başlangıç Konsantrasyonu | Son Konsantrasyon |
| HU-Fibronektin | 1 mg/mL | 10 μg/cm2 |
| Laminin 521 | 100 μg/ml | 20 μg/mL |
| Arjantin | * | 0.111111111 |
| Vitronektin XF | 250 μg/mL | 10 μg/mL |
Tablo 1. Birleşmeyi analiz etmek için kullanılan kaplama bileşiklerinin listesi. Kullanılan farklı kaplamaların adı, başlangıç ve son konsantrasyonları bildirilmiştir. * Matrigel'in başlangıç konsantrasyonu, partiye bağlı olarak değişkendir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hastalık modelleme ve gelecekteki ilaç taraması için iPSC'lerin kullanımı, hassas tıpta olası uygulamaları ile birlikte onu büyük önem taşıyan bir teknoloji haline getirmektedir ve bu nedenle embriyonik kök hücrelerin fizyolojik durumuna daha iyi benzeyen in vitro kültürleme durumunu açıkça anlamanın gerekli olduğuna inanıyoruz. Bu bağlamda, hücrelerin sağlıklı ve farklılaşmamış bir durumda kalmasına izin veren koşulları anlamak için vahşi tip iPSC'ler kullanarak farklı ECM kaplamalarını test ettik. Buna ek olarak, kritik bir nokta, iPSC'lerin MEF'lerin ve Matrigel'in ksenojenik bileşenlerinde kültürlenmesidir ve bu da üçlüler arasındaki deneysel değişkenliği açıklayabilir ve bu da mekanik çalışmalar yapma yeteneğini engeller26.
Bu çalışmada, iPSC'lerin ksenojenik içermeyen substratlar (yani, LN-521, Vitronektin, Hu-Fibronektin) üzerindeki birleşimini yüksek içerikli bir görüntü analizörü sitometresi kullanarak test ettik. Otomatik görüntü analiz sistemini kullanmanın nedeni, Trypan mavi dışlama yöntemini kullanarak hücreleri saymanın tek hücreli süspansiyonlar yapmayı gerektireceği gerçeğinden kaynaklanmaktadır ve bu, hücre ölümünü önlemek için hücre kümelerinde çoğaltılmaları gerektiğinden, iPSC'leri manipüle ederken önerilmez. Yüksek içerikli görüntü analizi ile elde edilen veriler, 5 gün boyunca her gün basitçe görüntülendikleri için hücreleri rahatsız etmeden hücre birleşmesini takip etmemizi sağlar. Bu teknoloji, iPSC hatlarını karakterize etmek için seçim yöntemi olarak düşünülebilir ve insan iPSC'lerinin kalite kontrol panellerini gerçekleştirmek için dahil edilebilir. Ticari bir yazılım paketi kullanırken, burada açıklanan metodoloji, eşdeğer yüksek içerikli / yüksek verimli görüntü analiz platformları ve benzeri analitik yazılım paketleri aracılığıyla başarıyla kullanılabilir. Elde edilen veriler, LN-521 üzerine tohumlanan iPSC'lerin, hücreleri bölmeden kültürde 5 gün boyunca doğrusal bir birleşme gösterdiğini ve bu nedenle bu çalışmada test edilen en iyi ksenojenik içermeyen substrat olduğunu göstermektedir. Bu protokolün bir sınırlaması, iPSC'nin farklı substratlara bağlanmasındaki farklılıkları göz önünde bulundurmak için elde edilen sonuçların ilk zaman noktasına normalleştirilmesi gerektiğidir. İlginç bir şekilde, elde edilen veriler büyük olasılıkla iPSC'lerin LN-521'e artan hücre bağlanma hızından kaynaklanmaktadır. Aslında, sonuçları ilk kez normalleştirirken, farklı substratlar arasında hiçbir fark gözlenmez.
Çalışma ile elde edilen sonuçlara dayanarak, pluripotent kök hücrelerin biyolojisini, hücre-ECM temaslarına aracılık eden ve spesifik hücre tiplerine kendiliğinden farklılaşmadan ziyade kendi kendini yenileme yeteneklerinin korunmasından sorumlu olabilecek ana hücre yüzey reseptörlerini bilmek açısından daha iyi anlamak ilginç olacaktır. İlginçtir ki, kültür yüzeyinin matris elastikiyetinin farklı hücre tiplerine doğru farklılaşmayı etkilediğini gösteren çalışmalar vardır ve bu muhtemelen hücre tipine özgü farklılaşma ile ilgili bazı hücre içi hücre sinyal yolunu aktive eden hücre-ECM etkileşimlerine bağlıdır27. Buna ek olarak, Vigilante ve ark.28 , hesaplamalı yaklaşımları gen ekspresyonu ve hücre biyolojisi veri kümeleriyle birleştirerek iPSC davranışındaki değişikliklere genetik katkıyı araştırdı. Bu nedenle, Vigilante ve ark.28 tarafından yapılan çalışma, genetik varyasyonu fenotipik varyasyonla eşleştirme girişiminde büyük bir ilerlemedir. Bu çalışmalar, kliniklerde gelecekteki olası kullanımları ışığında iPSC deneylerini gerçekleştirmek için kullanılacak standartlaştırılmış metodolojilerin geliştirilmesine yol açabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Çalışma, Fondazione Bambino Gesù ve Ricerca Corrente'den (İtalya Sağlık Bakanlığı) C.C.'ye yapılan hibelerle desteklendi. Dr. Enrico Bertini'ye (Nörobilim Dalı, Nöromüsküler ve Nörodejeneratif Hastalıklar Birimi, Moleküler Tıp Laboratuvarı, Bambino Gesù Çocuk Araştırma Hastanesi), Dr. Stefania Petrini'ye (Konfokal Mikroskopi Çekirdek Tesisi, Araştırma Laboratuvarları, Bambino Gesù Çocuk Araştırma Hastanesi), Giulia Pericoli'ye (Onko-hematoloji, Gen ve Hücre Terapisi Bölümü, Çocuk Araştırma Hastanesi Bambino Gesù) teşekkür ederiz. ve Roberta Ferretti (Onko-hematoloji, Gen ve Hücre Terapisi Bölümü, Çocuk Araştırma Hastanesi Bambino Gesù) bilimsel tartışmalar ve teknik yardım için. Maria Vinci, "Kanserli Çocuklar İngiltere bursu" sahibidir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, Sterile | Corning | 4488 | Tool |
| 15 mL high-clarity polypropylene (PP) conical centrifuge tubes | Falcon | 352097 | Tool |
| 1x PBS (With Ca2+; Mg2+) | Thermofisher | 14040133 | Medium |
| 1x PBS (without Ca2+; Mg2+) | Euroclone | ECB4004L | Medium |
| 5 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, Sterile | Corning | 4487 | Tool |
| Cell culture microplate, 96 WELL, PS, F-Bottom | Greiner Bio One | 655090 | Support |
| Cell culture plate, 6 well | Costar | 3516 | Support |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium- high glucose) | Sigma | D5671 | Medium |
| EDTA | Sigma | ED4SS-500g | Reagent |
| Epi Episomal iPSC Reprogramming Kit | Invitrogen | A15960 | Reagent |
| FAST - READ 102 | Biosigma | BVS100 | Tool |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270106 | Medium |
| Fibronectin | Merck | FC010 | Coating |
| Glycerol | Sigma | G5516 | Reagent |
| H2O | MILLIQ | ||
| Hoechst | Thermofisher | 33342 | Reagent |
| Laminin 521 | Stem Cell Technologies | 77003 | Coating |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | LS25030081 | Reagent |
| Matrigel | Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | 354277 | Coating |
| Mouse embryonic fibroblasts (MEF) | Life Technologies | A24903 | Coating |
| MTESR1 Medium | Stem Cell Technologies | 85851 | Medium |
| MTESR1 Supplement | Stem Cell Technologies | 85852 | Medium |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | Reagent |
| Phalloidin | Sigma | P1951 | Reagent |
| Vitronectin | Stem Cell Technologies | 7180 | Coating |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | Reagent |
References
- Masotti, A., et al. Aged iPSCs display an uncommon mitochondrial appearance and fail to undergo in vitro neurogenesis. Aging (Albany NY). 6 (12), 1094-1108 (2014).
- Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).
- Kleinman, H. K., et al. Isolation and characterization of type IV procollagen, laminin, and heparan sulfate proteoglycan from the EHS sarcoma. Biochemistry. 21 (24), 6188-6193 (1982).
- Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nature Communications. 5, 3195 (2014).
- Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521 based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nature Protocols. 9 (10), 2354-2368 (2014).
- Laperle, A., et al. α-5 Laminin Synthesized by Human Pluripotent Stem Cells Promotes Self-Renewal. Stem Cell Reports. 5 (2), 195-206 (2015).
- Albalushi, H., et al. Laminin 521 stabilizes the pluripotency expression pattern of human embryonic stem cells initially derived on feeder cells. Stem Cell International. 2018, 7127042 (2018).
- Zhang, D., et al. Niche-derived laminin-511 promotes midbrain dopaminergic neuron survival and differentiation through YAP. Science Signaling. 10 (493), (2017).
- Lu, H. F., et al. A defined xeno-free and feeder-free culture system for the derivation, expansion and direct differentiation of transgene-free patient-specific induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (9), 2816-2826 (2015).
- Miyazaki, T., Nakatsuji, N., Suemori, H. Optimization of slow cooling cryopreservation for human pluripotent stem cells. Genesis. 52 (1), 49-55 (2014).
- Bergström, R., Ström, S., Holm, F., Feki, A., Hovatta, O. Xeno-free culture of human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 767, 125-136 (2011).
- Braam, S. R., et al. Recombinant vitronectin is a functionally defined substrate that supports human embryonic stem cell self-renewal via alphavbeta5 integrin. Stem Cells. 26 (9), 2257-2265 (2008).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2008).
- Li, J., et al. Impact of vitronectin concentration and surface properties on the stable propagation of human embryonic stem cells. Biointerphases. 5 (3), 132-142 (2010).
- Prowse, A. B., et al. Long-term culture of human embryonic stem cells on recombinant vitronectin in ascorbate free media. Biomaterials. 31 (32), 8281-8288 (2010).
- Rowland, T. J., et al. Roles of integrins in human induced pluripotent stem cell growth on Matrigel and vitronectin. Stem Cells and Development. 19 (8), 1231-1240 (2010).
- Ruoslahti, E., Engvall, E., Hayman, E. G., Spiro, R. G. Comparative studies on amniotic fluid and plasma fibronectins. Biochemistry. 193 (1), 295-299 (1981).
- Ni, H., Li, A., Simonsen, N., Wilkins, J. A. Integrin activation by dithiothreitol or Mn2+ induces a ligand-occupied conformation and exposure of a novel NH2-terminal regulatory site on the beta1 integrin chain. Biological Chemistry. 273 (14), 7981-7987 (1998).
- Seltana, A., Basora, N., Beaulieu, J. F. Intestinal epithelial wound healing assay in an epithelial-mesenchymal co-culture system. Wound Repair & Regeneration. 18 (1), 114-122 (2010).
- Amit, M., Shariki, C., Margulets, V., Itskovitz-Eldor, J. Feeder layer-and serum-free culture of human embryonic stem cells. Biology of Reproduction. 70 (3), 837-845 (2004).
- Vaheri, A., Mosher, D. F. High molecular weight, cell surface-associated glyco-protein (fibronectin) lost in malignant transformation. Biochimica et Biophysica Acta. 516 (1), 1-25 (1978).
- Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. Fibronectin fibrillogenesis, a cell-mediated matrix assembly process. Matrix Biology. 24 (6), 389-399 (2005).
- Polyak, K., Weinberg, R. A. Transitions between epithelial and mesenchymal states: acquisition of malignant and stem cell traits. Nature Reviews Cancer. 9 (4), 265-273 (2009).
- Kadler, K. E., Hill, A., Canty-Laird, E. G. Collagen fibrillogenesis: fibronectin, integrins, and minor collagens as organizers and nucleators. Current Opinion in Cell Biology. 20 (5), 495-501 (2008).
- Hunt, G. C., Schwarzbauer, J. E. Tightening the connections between cadherins and fibronectin matrix. Developmental Cell. 16 (3), 327-328 (2009).
- Villa-Diaz, L. G., Ross, A. M., Lahann, J., Krebsbach, P. H. Concise review: The evolution of human pluripotent stem cell culture: from feeder cells to synthetic coatings. Stem Cells. 31 (1), 1-7 (2013).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Vigilante, A., et al. Identifying Extrinsic versus Intrinsic Drivers of Variation in Cell Behavior in Human iPSC Lines from Healthy Donors. Cell Reports. 26 (8), 2078-2087 (2019).
