Summary
Målet med protokollen er å sammenligne forskjellige ekstracellulære matriksbeleggforhold (ECM) for å vurdere hvordan differensialbelegg påvirker vekstraten til induserte pluripotente stamceller (iPSCs). Spesielt tar vi sikte på å sette opp forhold for å oppnå optimal vekst av iPSC-kulturer.
Abstract
Denne studien fokuserer på å forstå hvordan voksende iPSC-er på forskjellige ECM-beleggsubstrater kan påvirke cellekonfluens. En protokoll for å vurdere iPSC-sammenløp i sanntid er etablert uten behov for å telle celler i enkeltcellesuspensjon for å unngå vekstforstyrrelser. Et bildeanalysesystem med høyt innhold ble brukt til å vurdere iPCS-sammenløp på 4 forskjellige ECM-er over tid på en automatisert måte. Ulike analyseinnstillinger ble brukt til å vurdere cellekonfluens av adherente iPSC, og bare en liten forskjell (ved 24 og 48 timer med laminin) er observert om en 60, 80 eller 100% maske ble påført. Vi viser også at laminin fører til best samløp sammenlignet med Matrigel, vitronektin og fibronektin.
Introduction
Induserte pluripotente stamceller (iPSCs) er hentet fra somatiske celler og kan differensieres i forskjellige celletyper. De brukes ofte som et system for å modellere sykdomspatogenese eller utføre narkotikascreening, og tilbyr også potensialet til å bli brukt i sammenheng med personlig medisin. Siden iPSC-er har stort potensial, er det viktig å karakterisere dem fullt ut for bruk som et pålitelig modellsystem. Vi har tidligere vist viktigheten av å dyrke iPSC-er i et hypoksisk miljø, da disse cellene er avhengige av glykolyse og et aerobt miljø kan forårsake redoks ubalanse1. iPSC-er er også sårbare for andre kulturforhold, spesielt det ekstracellulære miljøet. Optimalisering av kulturforhold er et sentralt tema for å holde dem sunne og spredende. En sunn iPSC-kultur vil føre til sunne differensierte celler som generelt er endepunktet for modellen som brukes til å forstå molekylære, cellulære og funksjonelle trekk ved spesifikke menneskelige lidelser eller cellulære prosesser.
I denne studien har en enkel protokoll blitt brukt til å teste sammenløpet av iPSC-er ved hjelp av forskjellige beleggforhold i separate brønner. iPSCs krever et materlag av murine embryonale fibroblaster (MEF) for å festes riktig, men sameksistensen av iPSCs og MEF gjør det vanskelig å utføre analyser som RNA eller proteinekstraksjon siden to populasjoner av celler er tilstede. For å unngå materlaget har forskjellige proteiner som tilhører den ekstracellulære matrisen (ECM) blitt brukt til å gjenskape den naturlige cellenisjen og å ha materfri iPSC-kultur. Spesielt er Matrigel et løselig kjellermembranpreparat ekstrahert fra Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) musesarkom, som er beriket i ekstracellulære matriksproteiner (dvs. laminin, kollagen IV, heparansulfatproteoglykaner, entactin / nidogen og vekstfaktorer)2,3. De andre brukte beleggforholdene er i stedet rensede proteiner med kjent relevans i byggingen av ECM-ene: laminin-521 er kjent for å bli utskilt av humane pluripotente stamceller (hPSCs) i embryoets indre cellemasse, og det er en av de vanligste lamininene i kroppen etter fødselen 4,5,6,7,8,9, 10,11; vitronektin er en xenofri cellekulturmatrise kjent for å støtte vekst og differensiering av hPSC 12,13,14,15,16; fibronektin er et ECM-protein som er viktig for virveldyrutvikling og vedlegg og vedlikehold av embryonale stamceller i en pluripotent tilstand 17,18,19,20,21,22,23,24,25. Siden forskjellige beleggforhold er tilgjengelige, sammenligner vi dem når det gjelder deres effekt på iPSCs sammenløp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Belegg 96 brønnplater
MERK: Ulike belegg ble testet i samme plate, men separate brønner (se tilleggsfil).
- Fortynn Matrigel 1:100 i DMEM. Tilsett 100 μL per brønn til de 96 brønnplatene og inkuber i 1 time ved romtemperatur. Etter dette, fjern løsningen og vask brønnene med 100 μL DMEM to ganger.
- Fortynnet laminin (20 μg / ml, LN-521) i PBS (med kalsium og magnesium). Tilsett 100 μL i brønnen og inkuber ved 4 °C over natten. Neste dag utfør to vasker med DMEM før du seeder cellene.
- Fortynn vitronektin (10 μg/ml) i fortynningsbuffer. Tilsett 100 μL per brønn til 96-brønnplaten og inkuber i 1 time ved romtemperatur. Vask brønnene med PBS (uten kalsium og magnesium) før plating cellene.
- Fortynn HU-Fibronectin (30 μg / ml) i ddH2O. Tilsett 100 μL i brønnene og inkuber ved romtemperatur i 45 minutter. Etter dette, vask brønnene med mediet før du seeder cellene.
2. Vedlikehold av iPSC-er i kulturen
MERK: iPSC-er ble kjøpt kommersielt. IPSC-ene ble avledet fra sunne humane fibroblaster og omprogrammert ved hjelp av episomal teknologi.
- Fra -80 °C fryseren eller flytende nitrogen tiner du de kryopreserverte iPSC-ene i et 37 °C vannbad. Rengjør hetteglasset som inneholder cellene med 70% etanol før du flytter det inn i det biologiske sikkerhetsskapet.
- Tilsett cellesuspensjonen til 5 ml forvarmede cellekulturmedier (f.eks. mTeSR1) dråpe for dråpe med en 1000 μL pipette i et 15 ml sterilt konisk rør.
- Sentrifuger cellene ved 304 x g i 5 minutter ved romtemperatur (RT).
- Fjern mediet og resuspend cellepelleten i 4 ml cellekulturmedium.
- Plate cellesuspensjonen i to brønner av de 6 brønnplatene (105 iPSCs per 6-brønns cellekulturskål), hvor musens embryonale fibroblaster (MEFs) har blitt belagt tidligere. Frø MEFs to dager før plating iPSCs med en tetthet på 2,4 x 104 / cm2 i DMEM (inneholdende 10% Fetal Bovine Serum, 1% L-glutamin og 1% Penicillin-Streptomycin).
- Etter sådd, suppler cellemediet med 10 μM ROCK-hemmer Y-27632.
- Dyrk iPSC-ene på MEFs de første 4-5 ukene og deretter i materfri tilstand (MEF-fri tilstand), ved hjelp av et av beleggene av interesse (se trinn 1 og tabell 1) i mTeSR1.
- Når iPSC-ene er 70-80% sammenløpende, passasje 1: 4 ved bruk av 0,5 mM EDTA-behandling i 3-5 minutter ved RT. Tilsett 1 ml 0,5 mM EDTA for en 6-brønnplate (eller proporsjonale mengder for andre typer plater). Overfør til nye brønner under matefrie forhold og inkuber ved 37 °C, 5 % CO2, 20 % O2.
- Bytt media med fersk mTeSR1 hver dag og del cellene hver 2.
3. Karakterisering av cellesammenløp
- Bruk 96 brønnplater til forsøkene.
- Frø 10.000 celler per brønn etter minst 1 måned med dyrking i materfri tilstand for å være sikker på at MEF-ene ikke ble passert. Bruk engangs tellelysbilder for å telle cellene med det optiske mikroskopet.
- Utfør eksperimentene i tre eksemplarer. Test derfor hver såtilstand i tre brønner.
- Utfør automatisert bildeinnsamling fra dag 1 etter såing ved hjelp av et cytometer i lysfeltmodus. Utfør automatisert bildeinnsamling hver 24. time i 5 dager. Hvis du vil ha detaljert informasjon om eksperimentelle parametere, kan du se tilleggsfilen.
- Bruk automatisk kontrast og automatisk eksponering for å visualisere celler på en bedre måte.
- Still inn analyseinnstillingen (se Tilleggsfil) for sammenløpsanalyse til å bruke en maske på 60 %, 80 % og 100 % per brønn for å evaluere endringene i fokus på grunn av lysbrytningen ved grensen til brønnene. Bruk den forskjellige maskeanalyseinnstillingen nevnt ovenfor for å analysere cellesammenløpet ved hvert tidspunkt.
4. Statistiske analyser
- Rapporter kvantitative resultater som betyr ± standardfeil i gjennomsnittet (SEM).
- For å sammenligne generelle forskjeller i de forskjellige beleggforholdene, innhent data ved hjelp av de samme prøvene og utfør studentens sammenkoblede prøve-t-test. P-verdier under 0,05 regnes som statistisk signifikante, og alle rapporterte p-verdier er tosidige.
5. Karakterisering av cytoskeletale mikrofilamenter
- Fiks celler med 4% paraformaldehyd (4% PFA) i PBS i 10 minutter ved RT, etterfulgt av to vasker i PBS (10 min totalt).
- Tilsett 100 μL blokkeringsløsning (sammensatt av 5% BSA, 0,1% Triton i PBS) til hver brønn i 1 time ved RT.
- Fjern blokkeringsløsningen og vask prøvene to ganger med PBS i 10 minutter.
- Tilsett 100 μL av phalloidin-konjugert arbeidsløsning per prøve og inkuber i 1 time ved RT.
- Vask cellene to ganger med PBS (10 min ved RT).
- Flekkkjerner med Hoechst 33342 fortynnet 1:10000 i PBS i 10 min ved RT.
- Fjern Hoechst-løsningen og vask cellene to ganger med PBS i 10 minutter hver gang.
- Vask prøven med H2O og la den tørke under en kjemisk hette.
- Tilsett 100 μL monteringsmedier (dvs. PBS: glyserol, 1: 1) for å dekke cellene og bevare fluorescens av prøver.
- Observer celle ved Ex/Em 493/517 nm på et laserskanning konfokalt mikroskop utstyrt med en hvit lyslaser (WLL) kilde og en 405 nm diodelaser. Få sekvensielle konfokale bilder ved hjelp av et HC PLAPO 40x oljenedsenkingsmål. Bruk samme lasereffekt, strålesplittere, filterinnstillinger, pinhole-diametre og skannemodus for alle undersøkte prøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne studien undersøkte vi iPSCs-sammenløp når de dyrkes på forskjellige beleggforhold. Ved hjelp av et cytometer kunne vi oppnå lett informative resultater i tre eksemplarer på 5 dager. Siden iPSC-er knapt festes til plastbeholdere og et belegg er nødvendig for å støtte spredningen, bestemte vi oss for å overvåke sammenløpet av humane iPSC-er, da det indikerer helsen til cellekulturen, og det kan reflektere over deres differensieringspotensial. Etter in vitro-ekspansjon sådde vi iPSC-ene på forskjellige ECM-substrater og analyserte celler ved observasjon av prøvebildene som ble oppnådd i lyst felt og ved bruk av phalloidinfarging (brukt til farging av aktinfilamenter, også kjent som F-aktin) for å forstå deres vedheft til karene (figur 1). Faktisk tillater phalloidinfarging visualisering av graden av celleadhesjon til overflaten av karet og dermed til det spesifikke belegget som brukes til fartøyet. Celler som er festet til belegget viste tydelig synlige cytoskeletale mikrofilamenter i stedet for kollapsede mikrofilamenter. Observasjonen av lysfeltet i kombinasjon med phalloidinfarging dokumenterer et godt vedheftsnivå av iPSC-ene til den belagte overflaten.
For å undersøke samløpet sådde vi iPSC-ene med Matrigel, LN-521, vitronektin og Hu-fibronektin i triplikater, og utførte eksperimentet tre ganger. For å unngå lysbrytning på grunn av kanten av brønnen, brukte vi tre typer analyseinnstilling med en maske på 60, 80 og 100%, og observerte at de er like når det gjelder å plukke cellene og unngå bakgrunnen (figur 2). De oppnådde resultatene viser at iPSCs sådd på LN-521 viser en høy grad av celleproliferasjon på en lineær måte i løpet av tiden, sammenligner den med de andre beleggene, og at disse forskjellene er statistisk signifikante (stjerner i figur 3A-C). Celler sådd på Matrigel, Vitronectin eller Hu-Fibronectin viser en lineær proliferasjonshastighet i de første 96 timene, men de viser også en økt helling av sammenløpskurven de siste 24 timene (uavhengig av masken som brukes, 60%, 80% eller 100%, figur 3A-C). Siden den opprinnelige forskjellen ved 24 timer for de forskjellige beleggene kan skyldes forskjeller i cellefeste, har celleveksten blitt normalisert til 24 timer for de senere tidspunktene (fra 48 til 120 timer) (figur 3D-F). Grafene oppnådd ved bruk av 60, 80 og 100% masken viser at det ikke eksisterer forskjeller når det gjelder sammenløp mellom de forskjellige beleggene, og at forskjellene observert med LN-521 mest sannsynlig skyldes en økt evne til iPSC-ene til å feste seg til dette belegget når de passeres.
Figur 1. Representative lysfeltbilder og Phalloidin-farging av iPSC-er sådd på forskjellige ECM-belegg etter 3 dager. Lysfeltbilder som viser at cellene er friske på belegget som brukes, og at de er godt festet til karene som dokumentert av phalloidinfargingen som viser tydelig synlige cytoskeletale mikrofilamenter. Skala bar: 25 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. Representative lysfeltbilder som viser tre ulike analyser for maskene som brukes til å utføre samløpsanalyser. Mosaikk oppnådd med et cytometer ved bruk av lysfeltbilder (16 bilder / brønn fra en 96 brønnplate). I grønt viser analysesegmenteringen tydelig den forskjellige masken som brukes (60, 80 100%) for å unngå eller inkludere den runde kanten av brønnen. Skala bar: 500 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3. Cellekonfluensanalyse av iPSC-er sådd på forskjellig belagte kar. Graf som representerer cellesammenløpet av iPSC-er sådd på forskjellig belagte kar. Data ble analysert etter innsamling med riktig programvare ved hjelp av en (A) 60% maske (B) 80% (C) 100% i 5 dager (120 timer). Normalisering av sammenløpet av 48 timer til 120 timers tidspunkt peker til første gangpunkt (24 timer) er vist i (D, E, F). Dataene ble hentet fra tre uavhengige eksperimenter. Data er representert som gjennomsnitt ± SEM. n= 3 * p<0,05. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Belegg forbindelse | Innledende konsentrasjon | Endelig konsentrasjon |
| HU-Fibronectin | 1 mg/ml | 10 μg/cm2 |
| Laminin 521 | 100 mikrog/ml | 20 mikrog/ml |
| Matrigel | * | 0.111111111 |
| Vitronektin XF | 250 mikrog/ml | 10 mikrog/ml |
Tabell 1. Liste over beleggforbindelser som brukes til å analysere sammenløpet. Navnet, innledende og endelige konsentrasjonen av forskjellige belegg som brukes er rapportert. * Den opprinnelige konsentrasjonen av Matrigel er variabel, avhengig av batch.
Tilleggsfil. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bruken av iPSC for sykdomsmodellering og fremtidig legemiddelscreening sammen med deres mulige anvendelse i presisjonsmedisin gjør det til en teknologi av stor relevans, og av denne grunn tror vi at det er nødvendig å tydelig forstå in vitro-dyrkingstilstanden som bedre ligner den fysiologiske situasjonen til embryonale stamceller. I denne sammenheng testet vi forskjellige ECM-belegg ved hjelp av villtype iPSCs for å forstå forholdene som tillater cellene å forbli i en sunn og utifferentiert tilstand. I tillegg til dette er et kritisk punkt dyrking av iPSCs i xenogene komponenter av MEFs og Matrigel som kan utgjøre den eksperimentelle variabiliteten blant triplikater, og dette hindrer evnen til å utføre mekanistiske studier26.
I denne studien testet vi iPSCs sammenløp på xenogene-frie substrater (dvs. LN-521, Vitronectin, Hu-Fibronectin) ved hjelp av et høyinnholds bildeanalysatorcytometer. Årsaken til å bruke det automatiserte bildeanalysesystemet skyldes det faktum at telling av celler, ved hjelp av Trypan blå eksklusjonsmetode, ville være nødvendig å lage enkeltcellesuspensjoner, og dette anbefales ikke når man manipulerer iPSCer, da de skal forplantes i celleklynger for å unngå celledød. Dataene som er oppnådd med høyinnholdsbildeanalysen, lar oss følge cellekonfluens uten forstyrrende celler, da de bare blir avbildet hver dag i 5 dager. Denne teknologien kan betraktes som valgmetoden for å karakterisere iPSC-linjer, og den kan inkluderes for å utføre kvalitetskontrollpaneler av menneskelige iPSC-er. Mens vi brukte en kommersiell programvarepakke, kan metodikken som er beskrevet her, med hell brukes ved hjelp av tilsvarende bildeanalyseplattformer med høyt innhold / høy gjennomstrømning og lignende analytiske programvarepakker. Dataene som er oppnådd viser at iPSC-ene som er sådd på LN-521, presenterer en lineær sammenløp i løpet av 5 dager i kultur uten å splitte cellene og er derfor det beste xenogene-frie substratet som ble testet i denne studien. En begrensning av denne protokollen er at de oppnådde resultatene må normaliseres til første tidspunkt for å vurdere forskjeller i iPSC-vedlegg til forskjellige substrater. Interessant nok er dataene som er oppnådd, mest sannsynlig drevet av en økt cellevedleggshastighet på iPSCs til LN-521. Faktisk, når man normaliserer resultatene for første gangpunkt, observeres ingen forskjell mellom de forskjellige substratene.
Basert på resultatene oppnådd med studien, ville det være interessant å bedre forstå biologien til pluripotente stamceller når det gjelder å kjenne de viktigste celleoverflatereseptorene som formidler celle-ECM-kontakter, og som kan være ansvarlig for vedlikehold av deres selvfornyelsesevne i stedet for spontan differensiering i bestemte celletyper. Interessant nok er det studier som viser at matriseelastisiteten i kulturoverflaten påvirket differensieringen mot forskjellige celletyper, og dette er sannsynligvis avhengig av celle-ECM-interaksjonene som aktiverte en intracellulær cellesignalvei som er relevant for celletypespesifikk differensiering27. I tillegg til dette utforsket Vigilante et al.28 det genetiske bidraget til endringer i iPSC-oppførsel, ved å kombinere beregningsmetoder med genuttrykk og cellebiologiske datasett. Arbeidet til Vigilante et al.28 er derfor et stort fremskritt i forsøket på å kartlegge genetisk variasjon til fenotypisk variasjon. Disse studiene kan føre til utvikling av standardiserte metoder som skal brukes til å utføre iPSCs eksperimenter i lys av deres fremtidige mulige bruk i klinikker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Studien ble støttet av tilskudd fra Fondazione Bambino Gesù og Ricerca Corrente (det italienske helsedepartementet) til C.C. Vi vil gjerne takke Dr Enrico Bertini (Institutt for nevrovitenskap, Enhet for nevromuskulære og neurodegenerative sykdommer, Laboratorium for molekylærmedisin, Bambino Gesù Children's Research Hospital), Dr Stefania Petrini (Confocal Microscopy Core Facility, Research Laboratories, Bambino Gesù Children's Research Hospital), Giulia Pericoli (Institutt for onco-hematologi, Gen- og celleterapi, Children's Research Hospital Bambino Gesù) og Roberta Ferretti (Institutt for onco-hematologi, gen- og celleterapi, Children's Research Hospital Bambino Gesù) for vitenskapelige diskusjoner og teknisk hjelp. Maria Vinci er mottaker av et "Children with Cancer UK fellowship".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, Sterile | Corning | 4488 | Tool |
| 15 mL high-clarity polypropylene (PP) conical centrifuge tubes | Falcon | 352097 | Tool |
| 1x PBS (With Ca2+; Mg2+) | Thermofisher | 14040133 | Medium |
| 1x PBS (without Ca2+; Mg2+) | Euroclone | ECB4004L | Medium |
| 5 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, Sterile | Corning | 4487 | Tool |
| Cell culture microplate, 96 WELL, PS, F-Bottom | Greiner Bio One | 655090 | Support |
| Cell culture plate, 6 well | Costar | 3516 | Support |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium- high glucose) | Sigma | D5671 | Medium |
| EDTA | Sigma | ED4SS-500g | Reagent |
| Epi Episomal iPSC Reprogramming Kit | Invitrogen | A15960 | Reagent |
| FAST - READ 102 | Biosigma | BVS100 | Tool |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270106 | Medium |
| Fibronectin | Merck | FC010 | Coating |
| Glycerol | Sigma | G5516 | Reagent |
| H2O | MILLIQ | ||
| Hoechst | Thermofisher | 33342 | Reagent |
| Laminin 521 | Stem Cell Technologies | 77003 | Coating |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | LS25030081 | Reagent |
| Matrigel | Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | 354277 | Coating |
| Mouse embryonic fibroblasts (MEF) | Life Technologies | A24903 | Coating |
| MTESR1 Medium | Stem Cell Technologies | 85851 | Medium |
| MTESR1 Supplement | Stem Cell Technologies | 85852 | Medium |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | Reagent |
| Phalloidin | Sigma | P1951 | Reagent |
| Vitronectin | Stem Cell Technologies | 7180 | Coating |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | Reagent |
References
- Masotti, A., et al. Aged iPSCs display an uncommon mitochondrial appearance and fail to undergo in vitro neurogenesis. Aging (Albany NY). 6 (12), 1094-1108 (2014).
- Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).
- Kleinman, H. K., et al. Isolation and characterization of type IV procollagen, laminin, and heparan sulfate proteoglycan from the EHS sarcoma. Biochemistry. 21 (24), 6188-6193 (1982).
- Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nature Communications. 5, 3195 (2014).
- Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521 based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nature Protocols. 9 (10), 2354-2368 (2014).
- Laperle, A., et al. α-5 Laminin Synthesized by Human Pluripotent Stem Cells Promotes Self-Renewal. Stem Cell Reports. 5 (2), 195-206 (2015).
- Albalushi, H., et al. Laminin 521 stabilizes the pluripotency expression pattern of human embryonic stem cells initially derived on feeder cells. Stem Cell International. 2018, 7127042 (2018).
- Zhang, D., et al. Niche-derived laminin-511 promotes midbrain dopaminergic neuron survival and differentiation through YAP. Science Signaling. 10 (493), (2017).
- Lu, H. F., et al. A defined xeno-free and feeder-free culture system for the derivation, expansion and direct differentiation of transgene-free patient-specific induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (9), 2816-2826 (2015).
- Miyazaki, T., Nakatsuji, N., Suemori, H. Optimization of slow cooling cryopreservation for human pluripotent stem cells. Genesis. 52 (1), 49-55 (2014).
- Bergström, R., Ström, S., Holm, F., Feki, A., Hovatta, O. Xeno-free culture of human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 767, 125-136 (2011).
- Braam, S. R., et al. Recombinant vitronectin is a functionally defined substrate that supports human embryonic stem cell self-renewal via alphavbeta5 integrin. Stem Cells. 26 (9), 2257-2265 (2008).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2008).
- Li, J., et al. Impact of vitronectin concentration and surface properties on the stable propagation of human embryonic stem cells. Biointerphases. 5 (3), 132-142 (2010).
- Prowse, A. B., et al. Long-term culture of human embryonic stem cells on recombinant vitronectin in ascorbate free media. Biomaterials. 31 (32), 8281-8288 (2010).
- Rowland, T. J., et al. Roles of integrins in human induced pluripotent stem cell growth on Matrigel and vitronectin. Stem Cells and Development. 19 (8), 1231-1240 (2010).
- Ruoslahti, E., Engvall, E., Hayman, E. G., Spiro, R. G. Comparative studies on amniotic fluid and plasma fibronectins. Biochemistry. 193 (1), 295-299 (1981).
- Ni, H., Li, A., Simonsen, N., Wilkins, J. A. Integrin activation by dithiothreitol or Mn2+ induces a ligand-occupied conformation and exposure of a novel NH2-terminal regulatory site on the beta1 integrin chain. Biological Chemistry. 273 (14), 7981-7987 (1998).
- Seltana, A., Basora, N., Beaulieu, J. F. Intestinal epithelial wound healing assay in an epithelial-mesenchymal co-culture system. Wound Repair & Regeneration. 18 (1), 114-122 (2010).
- Amit, M., Shariki, C., Margulets, V., Itskovitz-Eldor, J. Feeder layer-and serum-free culture of human embryonic stem cells. Biology of Reproduction. 70 (3), 837-845 (2004).
- Vaheri, A., Mosher, D. F. High molecular weight, cell surface-associated glyco-protein (fibronectin) lost in malignant transformation. Biochimica et Biophysica Acta. 516 (1), 1-25 (1978).
- Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. Fibronectin fibrillogenesis, a cell-mediated matrix assembly process. Matrix Biology. 24 (6), 389-399 (2005).
- Polyak, K., Weinberg, R. A. Transitions between epithelial and mesenchymal states: acquisition of malignant and stem cell traits. Nature Reviews Cancer. 9 (4), 265-273 (2009).
- Kadler, K. E., Hill, A., Canty-Laird, E. G. Collagen fibrillogenesis: fibronectin, integrins, and minor collagens as organizers and nucleators. Current Opinion in Cell Biology. 20 (5), 495-501 (2008).
- Hunt, G. C., Schwarzbauer, J. E. Tightening the connections between cadherins and fibronectin matrix. Developmental Cell. 16 (3), 327-328 (2009).
- Villa-Diaz, L. G., Ross, A. M., Lahann, J., Krebsbach, P. H. Concise review: The evolution of human pluripotent stem cell culture: from feeder cells to synthetic coatings. Stem Cells. 31 (1), 1-7 (2013).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Vigilante, A., et al. Identifying Extrinsic versus Intrinsic Drivers of Variation in Cell Behavior in Human iPSC Lines from Healthy Donors. Cell Reports. 26 (8), 2078-2087 (2019).
