Summary

Medición de la confluencia de iPSCs utilizando un sistema automatizado de imágenes.

Published: June 10, 2020
doi:

Summary

El objetivo del protocolo es comparar diferentes condiciones de recubrimiento de matriz extracelular (ECM) para evaluar cómo el recubrimiento diferencial afecta la tasa de crecimiento de las células madre pluripotentes inducidas (iPSC). En particular, nuestro objetivo es establecer las condiciones para obtener un crecimiento óptimo de los cultivos iPSC.

Abstract

Este estudio se centra en comprender cómo el cultivo de iPSC en diferentes sustratos de recubrimiento ECM puede afectar la confluencia celular. Se ha establecido un protocolo para evaluar la confluencia de iPSC en tiempo real sin necesidad de contar células en suspensión unicelular para evitar cualquier perturbación del crecimiento. Se utilizó un sistema de análisis de imágenes de alto contenido para evaluar la confluencia de iPCS en 4 ECM diferentes a lo largo del tiempo de manera automatizada. Se utilizaron diferentes entornos de análisis para evaluar la confluencia celular de las iPSCs adherentes y solo se observó una ligera diferencia (a las 24 y 48 horas con laminina) si se aplicó una máscara al 60, 80 o 100%. También mostramos que la laminina conduce a la mejor confluencia en comparación con Matrigel, vitronectina y fibronectina.

Introduction

Las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) se obtienen de células somáticas y se pueden diferenciar en diferentes tipos de células. A menudo se utilizan como un sistema para modelar la patogénesis de la enfermedad o realizar la detección de drogas, y también ofrecen el potencial de ser utilizados en el contexto de la medicina personalizada. Dado que las iPSC tienen un gran potencial, es importante caracterizarlas completamente para su uso como un sistema modelo confiable. Anteriormente mostramos la importancia de cultivar iPSCs en un ambiente hipóxico, ya que estas células dependen de la glucólisis y un ambiente aeróbico puede causar desequilibrio redox1. Las iPSC también son vulnerables a otras condiciones de cultivo, particularmente al entorno extracelular. La optimización de las condiciones de cultivo es un tema clave para mantenerlas sanas y proliferantes. Un cultivo saludable de iPSC conducirá a células sanas diferenciadas que generalmente son el punto final del modelo utilizado para comprender las características moleculares, celulares y funcionales de trastornos humanos específicos o procesos celulares.

En este estudio, se ha utilizado un protocolo simple para probar la confluencia de iPSCs utilizando diferentes condiciones de recubrimiento en pozos separados. Las iPSC requieren una capa alimentadora de fibroblastos embrionarios murinos (MEF) para adherirse correctamente, pero la coexistencia de iPSCs y MEF dificulta la realización de análisis como ARN o extracción de proteínas, ya que hay dos poblaciones de células. Para evitar la capa de alimentación, se han utilizado diferentes proteínas pertenecientes a la matriz extracelular (ECM) para recrear el nicho celular natural y tener un cultivo de iPSC libre de alimentador. En particular, Matrigel es una preparación solubilizada de membrana basal extraída del sarcoma de ratón Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), que está enriquecida en proteínas de la matriz extracelular (es decir, laminina, colágeno IV, proteoglicanos de heparán sulfato, entactina/nidógeno y factores de crecimiento)2,3. Las otras condiciones de recubrimiento utilizadas son, en cambio, proteínas purificadas con relevancia conocida en la construcción de las ECM: se sabe que la laminina-521 es secretada por células madre pluripotentes humanas (hPSC) en la masa celular interna del embrión y es una de las lamininas más comunes en el cuerpo después del nacimiento 4,5,6,7,8,9, 10,11; la vitronectina es una matriz de cultivo celular libre de xeno-conocida por apoyar el crecimiento y la diferenciación de hPSC 12,13,14,15,16; La fibronectina es una proteína ECM importante para el desarrollo de vertebrados y la unión y mantenimiento de células madre embrionarias en estado pluripotente 17,18,19,20,21,22,23,24,25. Dado que existen diferentes condiciones de recubrimiento, las comparamos en términos de su efecto sobre la confluencia de las iPSC.

Protocol

1. Recubrimiento de placas de 96 pozos NOTA: Se probaron diferentes recubrimientos en la misma placa pero en pocillos separados (consulte el Archivo suplementario). Diluir el Matrigel 1:100 en DMEM. Añadir 100 μL por pocillo a las placas de 96 pocillos e incubar durante 1 h a temperatura ambiente. Después de esto, retire la solución y lave los pocillos con 100 μL de DMEM dos veces. Laminina diluida (20 μg/mL, LN-521) en PBS (con calcio y magnesio). A?…

Representative Results

En este estudio, investigamos la confluencia de iPSCs cuando se cultivan en diferentes condiciones de recubrimiento. Usando un citómetro, pudimos obtener resultados fácilmente informativos en triplicados en 5 días. Dado que las iPSC apenas se adhieren a recipientes de plástico y es necesario un recubrimiento para apoyar su proliferación, decidimos monitorear la confluencia de iPSCs humanas, ya que es indicativo de la salud del cultivo celular y puede reflejar su potencial de diferenciación. Después de la expansió…

Discussion

El uso de iPSCs para el modelado de enfermedades y el futuro cribado de fármacos junto con su posible aplicación en medicina de precisión lo convierte en una tecnología de gran relevancia y por esta razón creemos que es necesario entender claramente la condición de cultivo in vitro que mejor se asemeja a la situación fisiológica de las células madre embrionarias. En este contexto, probamos diferentes recubrimientos ECM utilizando iPSC de tipo salvaje para comprender las condiciones que permiten que las células …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

El estudio fue apoyado por subvenciones de la Fondazione Bambino Gesù y Ricerca Corrente (Ministerio de Salud italiano) a C.C.  Nos gustaría agradecer al Dr. Enrico Bertini (Departamento de Neurociencia, Unidad de Enfermedades Neuromusculares y Neurodegenerativas, Laboratorio de Medicina Molecular, Hospital de Investigación Infantil Bambino Gesù), Dr. Stefania Petrini (Centro Central de Microscopía Confocal, Laboratorios de Investigación, Hospital de Investigación Infantil Bambino Gesù), Giulia Pericoli (Departamento de Oncohematología, Terapia Génica y Celular, Hospital de Investigación Infantil Bambino Gesù) y Roberta Ferretti (Departamento de Oncohematología, Terapia Génica y Celular, Hospital de Investigación Infantil Bambino Gesù) para discusiones científicas y ayuda técnica. Maria Vinci recibió una “beca para niños con cáncer del Reino Unido”.

Materials

10 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, Sterile Corning 4488 Tool
15 mL high-clarity polypropylene (PP) conical centrifuge tubes Falcon 352097 Tool
1x PBS (With Ca2+; Mg2+) Thermofisher 14040133 Medium
1x PBS (without Ca2+; Mg2+) Euroclone ECB4004L Medium
5 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, Sterile Corning 4487 Tool
Cell culture microplate, 96 WELL, PS, F-Bottom Greiner Bio One 655090 Support
Cell culture plate, 6 well Costar 3516 Support
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium- high glucose) Sigma D5671 Medium
EDTA Sigma ED4SS-500g Reagent
Epi Episomal iPSC Reprogramming Kit Invitrogen A15960 Reagent
FAST – READ 102 Biosigma BVS100 Tool
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 10270106 Medium
Fibronectin Merck FC010 Coating
Glycerol Sigma G5516 Reagent
H2O MILLIQ
Hoechst Thermofisher 33342 Reagent
Laminin 521 Stem Cell Technologies 77003 Coating
L-Glutamine (200 mM) Gibco LS25030081 Reagent
Matrigel Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix 354277 Coating
Mouse embryonic fibroblasts (MEF) Life Technologies A24903 Coating
MTESR1 Medium Stem Cell Technologies 85851 Medium
MTESR1 Supplement Stem Cell Technologies 85852 Medium
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140122 Reagent
Phalloidin Sigma P1951 Reagent
Vitronectin Stem Cell Technologies 7180 Coating
Y-27632 Sigma Y0503 Reagent

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Cite This Article
Magliocca, V., Vinci, M., Persichini, T., Locatelli, F., Tartaglia, M., Compagnucci, C. Measuring the Confluence of iPSCs Using an Automated Imaging System. J. Vis. Exp. (160), e61225, doi:10.3791/61225 (2020).

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