Summary
Vi presenterer en protokoll ved hjelp av høyoppløselig mikro-computertomografiavbildning for å avgjøre om romferd indusert skade på okulære strukturer. Protokollen viser mikro-CT-avledet måling av ex vivo gnager okulære strukturer. Vi viser evnen til å vurdere okulære morfologiske endringer etter romferd ved hjelp av en ikke-destruktiv tridimensjonal teknikk for å evaluere okulær skade.
Abstract
Rapporter viser at langvarig eksponering for et romferdsmiljø produserer morfologiske og funksjonelle oftalmiske endringer i astronauter under og etter et internasjonalt romstasjonsoppdrag (ISS). De underliggende mekanismene for disse romflyvningsinduserte endringene er imidlertid foreløpig ukjente. Formålet med den nåværende studien var å bestemme virkningen av romferdsmiljøet på okulære strukturer ved å evaluere tykkelsen på musehinnen, retinal pigmentepitelet (RPE), choroid og sclera-laget ved hjelp av mikro-CT-avbildning. Ti uker gamle C57BL/6 hannmus ble plassert om bord på ISS for et 35-dagers oppdrag og deretter returnert til jorden i live for vevsanalyse. Til sammenligning ble bakkekontrollmus (GC) på jorden opprettholdt under identiske miljøforhold og maskinvare. Okulære vevsprøver ble samlet inn for mikro-CT-analyse innen 38 (±4) timer etter sprut. Bildene av tverrsnittet av netthinnen, RPE, choroid, og sclera laget av det faste øyet ble registrert i en aksial og sagittal visning ved hjelp av en mikro-CT imaging oppkjøpsmetode. Micro-CT-analysen viste at tverrsnittsområdene i netthinnen, RPE og choroid lagtykkelsen ble endret i romferdsprøver sammenlignet med GC, med romferdsprøver som viser betydelig tynnere tverrsnitt og lag sammenlignet med kontroller. Funnene fra denne studien indikerer at mikro-CT evaluering er en følsom og pålitelig metode for å karakterisere okulære strukturendringer. Disse resultatene forventes å forbedre forståelsen av virkningen av miljøstress på globale okulære strukturer.
Introduction
I mikrogravitasjonsmiljøet til romferd kan økt intrakranielt trykk (ICP) forårsaket av væskeskift ha bidratt til romferds-assosiert nevrookulært syndrom (SANS)1,2,3,4,5. Faktisk har over 40% av astronautene opplevd SANS under og etter en internasjonal romstasjon (ISS)oppdrag 6, inkludert romferdsemne i NASA Twins Study7. Den nåværende patofysiologien til SANS inkluderer fysiologiske endringer som optisk skiveødem, globusflating, koroide og netthinnefolder, hyperopisk brytningsfeilskift og nervefiberlag infarkter (det vil vil vil at bomullsullflekker) og er godt dokumentert5,8. De underliggende mekanismene for endringene og faktorene som bidrar til utviklingen av skade er imidlertid uklare. For å få en bedre forståelse av SANS, er dyremodeller tilgjengelige for å karakterisere romfly-tilknyttede endringer i retinal struktur og funksjon.
I en tidligere undersøkelse om de samme dyrene rapporterte vi virkningen av 35 dager med romferd på musens netthinnen. Resultatene belyser at romferd induserer betydelig skade i netthinnen og netthinnens vaskulatur, og noen proteiner/veier forbundet med celledød, betennelse og metabolsk stress ble betydelig endret etterromferd 9.
For tiden finnes det en rekke ikke-invasive bildeteknikker etablert for å overvåke sykdomsutvikling og progresjon, samt fysiologiske reaksjoner på ulike miljøstressorer, som også er mye brukt i små gnagermodeller. En av disse teknikkene er mikro-CT, som evaluerer anatomiske strukturer og patologiske prosesser, og har med hell blitt brukt på organismer så små som mus10.
Micro-CT kan oppnå en mikrosized oppløsning, og det kan gi høy kontrast for volumetrisk analyse av bløtvev med tillegg av riktig kontrastmiddel10,11,12,13,14. Micro-CT-teknologi er en fordel sammenlignet med tradisjonelle metoder som grov anatomi, lett mikroskopi og histologiundersøkelse, da det minimerer fysisk skade på den geometriske profilen til prøvene og endrer ikke det romlige forholdet mellom strukturer. I tillegg kan tredimensjonale (3D) modeller av strukturer rekonstrueres fra mikro-CT-bilder12,,14. Til dags dato, til tross for bevis som viser synshemming etter eksponering for rommiljøet, er det få data i dyremodeller tilgjengelig for en bedre forståelse av romflyvningsrelaterte endringer i retinal struktur og funksjon. I den nåværende studien ble mus fløyet på et 35-dagers oppdrag ombord på ISS for å bestemme virkningen av romferdsmiljøet på okulære vevsstrukturer ved å kvantifisere mikrostrukturen i netthinnen, RPE og choroidlagene ved hjelp av mikro-CT.
Protocol
Studien fulgte anbefalingene som er skissert i Guide for care and use of Laboratory Animals ved National Institutes of Health (NIH) og ble godkjent av både Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) av Loma Linda University (LLU) og The National Aeronautics and Space Administration (NASA). Mer detaljert informasjon om dette flyeksperimentet finner duandre steder 9,15.
1. Fly- og kontrollforhold
MERK: En 12th Commercial Resupply Service (CRS-12) nyttelast ble lansert av SpaceX på Kennedy Space Center (KSC) på et 35-dagers oppdrag i august 2017 som inkluderte ombord 10 uker gamle mannlige C57BL / 6 mus (n = 20) for NASAs niende Rodent Research eksperiment (RR-9).
- Før de vender tilbake til jorden via SpaceX's Dragon kapsel, har musene lever i NASAs Rodent Habitats (RH) ombord ISS i 35 dager ved en omgivelsestemperatur på 26-28 ° C med en 12-timers lys / mørk syklus gjennom hele flyturen.
- Plasser Ground Control (GC) mus i samme husmaskinvare som brukes i flukt, og match miljøparametere som temperatur- og karbondioksid (CO2)nivåer så nært som mulig basert på telemetridata.
- Mate GC mus samme NASA mat bar diett som sine plassbaserte kolleger. Gi både romferds- og GC-musene samme ad libitum tilgang til vann og mat.
2. Evaluering av musene etter flyturen
- Innen 28 timer etter splashdown på jorden, transportere musene til Loma Linda University (LLU). Når du er der, fjern musene fra dyreinnhegningsmaskinvaren og vurder for overlevelse og helse.
MERK: Ved observasjon rapporterte inspiserende personell at alle musene hadde overlevd 35-dagers romferd og var i god stand, det vil si ingen merkbare mangler / abnormiteter.
3. Dissekering og bevaring av museøyne etter romferd
- Innen 38 (±4) timer etter splashdown (n = 20 / gruppe), euthanize musene i 100% CO2 og samle øynene.
- Dissekere høyre øye netthinnen og plasser individuelt i sterile kryovialer, snap-fryse i flytende nitrogen, og hold ved -80 °C før bruk.
- Fest hele venstre øyne i 4% paraformaldehyd i fosfatbufret saltvann (PBS) i 24 timer og skyll deretter med fosfatbufret saltvann (PBS) for mikro-CT-analyser.
4. Prøveforberedelse for mikro-CT-skanning
- Etter fiksering dehydrerer musenes øyne i etanol. For å hindre ytterligere eller brå krymping av den faste prøven, bruk en gradert serie etanolløsninger: begynner med 50% etanol i 1 time og deretter øke konsentrasjonene av etanolløsningene som følger i 1 time hver: 70, 80, 90, 96 og 100%.
MERK: Musenes øyne må håndteres i et hettekammer. - Fosfafarsyre (PMA) farging
FORSIKTIG: På grunn av at PMA er etsende, kreftfremkallende og giftig for organer, er egnet verneutstyr nødvendig, inkludert bruk av en røykhette.- Klargjør fargeoppløsningen: 10 mg PMA i 100 ml absolutt etanol.
- Flekk musenes øyne (10 wt. % fosfafarsyre - PMA oppløst i absolutt etanol) i 6 dager.
- Før skanning, først vaske øyeprøvene i absolutt etanol og deretter plassere hvert øye i individuelle 2 ml plastbeholdere som er fylt med 100% absolutt etanol. Legg til en bomullsdott til stabiliserte prøver under skanning.
5. Micro-CT skanning og analyse
MERK: SkyScan 1272-skanneren, et stasjonært røntgenmikro-CT-system, ble brukt til evaluering av retinal skade i musenes øyne
- Monter bløtvevsprøven på en passende prøveholder. For å unngå bevegelse under CT-målingene for røntgen, sørg for en tett tilpasning av prøven på holderen (figur 1).
- Ved omhyggelig justering av hver prøve, individuelt skanne prøven via røntgenstråler.
- Når du har åpnet programvaren, midtstill prøven i rammen. I protokollen bruker du ikke noe filter og angir matrisen for å øke pikselen ved 4 μm. Bruk mikroposisjonering for å holde prøven på rammen.
- Deretter kontrollerer du parameteren for å maksimere kontrastagenten. Hvis du vil utføre kalibreringen, fjerner du prøven og kontrollerer at flatfeltkorrigeringen er større enn 80 %.
- Etter kalibreringen setter du prøven inn i skannekammeret igjen. For skanning, bruk et rotasjonstrinn på 0,400, et rammesnitt på 4, en tilfeldig bevegelse på 30, og roter prøvene 180°.
- Bruk en posisjoneringsjigg for gjentatte målinger. På grunn av fasekontrastforbedring utført som beskrevet, kan objektdetaljer så små som 4 μm oppdages fra røntgenstråler generert av et forseglet mikrofokus røntgenrør (wolframanode) ved 50 keV og 80 mA med en integrasjonstid på 90 minutter.
MERK: Anskaffelsesparametrene som er lagt ut i denne delen for valg for å produsere oversikt ct-skanninger med høyest bildekvalitet. - Etter skanning bruker du programvare (f.eks. NRecon) til å rekonstruere dataene.
- Juster histogrammet og bruk samme område (0 – 0,24) for alle prøvene. Rekonstrueringsområde var en sirkel, og ingen skalaer eller etiketter ble brukt.
- For å redusere artefakter under skanningen, bruk en stråleherdingskorreksjon på 20, en utjevningskorreksjon på 1, en ringartefaktreduksjon på 6, og utfører ingen endring i feiljusteringskompensasjonen. Etter gjenoppbygging ble det bekreftet at prøven var innenfor interesseområdet.
- Omplasser bilder ved hjelp av et plan parallelt med synsnerven og linsen i øynene.
- Etter skanning bruker du programvare (f.eks. DataViewer) til å visualisere de rekonstruerte bildene i alle tre visningene.
MERK: Med denne programvaren kan bildene omplasseringes ved hjelp av et plan parallelt med synsnerven og linsen i øynene for å utføre en standardisert analyse. - Beskrivende analyse
- Mål strukturene ved hjelp av et måleverktøy i programvaren (f.eks. Bruk den optiske nerven til å avgrense interesseområdet for analyse. Ved beregning brukte protokollen den midterste sektoren til å utføre målingene. Denne evalueringen ble utført ved beskrivende analyse (figur 2 og figur 3).
- Utfør målinger av netthinnen, retinal pigment epitel (RPE), choroid og sclera lag i sagittal (figur 2) og aksial visning (figur 3). Ta tre målinger av hver struktur for å beregne et gjennomsnitt.
Representative Results
Gjennomsnittlig tykkelse på netthinnen, RPE, choroid og sclera laget ble registrert ved hjelp av mikro-CT skanner etter å ha fulgt protokollen ovenfor (Figur 1). Teknikken viste en multiplanar rekonstruksjon av øynene i tre forskjellige visninger. Under analysen var observatøren i stand til å bla gjennom hele prøven for å standardisere analysen midt i prøven.
Mikro-CT-analysen viste tverrsnittsområdene av øynene i sagittal- og aksialvisningen (figur 2 og figur 3) der ble utført de lineære målingene. RPE og choroid laget var betydelig eller trend lavere i romferd gruppen sammenlignet med GC-gruppen (figur 3).
Figur 1: Mikro-CT prosedyre av bløtvev. (A)Bløtvevsprøve (museøye). (B) Prøvene ble fastsatt i 4 % formaldehyd i fosfatbufferløsning (PBS). Etter fiksering ble musenes øyne dehydrert i etanol. For å forhindre en ytterligere og brå krymping av den faste prøven, ble det brukt en gradert serie av etanolløsninger, som begynte med 50% etanol i 1 time og følgende etanolløsninger i konsentrasjonene som er oppført, i 1 time hver: 70, 80, 90, 96 og 100%. (C)Musenes øyne ble farget i fosfafatlybdic acid (PMA) i 6 dager, vasket i absolutt etanol og deretter plassert i individuelle 2 ml plastbeholdere fylt med absolutt etanol. (D)En stasjonær røntgen mikro-CT system skanner ble brukt til å evaluere retinal skade i mus øyne. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Skyttens syn på en bakkekontrollmus. Lag av øyet på høyre side av bildet er kommentert, fra topp til bunn, retina (0,077 mm), retina pigment lag (RPE, 0,038 mm), choroid (0,041 mm), sclera (0,059 mm). Dette tallet er hentet fra Overbey et al.15. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Aksial visning av en jordkontrollmus. Lag av øyet på høyre side av bildet er kommentert, fra topp til bunn, retina (0,144 mm), retina pigment lag (RPE, 0,051 mm), choroid (0,041 mm), sclera (0,073 mm). Dette tallet er hentet fra Overbey et al.15. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Gjennomsnittlig tykkelse på netthinnen, RPE-laget og choroidlaget målt ved mikro-CT i romferds- og kontrollgruppene. Antallet ble i gjennomsnitt over fem netthinnen per gruppe. Verdiene ble representert som gjennomsnittlig tykkelse ± standardfeil (SEM). SEM av gjennomsnittet er merket med feilfelt. Signifikant lavere i tverrsnittstykkelsen i romferdsgruppen (FLT) sammenlignet med gc-gruppen (ground control) er merket '*' (p < 0,05). Dette tallet er hentet fra Overbey et al.15. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Resultatene av denne studien viste at det var strukturelle endringer i romferdmuseøyet ved hjelp av mikro-CT-teknikken sammenlignet med GC-grupper, spesielt av netthinnen, RPE og choroidlagene i øyet, noe som fremgår av deres reduserte tykkelse. Micro-CT gir en effektiv og ikke-destruktiv teknikk for å karakterisere endringene uten behov for manipulasjon. Bruken av PMA-farging forbedret kvaliteten på mikro-CT-bildene for å kunne oppnå klare 3D-tomografiske bilder etter rekonstruksjon, og forutsagt ethvert behov for å fysisk endre strukturen på prøven. En ekstra fordel med disse bildene er at de viser hele interesseområdet digitalt, og dermed øker tilgjengeligheten samt reproduserbarheten av funnene. Gjennom mikro-CT-bildene som ble produsert i løpet av denne studien, viste den målrettede prøven differensiering av flere strukturer som netthinnen, RPE, choroid og sclera-laget for bestemmelse av tykkelsen på hvert lag.
Et kritisk skritt i protokollen er manipulering av prøvene på grunn av deres størrelse og tekstur. Håndteringen av prøven må gjøres nøye uten å legge press på prøven under tilberedningen. Mikro-CT har noen begrensninger: oppløsning og mangel på standardiserte verdier for parametrene. Under skanningen kan de forskjellige mikro-CT-skannerne ha ulike bildebehandlingsalgoritmer; men kalibrering for en gråtoner kan forfølges for å overvinne ethvert problem. Etter skanning bør rekonstruksjon av bildene være basert på vevet og analysen som skal utføres. Det kan være kritisk siden bildekvaliteten avhenger av det tomografiske systemet, innstillingene, prøvestørrelsen samt tilberedningsmetodene16,,17.
På grunn av sin vellykkede anvendelse i å studere flere typer normale og patologiske vev, bør mikro-CT-bildebehandlingsevner brukes i fremtidig forskning for å kompilere volumetriske data for andre analyser. Basert på den nåværende studiens formål, var det derfor akseptabelt å bruke todimensjonale målinger, men segmentering av brutto 3D-strukturen kan også være gunstig for å gi en nøyaktig oversikt over hele prøven. Selv med alle fordelene med en ikke-destruktiv teknikk, vil mikro-CT ikke erstatte andre metoder som immunohistochemistry, men vil supplere og tillate etterfølgende histologianalyser hvis ønskelig.
En langvarig romferdstilstand produserer en rekke strukturelle og funksjonelle okulære endringer i astronautene under og etter romferden definert som SANS. Funnene inkluderer hyperopiske skift, globusflating, koroide/ retinale folder og bomullsullflekker19. I motsetning til astronautenes optiske sammenhengtomografi (OCT) funn av retinal nervefiber lag fortykning, ble tynning av netthinnen og koroidelaget dokumentert i denne dyremikro-CT-studien. Disse resultatene var uventede. Denne avviket kan skyldes forvirrende faktorer. Mus har begrenset cephalad væskeskift sammenlignet med mennesker. Denne mangelen på væskeskift kan ha fremkalt forskjellige reaksjoner på gravitasjonsendringer. For det andre ble mus dissekert innen 38 timer etter splashdown, og en akutt respons for re-tilpasning kan også bidra til morfologiske endringer i netthinnen og choroid. Bekreftelse av denne muligheten krever ytterligere målinger under romferd og på lang sikt etter oppdraget.
Resultatene av denne studien indikerer at romflyforhold, spesielt gravitasjonsendringer, kan indusere en akutt og kortsiktig respons i øyet. Videre undersøkelser er nødvendig for å bestemme konsekvensene av de akutte endringene på okulær på retinal funksjon og mekanisme for romferd-indusert strukturendringer.
Disclosures
Alle forfattere har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av NASA Space Biology grant # NNX15AB41G og LLU Department of Basic Sciences. Sungshin Choi, Dennis Leveson og Rebecca Klotz bidro betydelig til suksessen til vår romferdsstudie, og vi setter stor pris på deres støtte. Forfatterne vil også takke hele NASA Biospecimen Sharing Program-gruppen for deres store hjelp.
Forfatterne vil også takke Center for Dental Research for Micro-CT-tjenesten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 wt. % phosphomolybdic | Sigma | 12026-57-2 | |
| Ethanol absolute by Baker Analyzed | VWR | 80252500 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Merck | L1825 | |
| X-ray micro-CT system SkyScan 1272 scanner | Bruker |
References
- Dawson, L. The New Space Race. The Politics and Perils of Space Exploration. , Springer Praxis Books. 1-24 (2017).
- Mao, X. W., et al. Spaceflight environment induces mitochondrial oxidative damage in ocular tissue. Radiation Research. 180, 340-350 (2013).
- Overbey, E. G., et al. Mice Exposed to Combined Chronic Low-Dose Irradiation and Modeled Microgravity Develop Long-Term Neurological Sequelae. International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 4094 (2019).
- Nelson, E. S., Mulugeta, L., Myers, J. G. Microgravity-induced fluid shift and ophthalmic changes. Life. 4, 621-665 (2014).
- Lee, A. G., Mader, T. H., Robert Gibson, C., Brunstetter, T. J., Tarver, W. J. Space flight-associated neuro-ocular syndrome (SANS). Eye. 32, 1164-1167 (2018).
- Stenger, M. B., et al. Evidence Report: Risk of Spaceflight Associated Neuro-ocular Syndrome (SANS). , (2017).
- Garrett-Bakelman, F. E., et al. The NASA Twins Study: A multidimensional analysis of a year-long human spaceflight. Science. 364, (2019).
- Mader, T. H., et al. Optic disc edema, globe flattening, choroidal folds, and hyperopic shifts observed in astronauts after long duration space flight. Ophthalmology. 118, 2058-2069 (2011).
- Mao, X. W., et al. Characterization of mouse ocular response to a 35-day spaceflight mission: Evidence of blood-retinal barrier disruption and ocular adaptations. Science Reports. 9 (1), 8215 (2019).
- Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: a versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Developmental Dynamics. , 632-640 (2009).
- Silva, J. M. S., et al. Three-dimensional non-destructive soft-tissue visualization with X-ray staining micro-tomography. Science Reports. 5, 14088 (2015).
- Descamps, E., et al. Soft tissue discrimination with contrast agents using micro-CT scanning. Belgian Journal of Zoology. , 20-40 (2014).
- Wu, J., Yin, N. Anatomy research of nasolabial muscle structure in fetus with cleft lip: an iodine staining technique based on microcomputed tomography. Journal of Craniofacial Surgery. 25 (3), 1056-1061 (2014).
- Roque-Torres, G. D. Application of Micro-CT in Soft Tissue Specimen Imaging. In: Orhan K. (eds) Micro-computed Tomography (micro-CT) in Medicine and Engineering. , Springer. 139-170 (2020).
- Overbey, E. G., et al. Spaceflight influences gene expression, photoreceptor integrity, and oxidative stress-related damage in the murine retina. Science Reports. 9 (1), 13304 (2019).
- Elkhoury, J. E., Shankar, R., Ramakrishnan, T. S. Resolution and Limitations of X-Ray Micro-CT with Applications to Sandstones and Limestones. Transport in Porous Media. 129, 413-425 (2019).
- Sombke, A., Lipke, E., Michalik, P., Uhl, G., Harzsch, S. Potential and limitations of X-Ray micro-computed tomography in arthropod neuroanatomy: A methodological and comparative survey. Journal of Comparative Neurology. 523 (8), 1281-1295 (2015).
- Huang, A. S., Stenger, M. B., Macias, B. R. Gravitational Influence on Intraocular Pressure: Implications for Spaceflight and Disease. Journal of Glaucoma. 28 (8), 756-764 (2019).
- Lee, A. G., et al. Spaceflight associated neuro-ocular syndrome (SANS) and the neuro-ophthalmologic effects of microgravity: a review and an update. NPJ Microgravity. 6, 7 (2020).
