Summary
वर्णित एक समय और अंतरिक्ष की बचत विधि अंडे गिनती और 24 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेटों का उपयोग कर व्यक्तिगत मच्छरों की हैच दरों का निर्धारण है, जो काफी पैमाने और fecundity और प्रजनन क्षमता परख की गति में वृद्धि कर सकते हैं ।
Abstract
मच्छर विभिन्न रोगजनकों के वैक्टर के रूप में एक महत्वपूर्ण सार्वजनिक स्वास्थ्य समस्या का प्रतिनिधित्व करते हैं। उन अध्ययनों के लिए है कि मच्छर फिटनेस मापदंडों के आकलन की आवश्यकता है, विशेष रूप से अंडा उत्पादन और व्यक्तिगत स्तर पर हैच दरों में, पारंपरिक तरीकों उच्च श्रम तीव्रता और प्रयोगशाला अंतरिक्ष आवश्यकताओं के कारण जांचकर्ताओं पर एक महत्वपूर्ण बोझ डाल दिया है । वर्णित एक सरल विधि है जो प्रत्येक अच्छी तरह से और प्रत्येक अच्छी तरह से डिजिटल इमेजिंग में एगर उठे के साथ 24 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेट का उपयोग करके काफी कम समय और अंतरिक्ष आवश्यकताओं के साथ एक व्यक्तिगत स्तर पर अंडे की संख्या और हैच दरों का निर्धारण करने के लिए है।
Introduction
वेक्टर जनित रोगजनकों से मनुष्यों की रक्षा के लिए मच्छरों का नियंत्रण एक महत्वपूर्ण सार्वजनिक स्वास्थ्य लक्ष्य है, मुख्य रूप से मच्छरों द्वारा किए गए अधिकांश रोगजनकों के लिए प्रभावी टीकों की कमी के कारण । कई अध्ययनों का उद्देश्य क्षेत्र में लागूजनसंख्या कटौती रणनीति1,2,3के साथ मिलकर मच्छरों की फिटनेस को कम करना है। इसमें ट्रांसजेनिक मच्छरों और/या CRISPR/Cas9 नॉकआउट लाइनों को बनाने के लिए व्यापक अध्ययन शामिल हैं । इस तरह के जनसंख्या संशोधन दृष्टिकोणों के लिए व्यक्तिगत फिटनेस मापदंडों का विस्तृत आकलनआवश्यकहै । मादा मच्छरों की फिटनेस का आकलन करने के लिए पारंपरिक प्रयोगशाला तकनीकों में 100 मिलीएल कंटेनरों में संभोग, रक्त-पोषित मादा मच्छरों की व्यक्तिगत रोकथाम शामिल है5,संशोधित 50 एमएल शंकु नली,या ड्रोसोफिला पालन के लिए ट्यूब, नम सतहों को ओसीपोजिशन (यानी अंडे के कागजात)1,2,6,7के लिए नम सतहों का उपयोग करके संशोधित किया गया है। इस तरह के तरीकों के लिए अपेक्षाकृत बड़ी जगह (उदाहरण के लिए, 30 सेमी x 30 सेमी x 10 सेमी: डब्ल्यू एक्स एल एक्स एच 100 ड्रोसोफिला ट्यूब)(चित्रा 1)तक की आवश्यकता होती है, और अंडे और हैचिंग लार्वा की गिनती के लिए व्यक्तिगत अंडे के कागजात में हेरफेर, जो श्रम गहन हो सकता है। यह पांडुलिपि मच्छरों के अंडों को गिनने और 24 अच्छी प्लेटों का उपयोग करके हैच दरों का निर्धारण करने की एक विधि प्रस्तुत करता है और इन मुद्दों को दरकिनार करने के लिए एक ओविपोजिशन सतह के रूप में उठता है8.
समवर्ती, Ioshino एट अल9 एक विस्तृत विधि 12 और 24 अच्छी तरह से प्लेटों का उपयोग करने के लिए व्यक्तिगत महिलाओं से प्राप्त अंडे की गिनती प्रदर्शन वर्णित है । उनके प्रोटोकॉल में समय और स्थान9की बचत में पारंपरिक तरीकों से उल्लेखनीय सुधार का प्रतिनिधित्व किया गया । हालांकि, उनके द्वारा वर्णित प्रोटोकॉल ओविपोजिशन के लिए एक सतह के रूप में गीले फिल्टर पेपर का उपयोग करना जारी रखता है, जिसके लिए प्रत्येक व्यक्तिगत पेपर को गिनती प्राप्त करने के लिए प्रकट करने की आवश्यकता होती है, क्योंकि अंडे अक्सर नीचे या सिलवटों में पाए जाते हैं। उनके प्रोटोकॉल में इमेजिंग प्रौद्योगिकियों का उपयोग या लार्वा गिनती के लिए एक विधि भी शामिल नहीं थी।
प्रस्तुत अंडे की संख्या (यानी, fecundity) और हैच दर (यानी, प्रजनन क्षमता) के लिए फिटनेस परख प्रदर्शन करने के लिए एक बेहतर तरीका है एई के लिए एक 24 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेट प्रारूप में एक अंडाशय सतह के रूप में agarose का उपयोग कर कि नम सतहों पर oviposit । इन प्लेटों को ईजीजी, आगागुलाब और एलअरवा से "ईएगल" प्लेटें नामित किया गया था। ये 24 अच्छी तरह से प्लेटें अंडे डालने के लिए एक न्यूनतम सतह के साथ व्यक्तिगत मच्छरों को प्रदान करती हैं, इस प्रकार कुछ दिनों के लिए अंडे और रची लार्वा को गिनने और बनाए रखने के लिए आवश्यक समय और प्रयास को सरल और तेजी से कम करती हैं। ईएगल प्लेट ओविपोजिशन सतह के लिए पारदर्शी एगर उठे का उपयोग करती है, जो अंडे के कागजात को संभालने और अंडे और लार्वा खोजने की आवश्यकता को समाप्त करती है जब रची जाती है; प्रत्येक अच्छी तरह से फोटो खिंचवाने के परिणामों का एक दीर्घकालिक संग्रहीत रिकॉर्ड स्थापित करता है और पालन से दोनों समय और अंतरिक्ष में गिनती की प्रक्रिया को अलग/
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. प्लेट तैयार करना
- 24 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेट lids में ड्रिल छेद (4−6 छेद प्रति अच्छी तरह) एक ~१.६ मिमी (1/16 में) बिट(चित्रा 2)के साथ एक घरेलू ड्रिल का उपयोग कर ।
नोट: ये छेद ढक्कन पर जमा होने के लिए एग्रिज से पानी के संघनन को रोकते हैं, जहां मच्छर अंडे डाल सकते हैं। महिला एई. एजिप्टी (लिवरपूल" तनाव) का मानक आकार ~ 3.11 मिमी पंख है। प्लेट से बचने से बचने के लिए छोटे मच्छरों का उपयोग करते समय छेद के आकार को कम करने की सिफारिश की जाती है। - ओविपोजिशन एक्सपेरिमेंट से पहले दिन, प्लेटों को अच्छी तरह से धोएं और कुल्ला करें और उन्हें कमरे के तापमान पर 30−60 मिनट के लिए 1−5% ब्लीच में भिगो दें। चल रहे डिएकीकृत पानी के तहत अच्छी तरह से कुल्ला करें और उन्हें सुखा लें।
नोट: इस प्रक्रिया कवक और agarose पर बढ़ बैक्टीरिया की संभावना कम कर देता है । - पिघल agionized पानी में 2% पर उठी और तुरंत पिघला हुआ ag के 500 μL एक 1,000 μL पिपेट(चित्रा 3A,बी)का उपयोग कर 24 अच्छी तरह से प्लेटों के प्रत्येक कुएं में उठी जोड़ें। जब एगर उठे शांत और पिपेट टिप को रोकना शुरू होता है, तो एगर उठे को फिर से गरम करें और एक नए पिपेट टिप का उपयोग करें।
नोट: पिपेट टिप के साथ अच्छी तरह से दीवारों को छूने से बचें क्योंकि यह दीवार पर उठते हुए एक टुकड़ा छोड़ सकता है जहां एक मादा अंडे डाल सकती है, इमेजिंग और गिनती की प्रक्रिया को जटिल बना सकती है। - उपयोग से पहले, लैब बेंच(चित्रा 3सी,डी)पर रात भर अच्छी दीवारों पर किसी भी संघनन को सुखा लें।
नोट: रक्त आहार से लार्वा इमेजिंग तक ईएएगल प्लेट परख की समयरेखा चित्र 4में दर्शाई गई है, जो कॉलोनी मच्छरों (एई) के लिएहै। एजिप्टी "लिवरपूल" 14 घंटे प्रकाश के तहत पाला: 10 एच डार्क लाइट चक्र, 27 डिग्री सेल्सियस, 80% सापेक्ष आर्द्रता, 49.5 सेमी x 29.2 सेमी x 9.5 सेमी ट्रे में 2 एल पानी के साथ, कीटीय परिस्थितियों में। यह सिफारिश की जाती है कि प्रत्येक प्रयोगशाला ईएएएल प्लेट का परीक्षण मच्छरों के साथ किया जा रहा है, खासकर जब विभिन्न उपभेदों, विभिन्न मच्छर प्रजातियों, साथ ही विभिन्न पालन प्रोटोकॉल का उपयोग करते हैं।
2. मच्छर खिला
नोट: सभी उपचार समूहों और नियंत्रण समूहों के लिए एक समान परिस्थितियों में पाला मच्छरों का उपयोग करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि लार्वा पोषण का मच्छर फिटनेस मापदंडों10, 11पर प्रभाव पड़ता है। पर्याप्त भोजन के साथ भीड़-भरी स्थितियों के तहत रियर लार्वा। मादा मच्छरों को पुरुषों की उपस्थिति में बंद कर दें ताकि संभोग सुनिश्चित हो सके, और कम से कम 3 दिनों तक परिपक्व हो जाएं।
- रक्त आहार को बढ़ाने के लिए रक्त आहार से कम से कम 16 घंटे पहले मादा मच्छरों से पानी और/या चीनी के किसी भी स्रोत को हटा दें ।
- 37 डिग्री सेल्सियस पर कृत्रिम भोजन के लिए एक पानी परिसंचरण गर्म करें और कृत्रिम फीडरों में रखे कशेरुकी रक्त का उपयोग करके मादा मच्छरों को 15−30 मिनट(चित्रा 5A)के लिए खिलाएं।
- सीओ2 या बर्फ पर मच्छरों को एनेस्थेटाइज करें, उन्हें बर्फ पर एक ग्लास डिश में स्थानांतरित करें, और उन लोगों का चयन करें जो रक्त(चित्रा 5B)के साथ 72 घंटे से अधिक के लिए 30% सुक्रोज पानी के साथ प्रदान किए गए कंटेनर में हैं, जब महिलाएं उत्सर्जन और अंडे के विकास को खत्म करती हैं।
नोट: यदि मादाओं को सुक्रोज पानी की कम एकाग्रता प्रदान की जाती है, तो महिलाओं को ओविपोसिटिंग से रोकने के लिए 48 घंटे के बाद सुक्रोज पानी और किसी भी गीली सतहों को हटा दें।
3. ओविपोजिशन
- प्लेटों में मच्छरों को स्थानांतरित करने से लगभग 1 घंटे पहले, स्थानांतरण पिपेट का उपयोग करके प्रत्येक प्लेट में 2−3 बूंदें (~ 80−120 माइक्रोल) पानी जोड़ें।
- रक्त आहार के बाद कम से कम 72 घंटे, सीओ2 या बर्फ पर नॉकडाउन मच्छरों, उन्हें बर्फ पर एक ग्लास डिश में स्थानांतरित करें, और व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक मच्छर को बर्फ पर 24 अच्छी प्लेट(चित्रा 6A)के उल्टे ढक्कन पर रखें।
नोट: यह प्रक्रिया Ioshino एट अल9से लागू किया गया है । - एक बार सभी 24 मच्छरों को रखा गया है, एक उल्टे प्लेटनीचे (चित्रा 6B)के साथ ढक्कन को कवर करें, ढक्कन और प्लेट को एक ताजा, नए रबर बैंड और एक पर्यावरण कक्ष (या पालन कक्ष)(चित्रा 6C)में जगह के साथ सुरक्षित करें जब तक कि मच्छर ठीक न हो जाएं (~ 10−15 मिनट) और प्लेट को दाईं ओर(चित्रा 6D)चालू करें।
- मादा मच्छरों को 24−48 घंटे के लिए ओविपोसिट करने की अनुमति दें और महिलाओं को प्लेटों से एक बड़े पिंजरे में छोड़कर हटा दें।
नोट: यदि व्यक्तिगत महिलाओं पर नज़र रखना महत्वपूर्ण है, तो प्लेटों को हल्का करके उन्हें एनेस्थेटाइज करें और उन्हें बर्फ पर व्यक्तिगत रूप से हटा दें। अंडे की गिनती में हस्तक्षेप करने वाले विलंबित अंडाशय और अंधेरे उत्सर्जन को तब देखा गया जब महिलाओं को 72 घंटे पोस्ट ब्लड मील (पीबीएम)(चित्रा 7 डी)से पहले प्लेटों में स्थानांतरित कर दिया गया।
4. अंडे की गिनती
- 24 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं की जांच करें, के रूप में कई बार मच्छरों कुओं की दीवार पर अंडे रखना और agarose/प्लास्टिक की सतह के मार्जिन पर, जहां वे तस्वीरों में हल करने के लिए मुश्किल है । गीले पेंट ब्रश का उपयोग करके, दीवार पर रखे अंडों को स्थानांतरित करें और एगर उठे की सपाट सतह पर जाएं ताकि सभी अंडे एक समान विमान में हों और एक दूसरे के साथ ओवरलैप न करें।
नोट: agarose समाधान की सतह तनाव के कारण agarose का किनारा आम तौर पर कैमरे के फोकल विमान से बाहर है । - संदंश का उपयोग करना, कुओं में किसी भी टूटे हुए पैर, पंख और अन्य कणों को हटा दें जो इमेजिंग अंडे(चित्रा 7C)में हस्तक्षेप कर सकते हैं।
- एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप इलेमिनेटर(चित्रा 7A)का उपयोग करके इमेजिंग से पहले गहरे मच्छर अंडे के साथ विपरीत बढ़ाने के लिए प्लेट के नीचे सफेद कागज डालें।
- माइक्रोस्कोप मोड में एक कॉम्पैक्ट डिजिटल कैमरा का उपयोग करके प्रत्येक अच्छी तरह से एक छवि लें, जो उपयोगकर्ता को 1 सेमी के रूप में वस्तुओं पर ध्यान केंद्रित करने की अनुमति देता है। यह क्षमता कैमरे को सीधे प्लेट पर एक तिपाई या स्टैंड(चित्रा 7A)के बिना अंडे की छवि के लिए रखा जा सकता है। झुरमुटों में रखे गए व्यक्तिगत अंडों को अलग करने के लिए, उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियों को कैप्चर करने के लिए ठीक या सुपर-फाइन मोड का उपयोग करें ताकि क्लोज-अप विवरण देखे जा सकें।
नोट: नई और पुरानी छवियों के बीच भ्रम को रोकने के लिए उपयोग से पहले कैमरे के मेमोरी कार्ड को साफ़ करें। - एक प्लेट के प्रत्येक कुएं की फोटो खींचने के बाद, प्रत्येक प्लेट को बाद में अलग करने के लिए इमेजिंग ऑर्डर लेबल के साथ पूरी प्लेट की एक छवि लें(चित्रा 7E)।
- अपने एगर उठे प्लग और अंडों को सूखने से रोकने और भ्रूण के विकास और हैचिंग को प्रेरित करने के लिए प्रत्येक कुएं में स्थानांतरण पिपेट के साथ पानी की एक पतली परत ~ 5 बूंदें (~ 200 माइक्रोन) जोड़ें। पहले कुछ घंटों के लिए जल स्तर पर ध्यान दें और हर दिन जांच करें, क्योंकि एगर उठे या वाष्पीकरण द्वारा अवशोषण के कारण पानी की हानि हो सकती है। लार्वा हैच करने के लिए इसका स्तर बहुत कम होने पर पानी जोड़ें।
नोट: पानी का वाष्पीकरण एक प्लेट के भीतर और प्लेटों के ढेर के भीतर गैर-समान रूप से होता है। यह देखा गया है कि सुखाने के निम्नलिखित क्रम में होता है: 1) कोने कुओं (A1, A6, D1, D6) सबसे तेजी से सूखी; 2 के बाद) थाली के बाहरी किनारे पर कुओं (A2-A5, B1, B6, C1, C6, D2-D5); और पिछले 3) अंदर कुओं । जब प्लेटें खड़ी होती हैं, तो शीर्ष प्लेट सबसे तेजी से सूख जाती है। - इमेजेज (फिजी) के साथ कंप्यूटर पर छवियों को स्थानांतरित करें और "[प्लेट आईडी]_[वेल आईडी] .jpg"(चित्र 8 ए,बी)जैसे आसान संगठन के लिए फ़ाइलों का नाम बदलें।
- अंडे की संख्या (यानी, fecundity) और लार्वा संख्या रिकॉर्ड करने के लिए एक स्प्रेडशीट फ़ाइल बनाएं और हैच दर (यानी, प्रजनन क्षमता)(चित्रा 9E)की गणना करें।
- इमेजजे (फिजी)12 के साथ छवियों को खोलें और प्रत्येक अंडे(चित्रा 9ए−सी)को चिह्नित करने के लिए"मल्टी-पॉइंट"उपकरण का उपयोग करें; "+"या"-झुरमुट में अंडे गिनने के लिए कुंजी का उपयोग करके ज़ूम-इन या ज़ूम-आउट। सभी अंडों को चिह्नित करने के बाद, अंकों की संख्या(चित्रा 9D)लाने के लिए मल्टी-पॉइंट आइकन पर डबल-क्लिक करें। परिणामों को स्प्रेडशीट में रिकॉर्ड करें।
5. फर्टिलिटी असेसमेंट
नोट: 2 दिनों में, पहले इंस्टार लार्वा कुओं में बंद करना शुरू कर सकते हैं। इमेजिंग/काउंटिंग से पहले 3−5 और दिनों की प्रतीक्षा करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि सभी व्यवहार्य अंडे निकलते हैं ।
- 20 मिली लीटर पानी में 1/16 चम्मच (~ 168 मिलीग्राम) ग्राउंड फिश फूड (यानी सामान्य मच्छर लार्वा आहार) मिलाकर लार्वा भोजन तैयार करें और बड़े ठोस कणों के बसने की प्रतीक्षा कर रहेहैं (चित्रा 10ए−डी)। उन कुओं में भोजन (सुपरनैंट) जोड़ना शुरू करें जिनमें जैसे ही वे दिखाई देते हैं, जैसे ही वे दिखाई देते हैं, क्योंकि वे भोजन के बिना लंबे समय तक जीवित नहीं रहते हैं।
नोट: खाद्य कणों के अतिरिक्त अतिरिक्त इमेजिंग और रची लार्वा की गिनती के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं । - कुओं में पानी डलने के लगभग 5-8 दिन बाद, लार्वा को एनेस्थेटाइज करने के लिए 15−20 मिनट के लिए कुचल बर्फ से कवर करके प्लेट को ठंडा करें।
- अंडे के साथ किया गया था के रूप में बर्फ पर प्लेटों रखते हुए प्रत्येक अच्छी तरह से छवियों ले लो। लार्वा छवियों के लिए, विपरीत बढ़ाने में मदद करने के लिए प्लेट के नीचे एक काली सामग्री डालकर एक अंधेरे पृष्ठभूमि प्रदान करें। एक प्लेट के प्रत्येक कुएं की फोटो खींचने के बाद, बाद में प्रत्येक प्लेट को अलग करने के लिए इमेजिंग ऑर्डर लेबल के साथ पूरी प्लेट की एक छवि लें।
नोट: छवियां ली जाती हैं, जबकि प्लेटें बर्फ पर होती हैं क्योंकि लार्वा आंदोलन गिनती से समझौता कर सकता है। प्लेटें पुन: प्रयोज्य हैं; अगले उपयोग के लिए साफ करने के लिए मच्छरों और एगर उठे को फ्रीज करें और हटा दें। ईजेएल प्लेट लार्वा को उन्नत चरणों में पालन करने के लिए उपयुक्त नहीं है। - इमेजजे (फिजी) के साथ छवियां खोलें और प्रत्येक लार्वा पर क्लिक करके गिनती करने के लिए"मल्टी-पॉइंट"टूल का उपयोग करें। 3−5 दिनों की अवधि में कुछ लार्वा पिघल सकते हैं, विशेष रूप से लार्वा की कम संख्या वाले कुओं में। इसलिए, गिनती करते समय, शेड क्यूटिकल्स (यानी, एक्सविया) को बाहर करें, जो थोड़ा सा शरीर के साथ सिर-केवल लार्वा की तरह दिखते हैं, यासिकुड़े हुए लार्वा (चित्रा 10E)। स्प्रेडशीट में परिणाम रिकॉर्ड करें।
6. विश्लेषण करें
- fecundity और प्रजनन विश्लेषण के लिए सभी आवश्यक डेटा एकत्र करने के बाद, उचित सांख्यिकीय विश्लेषण प्रदर्शन और पसंदीदा सॉफ्टवेयर का उपयोग कर रेखांकन बनाने के लिए ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
मच्छरों को एक उम्मीदवार आयरन ट्रांसपोर्टर (FeT) या नियंत्रण जीन (EGFP), रक्त-खिलाया, और ऊपर वर्णित प्रक्रिया का पालन करते हुए ईागल प्लेट विधि का उपयोग करके fecundity और प्रजनन उत्पादन के लिए मापा जाता है, को लक्षित करने वाले dsRNA के साथ इंजेक्शन दिया गया था ।
जिन मच्छरों में FeT अभिव्यक्ति को खामोश कर दिया गया था, डीएसआरएनए इंजेक्शन ने अंडे की संख्या और हैच दर(चित्र 11A−C)दोनों में महत्वपूर्ण कमी का प्रदर्शन किया । सभी नियंत्रण और उपचार मच्छरों को 72 एच पीबीएम के बाद ईजाएल प्लेटों में रखा गया था। FeT-खामोश मच्छरों ने भी देरी से उत्सर्जन और छोटे और हल्के रंग के अंडे(चित्रा 12A,बी)का प्रदर्शन किया । उदाहरण के परिणाम त्सुजिमोटो एट अल8में भी पाए जा सकते हैं।
चित्र 1: आमतौर पर मच्छर fecundity के लिए इस्तेमाल मक्खी ट्यूबों/ }स्पंज कैप के साथ नम कॉटन और सर्कुलर फिल्टर पेपर वाली सिंगल ट्यूब। (ख)एक रैक में 100 ट्यूब (~ 30 सेमी x 30 सेमी)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: 24 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेट के ढक्कन में ड्रिलिंग छेद । (A)प्रक्रिया में ड्रिलिंग । (ख)छेद के साथ एक ढक्कन जो संघनन को रोकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 3: कुओं में agarose (पानी में 2%) लागू करना। (क)1,000 माइक्रोल पिपेट का उपयोग करके एग्राट को लागू करना। ध्यान रहे कि टोटका कुएं की दीवार को नहीं छू रहा है। (ख)एक प्लेट जिसमें नीचे की ओर उठती है । (ग)एक कुएं की दीवार ठीक होने के बाद अगमज उठी जम गई । दीवार पर संघनन पर ध्यान दें। (घ)एक कुएं की दीवार जब संघनन सुखाया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4: रक्त आहार (दिन 0) से लार्वा इमेजिंग (दिन 10−13) तक की टाइमलाइन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 5: कृत्रिम रक्त आहार और engorged महिलाओं का चयन। (A)कृत्रिम फीडर का उपयोग करते हुए रक्त आहार। (ख)बर्फ पर engorged महिलाओं का चयन । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 6: EAgaL प्लेट में महिलाओं का स्थानांतरण। (क)एनेस्थेटाइज्ड मादाओं को बर्फ पर उल्टे प्लेट के ढक्कन में स्थानांतरित करें । (ख)फिर उल्टे एगरेग युक्त प्लेट को उल्टे ढक्कन पर रखें और(ग)बर्फ से जुड़े ढक्कन के साथ प्लेट निकालें और इसे एक उल्टे स्थिति में रखें जब तक कि महिलाएं संज्ञाहरण से बरामद न हो जाएं । (घ,ई) महिला युक्त प्लेट को ऊपर की ओर की स्थिति में घुमाएं। ध्यान दें कि ढक्कन और प्लेट के नीचे के हिस्से को रबर बैंड द्वारा आयोजित किया जाता है और नीचे का हिस्सा लेबल होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 7: महिलाओं को हटाने के बाद प्रत्येक अच्छी तरह से इमेजिंग। (A)इमेजिंग के लिए अंडे युक्त 24 वेल प्लेट के ऊपर डिजिटल कैमरा । (ख)एक कुएं की विशिष्ट छवि । (ग)एक कुआं जिसमें पैर होता है, जिसे हटाया जाना चाहिए । (घ)एक कुएं की नमूना छवि जिसमें एक महिला को 48 घंटे पीबीएम पर रखा गया था। गहरे उत्सर्जन के निशान पर ध्यान दें, जो अंडे की गिनती (तीर) को जटिल बना सकता है। (ई)पूरी प्लेट प्लेट के सभी कुओं की इमेजिंग के बाद तैयार एक इमेजिंग ऑर्डर लेबल दिखा। यह विश्लेषण के दौरान कुओं को पहचानने में मदद करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 8: बेहतर संगठन के लिए छवियों का नाम बदलना। (A)कैमरे द्वारा सौंपे गए नामों के साथ एक छवि आदेश लेबल सहित व्यक्तिगत अंडे युक्त कुओं की छवियां । (ख)एक ही छवियों को plateID_wellID.jpg प्रारूप के साथ नाम दिया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 9: "फिजी" (ImageJ2) सॉफ्टवेयर का उपयोग करके अंडे की गिनती। (A)फिजी सॉफ्टवेयर का स्क्रीनशॉट"मल्टी-पॉइंट"टूल हाइलाइट (फ़िरोज़ा स्क्वायर) दिखाता है। (ख)अंडे पर फिजी गिनती के निशान के साथ एक अच्छी छवि । (ग)बड़े अंडे समूहों की गिनती करते समय ज़ूम करने में मदद करता है। (घ)मुख्य खिड़की पर'मल्टी-पॉइंट'टूल आइकन पर डबल क्लिक करने से काउंट (रेड सर्कल) पता चलता है। (ई)हैच रेट कैलकुलेशन फॉर्मूले के साथ स्प्रेडशीट का एक उदाहरण । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 10: लार्वा आहार तैयार करना और लार्वा और एक्सयूविया युक्त एक अच्छी तरह से। (A)ग्राउंड फिश फूड । (ख)एक कप में 20 एमएल पानी । (ग)ग्राउंड फिश फूड और पानी का मिश्रण । (घ)भोजन/पानी 15 मिनट के लिए बसे । इस मिश्रण को लार्वा भोजन के रूप में लें। (ई)अच्छी तरह से पिघला हुआ लार्वा के साथ; प्रतिनिधि एक्सुविया तीर से संकेत दिया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 11: जीन साइलेंसिंग प्रयोग से डेटा गिनें। ख्यात लोहा ट्रांसपोर्टर (FeT) के खिलाफ dsRNA के साथ इंजेक्शन मच्छरों(ए)अंडा संख्या, (बी)लार्वा संख्या, और नियंत्रण (EGFP) की तुलना में(सी)हैच दर की महत्वपूर्ण कमी का प्रदर्शन किया । बार्स शो का मतलब ± एसडी है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 12: जीन में अतिरिक्त फेनोटाइप दिखाने वाले कुओं की प्रतिनिधि छवियां मच्छरों को खामोश कर देती हैं । dsFeT देरी उत्सर्जन (गहरे भूरे रंग के निशान) और छोटे, हल्के रंग का अंडे दिखाया । प्रत्येक उपचार के लिए दो प्रतिनिधि कुएं दिखाए जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
| लगभग से.मी | ईगाल | |
| (1) तैयारी | 20 मिनट 29.0 सेकंड | 3 मिनट 49.3 सेकंड |
| (2) F_in | 3 मिनट 55.0 सेकंड | 1 मिनट 56.0 सेकंड |
| (3) F_out/E_img | 43 मिनट 44.3 सेकंड | 15 मिनट 28.3 सेकंड |
| (4) L_img | 38 मिनट 03.5 सेकंड | 9 मिनट 30.5 सेकंड |
तालिका 1: ईएएएल प्लेट विधि की तुलना में फ्लाई ट्यूब विधि (एफटी) को पूरा करने के लिए समय आवश्यकताएं। (1)तैयारी: समय के लिए कपास जगह की आवश्यकता है, में पानी डालना, और ड्रोसोफिला पालन ट्यूबों (एफटी) बनाम 24 अच्छी तरह से थाली (EAgaL) के कुओं में agarose के डालने के लिए फिल्टर पेपर डिस्क डालें । (2)F_in: 24 अच्छी तरह से थाली (EAgaL) के पालन ट्यूबों (एफटी) या कुओं में व्यक्तिगत मच्छरों को रखने के लिए आवश्यक समय । (3)F_out/E_img: समय के लिए एक बड़ा पिंजरे में मच्छर जारी करने के लिए आवश्यक है, हटाने, अंडे कागज प्रकट करना, और कागज (एफटी) पर अंडे छवि या एक बड़ा पिंजरे और छवि में मच्छरों को जारी 24 अच्छी तरह से थाली (EAgaL) के हर अच्छी तरह से । (4)L_img: ठंड संज्ञाहरण के बाद एक छोटे कंटेनर (एफटी) या 24 अच्छी तरह से थाली (EAgaL) के प्रत्येक कुएं में रची छवि लार्वा के लिए आवश्यक समय । एफटी के लिए कुल 24 ट्यूबों का इस्तेमाल किया गया ।
| थोक लागत | |||||
| ईगाल प्लेट | फ्लाई ट्यूब | ||||
| समाचार | दाम | बड़ तादाद | समाचार | दाम | बड़ तादाद |
| 24-अच्छी तरह से प्लेटें | 45.61 डॉलर | 50 का मामला | क्रोमेटोग्राफी पेपर शीट्स | 103.63 डॉलर | 46 × 57 सेमी 100 चादरें/ |
| अगर उठे | $250.97 | 500 ग्राम | फ्लाई ट्यूब रैक + ट्यूब | $68.45 | 100 की 5 ट्रे |
| ओलंपस टीजी-6 | $375.00 | फ्लाई ट्यूब प्लग | $66.10 | 200 का मामला | |
| कॉटन बॉल्स | 104.27 डॉलर | 2000 का मामला | |||
| स्टार्टअप कुल | $671.58 | स्टार्टअप कुल | $342.45 | ||
| यूनिट लागत (एक 24-अच्छी तरह से प्लेट या 24 ट्यूब) | |||||
| ईगाल प्लेट | फ्लाई ट्यूब | ||||
| समाचार | दाम | नोट | समाचार | दाम | नोट |
| एक 24 अच्छी तरह से थाली | 0.91 डॉलर | थोक मूल्य/50 | क्रोमेटोग्राफी पेपर शीट्स | 0.16 डॉलर | 641.7 24 ट्यूबों के सेट मूल्य (2) |
| प्रति प्लेट एगर उठे | 0.15 डॉलर | 500g = 1667 प्लेटें (1) | फ्लाई ट्यूब रैक + ट्यूब | 3.29 डॉलर | (थोक मूल्य/500) × 24 |
| फ्लाई ट्यूब प्लग | 7.93 डॉलर | (थोक मूल्य/200) × 24 | |||
| कॉटन बॉल्स | 1.25 डॉलर | (थोक मूल्य/2000) × 24 | |||
| यूनिट कुल | 1.06 डॉलर | यूनिट कुल | 12.63 डॉलर | ||
तालिका 2: ईएएएल प्लेट और एफटी के बीच लागत तुलना। शीर्ष: स्टार्टअप के लिए थोक लागत (एक ड्रिल और एक ड्रिल बिट संभालने एक शोधकर्ता द्वारा प्रदान किया जा सकता है) । नीचे: एक 24 अच्छी तरह से थाली (EAgaL प्लेट) और 24 फुट(1)संभालने के लिए अनुमानित लागत एक थाली संभालने के लिए सिर्फ एक 24 अच्छी तरह से थाली (12mL), 2% के 15 मिलीएल = 0.3 ग्राम प्रति प्लेट के लिए पर्याप्त से थोड़ा अधिक की आवश्यकता है, agarose के 500 ग्राम की कुल 1,667 प्लेटें बना सकते हैं। 2पेपर की एक शीट ~38 एमएम व्यास डिस्क के 154 बना सकती है। 100 शीट्स के साथ 24 ट्यूब के 641.7 (15,400/24) सेट बनाए जा सकते हैं।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
EAgaL प्लेट एफटी विधि की तुलना में एडीज एजिप्टी में व्यक्तिगत fecundity और प्रजनन क्षमता का संचालन करने के लिए श्रम, समय और स्थान को काफी कम कर देती है। एफटी विधि और ईएएएल प्लेट के बीच प्रारंभिक तुलना के परिणामस्वरूप सभी चरणों के लिए कम समय हुआ (इमेजिंग तकनीक एफटी विधि पर लागू की गई थी)(तालिका 1)। एक संदर्भ के रूप में, स्टार्टअप और प्रति परख का अनुमान (एक 24 अच्छी तरह से ईएगल प्लेट बनाम 24 एफटीएस) लागत तालिका 2में प्रदान की जाती है।
ईएएएल प्लेटों का उपयोग करते समय विचार करने के लिए कुछ बिंदु हैं। एक प्रारंभिक चिंता यह थी कि इतनी छोटी जगह में रखे गए मच्छर सीमित आंदोलन के कारण सभी अंडे नहीं डाल सकते हैं। यह निर्धारित करने के लिए कि क्या यह मामला था, मच्छरों को सामूहिक रूप से एक बड़े पिंजरे में स्थानांतरित कर दिया गया था, जिसमें एक अतिरिक्त 48 घंटे के लिए पानी के साथ एक पेपर तौलिया के साथ लाइन में खड़ा एक ओविपोशन कप था, जिसके बाद उन्होंने ईएएएल प्लेटों में 48 घंटे बिताए थे। मच्छरों ने वास्तव में अतिरिक्त अंडे दिए थे, लेकिन प्रति मादा अंडे की औसत संख्या केवल 2.1 थी, जिसके परिणामस्वरूप किसी भी सांख्यिकीय विश्लेषण के परिणाम में कोई अंतर नहीं होता है, यदि सभी मामले नहीं हैं। ये संख्या 500 से अधिक मच्छरों की जांच (डेटा नहीं दिखाया गया) से हैं। हालांकि, यह केवल एई के लिए हो सकता है। एजिप्टी "लिवरपूल" मच्छर तनाव के साथ वर्णित शर्तों के साथ। प्रत्येक प्रयोगशाला को यह परीक्षण करने की आवश्यकता हो सकती है कि क्या यह इसके मच्छरों और स्थितियों के लिए मामला है।
इमेजिंग के लिए, एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप से जुड़े कैमरे की एकल छवि ने सबसे कम आवर्धन पर भी पूरी अच्छी तरह से कवर नहीं किया। यह अच्छी तरह से प्रति अच्छी तरह से कई छवियों को प्राप्त करने और बदले में छवियों को पैचिंग, या अंडे का ट्रैक रखने के लिए एक ही अच्छी तरह से कई छवियों में छा की आवश्यकता है । दोनों दृष्टिकोण गंभीर रूप से विश्लेषण जटिल है और काफी शामिल श्रम में वृद्धि हुई है । इसके अलावा, स्टीरियोमाइक्रोस्कोप की प्रकृति के कारण, कैमरा कोण हमेशा लंबवत कोण से थोड़ा बाएं या दाएं होता है, जो बाईं या दाईं ओर की दीवार को एगरेग्या सतह का एक हिस्सा अवरुद्ध करता है।
सूक्ष्मजीवों द्वारा संदूषण, विशेष रूप से कवक, परख के दौरान एक समस्या हो सकती है। हालांकि ब्लीचिंग अंडाशय से पहले संदूषण को कम कर सकती है, कवक कीट वातावरण में मौजूद हो सकता है और मच्छरों द्वारा स्वयं किया जा सकता है। ऐसे मामलों में, कीट रिक्त स्थान को साफ रखने से घटनाओं में कमी आ सकती है। किसी भी संभावित मुद्दों का पता लगाने के लिए ईएएएल प्लेट का परीक्षण करना हर प्रयोगशाला के लिए सबसे अच्छा है।
ध्यान दें कि ईएएएल प्लेट विधि को शुरुआती लार्वा चरणों से परे मच्छर संस्कृतियों को बनाए रखने के लिए डिज़ाइन नहीं किया गया था। प्रति कुएं लार्वा की औसत संख्या आमतौर पर 60 से अधिक थी, और प्रति अच्छी तरह से 100 से अधिक लार्वा होना असामान्य नहीं है। यह भीड़ की स्थिति बनाता है, जिसके परिणामस्वरूप विकास में देरी, कम पिल्ला दर, और बहुत छोटे वयस्क होते हैं, जो डाउनस्ट्रीम अध्ययनों से समझौता कर सकते हैं।
वर्तमान में इस विधि का परीक्षण केवल एई एजिप्टी केसाथ किया गया है। हालांकि, वर्तमान में एडीज की अन्य प्रजातियों और यहां तक कि मच्छरों के अन्य जेनेरा जैसे एनोफेल्स और क्यूलेक्समें भी अपने आवेदन का विस्तार करने के लिए इसका परीक्षण किया जा रहा है।
ईएगल प्लेट विधि के लिए कम समय और स्थान आवश्यकताओं के कारण, फेकुंदता और प्रजनन परख को अर्ध-उच्च थ्रूपुट (यानी, 5-10 प्लेटें या प्रति प्रयोग अधिक) तक बढ़ाया जा सकता है। ईएएएल प्लेट विधि की यह विशेषता कीटनाशक परीक्षण, बंध्यता मूल्यांकन, ट्रांसजेनेसिस और जीन संपादन अध्ययनों के लिए मच्छरों के महत्वपूर्ण फिटनेस मापदंडों का आकलन करने के लिए बेहद उपयोगी हो सकती है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखक इस अध्ययन के लिए हितों के कोई टकराव की घोषणा करते हैं ।
Acknowledgments
हम वित्तपोषण के लिए टेक्सास एएंडएम एग्रीलाइफ रिसर्च कीट वेक्टर्ड डिजीज ग्रांट प्रोग्राम का शुक्रिया अदा करते हैं । हम पांडुलिपि का मसौदा तैयार करते समय इस विधि और सुझावों को विकसित करने में मदद के लिए एडेलमैन लैब के सदस्यों के साथ-साथ केविन माइल्स लैब के सदस्यों को भी धन्यवाद देते हैं। हम इस पांडुलिपि को बेहतर बनाने के लिए समीक्षकों और संपादकों को उनकी मदद के लिए भी धन्यवाद देते हैं ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.6 mm Φ drill bit | alternatively heated nails can be used | ||
| 1000 μL pipette tips (long) | Olympus plastics | 24-165RL | |
| 24-well tissue culture plate | Thermo Scientific | 930186 | clear, flat-bottom with ringed lid plates |
| Agarose | VWR | 0710-500G | |
| Compact digital camera | Olympus | TG-5/TG-6 | |
| Computer (Windows, Mac or Linux) | |||
| Deionized water | |||
| Fiji (imageJ) software | download from: https://fiji.sc/ | ||
| Forceps | Dumont | sharp forceps may break mosquito's body | |
| Glass Petri dishes | VWR | ||
| Household bleach | |||
| Household electric drill | |||
| illuminator for stereomicroscope (gooseneck) | |||
| P-1000 pipette | Gilson | ||
| paint brushes | |||
| Rubber bands | |||
| SD card | to record digital camera images (DSHC, SDXC should be better) | ||
| Spreadsheet software (Microsoft Excel) | Microsoft | Any spreadsheet software works | |
| TetraMin fish food | Tetra | ground with coffee grinder, blender or morter & pestle | |
| Transfer pipetts | VWR | 16011-188 |
References
- Bond, J. G., et al. Optimization of irradiation dose to Aedes aegypti and Ae. albopictus in a sterile insect technique program. PLoS One. 14 (2), 0212520 (2019).
- Fernandes, K. M., et al. Aedes aegypti larvae treated with spinosad produce adults with damaged midgut and reduced fecundity. Chemosphere. 221, 464-470 (2019).
- Inocente, E. A., et al. Insecticidal and Antifeedant Activities of Malagasy Medicinal Plant (Cinnamosma sp.) Extracts and Drimane-Type Sesquiterpenes against Aedes aegypti Mosquitoes. Insects. 10 (11), 373 (2019).
- Marrelli, M. T., Moreira, C. K., Kelly, D., Alphey, L., Jacobs-Lorena, M. Mosquito transgenesis: what is the fitness cost. Trends in Parasitology. 22 (5), 197-202 (2006).
- da Silva Costa, G., Rodrigues, M. M. S., Silva, A. A. E. Toward a blood-free diet for Anopheles darlingi (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. , 217 (2019).
- Gonzales, K. K., Tsujimoto, H., Hansen, I. A. Blood serum and BSA, but neither red blood cells nor hemoglobin can support vitellogenesis and egg production in the dengue vector Aedes aegypti. PeerJ. 3, 938 (2015).
- Gonzales, K. K., et al. The Effect of SkitoSnack, an Artificial Blood Meal Replacement, on Aedes aegypti Life History Traits and Gut Microbiota. Scientific Reports. 8 (1), 11023 (2018).
- Tsujimoto, H., Anderson, M. A. E., Myles, K. M., Adelman, Z. N. Identification of Candidate Iron Transporters From the ZIP/ZnT Gene Families in the Mosquito Aedes aegypti. Frontiers in Physiology. 9, 380 (2018).
- Ioshino, R. S., et al. Oviplate: A Convenient and Space-Saving Method to Perform Individual Oviposition Assays in Aedes aegypti. Insects. 9 (3), 103 (2018).
- Price, D. P., Schilkey, F. D., Ulanov, A., Hansen, I. A. Small mosquitoes, large implications: crowding and starvation affects gene expression and nutrient accumulation in Aedes aegypti. Parasites & Vectors. 8, 252 (2015).
- Valerio, L., Matilda Collins, C., Lees, R. S., Benedict, M. Q. Benchmarking vector arthropod culture: an example using the African malaria mosquito, Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae). Malaria Journal. 15 (1), 262 (2016).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
