Summary
Beschreven is een tijd- en ruimtebesparende methode om eieren te tellen en de broedsnelheden van individuele muggen te bepalen met behulp van 24 putweefselkweekplaten, die de schaal en snelheid van vruchtbaarheids- en vruchtbaarheidstesten aanzienlijk kunnen verhogen.
Abstract
Muggen vertegenwoordigen een aanzienlijk probleem voor de volksgezondheid als vectoren van verschillende ziekteverwekkers. Voor die studies die een beoordeling van de geschiktheidsparameters van muggen vereisen, met name de productie van eieren en de broedsnelheden op individueel niveau, hebben conventionele methoden onderzoekers aanzienlijk belast vanwege de hoge arbeidsintensiteit en laboratoriumruimtevereisten. Beschreven is een eenvoudige methode met behulp van 24 put weefsel cultuur plaat met agarose in elke put en digitale beeldvorming van elke put om ei nummers en hatch rates te bepalen op een individueel niveau met aanzienlijk verminderde tijd en ruimte eisen.
Introduction
De bestrijding van muggen om mensen te beschermen tegen door vectoren overgedragen ziekteverwekkers is een belangrijk doel voor de volksgezondheid, voornamelijk vanwege het gebrek aan effectieve vaccins voor de meeste pathogenen die door muggen worden gedragen. Veel studies zijn gericht op het verminderen van de conditie van muggen in combinatie met een in het veld toepasbare strategie voor populatievermindering1,2,3. Dit omvat uitgebreide studies om transgene muggen en / of CRISPR / Cas9 knock-out lijnen te maken. Dergelijke benaderingen voor bevolkingsaanpassing vereisen een gedetailleerde beoordeling van individuele geschiktheidsparameters4. Conventionele laboratoriumtechnieken om de geschiktheid van vrouwelijke muggen te beoordelen, omvatten de individuele insluiting van gepaarde, met bloed gevoede vrouwelijke muggen in containers van 100 ml5, gemodificeerde conische buizen van 50 ml of buizen voor drosophila-opfok, gewijzigd door vochtige oppervlakken te bieden met vochtig katoen en filterpapierschijven voor ovipositie (d.w.z. eierpapier)1,2,6,7. Dergelijke methoden vereisen een relatief grote ruimte (bijv. 30 cm x 30 cm x 10 cm: B x L x H voor maximaal 100 Drosophila-buizen) (figuur 1), en de manipulatie van individuele eierpapieren voor het tellen van eieren en broedlarven, die arbeidsintensief kunnen zijn. Dit manuscript presenteert een methode om muggeneieren te tellen en broedsnelheden te bepalen met behulp van 24 putplaten en agarose als een ovipositieoppervlak om deze problemen te omzeilen8.
Tegelijkertijd beschreven Ioshino et al.9 een gedetailleerde methode waarbij 12 en 24 putplaten werden gebruikt om eiertellingen uit te voeren die van individuele vrouwtjes werden verkregen. Hun protocol vertegenwoordigde een aanzienlijke verbetering ten opzichte van conventionele methoden om tijd en ruimte te besparen9. Het protocol dat ze beschreven blijft echter nat filterpapier gebruiken als een oppervlak voor ovipositie, waarvoor elk afzonderlijk papier moet worden uitgevouwen om tellingen te krijgen, omdat eieren vaak onder of in plooien worden gevonden. Hun protocol omvatte ook niet het gebruik van beeldvormingstechnologieën of een methode voor het tellen van larven.
Gepresenteerd is een verbeterde methode om fitnesstesten uit te voeren voor einummer (d.w.z. vruchtbaarheid) en broedsnelheid (d.w.z. vruchtbaarheid) met behulp van agarose als ovipositieoppervlak in een 24-put weefselkweekplaatformaat voor Ae. aegypti dat legboor op vochtige oppervlakken. Deze platen werden "EAgaL" platen genoemd, van Egg, Agarose en Larva. Deze 24 putplaten bieden individuele muggen een minimaal oppervlak om eieren te leggen, waardoor de tijd en moeite die nodig is om eieren en uitgebroede larven een paar dagen te tellen en te onderhouden, wordt vereenvoudigd en drastisch wordt verminderd. De EAgaL-plaat maakt gebruik van doorschijnende agarose voor het ovipositieoppervlak, waardoor het niet meer nodig is om met eierpapier om te gaan en de eieren en larven te vinden wanneer ze uitkomen; het fotograferen van elke put zorgt voor een langetermijn gearchiveerde registratie van de resultaten en scheidt het telproces in zowel tijd als ruimte van het opfok- / hanteringsproces, waar de tijd vaak beperkt is.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Plaatvoorbereiding
- Boor gaten in 24 putweefselkweekplaatdeksels (4−6 gaten per put) met behulp van een huishoudboor met een boor van ~ 1,6 mm (1/16 inch) (figuur 2).
OPMERKING: Deze gaten voorkomen dat watercondensatie zich ophoopt op het deksel, waar muggen eieren kunnen leggen. De standaardgrootte van vrouwelijke Ae. aegypti ("Liverpool" stam) is ~3.11 mm spanwijdte. Het verminderen van de grootte van de gaten wordt aanbevolen bij het gebruik van kleinere muggen om te voorkomen dat ze uit de plaat ontsnappen. - Was en spoel de platen op de dag voorafgaand aan het ovipositie-experiment grondig af en week ze gedurende 30−60 min bij kamertemperatuur in 1−5% bleekmiddel. Spoel grondig af onder stromend gedeioneerd water en droog ze.
OPMERKING: Dit proces vermindert de kans dat schimmels en bacteriën op agarose groeien. - Smelt agarose bij 2% in gedeioneerd water en voeg onmiddellijk 500 μL gesmolten agarose toe aan elke put van de 24 putplaten met behulp van een pipet van 1.000 μL (figuur 3A,B). Wanneer de agarose begint af te koelen en de pipettip verstopt, verwarmt u de agarose opnieuw en gebruikt u een nieuwe pipettip.
OPMERKING: Raak de wanden van de put niet aan met de pipetpunt, omdat dit een stuk agarose op de muur kan achterlaten waar een vrouwtje eieren kan leggen, wat het beeldvormings- en telproces bemoeilijkt. - Droog voor gebruik condensatie op de wanden van de put 's nachts uit op een laboratoriumbank (figuur 3C,D).
OPMERKING: De tijdlijn van de EAgaL-plaattest van bloedtoevoer naar larvale beeldvorming is weergegeven in figuur 4, die is voor koloniemuggen (Ae. aegypti "Liverpool" gekweekt onder 14 uur licht: 10 uur donkere lichtcyclus, 27 °C, 80% relatieve vochtigheid, 500 larven in een 49,5 cm x 29,2 cm x 9,5 cm bak met 2 L. Het wordt aanbevolen dat elk laboratorium de EAgaL-plaat test met de muggen die worden gebruikt, vooral bij het gebruik van verschillende stammen, verschillende muggensoorten en verschillende opfokprotocollen.
2. Muggenvoer
OPMERKING: Het is van cruciaal belang om muggen te gebruiken die onder uniforme omstandigheden worden gekweekt voor alle behandelingsgroepen en controlegroepen, omdat larvale voeding een impact heeft op de fitnessparameters van muggen10,11. Achterlarven onder rustige omstandigheden met voldoende voedsel. Laat vrouwelijke muggen in de aanwezigheid van mannetjes sluiten, zodat de paring is verzekerd en rijp gedurende ten minste 3 dagen.
- Verwijder elke bron van water en/of suiker van de vrouwelijke muggen ten minste 16 uur voorafgaand aan de bloedtoevoer om de bloedtoevoer te verbeteren.
- Verwarm een watercirculatiepomp voor kunstmatige voeding bij 37 °C en voer vrouwelijke muggen met gewerveld bloed dat gedurende 15-30 minuten in kunstmatige feeders is geplaatst (figuur 5A).
- Verdoof muggen met CO2 of op ijs, breng ze over in een glazen schaal op ijs en selecteer degenen die met bloed zijn omhult (figuur 5B) in een container met 30% sacharosewater gedurende meer dan 72 uur, wanneer vrouwtjes klaar zijn met uitscheiding en eiontwikkeling.
OPMERKING: Als de vrouwtjes een lagere concentratie sacharosewater hebben, verwijder dan het sacharosewater en eventuele natte oppervlakken na 48 uur om te voorkomen dat de vrouwtjes legboor worden.
3. Ovipositie
- Voeg ongeveer 1 uur voordat u muggen naar de platen overbrengt 2−3 druppels (~ 80−120 μL) water toe aan elke plaatput met behulp van een transferpipet.
- Ten minste 72 uur na het bloed voeden, muggen met CO2 of op ijs neerhalen, overbrengen naar een glazen schaal op ijs en elke mug afzonderlijk op een omgekeerd deksel van de 24 putplaat op ijs plaatsen (figuur 6A).
OPMERKING: Deze procedure is toegepast vanuit Ioshino et al.9. - Zodra alle 24 muggen zijn geplaatst, bedekt u het deksel met een omgekeerde plaatbodem(afbeelding 6B),bevestigt u het deksel en de plaat met een frisse, nieuwe rubberen band en plaatst u deze in een milieukamer (of opfokkamer) (figuur 6C) totdat muggen zich herstellen (~ 10−15 min) en draait u de plaat naar rechts (Afbeelding 6D).
- Laat de vrouwelijke muggen 24−48 uur legponeren en verwijder vrouwtjes door ze in een grote kooi van de platen los te laten.
OPMERKING: Als het belangrijk is om individuele vrouwtjes in de gaten te houden, verdoof ze dan door de platen te koelen en ze afzonderlijk op ijs te verwijderen. Vertraagde ovipositie en donkere uitscheidingen die het tellen van eieren verstoren, werden waargenomen wanneer vrouwtjes eerder dan 72 uur na de bloedmaaltijd (PBM) naar de platen werden overgebracht (figuur 7D).
4. Eieren tellen
- Controleer elke put van de 24 putplaat, omdat muggen soms eieren leggen op de muur van putten en aan de rand van het agarose / plastic oppervlak, waar ze moeilijk op te lossen zijn in foto's. Verplaats met een natte kwast de eieren die op de muur en rand van agarose zijn gelegd naar het vlakke oppervlak van de agarose, zodat alle eieren zich in een uniform vlak bevinden en niet met elkaar overlappen.
OPMERKING: De rand van de agarose bevindt zich meestal buiten het brandpuntsvlak van de camera vanwege de oppervlaktespanning van de agarose-oplossing. - Verwijder met een tang gebroken benen, vleugels en andere deeltjes in de putten die de beeldvorming van eieren kunnen verstoren (figuur 7C).
- Plaats wit papier onder de plaat om het contrast met donkere muggeneieren te verhogen voordat u een stereomicroscoopverlichting gebruikt (figuur 7A).
- Maak een foto van elke put met behulp van een compacte digitale camera in microscoopmodus, waarmee de gebruiker zich kan concentreren op objecten vanaf 1 cm. Met deze mogelijkheid kan de camera direct op de plaat worden geplaatst om eieren zonder statief of standaard in beeld te brengen (figuur 7A). Om individuele eieren te onderscheiden die in klonten zijn gelegd, gebruikt u de fijne of superfijne modus om afbeeldingen met hoge resolutie vast te leggen, zodat close-updetails kunnen worden gezien.
OPMERKING: Wis de geheugenkaart van de camera voor gebruik om verwarring tussen nieuwe en oude beelden te voorkomen. - Nadat u elke put van een plaat hebt gefotografeerd, maakt u een afbeelding van de hele plaat met een afbeeldingsvolgordelabel om elke plaat later te onderscheiden(figuur 7E).
- Voeg een dunne laag ~ 5 druppels water (~ 200 μL) met een transferpipet toe aan elke put om te voorkomen dat de agaroseplug en de eieren drogen en om embryoontwikkeling en uitkomen te induceren. Let de eerste uren op de waterstanden en controleer elke dag, omdat er waterverlies kan zijn als gevolg van absorptie door de agarose of verdamping. Voeg water toe wanneer het niveau te laag is voor larven om uit te komen.
OPMERKING: Verdamping van water vindt niet-uniform plaats, zowel binnen een plaat als binnen een stapel platen. Er is waargenomen dat drogen in de volgende volgorde plaatsvindt: 1) hoekputten (A1, A6, D1, D6) drogen het snelst; gevolgd door 2) putten aan de buitenrand van de plaat (A2-A5, B1, B6, C1, C6, D2-D5); en laatste 3) putten binnen. Wanneer platen worden gestapeld, droogt de bovenste plaat het snelst. - Breng de afbeeldingen over naar een computer met ImageJ (Fiji) en hernoem de bestanden voor een eenvoudigere organisatie, zoals "[plate ID]_[well ID].jpg" (Figuur 8A,B).
- Maak een spreadsheetbestand om einummers (d.w.z. vruchtbaarheid) en larvale getallen vast te leggen en de broedsnelheid (d.w.z. vruchtbaarheid) te berekenen (figuur 9E).
- Open de afbeeldingen met Afbeelding J (Fiji)12 en gebruik het "meerpunts" gereedschap om elk ei te markeren (figuur 9A−C); zoom in of uit met de toets "+" of "–" om de eieren in klonten te tellen. Nadat u alle eieren hebt gemarkeerd, dubbelklikt u op het meerpuntspictogram om het aantal markeringen te weergeven (figuur 9D). Noteer de resultaten in een spreadsheet.
5. Vruchtbaarheidsbeoordeling
OPMERKING: Binnen 2 dagen kunnen de eerste instar-larven in de putten beginnen te sluiten. Wacht nog 3-5 dagen voordat u gaat beeldvorming/telling om ervoor te zorgen dat alle levensvatbare eieren uitkomen.
- Bereid larvaal voedsel door 1/16 eetlepel (~168 mg) gemalen visvoer (d.w.z. normaal muggenlarvendieet) te mengen in 20 ml water en te wachten tot grote vaste deeltjes zich vestigen (Figuur 10A−D). Begin met het toevoegen van voedsel (het supernatant) aan de putten die uitgebroede larven bevatten zodra ze verschijnen, omdat ze niet lang overleven zonder voedsel.
OPMERKING: Overmatige toevoeging van voedseldeeltjes kan de beeldvorming en het tellen van uitgebroede larven verstoren. - Ongeveer 5-8 dagen na toevoeging van water aan de putten, koel de plaat af door 15-20 minuten te bedekken met gemalen ijs om larven te verdoven.
- Maak foto's van elke put terwijl je de platen op ijs houdt zoals bij de eieren. Voor larvale afbeeldingen, zorg voor een donkere achtergrond door een zwart materiaal onder de plaat te plaatsen om het contrast te verbeteren. Nadat je elke put van een plaat hebt gefotografeerd, maak je een afbeelding van de hele plaat met een beeldvormingsorderlabel om elke plaat later te onderscheiden.
OPMERKING: Er worden foto's gemaakt terwijl de platen op ijs liggen, omdat de beweging van de larven het tellen in gevaar kan brengen. De platen zijn herbruikbaar; vries en verwijder de muggen en agarose om schoon te maken voor het volgende gebruik. De EAgaL-plaat is niet geschikt voor het fokken van larven tot gevorderde stadia. - Open afbeeldingen met ImageJ (Fiji) en gebruik het "multi-point" tool om te tellen door op elke larve te klikken. Gedurende de periode van 3-5 dagen kunnen sommige larven zijn vermolsten, vooral in putten met een laag aantal larven. Sluit daarom bij het tellen de afgeworpen nagelriemen (d.w.z. exuviae) uit, die eruit zien als larven met alleen kop met een beetje lichaam of gekrompen larven (figuur 10E). Noteer de resultaten in de spreadsheet.
6. Voer een analyse uit
- Nadat u alle benodigde gegevens voor de vruchtbaarheids- en vruchtbaarheidsanalyse hebt verzameld, voert u een passende statistische analyse uit en maakt u grafieken met behulp van voorkeurssoftware.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Muggen werden geïnjecteerd met dsRNA gericht op een kandidaat-ijzertransporter (FeT) of controlegen (EGFP), bloed gevoed en gemeten voor vruchtbaarheid en vruchtbaarheidsoutput met behulp van de EAgaL-plaatmethode, volgens de hierboven beschreven procedure.
Muggen waarbij fet-expressie werd gedempt na dsRNA-injectie vertoonden een significante vermindering van zowel het einummer als de broedsnelheid (figuur 11A−C). Alle bestrijdings- en behandelingsmuggen werden na 72 uur PBM in de EAgaL-platen geplaatst. FeT-gedempte muggen vertoonden ook vertraagde uitscheiding en kleine en lichtgekleurde eieren (figuur 12A,B). Voorbeeldresultaten zijn ook te vinden in Tsujimoto et al.8.
Figuur 1: Vliegenbuizen die vaak worden gebruikt voor muggenfecunditeit/ vruchtbaarheidstesten. (A) Een enkele buis met vochtig katoen en rond filterpapier met sponsdop. (B) 100 buizen in een rek (~30 cm x 30 cm). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Boren van gaten in een deksel van 24 putweefselkweekplaat. (A) Boren in bewerking. (B) Een deksel met gaten die condensatie voorkomen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Agarose (2% in water) aanbrengen in de putten. (A) Agarose aanbrengen met behulp van een pipet van 1.000 μL. Merk op dat de punt de wand van de put niet raakt. (B) Een plaat met agarose aan de onderkant. (C) Muur van een put direct nadat agarose gestold. Let op de condensatie op de muur. (D) Wand van een put wanneer condensatie verdampt. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Tijdlijn van bloedtoevoer (dag 0) tot larvale beeldvorming (dag 10−13). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: Kunstmatige bloedtoevoer en selectie van engorged vrouwtjes. (A) Bloedtoevoer met behulp van kunstmatige feeder. (B) Selectie van engorged vrouwtjes op ijs. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 6: Overdracht van vrouwtjes naar EAgaL-plaat. (A) Breng verdoofde vrouwtjes over op een omgekeerd plaatdeksel op ijs. (B) Plaats vervolgens voorzichtig de omgekeerde agarose-bevattende plaat op het omgekeerde deksel en (C) verwijder de plaat met deksel bevestigd van het ijs en houd deze in een omgekeerde positie totdat de vrouwtjes zijn hersteld van anesthesie. (D,E) Draai de vrouwelijke plaat in de opwaartse positie. Merk op dat het deksel en het onderste deel van de plaat worden vastgehouden door een elastiekje en dat het onderste deel is gelabeld. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 7: Beeldvorming van elke put nadat vrouwtjes werden verwijderd. (A) Digitale camera bovenop een ei-bevattende 24 put plaat voor beeldvorming. (B) Typische afbeelding van een put. (C) Een put met een been, die moet worden verwijderd. (D) Voorbeeldbeeld van een put waarin een vrouw op 48 h PBM was geplaatst. Let op de donkere uitscheidingssporen, die het tellen van eieren (pijlen) kunnen bemoeilijken. (E) Gehele plaat met een beeldvormingsorderetiket dat is opgesteld na de beeldvorming van alle putten van de plaat. Dit helpt bij het herkennen van putten tijdens de analyse. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 8: Hernoemen van de afbeeldingen voor een betere organisatie. (A) Afbeeldingen van individuele eierhoudende putten, waaronder een afbeeldingsorderlabel met de namen die automatisch door de camera worden toegewezen. (B) Dezelfde afbeeldingen hernoemd met plateID_wellID.jpg formaat. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 9: Eieren tellen met behulp van "Fiji" (ImageJ2) software. (A) Screenshot van Fiji software met de "multi-point" tool gemarkeerd (turquoise vierkant). (B) Een goed beeld met Fiji tellingstekens op de eieren. (C) Inzoomen helpt bij het tellen van grotere eigroepen. (D) Dubbelklikken op het "meerpunts" gereedschapspictogram in het hoofdvenster toont het aantal (rode cirkel). (E) Een voorbeeld van een spreadsheet met berekeningsformule voor arceringsfrequentie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 10: Larvale dieetpreparaat en een put met larven en exuviae. (A) Gemalen visvoer. (B) 20 ml water in een beker. (C) Mengsel van gemalen visvoer en water. (D) Voedsel / water bezinkte voor 15 min. Neem supernatant van dit mengsel als larvaal voedsel. (E) Goed met vermol molteerde larven; representatieve exuviae worden aangegeven met pijlen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 11: Tel gegevens van een genuitschakelingsexperiment. Muggen geïnjecteerd met dsRNA tegen putatieve ijzertransporter (FeT) vertoonden een significante vermindering van (A) einummer, (B) larvale aantal, en (C) hatch rate in vergelijking met controle (EGFP). Bars tonen gemiddelde ± SD. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 12: Representatieve beelden van de putten met extra fenotypes in genstilte muggen. dsFeT vertoonde vertraagde uitscheiding (donkerbruine vlekken) en kleine, lichtgekleurde eieren. Voor elke behandeling worden twee representatieve putten getoond. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| Ft. | EAgaL | |
| (1) Voorbereiding | 20 min 29.0 sec | 3 min 49.3 sec |
| (2) F_in | 3 min 55.0 sec | 1 min 56.0 sec |
| (3) F_out/E_img | 43 min 44.3 sec | 15 min 28.3 sec |
| (4) L_img | 38 min 03.5 sec | 9 min 30.5 sec |
Tabel 1: Tijdsvereisten voor de voltooiing van de vliegbuismethode (FT) in vergelijking met de EAgaL-plaatmethode. (1) Voorbereiding: Tijd die nodig is om katoen te plaatsen, water in te gieten en filterpapierschijf in Drosophila-opfokbuizen (FT) te plaatsen versus het gieten van agarose in putten van 24 putplaat (EAgaL). (2) F_in: Tijd die nodig is om individuele muggen in opfokbuizen (FT) of putten van de 24 putplaat (EAgaL) te plaatsen. (3) F_out/E_img: Tijd die nodig is om muggen in een grotere kooi los te laten, eierpapier te verwijderen, uit te vouwen en de eieren op het papier (FT) af te beelden of muggen in een grotere kooi los te laten en elke put van de 24 putplaat (EAgaL) in beeld te brengen. (4) L_img: Tijd die nodig is om larven in beeld te brengen die na koude anesthesie in een kleine container (FT) of elke put van de 24 putplaat (EAgaL) zijn uitgekomen. In totaal werden 24 buizen gebruikt voor FT.
| Bulkkosten | |||||
| EAgaL plaat | De buizen van de vlieg | ||||
| item | prijs | hoeveelheid | item | prijs | hoeveelheid |
| 24-put platen | 45,61 dollar | Geval van 50 | Chromatografie papieren vellen | 103,63 dollar | 46 × 57 cm 100 Vellen/PK |
| Agarose | 250,97 dollar | 500 gram | Fly buizenrekken + buizen | 68,45 dollar | 5 trays van 100 |
| Olympus TG-6 | 375,00 dollar | De buisstekkers van de vlieg | 66,10 dollar | Geval van 200 | |
| De ballen van het katoen | 104,27 dollar | Zaak van 2000 | |||
| Opstarttotaal | 671,58 dollar | Opstarttotaal | 342,45 dollar | ||
| Kostprijs (een 24-put plaat of 24 buizen) | |||||
| EAgaL plaat | De buizen van de vlieg | ||||
| item | prijs | notitie | item | prijs | notitie |
| een 24-put plaat | 0,91 dollar | bulkprijs/50 | Chromatografie papieren vellen | 0,16 dollar | 641.7 sets van 24 buizen ter waarde van(2) |
| Agarose per plaat | 0,15 dollar | 500g= 1667 platen(1) | Fly buizenrekken + buizen | 3,29 dollar | (bulkprijs/500) × 24 |
| De buisstekkers van de vlieg | 7,93 dollar | (bulkprijs/200) × 24 | |||
| De ballen van het katoen | 1,25 dollar | (bulkprijs/2000) × 24 | |||
| Totaal van de eenheid | 1,06 dollar | Totaal van de eenheid | 12,63 dollar | ||
Tabel 2: Kostenvergelijking tussen de EAgaL-plaat en FT. Boven: Bulkkosten voor opstarten (ervan uitgaande dat een boor en een boor door een onderzoeker kunnen worden geleverd). Bodem: Geschatte kosten voor een 24 put plaat (EAgaL plaat) en 24 FT. (1) Ervan uitgaande dat een plaat iets meer dan net genoeg nodig heeft voor een 24 put plaat (12mL), 15 ml van 2% = 0,3 g agarose per plaat, kan in totaal 500 g agarose 1.667 platen maken. (2)Een vel papier kan maken 154 van ~ 38 mm diameter schijven. Met 100 vellen kunnen 641,7 (15.400/24) sets van 24 buizen worden gemaakt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De EAgaL-plaat vermindert de arbeid, tijd en ruimte drastisch om individuele vruchtbaarheids- en vruchtbaarheidstesten in Aedes aegypti uit te voeren in vergelijking met de FT-methode. Voorlopige vergelijking tussen de FT-methode en de EAgaL-plaat resulteerde in kortere tijden voor alle stappen (beeldvormingstechniek werd toegepast op de FT-methode) (Tabel 1). Ter referentie: tabel 2 bevat een raming van de opstart- en testkosten (één EAgaL-plaat van 24 well versus 24 FT's).
Er zijn een paar punten om rekening mee te houden bij het gebruik van de EAgaL-platen. Een eerste zorg was dat muggen die in zo'n kleine ruimte zijn geplaatst, mogelijk niet alle eieren leggen vanwege beperkte beweging. Om te bepalen of dit het geval was, werden de muggen gezamenlijk overgebracht naar een grotere kooi met een ovipositiebeker bekleed met een papieren handdoek met water voor nog eens 48 uur nadat ze 48 uur in de EAgaL-platen hadden doorgebracht. De muggen legden inderdaad extra eieren, maar het gemiddelde aantal eieren per vrouw was slechts 2,1, wat in de meeste, zo niet alle gevallen niet leidt tot enig verschil in de uitkomst van een statistische analyse. Deze aantallen zijn afkomstig van meer dan 500 geteste muggen (gegevens niet getoond). Dit kan echter alleen voor de Ae. aegypti "Liverpool" muggensoort zijn met de beschreven omstandigheden. Elk laboratorium moet mogelijk testen of dit het geval is voor zijn muggen en omstandigheden.
Voor beeldvorming bedekte het enkele beeld van een camera die aan een stereomicroscoop was bevestigd niet een hele put, zelfs niet bij de laagste vergroting. Dit vereiste het verkrijgen van meerdere afbeeldingen per put en op zijn beurt het patchen van de afbeeldingen, of het bijhouden van eieren die in meerdere afbeeldingen van dezelfde put werden overlappen. Beide benaderingen bemoeilijkten de analyse ernstig en verhoogden de betrokken arbeid aanzienlijk. Bovendien is de camerahoek vanwege de aard van een stereomicroscoop altijd iets links of rechts van de loodrechte hoek, waardoor de linker- of rechterwand een deel van het agaroseoppervlak blokkeert.
Besmetting door micro-organismen, met name schimmels, kan een probleem zijn tijdens de test. Hoewel bleken de besmetting vóór de ovipositie kan minimaliseren, kunnen schimmels aanwezig zijn in de insectenomgeving en door de muggen zelf worden gedragen. In dergelijke gevallen kan het schoonhouden van insectenruimten de incidentie verminderen. Het is het beste voor elk lab om een EAgaL-plaat te testen om mogelijke problemen te detecteren.
Merk op dat de EAgaL-plaatmethode niet is ontworpen om muggenculturen buiten de vroege larvale stadia te behouden. Het gemiddelde aantal larven per put was meestal meer dan 60, en het is niet ongebruikelijk om meer dan 100 larven per put te hebben. Dit creëert overvolle omstandigheden, wat resulteert in een vertraging in de ontwikkeling, een lager verpoppingspercentage en zeer kleine volwassenen, wat downstreamstudies in gevaar kan brengen.
Momenteel is deze methode alleen getest met Ae. aegypti. Het wordt momenteel echter getest om de toepassing ervan uit te breiden naar andere soorten Aedes en zelfs andere geslachten van muggen zoals Anopheles en Culex.
Vanwege de verminderde tijd- en ruimtevereisten voor de EAgaL-plaatmethode kunnen de vruchtbaarheids- en vruchtbaarheidstesten worden opgeschaald tot semi-hoge doorvoer (d.w.z. 5-10 platen of meer per experiment). Deze functie van de EAgaL-plaatmethode kan zeer nuttig zijn om de belangrijke fitnessparameters van muggen te beoordelen voor insecticidetests, steriliteitsevaluatie, transgenese en genbewerkingsstudies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten voor deze studie.
Acknowledgments
We danken Texas A&M Agrilife Research Insect Vectored Diseases Grant Program voor financiering. We danken ook de Adelman-lableden voor hulp bij het ontwikkelen van deze methode en suggesties bij het opstellen van het manuscript, evenals Kevin Myles-lableden. We danken ook de recensenten en redacteuren voor hun hulp om dit manuscript beter te maken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.6 mm Φ drill bit | alternatively heated nails can be used | ||
| 1000 μL pipette tips (long) | Olympus plastics | 24-165RL | |
| 24-well tissue culture plate | Thermo Scientific | 930186 | clear, flat-bottom with ringed lid plates |
| Agarose | VWR | 0710-500G | |
| Compact digital camera | Olympus | TG-5/TG-6 | |
| Computer (Windows, Mac or Linux) | |||
| Deionized water | |||
| Fiji (imageJ) software | download from: https://fiji.sc/ | ||
| Forceps | Dumont | sharp forceps may break mosquito's body | |
| Glass Petri dishes | VWR | ||
| Household bleach | |||
| Household electric drill | |||
| illuminator for stereomicroscope (gooseneck) | |||
| P-1000 pipette | Gilson | ||
| paint brushes | |||
| Rubber bands | |||
| SD card | to record digital camera images (DSHC, SDXC should be better) | ||
| Spreadsheet software (Microsoft Excel) | Microsoft | Any spreadsheet software works | |
| TetraMin fish food | Tetra | ground with coffee grinder, blender or morter & pestle | |
| Transfer pipetts | VWR | 16011-188 |
References
- Bond, J. G., et al. Optimization of irradiation dose to Aedes aegypti and Ae. albopictus in a sterile insect technique program. PLoS One. 14 (2), 0212520 (2019).
- Fernandes, K. M., et al. Aedes aegypti larvae treated with spinosad produce adults with damaged midgut and reduced fecundity. Chemosphere. 221, 464-470 (2019).
- Inocente, E. A., et al. Insecticidal and Antifeedant Activities of Malagasy Medicinal Plant (Cinnamosma sp.) Extracts and Drimane-Type Sesquiterpenes against Aedes aegypti Mosquitoes. Insects. 10 (11), 373 (2019).
- Marrelli, M. T., Moreira, C. K., Kelly, D., Alphey, L., Jacobs-Lorena, M. Mosquito transgenesis: what is the fitness cost. Trends in Parasitology. 22 (5), 197-202 (2006).
- da Silva Costa, G., Rodrigues, M. M. S., Silva, A. A. E. Toward a blood-free diet for Anopheles darlingi (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. , 217 (2019).
- Gonzales, K. K., Tsujimoto, H., Hansen, I. A. Blood serum and BSA, but neither red blood cells nor hemoglobin can support vitellogenesis and egg production in the dengue vector Aedes aegypti. PeerJ. 3, 938 (2015).
- Gonzales, K. K., et al. The Effect of SkitoSnack, an Artificial Blood Meal Replacement, on Aedes aegypti Life History Traits and Gut Microbiota. Scientific Reports. 8 (1), 11023 (2018).
- Tsujimoto, H., Anderson, M. A. E., Myles, K. M., Adelman, Z. N. Identification of Candidate Iron Transporters From the ZIP/ZnT Gene Families in the Mosquito Aedes aegypti. Frontiers in Physiology. 9, 380 (2018).
- Ioshino, R. S., et al. Oviplate: A Convenient and Space-Saving Method to Perform Individual Oviposition Assays in Aedes aegypti. Insects. 9 (3), 103 (2018).
- Price, D. P., Schilkey, F. D., Ulanov, A., Hansen, I. A. Small mosquitoes, large implications: crowding and starvation affects gene expression and nutrient accumulation in Aedes aegypti. Parasites & Vectors. 8, 252 (2015).
- Valerio, L., Matilda Collins, C., Lees, R. S., Benedict, M. Q. Benchmarking vector arthropod culture: an example using the African malaria mosquito, Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae). Malaria Journal. 15 (1), 262 (2016).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
