Summary
O objetivo do protocolo é comparar diferentes condições de revestimento de matriz extracelular (ECM) para avaliar como o revestimento diferencial afeta a taxa de crescimento de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). Em particular, pretendemos estabelecer condições para obter o crescimento ideal das culturas de iPSC.
Abstract
Este estudo se concentra em entender como o crescimento de iPSCs em diferentes substratos de revestimento de ECM pode afetar a confluência celular. Um protocolo para avaliar a confluência de iPSC em tempo real foi estabelecido sem a necessidade de contar células em suspensão de célula única para evitar qualquer perturbação do crescimento. Um sistema de análise de imagens de alto conteúdo foi usado para avaliar a confluência de iPCS em 4 ECMs diferentes ao longo do tempo de forma automatizada. Diferentes configurações de análise foram usadas para avaliar a confluência celular de iPSCs aderentes e apenas uma pequena diferença (em 24 e 48 horas com laminina) foi observada se uma máscara de 60, 80 ou 100% foi aplicada. Também mostramos que a laminina leva à melhor confluência em comparação com Matrigel, vitronectina e fibronectina.
Introduction
As células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) são obtidas a partir de células somáticas e podem ser diferenciadas em diferentes tipos de células. Eles são frequentemente usados como um sistema para modelar a patogênese da doença ou realizar triagem de medicamentos, e também oferecem o potencial para ser usado no contexto da medicina personalizada. Como as iPSCs têm grande potencial, é importante caracterizá-las completamente para uso como um sistema modelo confiável. Mostramos anteriormente a importância do cultivo de iPSCs em um ambiente hipóxico, pois essas células dependem da glicólise e um ambiente aeróbio pode causar desequilíbrioredox1. As iPSCs também são vulneráveis a outras condições de cultura, particularmente o ambiente extracelular. A otimização das condições da cultura é uma questão fundamental para mantê-las saudáveis e proliferantes. Uma cultura saudável de iPSC levará a células diferenciadas saudáveis que geralmente são o ponto final do modelo usado para entender as características moleculares, celulares e funcionais de distúrbios humanos específicos ou processos celulares.
Neste estudo, um protocolo simples foi utilizado para testar a confluência de iPSCs utilizando diferentes condições de revestimento em poços separados. As iPSCs requerem uma camada alimentadora de fibroblastos embrionários murinos (MEF) para se ligarem adequadamente, mas a coexistência de iPSCs e MEF dificulta a realização de análises como RNA ou extração de proteínas, uma vez que duas populações de células estão presentes. A fim de evitar a camada de alimentação, diferentes proteínas pertencentes à matriz extracelular (ECM) têm sido utilizadas para recriar o nicho celular natural e para ter cultura iPSC livre de alimentador. Em particular, Matrigel é uma preparação de membrana basal solubilizada extraída do sarcoma de camundongo Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), que é enriquecida em proteínas da matriz extracelular (ou seja, laminina, colágeno IV, proteoglicanos de sulfato de heparano, entactina/nidogênio e fatores de crescimento)2,3. As outras condições de revestimento utilizadas são, em vez disso, proteínas purificadas com relevância conhecida na construção dos ECMs: a laminina-521 é conhecida por ser secretada por células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) na massa celular interna do embrião e é uma das lamininas mais comuns no corpo após o nascimento 4,5,6,7,8,9, 10,11; a vitronectina é uma matriz de cultura celular livre de xeno conhecida por apoiar o crescimento e a diferenciação da hPSC 12,13,14,15,16; a fibronectina é uma proteína da MEC importante para o desenvolvimento de vertebrados e a fixação e manutenção de células-tronco embrionárias em estado pluripotente 17,18,19,20,21,22,23,24,25. Uma vez que diferentes condições de revestimento estão disponíveis, nós as comparamos em termos de seu efeito na confluência das iPSCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Revestimento de 96 placas de poço
NOTA: Diferentes revestimentos foram testados na mesma placa, mas poços separados (consulte Arquivo Suplementar).
- Diluir o Matrigel 1:100 em DMEM. Adicionar 100 μL por poço às 96 placas de poço e incubar por 1 h à temperatura ambiente. Em seguida, remova a solução e lave os poços com 100 μL de DMEM duas vezes.
- Laminina diluída (20 μg/mL, LN-521) em PBS (com cálcio e magnésio). Adicionar 100 μL ao poço e incubar a 4 °C durante a noite. No dia seguinte, realize duas lavagens com DMEM antes de semear as células.
- Vitronectina diluída (10 μg/mL) em tampão de diluição. Adicionar 100 μL por poço à placa de 96 poços e incubar por 1 hora à temperatura ambiente. Lave os poços com PBS (sem cálcio e magnésio) antes de chapear as células.
- Diluir HU-Fibronectina (30 μg/mL) em ddH2O. Adicionar 100 μL aos poços e incubar à temperatura ambiente por 45 minutos. Em seguida, lave os poços com o meio antes de semear as células.
2. Manutenção das iPSCs em cultura
NOTA: iPSCs foram comprados comercialmente. As iPSCs foram derivadas de fibroblastos humanos saudáveis e reprogramadas usando tecnologia episómica.
- A partir do congelador a -80 °C ou do azoto líquido, descongelar as iPSCs criopreservadas num banho-maria de 37 °C. Limpe o frasco para injetáveis que contém as células com etanol a 70% antes de o mover para o armário de segurança biológica.
- Adicione a suspensão celular a 5 mL de meio de cultura celular pré-aquecido (por exemplo, mTeSR1) gota a gota com uma pipeta de 1000 μL em um tubo cônico estéril de 15 mL.
- Centrifugar as células a 304 x g durante 5 min à temperatura ambiente (RT).
- Remova o meio e ressuspenda o pellet celular em 4 mL de meio de cultura celular.
- Chapear a suspensão celular em dois poços das placas de 6 poços (105 iPSCs por placa de cultura celular de 6 poços), onde os fibroblastos embrionários de camundongos (MEFs) foram revestidos anteriormente. MEFs de sementes dois dias antes do revestimento de iPSCs a uma densidade de 2,4 x 104/cm2 em DMEM (contendo 10% de soro fetal bovino, 1% de L-glutamina e 1% de penicilina-estreptomicina).
- Após a semeadura, complemente o meio celular com 10 μM de inibidor de ROCK Y-27632.
- Cultivar as iPSCs em MEFs durante as primeiras 4-5 semanas e, em seguida, em condição livre de alimentador (condição livre de MEF), usando um dos revestimentos de interesse (ver etapa 1 e Tabela 1) em mTeSR1.
- Quando as iPSCs são 70-80% confluentes, passagem 1:4 usando o tratamento de EDTA 0,5 mM por 3-5 min no RT. Adicione 1 mL de EDTA 0,5 mM para uma placa de 6 poços (ou quantidades proporcionais para outros tipos de placas). Transferir para novos poços em condições livres de alimentadores e incubar a 37 °C, 5% de CO2, 20% de O2.
- Mude a mídia com mTeSR1 fresco todos os dias e divida as células a cada 2 dias.
3. Caracterização da confluência celular
- Use 96 placas de poço para os experimentos.
- Semear 10.000 células por poço após pelo menos 1 mês de cultura em condição livre de alimentadores, a fim de ter certeza de que os MEFs não foram passados. Use lâminas de contagem descartáveis para contar as células com o microscópio óptico.
- Realizar os experimentos em triplicado. Portanto, teste cada condição de semeadura em três poços.
- Realize a aquisição automatizada de imagens a partir do dia 1 após a semeadura usando um citômetro no modo de campo brilhante. Realize a aquisição automatizada de imagens a cada 24 horas durante 5 dias. Para obter informações detalhadas sobre os parâmetros experimentais, consulte o Arquivo Suplementar.
- Use o auto-contraste e auto-exposição para visualizar melhor as células.
- Defina a configuração de análise (consulte Arquivo Suplementar) para análise de confluência para aplicar uma máscara de 60%, 80% e 100% por poço, a fim de avaliar as mudanças de foco devido à refração de luz na borda dos poços. Use a configuração de análise de máscara diferente mencionada acima para analisar a confluência celular em cada ponto de tempo.
4. Análises estatísticas
- Relatar resultados quantitativos como meio ± erro padrão da média (EPM).
- Para comparar as diferenças gerais das diferentes condições de revestimento, obtenha dados usando as mesmas amostras e execute o teste t de amostra emparelhada de Student. Valores de p menores que 0,05 são considerados estatisticamente significativos, e todos os valores de p relatados são de dois lados.
5. Caracterização dos microfilamentos citoesqueléticos
- Fixar células com paraformaldeído a 4% (PFA a 4%) em PBS por 10 min no RT, seguido de duas lavagens em PBS (total de 10 min).
- Adicionar 100 μL de solução de bloqueio (composta por 5% de BSA, 0,1% de Triton em PBS) a cada poço por 1 h no RT.
- Retire a solução de bloqueio e lave as amostras duas vezes com PBS por 10 min.
- Adicionar 100 μL da solução de trabalho conjugada com faloidina por amostra e incubar durante 1 h a RT.
- Lave as células duas vezes com PBS (10 min no RT).
- Núcleos de coloração com Hoechst 33342 diluídos 1:10000 em PBS durante 10 min a RT.
- Retire a solução Hoechst e lave as células duas vezes com PBS durante 10 minutos de cada vez.
- Lavar a amostra com H2O e deixar secar debaixo de um exaustor químico.
- Adicionar 100 μL de meio de montagem (ou seja, PBS:glicerol, 1:1) para cobrir as células e preservar a fluorescência das amostras.
- Observe a célula em Ex/Em 493/517 nm em um microscópio confocal de varredura a laser equipado com uma fonte de laser de luz branca (WLL) e um laser de diodo de 405 nm. Adquira imagens confocais sequenciais usando um objetivo de imersão em óleo HC PLAPO 40x. Use a mesma potência do laser, divisores de feixe, configurações de filtro, diâmetros de orifício e modo de varredura para todas as amostras examinadas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Neste estudo, investigamos a confluência de iPSCs quando cultivadas em diferentes condições de revestimento. Usando um citômetro, fomos capazes de obter resultados prontamente informativos em triplicados em 5 dias. Como as iPSCs dificilmente se ligam a recipientes plásticos e um revestimento é necessário para suportar sua proliferação, decidimos monitorar a confluência de iPSCs humanas, pois é indicativa da saúde da cultura celular e pode refletir em seu potencial de diferenciação. Após a expansão in vitro, semeamos as iPSCs em diferentes substratos de ECM e analisamos as células por meio da observação das imagens das amostras adquiridas em campo claro e utilizando a coloração de faloidina (utilizada para coloração de filamentos de actina, também conhecida como F-actina) a fim de compreender sua adesão aos vasos (Figura 1). De fato, a coloração de faloidina permite a visualização do grau de adesão celular à superfície do vaso e, portanto, ao revestimento específico usado para o vaso. As células que são aderentes ao revestimento mostraram microfilamentos citoesqueléticos claramente visíveis em vez de microfilamentos colapsados. A observação do campo brilhante em combinação com a coloração de faloidina documenta um bom nível de adesão das iPSCs à superfície revestida.
Para investigar a confluência, semeamos as iPSCs com Matrigel, LN-521, vitronectina e Hu-fibronectina em triplicados, e realizamos o experimento três vezes. Para evitar a refração da luz devido à borda do poço, aplicamos três tipos de configuração de análise com máscara de 60, 80 e 100%, e observamos que eles são semelhantes na escolha das células e na prevenção do fundo (Figura 2). Os resultados obtidos mostram que as iPSCs semeadas no LN-521 apresentam uma alta taxa de proliferação celular de forma linear durante o tempo, comparando-a com os demais revestimentos e que essas diferenças são estatisticamente significativas (asteriscos na Figura 3A-C). As células semeadas em Matrigel, Vitronectina ou Hu-Fibronectina apresentam uma taxa de proliferação linear nas primeiras 96 horas, mas também apresentam uma inclinação aumentada da curva de confluência nas últimas 24 horas (independentemente da máscara utilizada, 60%, 80% ou 100%, Figura 3A-C). Uma vez que a diferença inicial em 24 h para os diferentes revestimentos pode ser devida a diferenças na fixação celular, o crescimento celular foi normalizado para as 24 h para os momentos posteriores (de 48 a 120 h) (Figura 3D-F). Os gráficos obtidos utilizando a máscara de 60, 80 e 100% mostram que não existem diferenças em termos de confluência entre os diferentes revestimentos e que as diferenças observadas com o LN-521 são provavelmente devidas a uma maior capacidade das iPSCs de aderir a esse revestimento quando passadas.
Figura 1. Imagens representativas de campo brilhante e coloração de faloidina de iPSCs semeadas em diferentes revestimentos de ECM após 3 dias. Imagens de campo brilhante mostrando que as células são saudáveis no revestimento usado e que estão bem ligadas aos vasos, conforme documentado pela coloração de faloidina, mostrando microfilamentos citoesqueléticos claramente visíveis. Barra de escala: 25 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Imagens representativas de campo brilhante mostrando três configurações de análise diferentes para as máscaras usadas para realizar análises de confluência. Mosaico obtido com citômetro utilizando imagens de campo brilhante (16 imagens/poço de uma placa de 96 poços). Em verde, a segmentação da análise exibe claramente a máscara diferente aplicada (60, 80 100%) para evitar ou incluir a borda redonda do poço. Barra de escala: 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Análise da confluência celular de iPSCs semeadas em vasos revestidos de forma diferente. Gráfico que representa a confluência celular de iPSCs semeadas em vasos revestidos de forma diferente. Os dados foram analisados após a aquisição com o software apropriado utilizando uma máscara (A) 60% (B) 80% (C) 100% por 5 dias (120 h). A normalização da confluência dos pontos de tempo de 48 h a 120 h com o primeiro ponto de tempo (24 h) é mostrada em (D, E, F). Os dados foram obtidos a partir de três experimentos independentes. Os dados são representados como média ± EPM. n= 3 * p<0,05. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Composto de revestimento | Concentração Inicial | Concentração Final |
| HU-Fibronectina | 1 mg/mL | 10 μg/cm2 |
| Laminina 521 | 100 μg/ml | 20 μg/mL |
| Matrigel | * | 0.111111111 |
| Vitronectina XF | 250 μg/mL | 10 μg/mL |
Tabela 1. Lista de compostos de revestimento utilizados para analisar a confluência. O nome, a concentração inicial e final dos diferentes revestimentos utilizados são indicados. * A concentração inicial de Matrigel é variável, dependendo do lote.
Arquivo Suplementar. Clique aqui para baixar este arquivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O uso de iPSCs para modelagem de doenças e futura triagem de medicamentos, juntamente com sua possível aplicação em medicina de precisão, torna-a uma tecnologia de grande relevância e, por essa razão, acreditamos que é necessário entender claramente a condição de cultura in vitro que melhor se assemelha à situação fisiológica das células-tronco embrionárias. Neste contexto, testamos diferentes revestimentos de ECM usando iPSCs do tipo selvagem, a fim de entender as condições que permitem que as células permaneçam em um estado saudável e indiferenciado. Além disso, um ponto crítico é a cultura de iPSCs em componentes xenogênicos de MEFs e Matrigel que pode explicar a variabilidade experimental entre triplicados e isso dificulta a capacidade de realizar estudos mecanicistas26.
Neste estudo, testamos a confluência das iPSCs em substratos livres de xenogênicos (ou seja, LN-521, Vitronectina, Hu-Fibronectina) usando um citômetro analisador de imagem de alto conteúdo. A razão para o uso do sistema automatizado de análise de imagens é devido ao fato de que a contagem de células, usando o método de exclusão azul de tripano, exigiria fazer suspensões de célula única e isso não é recomendado ao manipular iPSCs, pois elas devem ser propagadas em aglomerados de células para evitar a morte celular. Os dados obtidos com a análise de imagem de alto conteúdo nos permitem acompanhar a confluência celular sem perturbar as células, pois elas são simplesmente fotografadas todos os dias durante 5 dias. Essa tecnologia pode ser considerada como o método de eleição para caracterizar as linhas de iPSC e pode ser incluída para a realização de painéis de controle de qualidade de iPSCs humanas. Embora tenhamos usado um pacote de software comercial, a metodologia aqui descrita pode ser usada com sucesso por meio de plataformas equivalentes de análise de imagens de alto conteúdo/alto rendimento e pacotes de software analíticos semelhantes. Os dados obtidos mostram que as iPSCs semeadas no LN-521 apresentam confluência linear durante 5 dias em cultura sem divisão das células e, portanto, é o melhor substrato livre de xenogênicos testado neste estudo. Uma limitação deste protocolo é que os resultados obtidos precisam ser normalizados para o primeiro ponto de tempo, a fim de considerar diferenças na fixação de iPSC a diferentes substratos. Curiosamente, os dados obtidos são provavelmente impulsionados por um aumento da taxa de ligação celular de iPSCs para LN-521. De fato, ao normalizar os resultados pela primeira vez, nenhuma diferença é observada entre os diferentes substratos.
Com base nos resultados obtidos com o estudo, seria interessante compreender melhor a biologia das células-tronco pluripotentes em termos de conhecimento dos principais receptores de superfície celular que medeiam os contatos célula-MEC e que podem ser responsáveis pela manutenção de sua capacidade de auto-renovação, em vez da diferenciação espontânea em tipos específicos de células. Curiosamente, existem estudos mostrando que a elasticidade da matriz da superfície de cultura influenciou a diferenciação em direção a diferentes tipos de células e isso provavelmente depende das interações célula-ECM que ativaram alguma via intracelular de sinalização celular relevante para a diferenciação específica do tipo celular27. Além disso, Vigilante et al.28 exploraram a contribuição genética para mudanças no comportamento da iPSC, combinando abordagens computacionais com conjuntos de dados de expressão gênica e biologia celular. O trabalho de Vigilante et al.28 é, portanto, um grande avanço na tentativa de mapear a variação genética para a variação fenotípica. Esses estudos podem levar ao desenvolvimento de metodologias padronizadas a serem utilizadas para a realização de experimentos de iPSCs à luz de seu possível uso futuro em clínicas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
O estudo foi apoiado por bolsas da Fondazione Bambino Gesù e Ricerca Corrente (Ministério da Saúde italiano) para C.C. Gostaríamos de agradecer ao Dr. Enrico Bertini (Departamento de Neurociência, Unidade de Doenças Neuromusculares e Neurodegenerativas, Laboratório de Medicina Molecular, Hospital de Pesquisa Infantil Bambino Gesù), Dra. Stefania Petrini (Centro de Núcleo de Microscopia Confocal, Laboratórios de Pesquisa, Hospital de Pesquisa Infantil Bambino Gesù), Giulia Pericoli (Departamento de Onco-hematologia, Terapia Genética e Celular, Hospital de Pesquisa Infantil Bambino Gesù) e Roberta Ferretti (Departamento de Onco-hematologia, Terapia Gênica e Celular, Hospital de Pesquisa Infantil Bambino Gesù) para discussões científicas e ajuda técnica. Maria Vinci é beneficiária de uma "bolsa Children with Cancer UK".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, Sterile | Corning | 4488 | Tool |
| 15 mL high-clarity polypropylene (PP) conical centrifuge tubes | Falcon | 352097 | Tool |
| 1x PBS (With Ca2+; Mg2+) | Thermofisher | 14040133 | Medium |
| 1x PBS (without Ca2+; Mg2+) | Euroclone | ECB4004L | Medium |
| 5 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, Sterile | Corning | 4487 | Tool |
| Cell culture microplate, 96 WELL, PS, F-Bottom | Greiner Bio One | 655090 | Support |
| Cell culture plate, 6 well | Costar | 3516 | Support |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium- high glucose) | Sigma | D5671 | Medium |
| EDTA | Sigma | ED4SS-500g | Reagent |
| Epi Episomal iPSC Reprogramming Kit | Invitrogen | A15960 | Reagent |
| FAST - READ 102 | Biosigma | BVS100 | Tool |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270106 | Medium |
| Fibronectin | Merck | FC010 | Coating |
| Glycerol | Sigma | G5516 | Reagent |
| H2O | MILLIQ | ||
| Hoechst | Thermofisher | 33342 | Reagent |
| Laminin 521 | Stem Cell Technologies | 77003 | Coating |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | LS25030081 | Reagent |
| Matrigel | Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | 354277 | Coating |
| Mouse embryonic fibroblasts (MEF) | Life Technologies | A24903 | Coating |
| MTESR1 Medium | Stem Cell Technologies | 85851 | Medium |
| MTESR1 Supplement | Stem Cell Technologies | 85852 | Medium |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | Reagent |
| Phalloidin | Sigma | P1951 | Reagent |
| Vitronectin | Stem Cell Technologies | 7180 | Coating |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | Reagent |
References
- Masotti, A., et al. Aged iPSCs display an uncommon mitochondrial appearance and fail to undergo in vitro neurogenesis. Aging (Albany NY). 6 (12), 1094-1108 (2014).
- Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).
- Kleinman, H. K., et al. Isolation and characterization of type IV procollagen, laminin, and heparan sulfate proteoglycan from the EHS sarcoma. Biochemistry. 21 (24), 6188-6193 (1982).
- Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nature Communications. 5, 3195 (2014).
- Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521 based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nature Protocols. 9 (10), 2354-2368 (2014).
- Laperle, A., et al. α-5 Laminin Synthesized by Human Pluripotent Stem Cells Promotes Self-Renewal. Stem Cell Reports. 5 (2), 195-206 (2015).
- Albalushi, H., et al. Laminin 521 stabilizes the pluripotency expression pattern of human embryonic stem cells initially derived on feeder cells. Stem Cell International. 2018, 7127042 (2018).
- Zhang, D., et al. Niche-derived laminin-511 promotes midbrain dopaminergic neuron survival and differentiation through YAP. Science Signaling. 10 (493), (2017).
- Lu, H. F., et al. A defined xeno-free and feeder-free culture system for the derivation, expansion and direct differentiation of transgene-free patient-specific induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (9), 2816-2826 (2015).
- Miyazaki, T., Nakatsuji, N., Suemori, H. Optimization of slow cooling cryopreservation for human pluripotent stem cells. Genesis. 52 (1), 49-55 (2014).
- Bergström, R., Ström, S., Holm, F., Feki, A., Hovatta, O. Xeno-free culture of human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 767, 125-136 (2011).
- Braam, S. R., et al. Recombinant vitronectin is a functionally defined substrate that supports human embryonic stem cell self-renewal via alphavbeta5 integrin. Stem Cells. 26 (9), 2257-2265 (2008).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2008).
- Li, J., et al. Impact of vitronectin concentration and surface properties on the stable propagation of human embryonic stem cells. Biointerphases. 5 (3), 132-142 (2010).
- Prowse, A. B., et al. Long-term culture of human embryonic stem cells on recombinant vitronectin in ascorbate free media. Biomaterials. 31 (32), 8281-8288 (2010).
- Rowland, T. J., et al. Roles of integrins in human induced pluripotent stem cell growth on Matrigel and vitronectin. Stem Cells and Development. 19 (8), 1231-1240 (2010).
- Ruoslahti, E., Engvall, E., Hayman, E. G., Spiro, R. G. Comparative studies on amniotic fluid and plasma fibronectins. Biochemistry. 193 (1), 295-299 (1981).
- Ni, H., Li, A., Simonsen, N., Wilkins, J. A. Integrin activation by dithiothreitol or Mn2+ induces a ligand-occupied conformation and exposure of a novel NH2-terminal regulatory site on the beta1 integrin chain. Biological Chemistry. 273 (14), 7981-7987 (1998).
- Seltana, A., Basora, N., Beaulieu, J. F. Intestinal epithelial wound healing assay in an epithelial-mesenchymal co-culture system. Wound Repair & Regeneration. 18 (1), 114-122 (2010).
- Amit, M., Shariki, C., Margulets, V., Itskovitz-Eldor, J. Feeder layer-and serum-free culture of human embryonic stem cells. Biology of Reproduction. 70 (3), 837-845 (2004).
- Vaheri, A., Mosher, D. F. High molecular weight, cell surface-associated glyco-protein (fibronectin) lost in malignant transformation. Biochimica et Biophysica Acta. 516 (1), 1-25 (1978).
- Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. Fibronectin fibrillogenesis, a cell-mediated matrix assembly process. Matrix Biology. 24 (6), 389-399 (2005).
- Polyak, K., Weinberg, R. A. Transitions between epithelial and mesenchymal states: acquisition of malignant and stem cell traits. Nature Reviews Cancer. 9 (4), 265-273 (2009).
- Kadler, K. E., Hill, A., Canty-Laird, E. G. Collagen fibrillogenesis: fibronectin, integrins, and minor collagens as organizers and nucleators. Current Opinion in Cell Biology. 20 (5), 495-501 (2008).
- Hunt, G. C., Schwarzbauer, J. E. Tightening the connections between cadherins and fibronectin matrix. Developmental Cell. 16 (3), 327-328 (2009).
- Villa-Diaz, L. G., Ross, A. M., Lahann, J., Krebsbach, P. H. Concise review: The evolution of human pluripotent stem cell culture: from feeder cells to synthetic coatings. Stem Cells. 31 (1), 1-7 (2013).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Vigilante, A., et al. Identifying Extrinsic versus Intrinsic Drivers of Variation in Cell Behavior in Human iPSC Lines from Healthy Donors. Cell Reports. 26 (8), 2078-2087 (2019).
