Denne metode tilvejebringer en gravimetrisk kvantificering af humane stoffer (f.eks. huminsyre og fulvinsyrer) på askefri basis i tørre og flydende materialer fra bløde kul (dvs. oxideret og ikke-oxideret brunkul og subbituminøst kul), humatmalm og skifer, tørv, kompost og handelsgødning og jordændringer.
Formålet med denne metode er at tilvejebringe en nøjagtig og præcis koncentration af humane (HA) og/eller fulvinsyrer (FA) i bløde kul, huminmalm og skifer, tørv, kompost og humane stofholdige kommercielle produkter. Metoden er baseret på alkalisk ekstraktion af testmaterialer under anvendelse af 0,1 N NaOH som ekstraktionsmiddel og adskillelse af de alkaliske opløselige humane stoffer (HS) fra ikke-opløselige produkter ved centrifugering. PH-værdien af det centrifugerede alkaliske ekstrakt justeres derefter til pH 1 med konc. HCI, hvilket resulterer i udfældning af HA. Den udfældede HA adskilles fra fulvicfraktionen (FF) (den brøkdel af HS, der forbliver i opløsning) ved centrifugering. HA’en ovn- eller frysetørres derefter, og askeindholdet i den tørrede HA bestemmes. Vægten af den rene (dvs. askefri) HA divideres derefter med prøvens vægt og den resulterende fraktion ganget med 100 for at bestemme procentdelen HA i prøven. For at bestemme FA-indholdet lægges FF på en hydrofob DAX-8-harpiks, som adsorberer FA-fraktionen, også kaldet den hydrofobe fulvinsyre (HFA). Den resterende ikke-fulvinsyrefraktion, også kaldet den hydrofile fulvicfraktion (HyFF), fjernes derefter ved at vaske harpiksen med deioniseret H2O, indtil alt ikke-forstyrret materiale er helt fjernet. FA desorberes derefter med 0,1 N NaOH. Den resulterende Na-fulvat protoneres derefter ved at føre den over en stærk H +-udvekslingsharpiks. Den resulterende FA er ovn- eller frysetørret, askeindholdet bestemmes og koncentrationen i prøven beregnes som beskrevet ovenfor for HA.
Humane stoffer (HS) er dynamiske restkoncentrationer, der skyldes mikrobiel nedbrydning og omdannelse af døde plantevæv1,2,3 suppleret med mikrobielle biprodukter og biomasse3,4,5 gennem en proces, der betegnes befugtning6. HS er til stede i jordbund, naturlige farvande, søsedimenter, tørv, bløde kul og humiske skifer og udgør anslået 25% af det samlede organiske kulstof på jorden7. Disse stoffer er komplekse blandinger af tusindvis af unikke molekyler, der fraktioneres i tre hovedfraktioner baseret på deres forskellige opløseligheder i stærkt basiske og syre vandige opløsninger. Disse fraktioner er huminsyrer (FA’er), som omfatter den alkaliopløselige, men syreuopløselige fraktion; fulvinsyrer (FA’er), den fraktion, der er opløselig i både alkali og syre; og huminfraktionen, som er uopløselig ved alle pH-værdier6,8. Fulvic fraktionen (FF) er yderligere opdelt i de hydrofobe FA (HFA) og hydrofile (HyFA) fraktioner. Disse fraktioner defineres som den del af FF, der binder til en hydrofob DAX-8-harpiks (HFA) og den del, der ikke binder til harpiksen (HyFA).
HS anvendes i stigende grad i landbruget, hvor de i vid udstrækning anvendes som biostimulanser til afgrøder, i husdyrhold, navnlig som tilsætningsstof til husdyrfoder, i minedrift i boremudder og miljøafhjælpning som elektronbusser. Forskning i brugen af HS i humanmedicinske applikationer er også stigende.
Der findes mange metoder til kvantation af HA og FA. De fleste af disse metoder er dog hverken nøjagtige eller præcise. For eksempel er de to mest anvendte metoder til bestemmelse af HA i USA den kolorimetriske metode9 og California Department of Food and Agriculture (CDFA) -metoden, som begge viste sig at overvurdere mængden af HA i en række malm og ekstraktkilder fra det vestlige USA og Canada10. Den kolorimetriske eller spektrofotometriske metode er unøjagtig, fordi den er afhængig af absorbansen af alkaliske ekstrakter, der ud over HA omfatter FA og andre kromoforer, som alle absorberer ved den anvendte bølgelængde, og standarden er ikke repræsentativ for de materialer, der testes10. CDFA-metoden er ikke nøjagtig, fordi den ikke giver HA-koncentrationer på askefri basis. Fordi forskellige malme har forskellige mængder aske, hvoraf nogle bæres med ekstraktionen, og selve ekstraktionsprocessen tilføjer aske, giver denne metode ikke en nøjagtig værdi for HA-koncentrationer10. Som svar på behovet for en nøjagtig og præcis metode blev der i 2014 offentliggjort en standardiseret gravimetrisk procedure baseret på den, der er beskrevet af11 for at adressere kvantitation af både HA og FA på askefri basis12. Denne metode blev derefter tilpasset, med mindre ændringer, af Den Internationale Standardiseringsorganisation (ISO) i 2018 under Gødning og jordbalstandere som “Bestemmelse af humic og hydrofobe fulvinsyrekoncentrationer i gødningsmaterialer”13.
Dette papir skitserer protokollen for ekstraktion og kvantvantation af humic og hydrofobe fulvinsyrer og giver detaljer om nøjagtigheden og præcisionen af de data, der produceres fra metoden.
De indledende trin i ekstraktion og isolering af HA i denne metode er relativt ligetil. Fordi isoleringen af HFA involverer kolonnekromatografi, kommer opnåelse af repeterbare resultater med streng overholdelse af detaljerne i hvert trin og praksis. Især er korrekt fremstilling af harpikserne af største betydning. Det er ekstremt vigtigt, at polymethylmethacrylat DAX-8-harpiksen fremstilles og pakkes korrekt. Korrekt pakning af harpiksen påvirker både udbyttet og kvaliteten af HFA. Hvis der findes kanalisering, vil hverken forbehandling (dvs. forsuring) eller adsorption af HFA være fuldstændig, og adskillelsen vil føre til unøjagtige resultater. Hvis der observeres kanaler eller mellemrum i harpiksen inden prøvepåfyldning, skal kolonnen fjernes og rystes for at omfordele harpiksperlerne ved at lade dem sætte sig uden kanaler og derefter pakkes igen ved at pumpe ren DI H2O gennem harpiksen. Som nævnt i protokollen vil opretholdelse af et volumen væske over harpiksen, når FF’en lægges på harpiksen, desuden gøre det muligt for FF at blande, inden den kommer ind i harpiksen og resultere i mere effektiv adsorption. For den stærke kation H +-udvekslingsharpiks (Tabel over materialer) kan fuldstændig regenerering ikke forhastes. Na+/H+-udvekslingen tager tid, og derfor gøres dette bedst i en bulkbehandling, så harpiksen kan blandes, mens den gensyres. Blanding af harpiksen under skylning med DI H2O hjælper med at fjerne overskydende HCI. Når du hæver den forsurede harpiks for at fjerne overskydende syre, hjælper blanding af harpiksen med at fjerne HCI. Det er ekstremt vigtigt at fjerne syren til det punkt, hvor en elektrisk ledningsevne på ≤ 0,7 μS /cm nås. Hvis ikke, overføres HCL med HFA.
Endelig, når HFA desorberes fra DAX-8-harpiksen, når absorbansen af det influente er lig med spildevandets absorbans, er det en god praksis at lade søjlen sidde i et par timer for at se, om der frigives yderligere HFA. I så fald vil det blive set som en gulfarvning af væsken over harpiksen. Hvis dette sker, kan den ekstra HFA fjernes ved fortsat desorption, indtil influente/spildevandsabsorbenter er ens igen.
En af ulemperne ved HFA-isoleringen er, at hele processen er tidskrævende. Den fuldstændige desorption af HFA fra DAX-8-harpiksen og fuldstændig fjernelse fra H+-udvekslingsharpiksen resulterer begge i et betydeligt volumen HFA, der skal reduceres ved roterende fordampning. Dette er bestemt en flaskehals i analysen. I et forsøg på at reducere denne tid er det blevet foreslået at desorbere HFA fra DAX-8-harpiksen ved hjælp af acetone i stedet for 0,1 M NaOH14. Forfatterne hævdede, at ved at anvende 50% acetone som desorbent i stedet for NaOH blev der opnået et lignende HFA-resultat, og DAX-8 blev tilstrækkeligt regenereret, og dermed kunne H +-udvekslingstrinnet elimineres. Denne ændring resulterede i en stærkt reduceret analysetid som følge af nedsat produceret volumen og hurtigere roterende fordampning af acetone sammenlignet med vand. Denne ændring fortjener yderligere undersøgelse.
Denne metode er begrænset til analysen af organisk materiale, der har gennemgået befugtningsprocessen, og for så vidt angår tørv og bløde kul, de videre processer med tørvning og både tørvning og kulificering. Befugtning er den proces, hvorved døde, primært plantemateriale, nedbrydes af en sekvens af mikrober, der forbruger og modificerer stadig mere genstridige substrater. Abiotiske processer deltager også i nedbrydning og resyntesereaktioner. Befugtning resulterer i sidste ende i produktion af relativt genstridige materialer, der omfatter heterogene blandinger af tusindvis af molekyler, der danner en række molekylvægt og kulstof-, ilt- og hydrogenindhold, der danner HS. HS modificeres yderligere ved tørvning og kuldannelse. Derfor er denne metode ikke egnet til plantematerialer, der er blevet modificeret ved kemiske processer. For eksempel anvendes lignosulfonat i vid udstrækning som et HFA-forfalskningsmiddel. Lignosulfonat er et biprodukt af sulfitmasseprocessen. Derfor er dette materiale ikke blevet produceret ved befugtningsprocessen. Derudover er der mange stoffer, der binder til DAX-8-harpiksen. For eksempel er DAX-8-harpiks blevet brugt til at adsorbere pesticider fra opløsning15. Det er klart, at pesticider ikke er HS. Binding af et materiale til DAX-8-harpiks begrunder således ikke en påstand om, at det er en HFA. Forudsætningerne er både produktion ved befugtning og binding til DAX-8-harpiks.
Efterhånden som man får mere at vide om bidraget fra de forskellige komponenter i HS i forskellige anvendelser, kan det blive en fordel at fraktionere HS yderligere og dermed ændre metoden i overensstemmelse hermed. Som det eksisterer, kvantificerer metoden ikke HYFA. Denne fraktion kan dog også have aktivitet, f.eks. inden for plantebiostimulering, hvor hele FF generelt anvendes i landbrugsbehandlinger snarere end renset HFA.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne anerkende Humic Products Trade Association (HPTA) for deres støtte til finansiering af det arbejde, der resulterede i standardisering af de metoder, der er beskrevet i dette papir, og også Lawrence Mayhew og Dr. Dan Olk og Paul Bloom for teknisk support under standardiseringsarbejdet.
Amberlite IR 120 H+-exchange resin | Sigma-Aldrich | 10322 | H+ form |
Analytical Balance | Ohaus | PA214 | w/ glass draft shield |
Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-14 | minimum 4300 rpm |
Centrifuge tubes | Beckman Coulter | To fit rotor selected | |
Ceramic Combustion Crucibles | Sigma | Z247103 | |
Chromatography column for DAX-8 | Diba | Omnifit 006EZ-50-25-FF | |
Chromatography column for IR 120 | Chemglass | CG-1187-21 2 in. by 24 in. | |
Dessicator | Capitol Scientic | Kimax 21200-250 | Vacuum type |
Drying Oven | Fisher Scientific | Isotemp | Precision±3˚C |
Electrical conductivity meter | HM Digital | EC-3 | |
Erlenmeyer Flasks | Amazon | 1L, 2L | |
HCl concentrated | Sigma-Aldrich | 320331 | |
Magnetic Stir Plate | Barnstead-Thermolyne | Dataplate 721 | |
Magnetic Stir bars | These can be obtained at many outlets | ||
Muffle Furnace | Fisher scientific | Thermolyne Type 47900 | |
NaOH | Sigma-Aldrich | 795429 | |
Nitrogen gas | Praxair | UNI1066 | 99.99% purity |
Peristaltic pump | Cole Parmer | Masterflex 7518-00 | |
Perstaltic tubing | Cole Parmer | Masterflex Pharmed 06508-17 | |
pH meter | Oakton Instruments | WD-35618–03 | |
Rotary Evaporator | Buchi | R-210/R-215 | |
Spectrophotometer | Healthcare SCiences | Ultrospec II | Dual beam 200 to 900 nm with wavelength accuracy of ±1 nm and reproducibility of ±0.5 nm. |