使用微计算断层扫描（微CT）成像方法对太空飞行后全球眼结构进行评估

Summary

我们提出了一个使用高分辨率微计算断层成像的协议，以确定太空飞行是否对眼部结构造成损伤。该协议显示了外活鼠眼结构的 微CT 衍生测量。我们演示了使用非破坏性三维技术评估太空飞行后眼部形态变化的能力。

Abstract

报告显示，在国际空间站（ISS）任务期间和之后，长时间暴露在太空飞行环境中会给宇航员产生形态和功能性眼科变化。然而，这些空间飞行引起的变化的基本机制目前尚不得而知。本研究的目的是通过评估小鼠视网膜、视网膜色素上皮（RPE）、胆管和丝状层使用微CT成像的厚度来确定太空飞行环境对眼部结构的影响。十周大的C57BL/6只雄性小鼠被安置在国际空间站上进行为期35天的任务，然后活着返回地球进行组织分析。为了进行比较，地球上的地面控制（GC）小鼠在相同的环境条件和硬件中保持。在溅落后38（4）小时内采集眼 ±组织样本进行微CT分析。使用微CT成像采集方法，在轴向和下垂视图中记录了视网膜、RPE、胆管和固定眼的乳腺层截面的图像。微CT分析表明，与GC相比，航天样品中视网膜、RPE和胆微层厚度的横截面区域发生了变化，与对控相比，航天样品的横截面和层明显变薄。本研究的结果表明，微CT评价是一种敏感可靠的眼部结构变化特征。预计这些结果将增进对环境压力对全球眼部结构的影响的了解。

Introduction

在航天的微重力环境体变化引起的颅内压力增加（ ICP ）可能促成了与太空飞行相关的^,神经 - 眼综合征^{（ SANS ） 1 、 2 、 3 、 4 、 5 。,2,34,5}事实上，超过40%的宇航员在国际空间站^{（ISS）任务6}期间和之后都经历过SANS，包括美国宇航局"双胞胎^{研究7"的太空飞行课题}。SANS目前的病理生理学包括生理变化，如视盘水肿，球压，胆红和视网膜褶皱，高视折射误差转移，神经纤维层梗塞（即棉布斑），并记录^{良好的5，8。,8}然而，造成损害发展的变化和因素的基本机制尚不清楚。为了更好地了解SANS，动物模型可用于描述视网膜结构和功能与太空飞行相关的变化。

在此前对同一动物的调查中，我们报告了35天的太空飞行对小鼠视网膜的影响。结果表明，太空飞行在视网膜和视网膜血管中引起显著损伤，在太空飞行9之后，与细胞死亡、炎症和代谢应激相关的一些蛋白质/^{途径发生了显著变化}。

目前，有各种非侵入性成像技术建立，以监测疾病发展和进展，以及生理反应的各种环境压力，这也是广泛使用在小啮齿动物模型。其中一种技术是微CT，它评估解剖结构和病理过程，并成功地应用于像小鼠^{10小的生物}。

Micro-CT可以实现微分辨率，通过添加适当的对比剂^{10、11、12、13、14，,11,12,13}为软组织体积^{分析提供高对比度}。与粗解剖、光显微镜、组织学检查等传统方法相比，Micro-CT 技术是有利的，因为它最大限度地减少了对标本几何轮廓的物理损伤，并且不会改变结构之间的空间关系。此外，三维（3D）结构模型可以从微CT图像^{12，14,重建}。迄今为止，尽管有证据表明在接触空间环境后视力受损，但动物模型中几乎没有数据能够更好地了解与太空飞行相关的视网膜结构和功能变化。在目前的研究中，老鼠在国际空间站上进行了为期35天的任务，通过利用微CT量化视网膜、RPE和胆管层的微观结构，确定太空飞行环境对眼部组织结构的影响。

Protocol

这项研究遵循了国家卫生研究院实验室动物护理和使用指南中概述的建议，并经洛玛琳达大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）和国家航空和航天局（美国航天局）批准。有关这次飞行实验的更详细的信息可以在^{,9，15的其他地方找到}。⁹

1. 飞行和控制条件

注：2017年8月，SpaceX在肯尼迪航天中心（KSC）发射了第12次商业补给服务（CRS-12）有效载荷，执行为期35天的任务，其中包括在10周大的雄性C57BL/6小鼠（n = 20）上发射，用于美国宇航局的第九次罗登特研究实验（RR-9）。

1. 在通过SpaceX的"龙"号太空舱返回地球之前，让老鼠在国际空间站上的NAS罗登栖息地（RH）中生存35天，环境温度为26~28°C，整个飞行周期为12小时。
2. 将地面控制 （GC） 小鼠放入飞行中使用的相同外壳硬件中，并基于遥测数据尽可能匹配温度和二氧化碳 （CO_2）水平等环境参数。
3. 给GC老鼠喂食与太空老鼠相同的NASA食物吧饮食。为太空飞行和GC小鼠提供相同的水和食物。

2. 小鼠的飞行后评估

1. 在地球上飞溅的28小时内，将老鼠运送到洛玛琳达大学（LLU）。一旦到达那里，从动物外壳硬件中删除小鼠，并评估生存和健康。
   注：经观察，检查人员报告说，所有小鼠都经受了35天的太空任务，状况良好，即无明显缺陷/异常。

3. 太空飞行后对老鼠眼睛进行解剖和保存

1. 在飞溅（±4）小时内（n=20/组），在100%CO₂ 中对小鼠实施安乐死并采集它们的眼睛。
2. 解剖右眼视网膜，单独放置在无菌冷冻液中，在液氮中捕捉冻结，并在使用前保持+80°C。
3. 将整个左眼在磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中固定为 4% 的对甲醛 24 小时，然后用磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 冲洗，进行微 CT 测定。

4. 微CT扫描的样品制备

1. 固定后，用乙醇脱水老鼠的眼睛。要保持固定样品的进一步或突然收缩，请使用分级的乙醇溶液：从 50% 乙醇开始 1 小时，然后增加乙醇溶液的浓度，如下所示 1 小时：70、80、90、96 和 100%。
   注：小鼠的眼睛必须在机罩室中处理。
2. 磷酸酸 （PMA） 染色
   注意：由于PMA具有腐蚀性、致癌和对器官有毒，因此需要适当的防护个人设备，包括使用烟罩。
   1. 准备染色溶液：100 mL绝对乙醇中10毫克PMA。
   2. 染色小鼠的眼睛（10 wt. 磷酸酸 - PMA溶解在绝对乙醇中）6天。
   3. 在扫描之前，首先用绝对乙醇清洗眼睛样本，然后将每只眼睛放在单独的 2 mL 塑料容器中，这些塑料容器中填充了 100% 绝对乙醇。在扫描过程中添加棉垫以稳定样品。

5. 微CT扫描和分析

注：SkyScan 1272扫描仪是一种桌面X射线微型CT系统，用于评估小鼠眼睛的视网膜损伤

1. 将软组织样品安装到适当的样品支架上。为防止在 X 射线 CT 测量过程中发生任何移动，请确保样品紧贴其支架上（图 1）。
2. 对每个样品进行细致的校准后，通过 X 射线单独扫描样品。
   1. 打开软件后，将样品居中框架中。在协议中，不使用滤镜，并设置矩阵以将像素增加为 4 μm。使用微定位使样品居中在框架上。
   2. 之后，检查参数以最大化对比剂。要执行校准，请取出样品并检查平场校正是否大于 80%。
   3. 校准后，将样品重新插入扫描室。对于扫描，使用 0.400 的旋转步进，平均帧 4，随机运动 30，并旋转样本 180°。
3. 使用定位夹具进行重复测量。由于按所述执行相位对比度增强，从 50 keV 和 80 mA 的密封微焦 X 射线管（钨阳极）生成的 X 射线中可以检测到小至 4 μm 的物体细节，集成时间为 90 分钟。
   注：本节中为选择而设置的采集参数，以生成具有最高图像质量的 CT 扫描概览。
4. 扫描后，使用软件（例如 NRecon）重建数据。
   1. 调整直方图，并使用相同的范围 （0 = 0.24） 所有样本。重建感兴趣的区域是一个圆圈，没有使用比例或标签。
   2. 要减少扫描期间的伪影，请使用 20 的光束硬化校正，平滑校正 1，环伪影减少 6，并且不改变不对齐补偿。重建后，确认样品属于感兴趣的区域。
   3. 使用平行于眼睛的视神经和透镜的平面重新定位图像。
5. 扫描后，使用软件（例如 DataViewer）在所有三个视图中可视化重建的图像。
   注：如有必要，使用该软件，可以使用与眼睛的视神经和透镜平行的平面对图像进行重新定位，以执行标准化分析。
6. 描述性分析
   1. 使用软件中的测量工具（例如 CTAn）测量结构。使用光学神经来划定感兴趣的区域进行分析。通过计算，协议使用中间切片执行测量。此评估通过描述性分析（图 2 和 图 3） 执行。
   2. 测量下垂（图2）和轴向视图（图3）中的视网膜、视网膜色素上皮（RPE）、胆管和鼻塞层。对每个结构进行三次测量，以计算平均值。

Representative Results

视网膜、RPE、胆小球和板条层的平均厚度是在遵循上述协议后使用微CT扫描记录的（图1）。该技术以三种不同的观点展示了眼睛的多平面重建。在分析过程中，观察者能够滚动浏览整个样本，以标准化样品中间的分析权。

微CT分析显示了在下垂和轴向视图中眼睛的横截面区域（图2和图3），其中进行了线性测量。与GC组相比，空间飞行组的RPE和胆小球层明显或呈下降趋势（图3）。

图1：软组织微CT程序。（A） 软组织样本（小鼠眼）。（B） 样品固定在磷酸盐缓冲液（PBS）中4%甲醛中。固定后，老鼠的眼睛在乙醇中脱水。为了防止固定样品进一步突然收缩，使用了一系列分级乙醇溶液，从1小时50%乙醇开始，在所列浓度中采用以下乙醇溶液，每次1小时：70、80、90、96和100%。（C） 小鼠的眼睛被磷酸（PMA）染色6天，用绝对乙醇清洗，然后放入单独的2mL塑料容器中，里面装满了绝对乙醇。（D） 台式X射线微CT系统扫描仪用于评估小鼠眼睛的视网膜损伤。 请单击此处查看此图的较大版本。

图2：地面控制鼠标的下垂视图。图像右侧的眼睛层有注释，从上到下，视网膜（0.077 毫米），视网膜色素层 （RPE， 0.038 毫米）， 胆小球 （0.041 毫米）， sclera （0.059 毫米）。这个数字取自 Overbey 等人¹⁵。 请单击此处查看此图的较大版本。

图3：地面控制鼠标的轴向视图。图像右侧的眼睛层有注释，从上到下，视网膜（0.144 毫米），视网膜色素层 （RPE， 0.051 毫米）， 胆小球 （0.041 毫米）， sclera （0.073 毫米）。这个数字取自 Overbey 等人¹⁵。 请单击此处查看此图的较大版本。

图4：在航天和控制组中，由微CT测量的视网膜层、RPE层和胆光层的平均厚度。平均每组五个视网膜的计数。值表示为标准误差 （SEM） ±厚度。均值的 SEM 标有误差条。与地面控制 （GC） 组相比，空间飞行 （FLT） 组中横截面厚度明显较低，表示"*"（p < 0.05）。这个数字取自 Overbey 等人¹⁵。 请单击此处查看此图的较大版本。

Discussion

这项研究结果表明，与GC组相比，使用微CT技术进行太空飞行鼠标眼的结构变化，特别是视网膜、RPE和眼睛的胆小板层，其厚度减少就证明了这一点。Micro-CT 提供了一种高效且无损的技术，可描述这些变化，无需操作。使用PMA染色提高了微CT图像的质量，在重建后成功获得清晰的3D断层图像，无需物理改变标本的结构。这些图像的一个附加好处是，它们以数字方式显示整个感兴趣区域，从而提高了结果的可访问性和可重复性。通过本研究期间产生的微CT图像，目标样本显示视网膜、RPE、胆小球和硬化层等多个结构的分化，用于确定每一层的厚度。

协议中的一个关键步骤是由于样本的大小和纹理而对样本进行操作。在制备过程中，必须仔细处理试样，不要对试样施加压力。微CT有一些局限性：分辨率和参数缺乏标准化值。在扫描过程中，不同的微CT扫描仪可能具有不同的图像处理算法;然而，为了克服任何问题，可能会进行灰度的校准。扫描后，图像的重建应基于组织以及将执行的分析。它可以是至关重要的，因为图像质量取决于断层扫描系统，设置，标本大小以及制备方法^{16，17。16,}

由于其成功应用于研究几种类型的正常组织和病理组织，微CT成像能力应用于未来的研究，以汇编体积数据进行其他分析。因此，根据本研究的目的，使用双维测量是可以接受的，但对总三维结构的分割也有利于提供整个标本的精确轮廓。即使具有非破坏性技术的所有优点，微CT也无法取代其他方法，如免疫组织化学，而是会根据需要补充并允许随后进行组织学分析。

在被定义为SANS的太空任务期间和之后，长时间的太空飞行条件在宇航员中产生了一系列结构和功能性眼部变化。研究结果包括高视移、球体扁平化、胆状/视网膜褶皱和棉布^斑点19。与宇航员的光学相干断层扫描（OCT）相比，在动物微CT研究中记录了视网膜神经纤维层增厚、视网膜和胆结层的变薄。这些结果出人意料。这种差异可能是由于混淆因素造成的。与人类相比，小鼠的脑积液变化有限。这种缺乏流体变化的这种反应可能引发了对重力变化的不同反应。其次，小鼠在溅落后38小时内被解剖，而重新适应的急性反应也可能导致视网膜和胆瘤的形态变化。确认这种可能性需要在航天飞行期间和飞行任务后的长期进行进一步测量。

这项研究结果表明，太空飞行条件，特别是引力变化，可能会诱发眼睛的急性和短期反应。需要进一步调查，以确定眼部对视网膜功能和空间飞行诱导结构变化机制的急性变化的后果。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 wt. % phosphomolybdic	Sigma	12026-57-2
Ethanol absolute by Baker Analyzed	VWR	80252500
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Merck	L1825
X-ray micro-CT system SkyScan 1272 scanner	Bruker