Summary
Vi presenterar ett protokoll med hjälp av högupplösta mikro-datortomografi imaging att avgöra om spaceflight inducerad skador på okulär strukturer. Protokollet visar mikro-CT-härledda mätning av ex vivo gnagare okulär strukturer. Vi visar förmåga att bedöma okulär morfologiska förändringar efter spaceflight med hjälp av en icke-förstörande tridimensional teknik för att utvärdera okulär skador.
Abstract
Rapporter visar att långvarig exponering för en rymdfärd miljö producerar morfologic och funktionella oftalmiska förändringar i astronauter under och efter en internationell rymdstation (ISS) uppdrag. De underliggande mekanismerna för dessa spaceflight-inducerade förändringar är dock för närvarande okända. Syftet med den föreliggande studien var att fastställa påverkan av spaceflight miljön på okulär strukturer genom att utvärdera tjockleken på musen näthinnan, retinal pigment epitel (RPE), den choroid och sclera lagret med hjälp av mikro-CT imaging. Tio veckor gamla C57BL/6 hanmöss var inrymt ombord på ISS för en 35-dagars uppdrag och sedan återvände till jorden levande för vävnad analys. Som jämförelse, markkontroll (GC) möss på jorden bibehölls i identiska miljöförhållanden och hårdvara. Okulära vävnadsprover samlades in för mikro-CT-analys inom 38(±4) timmar efter splashdown. Bilderna av tvärsnitt av näthinnan, RPE, den choroid och sclera lagret av den fasta ögat spelades in i en axiell och sagittal vy med hjälp av en mikro-CT imaging förvärv metod. Mikro-CT-analysen visade att tvärsnittsområdena i näthinnan, RPE och choroid skikttjockleken ändrades i spaceflight prover jämfört med GC, med rymdfärder prover visar betydligt tunnare tvärsnitt och lager jämfört med kontroller. Resultaten från denna studie visar att mikro-CT utvärdering är en känslig och tillförlitlig metod för att karakterisera okulär struktur förändringar. Dessa resultat förväntas förbättra förståelsen av miljöbelastningens inverkan på globala okulärstrukturer.
Introduction
I mikrogravitationsmiljön hos rymdfärder kan ökat intrakraniellt tryck (ICP) som orsakas av vätskeförskjutning ha bidragit till rymdfärdsrelacierat neurookulärt syndrom (SANS)1,2,3,4,5. Faktum är att över 40% av astronauterna har upplevt SANS under och efter en internationell rymdstation (ISS) uppdrag6, inklusive rymdfärder föremål för NASA Twins Study7. Den nuvarande patofysiologi av SANS omfattar fysiologiska förändringar såsom optisk skiva ödem, globe flattening, choroidal och retinal veck, hyperopic brytning fel skift, och nerv fiber lager infarcts (dvs. bomull fläckar ull) och är väl dokumenterade5,8. De underliggande mekanismerna för de förändringar och faktorer som bidrar till skadeutvecklingen är dock oklara. För att få en bättre förståelse av SANS finns djurmodeller för att karakterisera de rymdfärdsrelaterade förändringarna i näthinnans struktur och funktion.
I en tidigare undersökning på samma djur, rapporterade vi effekterna av 35 dagars rymdfärder på mus näthinnan. Resultaten belyser att rymdfärder framkallar betydande skador i näthinnan och näthinnan vasculature, och vissa proteiner / vägar i samband med celldöd, inflammation och metabolisk stress ändrades avsevärt efterrymdfärder 9.
För närvarande finns det en mängd noninvasive imaging tekniker som fastställts för att övervaka sjukdomsutveckling och progression, samt fysiologiska reaktioner på olika miljö stressfaktorer, som också används i stor utsträckning i små gnagare modeller. En av dessa tekniker är mikro-CT, som utvärderar anatomiska strukturer och patologiska processer, och har framgångsrikt använts på organismer så små som möss10.
Micro-CT kan uppnå en microsized upplösning, och det kan ge hög kontrast för volymetrisk analys av mjuka vävnader med tillägg av lämplig kontrastmedel10,11,12,13,14. Mikro-CT-teknik är fördelaktig jämfört med traditionella metoder som bruttoanatomi, lättmikroskopi och histologiundersökning, eftersom den minimerar fysisk skada på exemplarens geometriska profil och inte förändrar det rumsliga förhållandet mellan strukturer. Dessutom kan tredimensionella (3D) modeller av strukturer rekonstrueras från mikro-CT bilder12,14. Hittills, trots bevis som visar synnedsättning efter exponering för rymdmiljön, få data i djurmodeller finns tillgängliga för en bättre förståelse av rymdfärder-associerade förändringar i näthinnans struktur och funktion. I den aktuella studien flögs möss på ett 35-dagars uppdrag ombord på ISS för att fastställa rymdfärdsmiljöns inverkan på okulär vävnadsstrukturer genom att kvantifiera mikrostrukturen i näthinnan, RPE och choroidlagren med hjälp av mikro-CT.
Protocol
Studien följde de rekommendationer som beskrivs i Guide for the Care and Use of Laboratory Animals of the National Institutes of Health (NIH) och godkändes av både Institutionella Animal Care and Use Committee (IACUC) av Loma Linda University (LLU) och National Aeronautics and Space Administration (NASA). Mer detaljerad information angående detta flygexperiment finns på annathåll 9,15.
1. Flyg- och kontrollförhållanden
OBS: En 12: e kommersiella Resupply Service (CRS-12) nyttolast lanserades av SpaceX på Kennedy Space Center (KSC) på ett 35-dagars uppdrag i augusti 2017 som inkluderade ombord 10-veckors manliga C57BL/6 möss (n = 20) för NASA: s nionde Gnagare Research experiment (RR-9).
- Innan du återvänder till jorden via SpaceX's Dragon kapsel, ha mössen bor i NASA: s Gnagare Livsmiljöer (RH) ombord ISS i 35 dagar vid en omgivande temperatur på 26–28 °C med en 12-timmars ljus / mörker cykel under hela flygningen.
- Placera Jordkontroll (GC) möss i samma hölje hårdvara som används i flygning och matcha miljöparametrar såsom temperatur och koldioxid (CO2) nivåer så nära som möjligt baserat på telemetri data.
- Feed GC möss samma NASA mat bar diet som deras rymdbaserade motsvarigheter. Ge både rymdfärder och GC-möss med samma ad libitum tillgång till vatten och mat.
2. Utvärdering av mössen efter flygning
- Inom 28 timmar efter splashdown på jorden, transportera möss till Loma Linda University (LLU). Väl där, ta bort möss från djurutrymmet hårdvara och bedöma för överlevnad och hälsa.
OBS: Vid observation rapporterade inspekterande personal att alla möss hade överlevt 35-dagars rymduppdrag och var i gott skick, dvs inga märkbara brister/avvikelser.
3. Dissekera och bevarande av mus ögon efter rymdfärder
- Inom 38(±4) timmar av splashdown (n= 20/grupp), avliva mössen i 100% CO2 och samla deras ögon.
- Dissekera höger öga näthinnor och placera individuellt i sterila cryovials, snap-frysa i flytande kväve, och hålla vid −80 °C före användning.
- Fixera hela vänsterögon i 4% paraformaldehyd i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i 24 h och skölj sedan med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för mikro-CT-analyser.
4. Provförberedelse för mikro-CT-scanning
- Efter fixering, torka mössens ögon i etanol. För att förebygga ytterligare eller abrupt krympning av det fasta provet, använd en graderad serie av etanollösningar: börjar med 50% etanol i 1 timme och sedan öka koncentrationerna av etanollösningarna enligt följande i 1 timme vardera: 70, 80, 90, 96 och 100%.
OBS: Mössens ögon måste hanteras i en huvkammare. - Fosfomolybdinsyra (PMA) färgning
VARNING: På grund av PMA är frätande, en cancerframkallande, och giftiga för organ, lämplig skyddande personlig utrustning är nödvändig, inklusive användning av en rök huva.- Bered färgningslösningen: 10 mg PMA i 100 mL absolut etanol.
- Fläcka mössens ögon (10 wt. % fosfomolybdisk syra - PMA upplöst i absolut etanol) i 6 dagar.
- Före skanning, först tvätta ögonproverna i absolut etanol och sedan placera varje öga i enskilda 2 mL plastbehållare som är fyllda med 100% absolut etanol. Tillsätt en bomullstuss till stabiliserade prover under skanningen.
5. Mikro-CT scanning och analys
OBS: SkyScan 1272 scanner, en stationär röntgen Micro-CT-system, användes för utvärdering av näthinnans skador i mössens ögon
- Montera mjukdelsprovet på en lämplig provhållare. För att förhindra all rörelse under röntgen-CT-mätningarna, säkerställa en tät passform av provet på sin hållare (Bild 1).
- Vid noggrann anpassning av varje prov, individuellt skanna provet via röntgenstrålar.
- När du har öppnat programvaran, centrera provet i ramen. I protokollet använder du inget filter och ställer in matrisen för att öka pixeln vid 4 μm. Använd mikro-positionering för att hålla provcentret på ramen.
- Efter det, kontrollera parametern för att maximera kontrastmedel. För att utföra kalibreringen, ta bort provet och kontrollera att korrigeringen med platt fält är större än 80 %.
- Efter kalibreringen sätter du in provet i skanningskammaren igen. För skanning, använd ett rotationssteg på 0,400, en ram i genomsnitt 4, en slumpmässig rörelse på 30, och rotera proverna 180°.
- Använd en positioneringsjigg för upprepade mätningar. På grund av fas-kontrast förbättring utförs enligt beskrivningen, objekt detaljer så liten som 4 μm kan upptäckas från röntgenstrålar som genereras av en förseglad mikro-fokus röntgenrör (volfram anod) vid 50 keV och 80 mA med en integrationstid på 90 minuter.
OBS: De förvärvsparametrar som anges i detta avsnitt för val för att producera översikt ct skanningar med högsta bildkvalitet. - Efter skanning, använd programvara (t.ex. NRecon) för att rekonstruera data.
- Justera histogrammet och använd samma räckvidd (0 – 0,24) för alla proverna. Rekonstruera region av intresse var en cirkel, och inga skalor eller etiketter användes.
- För att minska artefakter under skanningen, använd en beam-härdning korrigering av 20, en utjämning korrigering av 1, en ring artefakt minskning av 6, och utför ingen förändring i feljustering ersättning. Efter återuppbyggnaden bekräftades det att urvalet låg inom den region som var av intresse.
- Flytta om bilder med hjälp av ett plan parallellt med synnerven och linsen i ögonen.
- Efter skanning, använd programvara (t.ex. DataViewer) för att visualisera de rekonstruerade bilderna i alla tre vyerna.
OBS: Vid behov kan bilderna med denna programvara åter placeras med hjälp av ett plan parallellt med synnerven och linsen i ögonen för att utföra en standardiserad analys. - Beskrivande analys
- Mät strukturerna med hjälp av ett mätverktyg i programvaran (t.ex. CTAn). Använd den optiska nerven för att avgränsa den region av intresse för analys. Genom beräkning använde protokollet det mellersta segmentet för att utföra mätningarna. Denna utvärdering utfördes genom beskrivande analys (figur 2 och figur 3).
- Utför mätningar av näthinnan, näthinnans pigmentepitel (RPE), koroid, och sclera-skikt i sagittal (Figur 2) och axial vy (Figur 3). Gör tre mätningar av varje struktur för att beräkna ett medelvärde.
Representative Results
Medelvärdet tjocklek näthinnan, RPE, choroid, och sclera skiktet spelades in med hjälp av mikro-CT-skanningar efter att ha följt protokollet ovan (Figur 1). Tekniken visade en multiplanar rekonstruktion av ögonen i tre olika vyer. Under analysen kunde observatören bläddra igenom hela provet för att standardisera analysen mitt i provet.
Mikro-CT-analysen visade tvärsnittsområdena i ögonen i sagittal och axiell vy (figur 2 och figur 3) i vilka utfördes de linjära mätningarna. RPE och choroid skikt var betydligt eller trend lägre i gruppen rymdfärder när jämfört med GC-gruppen (Figur 3).
Figur 1: Mikro-CT-förfarande av mjuk vävnad. (A) Mjukdelsprov (musöga). (B) Prov fastställdes i 4% formaldehyd i fosfat buffertlösning (PBS). Efter fixering var mössens ögon uttorkade i etanol. För att förhindra en ytterligare och abrupt krympning av det fasta provet användes en graderad serie av etanollösningar, som började med 50% etanol för 1 h och följande etanollösningar i de koncentrationer som anges, under 1 timme vardera: 70, 80, 90, 96 och 100%. (C) Mössens ögon var färgas i fosfomolybdinsyra (PMA) i 6 dagar, tvättas i absolut etanol och sedan placeras i enskilda 2 mL plastbehållare fyllda med absolut etanol. (D) En stationär röntgen mikro-CT system scanner användes för att utvärdera retinal skada i möss ögon. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 2: Sagittal vy av en markkontrollmus. Lager av ögat på bildens högra sida är kommenterade, från topp till botten, näthinnan (0,077 mm), näthinnans pigmentskikt (RPE, 0,038 mm), koroid (0,041 mm), sclera (0,059 mm). Denna siffra har tagits från Overbey et al.15. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 3: Axiell vy av en markkontrollmus. Lager av ögat på den högra sidan av bilden är kommenterade, från topp-till-botten, näthinnan (0,144 mm), näthinnan pigmentskikt (RPE, 0,051 mm), koroid (0,041 mm), sclera (0,073 mm). Denna siffra har tagits från Overbey et al.15. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 4: Medeltjocklek på näthinneskiktet, RPE-skiktet och det koroidlager som uppmätts med mikro-CT i rymdfärds- och kontrollgrupperna. Antalet var i genomsnitt över fem näthinnor per grupp. Värden representerades som medeltjocklek ± standardfel (SEM). SEM av medelvärdet är markerat med felstaplar. Betydligt lägre i tvärsnittstjocklek i gruppen rymdfärder (FLT) jämfört med gruppen för markkontroll (GC) betecknas '*' (p < 0.05). Denna siffra har tagits från Overbey et al.15. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Discussion
Resultaten av denna studie visade att det fanns strukturella förändringar i spaceflight musögat med hjälp av mikro-CT-tekniken jämfört med GC-grupper, särskilt av näthinnan, RPE, och choroid lagren av ögat, vilket framgår av deras minskade tjocklek. Micro-CT ger en effektiv och icke-förstörande teknik för att karakterisera förändringarna utan behov av manipulation. Användningen av PMA färgning förbättrade kvaliteten på mikro-CT bilder för att framgångsrikt få tydliga 3D-tomographic bilder efter återuppbyggnad, föregående något behov av att fysiskt ändra strukturen i exemplaret. En extra fördel med dessa bilder är att de visar hela regionen av intresse digitalt, och därigenom öka tillgängligheten samt reproducerbarhet av resultaten. Genom mikro-CT bilder som produceras under denna studie, visade riktade exemplar differentiering av flera strukturer som näthinnan, RPE, choroid och sclera skikt för bestämning av tjockleken på varje lager.
Ett kritiskt steg inom protokollet är manipuleringen av proverna på grund av deras storlek och konsistens. Hanteringen av preparatet måste göras noggrant utan att sätta press på preparatet under beredningen. Mikro-CT har vissa begränsningar: upplösning och bristen på standardiserade värden för parametrarna. Under skanningen kan de olika mikro-CT-skannrarna ha olika bildbehandlingsalgoritmer; ändå kalibrering för en gråskala kan eftersträvas för att övervinna alla problem. Efter skanning ska rekonstruktion av bilderna baseras på vävnaden och den analys som kommer att utföras. Det kan vara kritisk eftersom bildkvaliteten beror på det tomographic systemet, inställningarna, provexemplarstorleken samtberedningsmetoderna 16,17.
På grund av dess framgångsrika tillämpning i att studera flera typer av normala och patologiskt vävnader, mikro-CT imaging kapacitet bör användas i framtida forskning för att sammanställa volumetric data för andra analyser. Baserat på den aktuella studiens syfte var det således acceptabelt att använda måttmått av bidimensionell typ, men segmentering av 3D-bruttostrukturen kan också vara fördelaktigt att ge en exakt kontur av hela exemplaret. Även med alla fördelar med en icke-förstörande teknik, kommer mikro-CT inte ersätta andra metoder såsom immunohistokemi, men kommer att komplettera och tillåta efterföljande analyser histologi om så önskas.
En långvarig rymdfärder tillstånd producerar en rad strukturella och funktionella okulär förändringar i astronauterna under och efter rymduppdraget definieras som SANS. Resultaten inkluderar hyperopic skift, jordglob tillplattad, koroidal / retinal veck, och bomull fläckar19. I motsats till astronauternas optisk koherens tomografi (OCT) konstaterande av retinal nerv fiber skikt förtjockning, var gallring av näthinnan och choroidal lagret dokumenteras i denna djur mikro-CT studie. Dessa resultat var oväntade. Denna diskrepans kan bero på förvirrande faktorer. Möss har begränsad cephalad vätska skift jämfört med människa. Denna brist på vätskeskifte kan ha framkallat olika svar på gravitationella förändringar. För det andra, möss dissekerades inom 38 timmar efter splashdown, och ett akut svar för re-anpassning kan också bidra till morfologiska förändringar i näthinnan och choroid. Bekräftelse av denna möjlighet kräver ytterligare mätningar under rymdfärder och lång sikt efter uppdraget.
Resultaten av denna studie visar att rymdfärder, särskilt gravitationsförändringar, kan framkalla ett akut och kortvarigt svar i ögat. Ytterligare utredning behövs för att fastställa konsekvenserna av de akuta förändringar på okulär på näthinnefunktion och mekanism för rymdfärder–inducerad struktur förändringar.
Disclosures
Alla författare har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av NASA Space Biology grant # NNX15AB41G och LLU Institutionen för grundvetenskaper. Sungshin Choi, Dennis Leveson och Rebecca Klotz bidrog avsevärt till framgången för vår rymdfärdsstudie och vi uppskattar verkligen deras stöd. Författarna vill också tacka hela NASA Biospecimen Sharing Program grupp för deras stora hjälp.
Författarna vill också tacka Center for Dental Research för Micro-CT service.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 wt. % phosphomolybdic | Sigma | 12026-57-2 | |
| Ethanol absolute by Baker Analyzed | VWR | 80252500 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Merck | L1825 | |
| X-ray micro-CT system SkyScan 1272 scanner | Bruker |
References
- Dawson, L. The New Space Race. The Politics and Perils of Space Exploration. , Springer Praxis Books. 1-24 (2017).
- Mao, X. W., et al. Spaceflight environment induces mitochondrial oxidative damage in ocular tissue. Radiation Research. 180, 340-350 (2013).
- Overbey, E. G., et al. Mice Exposed to Combined Chronic Low-Dose Irradiation and Modeled Microgravity Develop Long-Term Neurological Sequelae. International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 4094 (2019).
- Nelson, E. S., Mulugeta, L., Myers, J. G. Microgravity-induced fluid shift and ophthalmic changes. Life. 4, 621-665 (2014).
- Lee, A. G., Mader, T. H., Robert Gibson, C., Brunstetter, T. J., Tarver, W. J. Space flight-associated neuro-ocular syndrome (SANS). Eye. 32, 1164-1167 (2018).
- Stenger, M. B., et al. Evidence Report: Risk of Spaceflight Associated Neuro-ocular Syndrome (SANS). , (2017).
- Garrett-Bakelman, F. E., et al. The NASA Twins Study: A multidimensional analysis of a year-long human spaceflight. Science. 364, (2019).
- Mader, T. H., et al. Optic disc edema, globe flattening, choroidal folds, and hyperopic shifts observed in astronauts after long duration space flight. Ophthalmology. 118, 2058-2069 (2011).
- Mao, X. W., et al. Characterization of mouse ocular response to a 35-day spaceflight mission: Evidence of blood-retinal barrier disruption and ocular adaptations. Science Reports. 9 (1), 8215 (2019).
- Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: a versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Developmental Dynamics. , 632-640 (2009).
- Silva, J. M. S., et al. Three-dimensional non-destructive soft-tissue visualization with X-ray staining micro-tomography. Science Reports. 5, 14088 (2015).
- Descamps, E., et al. Soft tissue discrimination with contrast agents using micro-CT scanning. Belgian Journal of Zoology. , 20-40 (2014).
- Wu, J., Yin, N. Anatomy research of nasolabial muscle structure in fetus with cleft lip: an iodine staining technique based on microcomputed tomography. Journal of Craniofacial Surgery. 25 (3), 1056-1061 (2014).
- Roque-Torres, G. D. Application of Micro-CT in Soft Tissue Specimen Imaging. In: Orhan K. (eds) Micro-computed Tomography (micro-CT) in Medicine and Engineering. , Springer. 139-170 (2020).
- Overbey, E. G., et al. Spaceflight influences gene expression, photoreceptor integrity, and oxidative stress-related damage in the murine retina. Science Reports. 9 (1), 13304 (2019).
- Elkhoury, J. E., Shankar, R., Ramakrishnan, T. S. Resolution and Limitations of X-Ray Micro-CT with Applications to Sandstones and Limestones. Transport in Porous Media. 129, 413-425 (2019).
- Sombke, A., Lipke, E., Michalik, P., Uhl, G., Harzsch, S. Potential and limitations of X-Ray micro-computed tomography in arthropod neuroanatomy: A methodological and comparative survey. Journal of Comparative Neurology. 523 (8), 1281-1295 (2015).
- Huang, A. S., Stenger, M. B., Macias, B. R. Gravitational Influence on Intraocular Pressure: Implications for Spaceflight and Disease. Journal of Glaucoma. 28 (8), 756-764 (2019).
- Lee, A. G., et al. Spaceflight associated neuro-ocular syndrome (SANS) and the neuro-ophthalmologic effects of microgravity: a review and an update. NPJ Microgravity. 6, 7 (2020).
