Summary
Presentiamo un protocollo utilizzando l'imaging tomografia micro-calcolato ad alta risoluzione per determinare se il volo spaziale ha indotto danni alle strutture oculari. Il protocollo mostra la misura micro-CT-derivata delle strutture oculari di roditori ex vivo. Dimostriamo la capacità di valutare i cambiamenti morfologici oculari dopo il volo spaziale utilizzando una tecnica tridimensionale non distruttiva per valutare i danni oculari.
Abstract
I rapporti mostrano che l'esposizione prolungata a un ambiente di volo spaziale produce cambiamenti oftalmici morfologici e funzionali negli astronauti durante e dopo una missione della Stazione Spaziale Internazionale (ISS). Tuttavia, i meccanismi sottostanti di questi cambiamenti indotti dal volo spaziale sono attualmente sconosciuti. Lo scopo del presente studio era quello di determinare l'impatto dell'ambiente del volo spaziale sulle strutture oculari valutando lo spessore della retina del topo, l'epitelio del pigmento retino (RPE), il coroide e lo strato di sclera utilizzando l'imaging micro-CT. I topi maschi C57BL/6 di dieci settimane sono stati alloggiati a bordo della ISS per una missione di 35 giorni e poi sono tornati sulla Terra vivi per l'analisi dei tessuti. Per fare un confronto, i topi di controllo del suolo (GC) sulla Terra sono stati mantenuti in condizioni ambientali e hardware identici. Sono stati raccolti campioni di tessuto oculare per l'analisi della microC entro 38(±4) ore dopo lo splashdown. Le immagini della sezione trasversale della retina, della RPE, della coroide e dello strato di sclera dell'occhio fisso sono state registrate in una vista assiale e sagittale utilizzando un metodo di acquisizione dell'imaging micro-CT. L'analisi micro-CT ha mostrato che le aree della sezione trasversale dello spessore dello strato di retina, RPE e coroide sono state modificate nei campioni di volo spaziale rispetto al GC, con campioni di volo spaziale che mostrano sezioni trasversali e strati significativamente più sottili rispetto ai controlli. I risultati di questo studio indicano che la valutazione della microC è un metodo sensibile e affidabile per caratterizzare i cambiamenti della struttura oculare. Questi risultati dovrebbero migliorare la comprensione dell'impatto dello stress ambientale sulle strutture oculari globali.
Introduction
Nell'ambiente di microgravità del volo spaziale, l'aumento della pressione intraranziale (ICP) causata dallo spostamento dei fluidi può aver contribuito alla sindrome neuro-oculare associata al volo spaziale (SANS)1,2,3,4,5. Infatti, oltre il 40% degli astronauti ha sperimentato SANS durante e dopo una missione della Stazione Spaziale Internazionale (ISS)6, compreso il soggetto del volo spaziale del NASA Twins Study7. L'attuale fisiofisiologia di SANS include cambiamenti fisiologici come l'edema del disco ottico, l'appiattimento del globo, le pieghe cororoidali e retiniche, gli spostamenti di errore rifrattivi iperopici e gli infarti dello strato di fibra nervosa (cioè macchie di cotone) e sono ben documentati5,8. Tuttavia, i meccanismi sottostanti dei cambiamenti e dei fattori che contribuiscono allo sviluppo dei danni non sono chiari. Per avere una migliore comprensione della SANS, sono disponibili modelli animali per caratterizzare i cambiamenti associati al volo spaziale nella struttura e nella funzione della retina.
In una precedente indagine sugli stessi animali, abbiamo segnalato l'impatto di 35 giorni di volo spaziale sulla retina del topo. I risultati chiariano che il volo spaziale induce danni significativi nella retina e nella vascolatura reticolare, e alcune proteine/percorsi associati alla morte cellulare, all'infiammazione e allo stress metabolico sono state significativamente alterate dopo il volospaziale 9.
Attualmente, ci sono una varietà di tecniche di imaging non invasive stabilite per monitorare lo sviluppo e la progressione della malattia, così come le risposte fisiologiche a vari fattori di stress ambientale, che sono anche ampiamente utilizzati in modelli di piccoli roditori. Una di queste tecniche è la micro-CT, che valuta le strutture anatomiche e i processi patologici, ed è stata utilizzata con successo su organismi piccoli come topi10.
Micro-CT può ottenere una risoluzione microsizzata, e può fornire un contrasto elevato per l'analisi volumetrica dei tessuti molli con l'aggiunta dell'agente di contrastoappropriato 10,11,12,13,14. La tecnologia microC è vantaggiosa rispetto ai metodi tradizionali come l'anatomia lorda, la microscopia leggera e l'esame istologico, in quanto riduce al minimo i danni fisici al profilo geometrico degli esemplari e non altera la relazione spaziale tra le strutture. Inoltre, i modelli tridimensionali (3D) delle strutture possono essere ricostruiti da immagini micro-CT12,14. Ad oggi, nonostante le prove che mostrano una compromissione della vista in seguito all'esposizione all'ambiente spaziale, sono disponibili pochi dati nei modelli animali per una migliore comprensione dei cambiamenti associati al volo spaziale nella struttura e nella funzione della retina. Nello studio attuale, i topi sono stati trasportati in una missione di 35 giorni a bordo della ISS per determinare l'impatto dell'ambiente del volo spaziale sulle strutture dei tessuti oculari quantificando la microstruttura della retina, dell'RPE e degli strati coroidi utilizzando micro-CT.
Protocol
Lo studio ha seguito le raccomandazioni delineate nella Guida per la cura e l'uso degli animali di laboratorio dei National Institutes of Health (NIH) ed è stato approvato sia dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Loma Linda University (LLU) che dalla National Aeronautics and Space Administration (NASA). Informazioni più dettagliate su questo esperimento di volo possono essere trovatealtrove 9,15.
1. Condizioni di volo e di controllo
NOTA: un carico utile del 12th Commercial Resupply Service (CRS-12) è stato lanciato da SpaceX al Kennedy Space Center (KSC) in una missione di 35 giorni nell'agosto 2017 che includeva topi C57BL/6 maschi di 10 settimane (n - 20) per il nono esperimento di ricerca sui roditori della NASA (RR-9).
- Prima di tornare sulla Terra tramite la capsula Dragon di SpaceX, i topi vivono negli Habitat Roditori (RH) della NASA a bordo della ISS per 35 giorni ad una temperatura ambiente di 26-28 gradi centigradi con un ciclo di luce/scuro di 12 ore durante il volo.
- Posizionare i topi Ground Control (GC) nello stesso hardware abitativo utilizzato in volo e abbinare i parametri ambientali come i livelli di temperatura e biossido di carbonio (CO2)il più vicino possibile in base ai dati di telemetria.
- Nutrire i topi GC la stessa dieta della NASA food bar come loro omologhi spaziali. Fornire sia il volo spaziale che i topi GC con lo stesso accesso ad libitum all'acqua e al cibo.
2. Valutazione post-volo dei topi
- Entro 28 ore dall'abbattimento sulla Terra, trasporta i topi alla Loma Linda University (LLU). Una volta lì, rimuovere i topi dall'hardware del recinto animale e valutare la sopravvivenza e la salute.
NOTA: Al momento dell'osservazione, il personale di ispezione ha riferito che tutti i topi erano sopravvissuti alla missione spaziale di 35 giorni ed erano in buone condizioni, cioè non evidenti carenze/ anomalie.
3. Dissezione e conservazione degli occhi dei topi dopo il volo spaziale
- Entro 38 (±4) ore di splashdown (n-20/gruppo), eutanasia i topi in 100% CO2 e raccogliere i loro occhi.
- Dissalare le retine dell'occhio destro e posizionarsi singolarmente in criovials sterili, bloccare a scatto in azoto liquido e mantenere a 80 gradi centigradi prima dell'uso.
- Fissare l'intero occhi sinistro in paraformaldeide del 4% in salina tamponata di fosfato (PBS) per 24 h e poi risciacquare con salina tamponata di fosfato (PBS) per i saggi micro-CT.
4. Preparazione del campione per la scansione micro-CT
- Dopo la fissazione, disidratare gli occhi dei topi in etanolo. Per prevenire ulteriori o bruschi restringimenti del campione fisso, utilizzare una serie di soluzioni di etanolo: a partire dal 50% di etanolo per 1 ora e quindi aumentando le concentrazioni delle soluzioni di etanolo come segue per 1 ora ciascuna: 70, 80, 90, 96 e 100%.
NOTA: Gli occhi dei topi devono essere maneggiati in una camera del cappuccio. - Colorazione dell'acido fosfomolybdico (PMA)
CAUTION: A causa della corrosiva della PMA, cancerogena e tossica per gli organi, sono necessarie adeguate attrezzature personali protettive, compreso l'uso di una cappa di fumi.- Preparare la soluzione di colorazione: 10 mg di PMA in 100 mL di etanolo assoluto.
- Macchiare gli occhi dei topi (10 wt. % acido fosfomolybdic - PMA sciolto in etanolo assoluto) per 6 giorni.
- Prima della scansione, lavare prima i campioni di occhio in etanolo assoluto e quindi posizionare ogni occhio in singoli contenitori di plastica da 2 mL che vengono riempiti con etanolo assoluto al 100%. Aggiungere un batuffolo di cotone per i campioni stabilizzati durante la scansione.
5. Scansione e analisi Micro-CT
NOTA: Lo scanner SkyScan 1272, un sistema Micro-CT a raggi X desktop, è stato utilizzato per la valutazione dei danni alla retina negli occhi dei topi
- Montare il campione di tessuto molle su un supporto campione appropriato. Per evitare qualsiasi movimento durante le misurazioni TC a raggi X, assicurarsi una stretta vestibilità del campione sul suo supporto (Figura 1).
- Dopo un allineamento meticoloso di ogni campione, eseguire la scansione individuale del campione tramite raggi X.
- Dopo aver aperto il software, centrare il campione nel frame. Nel protocollo, non utilizzare alcun filtro e impostare la matrice per aumentare il pixel a 4 m. Utilizzare il micro-posizionamento per mantenere il centro del campione sul telaio.
- Dopo di che, controllare il parametro per massimizzare l'agente di contrasto. Per eseguire la calibrazione, rimuovere il campione e verificare che la correzione a campo piatto sia maggiore dell'80%.
- Dopo la calibrazione, reinserire il campione nella camera di scansione. Per la scansione, utilizzare un passo di rotazione di 0,400, un fotogramma in media di 4, un movimento casuale di 30 e ruotare i campioni di 180 gradi.
- Utilizzare un jig di posizionamento per misurazioni ripetute. A causa del miglioramento del contrasto di fase eseguito come descritto, i dettagli dell'oggetto possono essere rilevati da raggi X generati da un tubo a raggi X a micro-focus sigillato (anodo di tungsteno) a 50 keV e 80 mA con un tempo di integrazione di 90 minuti.
NOTA: i parametri di acquisizione disposti in questa sezione per la selezione per produrre scansioni TC di panoramica con la massima qualità dell'immagine. - Dopo la scansione, utilizzare il software (ad esempio, NRecon) per ricostruire i dati.
- Regolare l'istogramma e utilizzare lo stesso intervallo (0 – 0,24) per tutti i campioni. Ricostruire la regione di interesse era un cerchio e non sono state utilizzate scale o etichette.
- Per ridurre gli artefatti durante la scansione, utilizzare una correzione di indurimento del fascio di 20, una correzione di levigatezza di 1, una riduzione dell'artefatto ad anello di 6 ed eseguire alcuna alterazione nella compensazione del disallineamento. Dopo la ricostruzione, è stato confermato che il campione era all'interno della regione di interesse.
- Riposizionare le immagini utilizzando un piano parallelo al nervo ottico e alla lente degli occhi.
- Dopo la scansione, utilizzare il software (ad esempio, DataViewer) per visualizzare le immagini ricostruite in tutte e tre le visualizzazioni.
NOTA: Se necessario, con questo software, le immagini possono essere riposizionate utilizzando un piano parallelo al nervo ottico e alla lente degli occhi per eseguire un'analisi standardizzata. - Analisi descrittiva
- Misurare le strutture utilizzando uno strumento di misurazione nel software (ad esempio, CTAn). Utilizzare il nervo ottico per delimitare la regione di interesse per l'analisi. Per calcolo, il protocollo ha utilizzato la sezione centrale per eseguire le misurazioni. Questa valutazione è stata eseguita mediante analisi descrittiva (Figura 2 e Figura 3).
- Eseguire misurazioni della retina, dell'epitelio del pigmento retino (RPE), della coroide e dello strato di sclera nella vista sagittale (Figura 2) e della vista assiale (Figura 3). Prendere tre misure di ogni struttura per calcolare una media.
Representative Results
Lo spessore medio dello strato di retina, RPE, coroide e sclera è stato registrato utilizzando le scansioni micro-CT dopo aver seguito il protocollo precedente (Figura 1). La tecnica ha mostrato una ricostruzione multiplana degli occhi in tre diverse viste. Durante l'analisi, l'osservatore è stato in grado di scorrere l'intero campione per standardizzare l'analisi proprio al centro del campione.
L'analisi micro-CT ha mostrato le aree della sezione trasversale degli occhi nella vista sagittale e assiale (Figura 2 e Figura 3) in cui sono state eseguite le misurazioni lineari. Lo strato RPE e coroide era significativamente o tende più basso nel gruppo di volo spaziale rispetto al gruppo GC (Figura 3).
Figura 1: Micro-CT procedura di tessuto molle. (A) Campione di tessuto molle (occhio di topo). (B) I campioni sono stati fissati in 4% formaldeide nella soluzione tampone di fosfati (PBS). Dopo la fissazione, gli occhi dei topi erano disidratati in etanolo. Per evitare un ulteriore e brusco restringimento del campione fisso, è stata utilizzata una serie di soluzioni etanolica, a partire dal 50% di etanolo per 1 h e dalle seguenti soluzioni di etanolo nelle concentrazioni elencate, per 1 ora ciascuna: 70, 80, 90, 96 e 100%. (C) Gli occhi dei topi sono stati macchiati di acido fosfomolybdic (PMA) per 6 giorni, lavati in etanolo assoluto e poi collocati in singoli contenitori di plastica da 2 mL riempiti di etanolo assoluto. (D) Uno scanner di sistema micro-CT a raggi X desktop è stato utilizzato per valutare la lesione della retina negli occhi dei topi. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Vista sagittale di un mouse di controllo a terra. Gli strati dell'occhio sul lato destro dell'immagine sono annotati, dall'alto verso il basso, retina (0,077 mm), strato di pigmento della retina (RPE, 0,038 mm), coroide (0,041 mm), sclera (0,059 mm). Questa cifra è stata presa da Overbey et al.15. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Vista assiale di un mouse di controllo a terra. Gli strati dell'occhio sul lato destro dell'immagine sono annotati, dall'alto verso il basso, retina (0,144 mm), strato di pigmento della retina (RPE, 0,051 mm), coroide (0,041 mm), sclera (0,073 mm). Questa cifra è stata presa da Overbey et al.15. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Spessore medio dello strato retino, dello strato RPE e dello strato coroideo misurato dalla micro-CT nei gruppi di volo spaziale e di controllo. I conteggi sono stati mediati su cinque retine per gruppo. I valori sono stati rappresentati come spessore medio ± errore standard (SEM). SEM della media è contrassegnato con barre di errore. Significativamente più basso nello spessore della sezione trasversale nel gruppo di volo spaziale (FLT) rispetto al gruppo di controllo a terra (GC) è indicato ''' (p < 0.05). Questa cifra è stata presa da Overbey et al.15. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
I risultati di questo studio hanno mostrato che ci sono stati cambiamenti strutturali nell'occhio del topo spaziale utilizzando la tecnica micro-CT rispetto ai gruppi GC, in particolare della retina, dell'RPE e degli strati coroidi dell'occhio, come evidenziato dal loro spessore ridotto. Micro-CT fornisce una tecnica efficiente e non distruttiva per caratterizzare i cambiamenti senza bisogno di manipolazione. L'uso della colorazione PMA ha migliorato la qualità delle immagini micro-CT per ottenere con successo immagini tomografiche 3D chiare dopo la ricostruzione, rinunciando a qualsiasi necessità di alterare fisicamente la struttura del campione. Un ulteriore vantaggio di queste immagini è che mostrano l'intera regione di interesse digitalmente, aumentando così l'accessibilità e la riproducibilità dei risultati. Attraverso le immagini micro-CT prodotte durante questo studio, il campione mirato ha mostrato la differenziazione delle strutture multiple come la retina, RPE, coroide e sclera strato per la determinazione dello spessore di ogni strato.
Un passo critico all'interno del protocollo è la manipolazione dei campioni a causa delle loro dimensioni e texture. La manipolazione del campione deve essere eseguita con attenzione senza esercitare pressione sul campione durante la preparazione. Il micro-CT ha alcune limitazioni: risoluzione e la mancanza di valori standardizzati per i parametri. Durante la scansione, i diversi scanner micro-CT possono avere diversi algoritmi di elaborazione delle immagini; ma la calibrazione per una scala di grigi potrebbe essere perseguita per superare qualsiasi problema. Dopo la scansione, la ricostruzione delle immagini dovrebbe essere basata sul tessuto e l'analisi che verrà eseguita. Può essere fondamentale poiché la qualità dell'immagine dipende dal sistema tomografico, dalle impostazioni, dalle dimensioni del campione e dai metodi dipreparazione 16,17.
Grazie alla sua applicazione di successo nello studio di diversi tipi di tessuti normali e patologici, le capacità di imaging micro-TC dovrebbero essere utilizzate nella ricerca futura per compilare dati volumetrici per altre analisi. Pertanto, sulla base dello scopo del presente studio, era accettabile utilizzare misurazioni bidimensionali, ma la segmentazione della struttura 3D lorda può anche essere utile per fornire un contorno preciso dell'intero campione. Anche con tutti i vantaggi di una tecnica non distruttiva, la micro-CT non sostituirà altri metodi come l'immunostochimica, ma completerà e consentirà successive analisi istologiche, se lo si desidera.
Una prolungata condizione di volo spaziale produce una serie di cambiamenti oculari strutturali e funzionali negli astronauti durante e dopo la missione spaziale definita SANS. I risultati includono spostamenti iperoppici, appiattimento del globo, pieghe cororoidali/retinali e macchie di cotone19. In contrasto con la tomografia a coerenza ottica (OCT) degli astronauti, è stata documentata in questo studio sulla micro-CT animale la ricerca di un ispessimento dello strato di fibra nervosa reticolare, l'assottigliamento della retina e dello strato corazza. Questi risultati sono stati inaspettati. Questa discrepanza può essere dovuta a fattori di confusione. I topi hanno un limitato spostamento del fluido di cefala rispetto all'uomo. Questa mancanza di spostamento fluido può aver evocato diverse risposte ai cambiamenti gravitazionali. In secondo luogo, i topi sono stati sezionati entro 38 ore dopo lo spruzzi, e una risposta acuta per il re-adattamento può anche contribuire a cambiamenti morfologici nella retina e nel coroide. La conferma di questa possibilità richiede ulteriori misurazioni durante il volo spaziale e a lungo termine dopo la missione.
I risultati di questo studio indicano che le condizioni di volo spaziale, in particolare i cambiamenti gravitazionali, possono indurre una risposta acuta e a breve termine nell'occhio. Sono necessarie ulteriori indagini per determinare le conseguenze dei cambiamenti acuti sulla funzione oculare sulla retina e sul meccanismo dei cambiamenti di struttura indotti dal volo spaziale.
Disclosures
Tutti gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto dalla sovvenzione NASA Space Biology - NNX15AB41G e LLU Department of Basic Sciences. Sungshin Choi, Dennis Leveson e Rebecca Klotz hanno contribuito in modo significativo al successo del nostro studio sui volo spaziali e apprezziamo molto il loro sostegno. Gli autori vorrebbero anche ringraziare l'intero gruppo NASA Biospecimen Sharing Program per la loro grande assistenza.
Gli autori ringraziano anche il Centro per la ricerca dentale per il servizio Micro-CT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 wt. % phosphomolybdic | Sigma | 12026-57-2 | |
| Ethanol absolute by Baker Analyzed | VWR | 80252500 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Merck | L1825 | |
| X-ray micro-CT system SkyScan 1272 scanner | Bruker |
References
- Dawson, L. The New Space Race. The Politics and Perils of Space Exploration. , Springer Praxis Books. 1-24 (2017).
- Mao, X. W., et al. Spaceflight environment induces mitochondrial oxidative damage in ocular tissue. Radiation Research. 180, 340-350 (2013).
- Overbey, E. G., et al. Mice Exposed to Combined Chronic Low-Dose Irradiation and Modeled Microgravity Develop Long-Term Neurological Sequelae. International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 4094 (2019).
- Nelson, E. S., Mulugeta, L., Myers, J. G. Microgravity-induced fluid shift and ophthalmic changes. Life. 4, 621-665 (2014).
- Lee, A. G., Mader, T. H., Robert Gibson, C., Brunstetter, T. J., Tarver, W. J. Space flight-associated neuro-ocular syndrome (SANS). Eye. 32, 1164-1167 (2018).
- Stenger, M. B., et al. Evidence Report: Risk of Spaceflight Associated Neuro-ocular Syndrome (SANS). , (2017).
- Garrett-Bakelman, F. E., et al. The NASA Twins Study: A multidimensional analysis of a year-long human spaceflight. Science. 364, (2019).
- Mader, T. H., et al. Optic disc edema, globe flattening, choroidal folds, and hyperopic shifts observed in astronauts after long duration space flight. Ophthalmology. 118, 2058-2069 (2011).
- Mao, X. W., et al. Characterization of mouse ocular response to a 35-day spaceflight mission: Evidence of blood-retinal barrier disruption and ocular adaptations. Science Reports. 9 (1), 8215 (2019).
- Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: a versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Developmental Dynamics. , 632-640 (2009).
- Silva, J. M. S., et al. Three-dimensional non-destructive soft-tissue visualization with X-ray staining micro-tomography. Science Reports. 5, 14088 (2015).
- Descamps, E., et al. Soft tissue discrimination with contrast agents using micro-CT scanning. Belgian Journal of Zoology. , 20-40 (2014).
- Wu, J., Yin, N. Anatomy research of nasolabial muscle structure in fetus with cleft lip: an iodine staining technique based on microcomputed tomography. Journal of Craniofacial Surgery. 25 (3), 1056-1061 (2014).
- Roque-Torres, G. D. Application of Micro-CT in Soft Tissue Specimen Imaging. In: Orhan K. (eds) Micro-computed Tomography (micro-CT) in Medicine and Engineering. , Springer. 139-170 (2020).
- Overbey, E. G., et al. Spaceflight influences gene expression, photoreceptor integrity, and oxidative stress-related damage in the murine retina. Science Reports. 9 (1), 13304 (2019).
- Elkhoury, J. E., Shankar, R., Ramakrishnan, T. S. Resolution and Limitations of X-Ray Micro-CT with Applications to Sandstones and Limestones. Transport in Porous Media. 129, 413-425 (2019).
- Sombke, A., Lipke, E., Michalik, P., Uhl, G., Harzsch, S. Potential and limitations of X-Ray micro-computed tomography in arthropod neuroanatomy: A methodological and comparative survey. Journal of Comparative Neurology. 523 (8), 1281-1295 (2015).
- Huang, A. S., Stenger, M. B., Macias, B. R. Gravitational Influence on Intraocular Pressure: Implications for Spaceflight and Disease. Journal of Glaucoma. 28 (8), 756-764 (2019).
- Lee, A. G., et al. Spaceflight associated neuro-ocular syndrome (SANS) and the neuro-ophthalmologic effects of microgravity: a review and an update. NPJ Microgravity. 6, 7 (2020).
