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May 04, 2021
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यह प्रक्रिया मच्छर शोधकर्ताओं को व्यक्तिगत स्तर पर अपने मच्छरों की प्रजनन फिटनेस को आसानी से संबोधित करने की अनुमति देती है। पारंपरिक तरीकों की तुलना में, यह प्रोटोकॉल व्यक्तिगत स्तर पर मच्छरों की fecundity और प्रजनन क्षमता का परीक्षण करने के लिए आवश्यक समय, स्थान और श्रम को काफी कम कर देता है। ओविपोजिशन प्रयोग के लिए प्लेट तैयार करके शुरू करें।
एक १.६ मिलीमीटर बिट के साथ एक घरेलू ड्रिल का उपयोग कर एक 24 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट के ढक्कन में अच्छी तरह से प्रति चार से छह छेद ड्रिल । प्रयोग से एक दिन पहले, प्लेटों को धोएं और कुल्ला करें और उन्हें कमरे के तापमान पर 30 से 60 मिनट के लिए 1% से 5% ब्लीच में भिगो दें। फिर, प्लेटों को अच्छी तरह से पानी के नीचे धोएं और उन्हें सुखा लें।
पिघल 2% deionized पानी में agarose और तुरंत पिघला हुआ ag के 500 माइक्रोलीटर एक 24 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं के लिए उठी जोड़ें। किसी भी संघनन को सुखाने के लिए रात भर लैब बेंच पर प्लेटें छोड़ दें। खून भरने से कम से कम 16 घंटे पहले मादा मच्छरों से पानी या चीनी का कोई भी स्रोत निकाल लें।
फीडिंग के दिन एक पानी का परिसंचरण 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें और मच्छरों को कृत्रिम फीडरों में रखे कशेरुकी रक्त से 15 से 30 मिनट तक खिलाएं। फिर, मच्छरों को बर्फ पर एक ग्लास डिश में स्थानांतरित करें। उन लोगों का चयन करें जो रक्त से घिरे हुए हैं और उन्हें 30% सुक्रोज पानी के साथ एक कंटेनर में रखें।
महिलाओं को उत्सर्जन और अंडे के विकास को खत्म करने के लिए कम से कम 72 घंटे की अनुमति दें। मच्छरों को 24-अच्छी प्लेट में स्थानांतरित करने से लगभग एक घंटे पहले, प्रत्येक कुएं में दो से तीन बूंदें पानी जोड़ने के लिए स्थानांतरण पिपेट का उपयोग करें। कार्बन डाइऑक्साइड के साथ मच्छरों को नीचे गिराएं और उन्हें बर्फ पर एक ग्लास डिश में स्थानांतरित करें।
फिर, व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक मच्छर को 24-अच्छी प्लेट के उल्टे ढक्कन पर रखें। एक बार सभी 24 मच्छरों को रखा गया है, एक उल्टे प्लेट नीचे के साथ ढक्कन को कवर करें, इसे एक ताजा नए रबर बैंड के साथ सुरक्षित करें और मच्छरों के ठीक होने तक इसे पर्यावरणीय कक्ष में रखें। इसके बाद प्लेट को राइट साइड में घुमाएं।
मादा मच्छरों को 24 से 48 घंटे तक ओविपोसिट करने की अनुमति दें। फिर, महिलाओं को प्लेटों से एक बड़े पिंजरे में छोड़ कर हटा दें। अंडे गिनने से पहले, उन अंडों के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से जांचें जो अच्छी दीवारों पर हैं और एगर उठे और प्लास्टिक की सतह के मार्जिन पर जहां उन्हें तस्वीरों में हल करना मुश्किल है।
इन अंडों को सपाट सतह पर ले जाने के लिए गीले तूलिका का प्रयोग करें ताकि सभी अंडे एक समान प्लेन में हों और एक-दूसरे को ओवरलैप न करें। उन कुओं में किसी भी टूटे हुए पैर, पंख और अन्य कणों को हटाने के लिए संदंश का उपयोग करें जो इमेजिंग अंडे में हस्तक्षेप कर सकते हैं। माइक्रोस्कोप मोड में एक कॉम्पैक्ट डिजिटल कैमरा सेट करें, जो उपयोगकर्ता को एक सेंटीमीटर के रूप में वस्तुओं पर ध्यान केंद्रित करने और प्रत्येक अच्छी तरह से एक छवि लेने की अनुमति देता है।
एक प्लेट के प्रत्येक कुएं की फोटो खींचने के बाद, पूरी प्लेट की एक छवि लें। बाद में प्रत्येक प्लेट को अलग करने के लिए इमेजिंग ऑर्डर लेबल का उपयोग करें। अपने एगर उठे प्लग और अंडों को सूखने से रोकने और भ्रूण के विकास और हैचिंग को प्रेरित करने के लिए प्रत्येक कुएं में लगभग पांच बूंदें पानी जोड़ें।
छवियों को कंप्यूटर में स्थानांतरित करें और आसान संगठन के लिए प्लेट और अच्छी तरह से विज्ञापनों के साथ फ़ाइलों का नाम बदलें। इमेजजे के साथ छवियों को खोलें और अंडे के झुरमुटों की गिनती करने के लिए प्रत्येक अंडे को चिह्नित करने के लिए मल्टी-पॉइंट टूल का उपयोग करें। सभी अंडों को चिह्नित करने के बाद, अंकों की संख्या को लाने और स्प्रेडशीट में परिणाम रिकॉर्ड करने के लिए मल्टी-पॉइंट आइकन पर डबल क्लिक करें।
उन कुओं में भोजन जोड़ना शुरू करें जिनमें दिखाई देते ही लार्वा होते हैं। लगभग पांच से आठ दिन बाद, 15 से 20 मिनट के लिए कुचल बर्फ के साथ प्लेट को कवर करके लार्वा को एनेस्थेटाइज करें। इसके विपरीत बढ़ाने के लिए प्लेट के नीचे एक काली सामग्री डालें और बर्फ पर प्लेटों को रखते हुए प्रत्येक अच्छी तरह से छवियां लें।
प्रत्येक अच्छी तरह से फोटो खिंचवाने के बाद, एक इमेजिंग ऑर्डर लेबल के साथ पूरी प्लेट की एक छवि लें। इमेजजे के साथ छवियां खोलें और लार्वा को गिनने के लिए मल्टी-पॉइंट टूल का उपयोग करें। लार्वा आकार, कोण और ध्यान में भिन्न हो सकते हैं।
शेड क्यूटिकल्स को बाहर करें, जो थोड़ा सा शरीर, या सिकुड़े लार्वा के साथ सिर-केवल लार्वा की तरह दिखते हैं। स्प्रेडशीट में परिणाम रिकॉर्ड करें। मच्छरों को एक उम्मीदवार आयरन ट्रांसपोर्टर, FeT, या एक नियंत्रण जीन, EGFP को निशाना बनाते हुए डबल-फंसे आरएनए के साथ इंजेक्शन दिया गया था ।
फिर, वे रक्त खिलाया और ईगल प्लेट विधि का उपयोग कर fecundity और प्रजनन उत्पादन के लिए मापा गया । मच्छरों जिसमें लोहा ट्रांसपोर्टर अभिव्यक्ति खामोश था अंडे की संख्या और हैच दर दोनों में एक महत्वपूर्ण कमी का प्रदर्शन किया । FeT-खामोश मच्छरों ने भी देरी से उत्सर्जन और छोटे और हल्के रंग के अंडों का प्रदर्शन किया ।
अच्छी तस्वीरें लेना इस विधि के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है क्योंकि चित्रों की गुणवत्ता और व्यक्तिगत अंडे या लार्वा की मात्रा सीधे परिणामों की गुणवत्ता को प्रभावित करते हैं।
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वर्णित एक समय और अंतरिक्ष की बचत विधि अंडे गिनती और 24 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेटों का उपयोग कर व्यक्तिगत मच्छरों की हैच दरों का निर्धारण है, जो काफी पैमाने और fecundity और प्रजनन क्षमता परख की गति में वृद्धि कर सकते हैं ।
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Tsujimoto, H., Adelman, Z. N. Improved Fecundity and Fertility Assay for Aedes aegypti using 24 Well Tissue Culture Plates (EAgaL Plates). J. Vis. Exp. (171), e61232, doi:10.3791/61232 (2021).
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