Summary
Das Ziel des Protokolls ist es, verschiedene extrazelluläre Matrix-Beschichtungsbedingungen (ECM) zu vergleichen, um zu beurteilen, wie sich eine differentielle Beschichtung auf die Wachstumsrate von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) auswirkt. Insbesondere wollen wir Bedingungen schaffen, um ein optimales Wachstum von iPSC-Kulturen zu erreichen.
Abstract
Diese Studie konzentriert sich auf das Verständnis, wie wachsende iPS-Zellen auf verschiedenen ECM-Beschichtungssubstraten die Zellkonfluenz beeinflussen können. Es wurde ein Protokoll zur Bewertung der iPSC-Konfluenz in Echtzeit erstellt, ohne dass Zellen in Einzelzellsuspension gezählt werden müssen, um Wachstumsstörungen zu vermeiden. Ein High-Content-Bildanalysesystem wurde verwendet, um die iPCS-Konfluenz auf 4 verschiedenen ECMs im Laufe der Zeit automatisiert zu bewerten. Verschiedene Analyseeinstellungen wurden verwendet, um die Zellkonfluenz von adhärenten iPS-Zellen zu beurteilen, und es wurde nur ein geringer Unterschied (nach 24 und 48 Stunden mit Laminin) beobachtet, ob eine 60-, 80- oder 100%-Maske angewendet wurde. Wir zeigen auch, dass Laminin im Vergleich zu Matrigel, Vitronektin und Fibronektin zum besten Zusammenfluss führt.
Introduction
Induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) werden aus somatischen Zellen gewonnen und können in verschiedene Zelltypen differenziert werden. Sie werden oft als System zur Modellierung der Krankheitspathogenese oder zur Durchführung von Medikamentenscreenings eingesetzt und bieten auch das Potenzial, im Kontext der personalisierten Medizin eingesetzt zu werden. Da iPSCs ein großes Potenzial haben, ist es wichtig, sie für den Einsatz als zuverlässiges Modellsystem vollständig zu charakterisieren. Wir haben bereits gezeigt, wie wichtig es ist, iPS-Zellen in einer hypoxischen Umgebung zu züchten, da diese Zellen auf Glykolyse angewiesen sind und eine aerobe Umgebung ein Redoxungleichgewicht verursachen kann1. iPSCs sind auch anfällig für andere Kulturbedingungen, insbesondere die extrazelluläre Umgebung. Die Optimierung der Kulturbedingungen ist ein Schlüsselthema, um sie gesund zu halten und zu vermehren. Eine gesunde iPSC-Kultur führt zu gesunden, differenzierten Zellen, die im Allgemeinen der Endpunkt des Modells sind, das zum Verständnis molekularer, zellulärer und funktioneller Merkmale spezifischer menschlicher Störungen oder zellulärer Prozesse verwendet wird.
In dieser Studie wurde ein einfaches Protokoll verwendet, um den Zusammenfluss von iPSCs unter Verwendung verschiedener Beschichtungsbedingungen in separaten Vertiefungen zu testen. iPSCs benötigen eine Feederschicht von murinen embryonalen Fibroblasten (MEF), um richtig zu binden, aber die Koexistenz von iPSCs und MEF macht es schwierig, Analysen wie RNA- oder Proteinextraktion durchzuführen, da zwei Zellpopulationen vorhanden sind. Um die Feederschicht zu vermeiden, wurden verschiedene Proteine der extrazellulären Matrix (ECM) verwendet, um die natürliche Zellnische nachzubilden und eine feederfreie iPSC-Kultur zu haben. Insbesondere ist Matrigel ein lösliches Basalmembranpräparat, das aus dem Engelbreth-Holm-Swarm (EHS)-Maussarkom extrahiert wird und mit extrazellulären Matrixproteinen (d. h. Laminin, Kollagen IV, Heparansulfat-Proteoglykanen, Entactin/Nidogen und Wachstumsfaktoren) angereichert ist2,3. Die anderen verwendeten Beschichtungsbedingungen sind stattdessen gereinigte Proteine mit bekannter Relevanz für den Aufbau der ECMs: Laminin-521 ist dafür bekannt, von humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) in der inneren Zellmasse des Embryos sezerniert zu werden, und es ist eines der häufigsten Lamininine im Körper nach der Geburt 4,5,6,7,8,9, 10,11; vitronectin ist eine xenofreie Zellkulturmatrix, von der bekannt ist, dass sie das Wachstum und die Differenzierung von hPSC 12,13,14,15,16 unterstützt; Fibronektin ist ein ECM-Protein, das für die Entwicklung von Wirbeltieren und die Anheftung und Erhaltung embryonaler Stammzellen in einem pluripotenten Zustand wichtig ist 17,18,19,20,21,22,23,24,25. Da unterschiedliche Beschichtungsbedingungen zur Verfügung stehen, vergleichen wir sie hinsichtlich ihrer Wirkung auf den Zusammenfluss von iPSCs.
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Protocol
1. Beschichtung von 96 Well-Platten
HINWEIS: Verschiedene Beschichtungen wurden in derselben Platte, aber separaten Vertiefungen getestet (siehe Zusatzdatei).
- Verdünnen Sie das Matrigel 1:100 in DMEM. 100 μL pro Vertiefung in die 96 Wellplatten geben und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. Entfernen Sie anschließend die Lösung und waschen Sie die Vertiefungen zweimal mit 100 μL DMEM.
- Verdünnen Sie Laminin (20 μg/ml, LN-521) in PBS (mit Calcium und Magnesium). 100 μL in die Vertiefung geben und bei 4 °C über Nacht inkubieren. Am nächsten Tag führen Sie zwei Wäschen mit DMEM durch, bevor Sie die Zellen säen.
- Verdünntes Invitronektin (10 μg/ml) in Verdünnungspuffer. 100 μL pro Vertiefung in die 96-Well-Platte geben und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Waschen Sie die Vertiefungen mit PBS (ohne Kalzium und Magnesium), bevor Sie die Zellen plattieren.
- HU-Fibronektin (30 μg/ml) inddH2Overdünnen. 100 μL in die Vertiefungen geben und 45 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Anschließend waschen Sie die Vertiefungen mit dem Medium, bevor Sie die Zellen säen.
2. Aufrechterhaltung von iPSC in Kultur
HINWEIS: iPSCs wurden kommerziell erworben. Die iPS-Zellen wurden aus gesunden menschlichen Fibroblasten gewonnen und mittels episomaler Technologie umprogrammiert.
- Aus dem -80 °C Gefrierschrank oder flüssigem Stickstoff die kryokonservierten iPSCs in einem 37 °C warmen Wasserbad auftauen. Reinigen Sie die Durchstechflasche mit den Zellen mit 70% Ethanol, bevor Sie sie in die biologische Sicherheitswerkbank bringen.
- Geben Sie die Zellsuspension in 5 mL vorgewärmtes Zellkulturmedium (z. B. mTeSR1) Tropfen für Tropfen mit einer 1000 μL Pipette in einem 15 ml sterilen konischen Röhrchen.
- Zentrifugieren Sie die Zellen bei 304 x g für 5 min bei Raumtemperatur (RT).
- Entfernen Sie das Medium und resuspendieren Sie das Zellpellet in 4 ml Zellkulturmedium.
- Die Zellsuspension wird in zwei Vertiefungen der 6 Wellplatten (105 iPSCs pro 6-Well-Zellkulturschale) gegeben, wo die embryonalen Fibroblasten (MEFs) der Maus zuvor plattiert wurden. Seed MEFs zwei Tage vor der Beschichtung von iPSCs mit einer Dichte von 2,4 x 104/cm2 in DMEM (enthält 10% Fetal Bovine Serum, 1% L-Glutamin und 1% Penicillin-Streptomycin).
- Nach der Aussaat ergänzen Sie die Zellmedien mit 10 μM ROCK-Inhibitor Y-27632.
- Züchten Sie die iPSCs auf MEFs für die ersten 4-5 Wochen und dann in dosierfreiem Zustand (MEF-freier Zustand), wobei eine der interessierenden Beschichtungen (siehe Schritt 1 und Tabelle 1) in mTeSR1 verwendet wird.
- Wenn die iPSCs zu 70-80% konfluent sind, Durchgang 1:4 mit 0,5 mM EDTA-Behandlung für 3-5 min bei RT. Fügen Sie 1 ml 0,5 mM EDTA für eine 6-Well-Platte (oder proportionale Mengen für andere Arten von Platten) hinzu. Überführung in neue Bohrlöcher unter feederfreien Bedingungen und Inkubation bei 37 °C, 5% CO2, 20%O2.
- Wechseln Sie die Medien täglich mit frischem mTeSR1 und teilen Sie die Zellen alle 2 Tage.
3. Charakterisierung der Zellkonfluenz
- Verwenden Sie 96 Well-Platten für die Experimente.
- Aussaat von 10.000 Zellen pro Vertiefung nach mindestens 1 Monat Kultivierung in feederfreiem Zustand, um sicher zu sein, dass die MEFs nicht passiert wurden. Verwenden Sie Einweg-Zählobjektträger, um die Zellen mit dem Lichtmikroskop zu zählen.
- Führen Sie die Experimente in dreifacher Ausführung durch. Testen Sie daher jede Aussaatbedingung in drei Vertiefungen.
- Führen Sie eine automatisierte Bildaufnahme ab Tag 1 nach der Aussaat mit einem Zytometer im Hellfeldmodus durch. Führen Sie eine automatisierte Bildaufnahme alle 24 Stunden für 5 Tage durch. Ausführliche Informationen zu den experimentellen Parametern finden Sie in der Zusatzdatei.
- Verwenden Sie Autokontrast und Autobelichtung, um Zellen besser sichtbar zu machen.
- Legen Sie die Analyseeinstellung (siehe Zusatzdatei) für die Konfluenzanalyse so fest, dass eine Maske von 60%, 80% und 100% pro Vertiefung angewendet wird, um die Fokusänderungen aufgrund der Lichtbrechung am Rand der Vertiefungen zu bewerten. Verwenden Sie die oben erwähnte andere Maskenanalyseeinstellung, um den Zellzusammenfluss zu jedem Zeitpunkt zu analysieren.
4. Statistische Analysen
- Geben Sie quantitative Ergebnisse als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) an.
- Um die Gesamtunterschiede der verschiedenen Beschichtungsbedingungen zu vergleichen, erhalten Sie Daten mit denselben Proben und führen Sie den Paired-Sample-t-Test des Studenten durch. P-Werte kleiner als 0,05 gelten als statistisch signifikant, und alle gemeldeten p-Werte sind zweiseitig.
5. Charakterisierung der Mikrofilamente des Zytoskeletts
- Fixieren Sie Zellen mit 4% Paraformaldehyd (4% PFA) in PBS für 10 min bei RT, gefolgt von zwei Wäschen in PBS (10 min insgesamt).
- 100 μL Blockierlösung (bestehend aus 5% BSA, 0,1% Triton in PBS) für 1 h RT in jede Vertiefung geben.
- Entfernen Sie die Blockierlösung und waschen Sie die Proben zweimal mit PBS für 10 min.
- 100 μL der Phalloidin-konjugierten Arbeitslösung pro Probe zugeben und 1 h bei RT inkubieren.
- Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS (10 min bei RT).
- Färbekerne mit Hoechst 33342 verdünnt 1:10000 in PBS für 10 min bei RT.
- Entfernen Sie die Hoechst-Lösung und waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS für jeweils 10 Minuten.
- Die Probe mitH2Owaschen und unter einer chemischen Haube trocknen lassen.
- Fügen Sie 100 μL Montagemedien (z. B. PBS: Glycerin, 1: 1) hinzu, um die Zellen abzudecken und die Fluoreszenz der Proben zu erhalten.
- Beobachten Sie die Zelle bei Ex/Em 493/517 nm auf einem konfokalen Laserscanning-Mikroskop, das mit einer Weißlichtlaserquelle (WLL) und einem 405-nm-Diodenlaser ausgestattet ist. Nehmen Sie sequenzielle konfokale Bilder mit einem HC PLAPO 40x Ölimmersionsobjektiv auf. Verwenden Sie die gleiche Laserleistung, Strahlteiler, Filtereinstellungen, Pinhole-Durchmesser und Scan-Modus für alle untersuchten Proben.
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Representative Results
In dieser Studie untersuchten wir den Zusammenfluss von iPSCs, wenn er unter verschiedenen Beschichtungsbedingungen gezüchtet wurde. Mit einem Zytometer konnten wir in 5 Tagen leicht aussagekräftige Ergebnisse in dreifacher Ausfertigung erhalten. Da iPSCs kaum an Kunststoffgefäßen haften und eine Beschichtung notwendig ist, um ihre Proliferation zu unterstützen, haben wir uns entschieden, den Zusammenfluss von humanen iPSCs zu überwachen, da dies auf die Gesundheit der Zellkultur hinweist und ihr Differenzierungspotenzial widerspiegeln kann. Nach der In-vitro-Expansion säten wir die iPSCs auf verschiedenen ECM-Substraten und analysierten Zellen durch Beobachtung der im Hellfeld aufgenommenen Probenbilder und unter Verwendung von Phalloidin-Färbung (zur Färbung von Aktinfilamenten, auch bekannt als F-Actin), um deren Adhäsion an den Gefäßen zu verstehen (Abbildung 1). Tatsächlich ermöglicht die Phalloidinfärbung die Visualisierung des Grades der Zelladhäsion an der Oberfläche des Gefäßes und damit an die spezifische Beschichtung, die für das Gefäß verwendet wird. Zellen, die an der Beschichtung haften, zeigten deutlich sichtbare Mikrofilamente des Zytoskeletts anstelle von kollabierten Mikrofilamenten. Die Beobachtung des Hellfeldes in Kombination mit der Phalloidin-Färbung dokumentiert eine gute Haftung der iPSCs auf der beschichteten Oberfläche.
Um den Zusammenfluss zu untersuchen, säten wir die iPSCs mit Matrigel, LN-521, Vitronektin und Hu-Fibronektin in dreifacher Ausfertigung und führten das Experiment dreimal durch. Um die Lichtbrechung aufgrund des Rand des Brunnens zu vermeiden, haben wir drei Arten von Analyseeinstellungen mit einer Maske von 60, 80 und 100% angewendet und beobachtet, dass sie bei der Auswahl der Zellen und der Vermeidung des Hintergrunds ähnlich sind (Abbildung 2). Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass iPSCs, die auf LN-521 gesät wurden, im Vergleich zu den anderen Beschichtungen eine hohe Zellproliferation in linearer Weise aufweisen und dass diese Unterschiede statistisch signifikant sind (Sternchen in Abbildung 3A-C). Zellen, die auf Matrigel, Vitronectin oder Hu-Fibronektin ausgesät wurden, zeigen eine lineare Proliferationsrate in den ersten 96 Stunden, aber sie zeigen auch eine erhöhte Steigung der Konfluenzkurve in den letzten 24 Stunden (unabhängig von der verwendeten Maske 60%, 80% oder 100%, Abbildung 3A-C). Da die anfängliche Differenz bei 24 h für die verschiedenen Beschichtungen auf Unterschiede in der Zellbindung zurückzuführen sein kann, wurde das Zellwachstum für die späteren Zeitpunkte (von 48 auf 120 h) auf 24 h normalisiert (Abbildung 3D-F). Die Grafiken, die mit der 60-, 80- und 100%-Maske erhalten wurden, zeigen, dass keine Unterschiede in Bezug auf die Konfluenz zwischen den verschiedenen Beschichtungen bestehen und dass die mit LN-521 beobachteten Unterschiede höchstwahrscheinlich auf eine erhöhte Fähigkeit der iPSCs zurückzuführen sind, beim Durchgang an dieser Beschichtung zu haften.
Abbildung 1. Repräsentative Hellfeldbilder und Phalloidin-Färbung von iPSCs, die nach 3 Tagen auf verschiedenen ECM-Beschichtungen ausgesät wurden. Hellfeldbilder, die zeigen, dass die Zellen auf der verwendeten Beschichtung gesund sind und dass sie gut an den Gefäßen befestigt sind, wie durch die Phalloidin-Färbung dokumentiert, die deutlich sichtbare Mikrofilamente des Zytoskeletts zeigen. Maßstabsleiste: 25 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2. Repräsentative Hellfeldbilder zeigen drei verschiedene Analyseeinstellungen für die Masken, die zur Durchführung von Konfluenzanalysen verwendet werden. Mosaik aufgenommen mit einem Zytometer unter Verwendung von Hellfeldbildern (16 Bilder/Vertiefung von einer 96-Well-Platte). In Grün zeigt die Analysesegmentierung deutlich die verschiedenen Masken, die angewendet wurden (60, 80 100%), um den runden Rand des Bohrlochs zu vermeiden oder einzubeziehen. Maßstabsleiste: 500 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3. Zellkonfluenzanalyse von iPS-Gefäßen, die auf unterschiedlich beschichteten Gefäßen ausgesät wurden. Graph, die den Zellzusammenfluss von iPSCs darstellt, die auf unterschiedlich beschichteten Gefäßen ausgesät sind. Die Daten wurden nach der Erfassung mit der entsprechenden Software unter Verwendung einer (A) 60% Maske (B) 80% (C) 100% für 5 Tage (120 h) analysiert. Die Normalisierung des Zusammenflusses der 48 h bis 120 h Zeitpunkte zum ersten Zeitpunkt (24 h) ist in (D, E, F) dargestellt. Die Daten stammen aus drei unabhängigen Experimenten. Die Daten werden als Mittelwert ± REM dargestellt. n= 3 * p<0,05. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Beschichtungsmasse | Anfängliche Konzentration | Endkonzentration |
| HU-Fibronektin | 1 mg/ml | 10 μg/cm2 |
| Laminin 521 | 100 μg/ml | 20 μg/ml |
| Matrigel | * | 0.111111111 |
| Vitronectin XF | 250 μg/ml | 10 μg/ml |
Tabelle 1. Liste der Beschichtungsverbindungen, die zur Analyse des Zusammenflusses verwendet werden. Die Bezeichnung, die Anfangs- und Endkonzentration der verschiedenen verwendeten Beschichtungen werden angegeben. * Die Anfangskonzentration von Matrigel ist je nach Charge variabel.
Ergänzende Datei. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Die Verwendung von iPS-Zellen für die Krankheitsmodellierung und das zukünftige Arzneimittelscreening zusammen mit ihrer möglichen Anwendung in der Präzisionsmedizin macht sie zu einer Technologie von großer Relevanz, und aus diesem Grund glauben wir, dass es notwendig ist, die In-vitro-Kultivierungsbedingungen klar zu verstehen, die der physiologischen Situation embryonaler Stammzellen besser ähneln. In diesem Zusammenhang haben wir verschiedene ECM-Beschichtungen mit Wildtyp-iPSCs getestet, um die Bedingungen zu verstehen, die es den Zellen ermöglichen, in einem gesunden und undifferenzierten Zustand zu bleiben. Darüber hinaus ist ein kritischer Punkt die Kultivierung von iPS-Zellen in xenogenen Komponenten von MEFs und Matrigel, die für die experimentelle Variabilität zwischen Triplikaten verantwortlich sein kann und die Fähigkeit zur Durchführung mechanistischer Studien behindert26.
In dieser Studie testeten wir den Konfluenz der iPS-Zellen auf xenogenfreien Substraten (d.h. LN-521, Vitronectin, Hu-Fibronektin) mit einem High-Content-Bildanalysator-Zytometer. Der Grund für die Verwendung des automatisierten Bildanalysesystems liegt in der Tatsache, dass das Zählen von Zellen mit der Trypan-Blau-Ausschlussmethode die Herstellung von Einzelzellsuspensionen erfordern würde, was bei der Manipulation von iPS-Zellen nicht empfohlen wird, da sie in Zellclustern vermehrt werden sollten, um den Zelltod zu vermeiden. Die mit der High-Content-Bildanalyse erhaltenen Daten ermöglichen es uns, den Zellzusammenfluss zu verfolgen, ohne die Zellen zu stören, da sie einfach jeden Tag für 5 Tage abgebildet werden. Diese Technologie kann als Wahlmethode zur Charakterisierung von iPSC-Linien betrachtet werden und kann zur Durchführung von Qualitätskontrollpanels für menschliche iPSCs verwendet werden. Während wir ein kommerzielles Softwarepaket verwendet haben, kann die hier beschriebene Methodik mittels gleichwertiger High-Content/High-Throughput-Bildanalyseplattformen und ähnlicher analytischer Softwarepakete erfolgreich eingesetzt werden. Die erhaltenen Daten zeigen, dass die auf LN-521 gesäten iPS-Zellen während 5 Tagen in Kultur einen linearen Zusammenfluss aufweisen, ohne die Zellen zu spalten, und daher das beste xenogenfreie Substrat sind, das in dieser Studie getestet wurde. Eine Einschränkung dieses Protokolls besteht darin, dass die erzielten Ergebnisse auf den ersten Zeitpunkt normiert werden müssen, um Unterschiede in der iPSC-Bindung an verschiedene Substrate zu berücksichtigen. Interessanterweise werden die erhaltenen Daten höchstwahrscheinlich durch eine erhöhte Zellanheftungsrate von iPSCs an LN-521 angetrieben. Tatsächlich wird bei der Normalisierung der Ergebnisse für den ersten Zeitpunkt kein Unterschied zwischen den verschiedenen Substraten beobachtet.
Basierend auf den Ergebnissen der Studie wäre es interessant, die Biologie pluripotenter Stammzellen besser zu verstehen, indem man die wichtigsten Zelloberflächenrezeptoren kennt, die Zell-ECM-Kontakte vermitteln und die für die Aufrechterhaltung ihrer Selbsterneuerungsfähigkeit verantwortlich sein könnten, anstatt spontane Differenzierung in bestimmte Zelltypen. Interessanterweise gibt es Studien, die zeigen, dass die Matrixelastizität der Kulturoberfläche die Differenzierung in Richtung verschiedener Zelltypen beeinflusst, und dies hängt wahrscheinlich von den Zell-ECM-Interaktionen ab, die einen intrazellulären Zellsignalweg aktiviert haben, der für die zelltypspezifische Differenzierung relevant ist27. Darüber hinaus untersuchten Vigilante et al.28 den genetischen Beitrag zu Veränderungen im iPSC-Verhalten, indem sie computergestützte Ansätze mit Genexpressions- und zellbiologischen Datensätzen kombinierten. Die Arbeit von Vigilante et al.28 ist daher ein großer Fortschritt bei dem Versuch, genetische Variation auf phänotypische Variation abzubilden. Diese Studien können zur Entwicklung standardisierter Methoden führen, die zur Durchführung von iPS-Experimenten im Hinblick auf ihre zukünftige mögliche Verwendung in Kliniken verwendet werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Die Studie wurde durch Zuschüsse der Fondazione Bambino Gesù und Ricerca Corrente (italienisches Gesundheitsministerium) an C.C. Wir danken Dr. Enrico Bertini (Abteilung für Neurowissenschaften, Abteilung für neuromuskuläre und neurodegenerative Erkrankungen, Labor für Molekulare Medizin, Kinderforschungskrankenhaus Bambino Gesù), Dr. Stefania Petrini (Kerneinrichtung für Konfokale Mikroskopie, Forschungslabors, Kinderforschungskrankenhaus Bambino Gesù), Giulia Pericoli (Abteilung für Onkohämatologie, Gen- und Zelltherapie, Kinderforschungskrankenhaus Bambino Gesù) und Roberta Ferretti (Abteilung für Onkohämatologie, Gen- und Zelltherapie, Kinderforschungsklinik Bambino Gesù) für wissenschaftliche Diskussionen und technische Hilfe. Maria Vinci ist Empfängerin eines "Children with Cancer UK Fellowship".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, Sterile | Corning | 4488 | Tool |
| 15 mL high-clarity polypropylene (PP) conical centrifuge tubes | Falcon | 352097 | Tool |
| 1x PBS (With Ca2+; Mg2+) | Thermofisher | 14040133 | Medium |
| 1x PBS (without Ca2+; Mg2+) | Euroclone | ECB4004L | Medium |
| 5 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, Sterile | Corning | 4487 | Tool |
| Cell culture microplate, 96 WELL, PS, F-Bottom | Greiner Bio One | 655090 | Support |
| Cell culture plate, 6 well | Costar | 3516 | Support |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium- high glucose) | Sigma | D5671 | Medium |
| EDTA | Sigma | ED4SS-500g | Reagent |
| Epi Episomal iPSC Reprogramming Kit | Invitrogen | A15960 | Reagent |
| FAST - READ 102 | Biosigma | BVS100 | Tool |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270106 | Medium |
| Fibronectin | Merck | FC010 | Coating |
| Glycerol | Sigma | G5516 | Reagent |
| H2O | MILLIQ | ||
| Hoechst | Thermofisher | 33342 | Reagent |
| Laminin 521 | Stem Cell Technologies | 77003 | Coating |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | LS25030081 | Reagent |
| Matrigel | Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | 354277 | Coating |
| Mouse embryonic fibroblasts (MEF) | Life Technologies | A24903 | Coating |
| MTESR1 Medium | Stem Cell Technologies | 85851 | Medium |
| MTESR1 Supplement | Stem Cell Technologies | 85852 | Medium |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | Reagent |
| Phalloidin | Sigma | P1951 | Reagent |
| Vitronectin | Stem Cell Technologies | 7180 | Coating |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | Reagent |
References
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