Summary
Presentamos un protocolo que utiliza imágenes de tomografía microc calcular por microcompasión de alta resolución para determinar si los rayos espaciales indujeron daño en las estructuras oculares. El protocolo muestra la medición derivada de micro-CT de estructuras oculares de roedores ex vivo. Demostramos la capacidad de evaluar los cambios morfológicos oculares después de los vuelos espaciales utilizando una técnica tridimensional no destructiva para evaluar el daño ocular.
Abstract
Los informes muestran que la exposición prolongada a un entorno de vuelo espacial produce cambios oftálmicos morfológicos y funcionales en los astronautas durante y después de una misión de la Estación Espacial Internacional (ISS). Sin embargo, actualmente se desconocen los mecanismos subyacentes de estos cambios inducidos por el vuelo espacial. El propósito del presente estudio fue determinar el impacto del ambiente de vuelo espacial en las estructuras oculares mediante la evaluación del grosor de la retina del ratón, el epitelio pigmentario de la retina (RPE), la capa de coroides y la capa de esclerótica utilizando imágenes micro-CT. Los ratones macho C57BL/6 de diez semanas de edad fueron alojados a bordo de la ISS para una misión de 35 días y luego regresaron a la Tierra con vida para el análisis de tejidos. Para comparar, los ratones de control de tierra (GC) en la Tierra se mantuvieron en condiciones ambientales y hardware idénticos. Se recogieron muestras de tejido ocular para el análisis de micro-CT dentro de 38(±4) horas después de la salpicadura. Las imágenes de la sección transversal de la retina, el RPE, la coroides y la capa de esclerótica del ojo fijo se registraron en una vista axial y sagital utilizando un método de adquisición de imágenes micro-CT. El análisis de micro-CT mostró que las áreas de sección transversal de la retina, el RPE y el grosor de la capa coroides se cambiaron en muestras de vuelo espacial en comparación con GC, con muestras de vuelo espacial que muestran secciones transversales y capas significativamente más delgadas en comparación con los controles. Los resultados de este estudio indican que la evaluación de la micro-TC es un método sensible y confiable para caracterizar los cambios en la estructura ocular. Se espera que estos resultados mejoren la comprensión del impacto del estrés ambiental en las estructuras oculares globales.
Introduction
En el entorno de microgravedad de los rayos espaciales, el aumento de la presión intracraneal (ICP) causada por el cambio de fluidos puede haber contribuido al síndrome neuroo ocular asociado a los rayos espaciales (SANS)1,2,3,4,5. De hecho, más del 40% de los astronautas han experimentado SANS durante y después de una misión6de la Estación Espacial Internacional (ISS), incluyendo el tema de los vuelos espaciales del Estudio7 delos Gemelos de la NASA. La fisiopatología actual del SANS incluye cambios fisiológicos tales como edema de disco óptico, aplanamiento del globo, pliegues coroidales y retinales, cambios de error refractivo hiperópico e infartos de capa de fibra nerviosa (es decir, manchas de lana de algodón) y están bien documentados5,,8. Sin embargo, los mecanismos subyacentes de los cambios y factores que contribuyen al desarrollo del daño no están claros. Con el fin de tener una mejor comprensión de SANS, los modelos de animales están disponibles para caracterizar los cambios asociados a los flujos espaciales en la estructura y función de la retina.
En una investigación previa sobre los mismos animales, reportamos el impacto de 35 días de vuelo espacial en la retina del ratón. Los resultados aclaran que el vuelo espacial induce daños significativos en la retina y la vasculatura de la retina, y algunas proteínas / vías asociadas con la muerte celular, la inflamación y el estrés metabólico se alteraron significativamente después del vuelo espacial9.
Actualmente, hay una variedad de técnicas de imagen no invasivas establecidas para monitorear el desarrollo y la progresión de la enfermedad, así como respuestas fisiológicas a diversos factores estresantes ambientales, que también se utilizan ampliamente en pequeños modelos de roedores. Una de estas técnicas es el micro-CT, que evalúa las estructuras anatómicas y los procesos patológicos, y se ha utilizado con éxito en organismos tan pequeños como ratones10.
Micro-CT puede lograr una resolución microsized, y puede proporcionar un alto contraste para el análisis volumétrico de tejidos blandos con la adición del agente de contraste apropiado10,11,12,13,14. La tecnología de micro-CT es ventajosa en comparación con los métodos tradicionales como la anatomía bruta, la microscopía de luz y el examen de histología, ya que minimiza el daño físico al perfil geométrico de los especímenes y no altera la relación espacial entre las estructuras. Además, los modelos tridimensionales (3D) de estructuras se pueden reconstruir a partir de imágenes micro-CT12,,14. Hasta la fecha, a pesar de la evidencia que muestra deterioro de la visión después de la exposición al entorno espacial, pocos datos en modelos animales están disponibles para una mejor comprensión de los cambios asociados al vuelo espacial en la estructura y función de la retina. En el estudio actual, los ratones fueron volados en una misión de 35 días a bordo de la ISS para determinar el impacto del ambiente del vuelo espacial en las estructuras de tejido ocular mediante la cuantificación de la microestructura de la retina, el RPE y las capas coroides utilizando micro-CT.
Protocol
El estudio siguió las recomendaciones descritas en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) y fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Loma Linda (LLU) y la Administración Nacional de Aeronáutica y del Espacio (NASA). Puede encontrar información más detallada sobre este experimento de vuelo en otroslugares 9,,15.
1. Condiciones de vuelo y control
NOTA: Un 12o Servicio de Reabastecimiento Comercial (CRS-12) fue lanzado por SpaceX en el Centro Espacial Kennedy (KSC) en una misión de 35 días en agosto de 2017 que incluyó a bordo a bordo a bordo masculino C57BL/6 ratones de 10 semanas de edad para el noveno experimento de investigación de roedores de la NASA (RR-9).
- Antes de regresar a la Tierra a través de la cápsula Dragon de SpaceX, pida a los ratones que vivan en los Hábitats de Rodent (RH) de la NASA a bordo de la ISS durante 35 días a una temperatura ambiente de 26-28 oC con un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas durante todo el vuelo.
- Coloque los ratones de control de tierra (GC) en el mismo hardware de carcasa utilizado en vuelo y haga coincidir parámetros ambientales como la temperatura y los niveles de dióxido de carbono (CO2)lo más cerca posible en función de los datos de telemetría.
- Alimenta a los ratones GC en la misma dieta de barras de alimentos de la NASA que sus contrapartes basadas en el espacio. Proporcione tanto a los ratones de vuelo espacial como a los ratones GC el mismo acceso ad libitum al agua y a los alimentos.
2. Evaluación posterior al vuelo de los ratones
- Dentro de las 28 horas de salpicaduras en la Tierra, transporta a los ratones a la Universidad Loma Linda (LLU). Una vez allí, retire los ratones del hardware del recinto de animales y evalúe la supervivencia y la salud.
NOTA: Tras la observación, el personal de inspección informó que todos los ratones habían sobrevivido a la misión espacial de 35 días y estaban en buenas condiciones, es decir, no había deficiencias/anomalías notables.
3. Disección y preservación de los ojos del ratón después del vuelo espacial
- Dentro de las 38(±4) horas de salpicaduras (n-20/grupo), eutanasia a los ratones en 100% CO2 y recoge sus ojos.
- Diseccione las retinas del ojo derecho y colóquese individualmente en criooviales estériles, congele el presión en nitrógeno líquido y manténgalo a 80 oC antes de su uso.
- Fijar todo el ojo izquierdo en 4% de paraformaldehído en solución salina tamponada por fosfato (PBS) durante 24 h y luego enjuagar con solución salina tamponada por fosfato (PBS) para ensayos de micro-CT.
4. Preparación de muestras para la exploración de micro-CT
- Después de la fijación, deshidratar los ojos de los ratones en etanol. Para evitar cualquier contracción posterior o abrupta de la muestra fija, utilice una serie de soluciones de etanol calificadas: comenzando con 50% de etanol durante 1 hora y luego aumentando las concentraciones de las soluciones de etanol de la siguiente manera durante 1 hora cada una: 70, 80, 90, 96 y 100%.
NOTA: Los ojos de los ratones deben ser manejados en una cámara de la capucha. - Tinción de ácido fosfomolídico (PMA)
ADVERTENCIA: Debido a que el PMA es corrosivo, cancerígeno y tóxico para los órganos, se necesitan equipos personales de protección adecuados, incluido el uso de una campana de humo.- Preparar la solución de tinción: 10 mg de PMA en 100 ml de etanol absoluto.
- Manchar los ojos de los ratones (10 wt. % ácido fosfomolíbico - PMA disuelto en etanol absoluto) durante 6 días.
- Antes de escanear, primero lave las muestras de ojos en etanol absoluto y luego coloque cada ojo en recipientes individuales de plástico de 2 ml que estén llenos de etanol 100% absoluto. Agregue una almohadilla de algodón a las muestras estabilizadas durante la exploración.
5. Escaneo y análisis de micro-CT
NOTA: El escáner SkyScan 1272, un sistema Micro-CT de rayos X de escritorio, se utilizó para la evaluación del daño de la retina en los ojos de los ratones
- Monte la muestra de tejido blando en un soporte de muestra adecuado. Para evitar cualquier movimiento durante las mediciones de TC de rayos X, asegúrese de un ajuste ajustado de la muestra en su soporte (Figura 1).
- Tras la alineación meticulosa de cada muestra, escanee individualmente la muestra a través de rayos X.
- Después de abrir el software, centre la muestra en el marco. En el protocolo, no utilice ningún filtro y establezca la matriz para aumentar el píxel a 4 m. Utilice el microposicionamiento para mantener el centro de muestra en el marco.
- Después de eso, marque el parámetro para maximizar el agente de contraste. Para realizar la calibración, quite la muestra y compruebe que la corrección de campo plano es superior al 80%.
- Después de la calibración, vuelva a insertar la muestra en la cámara de escaneado. Para escanear, utilice un paso de rotación de 0.400, un marco con un promedio de 4, un movimiento aleatorio de 30 y gire las muestras 180o.
- Utilice una plantilla de posicionamiento para mediciones repetidas. Debido a la mejora del contraste de fase realizada como se describe, los detalles del objeto tan pequeños como 4 m se pueden detectar a partir de rayos X generados por un tubo de rayos X de microenfoco sellado (ánodo de tungsteno) a 50 keV y 80 mA con un tiempo de integración de 90 minutos.
NOTA: Los parámetros de adquisición establecidos en esta sección para la selección para producir escaneos de TC de visión general con la más alta calidad de imagen. - Después de escanear, utilice software (por ejemplo, NRecon) para reconstruir los datos.
- Ajuste el histograma y utilice el mismo rango (0 – 0.24) para todas las muestras. Reconstruir región de interés era un círculo, y no se utilizaron escalas o etiquetas.
- Para reducir los artefactos durante el escaneo, utilice una corrección de endurecimiento de haz de 20, una corrección de suavizado de 1, una reducción de artefacto de anillo de 6 y no realice ninguna alteración en la compensación de desalineación. Después de la reconstrucción, se confirmó que la muestra estaba dentro de la región de interés.
- Vuelva a colocar las imágenes utilizando un plano paralelo al nervio óptico y la lente de los ojos.
- Después de escanear, utilice software (por ejemplo, DataViewer) para visualizar las imágenes reconstruidas en las tres vistas.
NOTA: Si es necesario, con este software, las imágenes se pueden volver a colocar utilizando un plano paralelo al nervio óptico y la lente de los ojos para realizar un análisis estandarizado. - Análisis descriptivo
- Mida las estructuras utilizando una herramienta de medición en el software (por ejemplo, CTAn). Utilice el nervio óptico para delimitar la región de interés para el análisis. Por cálculo, el protocolo utilizaba el sector medio para realizar las mediciones. Esta evaluación se realizó mediante un análisis descriptivo(Figura 2 y Figura 3).
- Realizar mediciones de la retina, el epitelio pigmentario de la retina (RPE), la coroides y la capa de esclerótica en la vista sagital (Figura 2) y axial (Figura 3). Tome tres medidas de cada estructura para calcular un promedio.
Representative Results
El grosor medio de la capa de retina, RPE, coroides y esclerótica se registró utilizando las exploraciones micro-CT después de seguir el protocolo anterior (Figura 1). La técnica mostró una reconstrucción multiplanar de los ojos en tres puntos de vista diferentes. Durante el análisis, el observador pudo desplazarse por toda la muestra para estandarizar el análisis justo en el centro de la muestra.
El análisis de micro-CT mostró las áreas transversales de los ojos en la vista sagital y axial (Figura 2 y Figura 3) en las que se realizaron las mediciones lineales. RPE y capa coroides fueron significativamente o tendencia más baja en el grupo de vuelo espacial en comparación con el grupo GC (Figura 3).
Figura 1: Procedimiento micro-CT de tejido blando. (A) Muestra de tejido blando (ojo de ratón). (B) Las muestras se fijaron en un 4% de formaldehído en solución tampón de fosfato (PBS). Después de la fijación, los ojos de los ratones se deshidrataron en etanol. Para evitar una contracción más y abrupta de la muestra fija, se utilizó una serie de soluciones etanólicas calificadas, comenzando con 50% de etanol durante 1 h y las siguientes soluciones de etanol en las concentraciones enumeradas, durante 1 hora cada una: 70, 80, 90, 96 y 100%. (C) Los ojos de los ratones se teñiron de ácido fosfomolíbdico (PMA) durante 6 días, se lavaron en etanol absoluto y luego se colocaron en recipientes individuales de plástico de 2 ml llenos de etanol absoluto. (D) Se utilizó un escáner de sistema de micro-CT de rayos X de escritorio para evaluar la lesión de la retina en los ojos de los ratones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Vista sagittal de un ratón de control de tierra. Las capas del ojo en el lado derecho de la imagen están anotadas, de arriba a abajo, retina (0.077 mm), capa de pigmento de retina (RPE, 0.038 mm), coroides (0.041 mm), esclerótica (0.059 mm). Esta cifra ha sido tomada de Overbey et al.15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Vista axial de un ratón de control de tierra. Las capas del ojo en el lado derecho de la imagen están anotadas, de arriba a abajo, retina (0.144 mm), capa de pigmento de retina (RPE, 0.051 mm), coroides (0.041 mm), esclerótica (0.073 mm). Esta cifra ha sido tomada de Overbey et al.15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Espesor medio de la capa de retina, capa de RPE y la capa coroides medida por micro-CT en los grupos de control y vuelo espacial. Los recuentos se promediaron en cinco retinas por grupo. Los valores se representaron como espesor medio ± error estándar (SEM). El SEM de la media está marcado con barras de error. Se denota '*' (p < 0,05) el espesor de espesor de sección transversal significativamente inferior en el grupo de vuelo espacial (FLT) en comparación con el grupo de control de tierra (GC). Esta cifra ha sido tomada de Overbey et al.15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Los resultados de este estudio mostraron que hubo cambios estructurales en el ojo del ratón del vuelo espacial utilizando la técnica de micro-CT en comparación con los grupos de GC, particularmente de la retina, el RPE, y las capas coroides del ojo, como lo demuestra su disminución del grosor. Micro-CT proporciona una técnica eficiente y no destructiva para caracterizar los cambios sin necesidad de manipulación. El uso de tinción de PMA mejoró la calidad de las imágenes de micro-CT para obtener con éxito imágenes tomográficas 3D claras después de la reconstrucción, renunciando a cualquier necesidad de alterar físicamente la estructura de la muestra. Una ventaja adicional de estas imágenes es que muestran toda la región de interés digitalmente, aumentando así la accesibilidad y la reproducibilidad de los hallazgos. A través de las imágenes de micro-CT producidas durante este estudio, la muestra objetivo mostró diferenciación de las múltiples estructuras como la retina, RPE, coroides y esclerótica para la determinación del grosor de cada capa.
Un paso crítico dentro del protocolo es la manipulación de las muestras debido a su tamaño y textura. La manipulación de la muestra debe realizarse cuidadosamente sin ejercer presión sobre la muestra durante la preparación. El micro-CT tiene algunas limitaciones: resolución y la falta de valores estandarizados para los parámetros. Durante el escaneo, los diferentes escáneres de micro-CT pueden tener diversos algoritmos de procesamiento de imágenes; sin embargo, la calibración de una escala de grises podría perseguirse para superar cualquier problema. Después de la exploración, la reconstrucción de las imágenes debe basarse en el tejido y el análisis que se realizará. Puede ser fundamental ya que la calidad de la imagen depende del sistema tomográfico, los ajustes, el tamaño de la muestra, así como los métodos de preparación16,17.
Debido a su aplicación exitosa en el estudio de varios tipos de tejidos normales y patéticos, las capacidades de imágenes de micro-CT deben utilizarse en futuras investigaciones para recopilar datos volumétricos para otros análisis. Por lo tanto, sobre la base del propósito del presente estudio, era aceptable utilizar mediciones bidimensionales, pero la segmentación de la estructura 3D bruta también puede ser beneficiosa para proporcionar un esquema preciso de todo el espécimen. Incluso con todas las ventajas de una técnica no destructiva, micro-CT no reemplazará otros métodos como la inmunohistoquímica, sino que complementará y permitirá análisis histológicos posteriores si se desea.
Una condición prolongada del vuelo espacial produce una serie de cambios oculares estructurales y funcionales en los astronautas durante y después de la misión espacial definida como SANS. Los hallazgos incluyen cambios hiperópicos, aplanamiento del globo, pliegues coroidales/retinales y manchas de lana de algodón19. A diferencia del hallazgo de la tomografía de coherencia óptica (OCT) de los astronautas de engrosamiento de la capa de fibra nerviosa, el adelgazamiento de la retina y la capa coroidal se documentó en este estudio de micro-CT animal. Estos resultados fueron inesperados. Esta discrepancia puede deberse a factores de confusión. Los ratones tienen un cambio de líquido cefaláido limitado en comparación con los humanos. Esta falta de cambio de fluido puede haber evocado diferentes respuestas a los cambios gravitacionales. En segundo lugar, los ratones fueron diseccionados dentro de las 38 horas después de la salpicadura, y una respuesta aguda para la readapción también puede contribuir a cambios morfológicos en la retina y la coroides. La confirmación de esta posibilidad requiere mediciones adicionales durante el vuelo espacial y a largo plazo después de la misión.
Los resultados de este estudio indican que las condiciones de vuelo espacial, especialmente los cambios gravitacionales, pueden inducir una respuesta aguda y a corto plazo en el ojo. Se necesitan más investigaciones para determinar las consecuencias de los cambios agudos en la función de la retina y el mecanismo de los cambios en la estructura inducidos por el vuelo espacial.
Disclosures
Todos los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por la beca de Biología Espacial de la NASA NNX15AB41G y el Departamento de Ciencias Básicas de LLU. Sungshin Choi, Dennis Leveson y Rebecca Klotz contribuyeron significativamente al éxito de nuestro estudio de los vuelos espaciales y apreciamos enormemente su apoyo. Los autores también quieren agradecer a todo el grupo del Programa Biospecimen Sharing de la NASA por su gran ayuda.
Los autores también quieren agradecer al Centro de Investigación Dental para el servicio micro-CT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 wt. % phosphomolybdic | Sigma | 12026-57-2 | |
| Ethanol absolute by Baker Analyzed | VWR | 80252500 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Merck | L1825 | |
| X-ray micro-CT system SkyScan 1272 scanner | Bruker |
References
- Dawson, L. The New Space Race. The Politics and Perils of Space Exploration. , Springer Praxis Books. 1-24 (2017).
- Mao, X. W., et al. Spaceflight environment induces mitochondrial oxidative damage in ocular tissue. Radiation Research. 180, 340-350 (2013).
- Overbey, E. G., et al. Mice Exposed to Combined Chronic Low-Dose Irradiation and Modeled Microgravity Develop Long-Term Neurological Sequelae. International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 4094 (2019).
- Nelson, E. S., Mulugeta, L., Myers, J. G. Microgravity-induced fluid shift and ophthalmic changes. Life. 4, 621-665 (2014).
- Lee, A. G., Mader, T. H., Robert Gibson, C., Brunstetter, T. J., Tarver, W. J. Space flight-associated neuro-ocular syndrome (SANS). Eye. 32, 1164-1167 (2018).
- Stenger, M. B., et al. Evidence Report: Risk of Spaceflight Associated Neuro-ocular Syndrome (SANS). , (2017).
- Garrett-Bakelman, F. E., et al. The NASA Twins Study: A multidimensional analysis of a year-long human spaceflight. Science. 364, (2019).
- Mader, T. H., et al. Optic disc edema, globe flattening, choroidal folds, and hyperopic shifts observed in astronauts after long duration space flight. Ophthalmology. 118, 2058-2069 (2011).
- Mao, X. W., et al. Characterization of mouse ocular response to a 35-day spaceflight mission: Evidence of blood-retinal barrier disruption and ocular adaptations. Science Reports. 9 (1), 8215 (2019).
- Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: a versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Developmental Dynamics. , 632-640 (2009).
- Silva, J. M. S., et al. Three-dimensional non-destructive soft-tissue visualization with X-ray staining micro-tomography. Science Reports. 5, 14088 (2015).
- Descamps, E., et al. Soft tissue discrimination with contrast agents using micro-CT scanning. Belgian Journal of Zoology. , 20-40 (2014).
- Wu, J., Yin, N. Anatomy research of nasolabial muscle structure in fetus with cleft lip: an iodine staining technique based on microcomputed tomography. Journal of Craniofacial Surgery. 25 (3), 1056-1061 (2014).
- Roque-Torres, G. D. Application of Micro-CT in Soft Tissue Specimen Imaging. In: Orhan K. (eds) Micro-computed Tomography (micro-CT) in Medicine and Engineering. , Springer. 139-170 (2020).
- Overbey, E. G., et al. Spaceflight influences gene expression, photoreceptor integrity, and oxidative stress-related damage in the murine retina. Science Reports. 9 (1), 13304 (2019).
- Elkhoury, J. E., Shankar, R., Ramakrishnan, T. S. Resolution and Limitations of X-Ray Micro-CT with Applications to Sandstones and Limestones. Transport in Porous Media. 129, 413-425 (2019).
- Sombke, A., Lipke, E., Michalik, P., Uhl, G., Harzsch, S. Potential and limitations of X-Ray micro-computed tomography in arthropod neuroanatomy: A methodological and comparative survey. Journal of Comparative Neurology. 523 (8), 1281-1295 (2015).
- Huang, A. S., Stenger, M. B., Macias, B. R. Gravitational Influence on Intraocular Pressure: Implications for Spaceflight and Disease. Journal of Glaucoma. 28 (8), 756-764 (2019).
- Lee, A. G., et al. Spaceflight associated neuro-ocular syndrome (SANS) and the neuro-ophthalmologic effects of microgravity: a review and an update. NPJ Microgravity. 6, 7 (2020).
