Summary
Denne metode tilvejebringer en gravimetrisk kvantificering af humane stoffer (f.eks. huminsyre og fulvinsyrer) på askefri basis i tørre og flydende materialer fra bløde kul (dvs. oxideret og ikke-oxideret brunkul og subbituminøst kul), humatmalm og skifer, tørv, kompost og handelsgødning og jordændringer.
Abstract
Formålet med denne metode er at tilvejebringe en nøjagtig og præcis koncentration af humane (HA) og/eller fulvinsyrer (FA) i bløde kul, huminmalm og skifer, tørv, kompost og humane stofholdige kommercielle produkter. Metoden er baseret på alkalisk ekstraktion af testmaterialer under anvendelse af 0,1 N NaOH som ekstraktionsmiddel og adskillelse af de alkaliske opløselige humane stoffer (HS) fra ikke-opløselige produkter ved centrifugering. PH-værdien af det centrifugerede alkaliske ekstrakt justeres derefter til pH 1 med konc. HCI, hvilket resulterer i udfældning af HA. Den udfældede HA adskilles fra fulvicfraktionen (FF) (den brøkdel af HS, der forbliver i opløsning) ved centrifugering. HA'en ovn- eller frysetørres derefter, og askeindholdet i den tørrede HA bestemmes. Vægten af den rene (dvs. askefri) HA divideres derefter med prøvens vægt og den resulterende fraktion ganget med 100 for at bestemme procentdelen HA i prøven. For at bestemme FA-indholdet lægges FF på en hydrofob DAX-8-harpiks, som adsorberer FA-fraktionen, også kaldet den hydrofobe fulvinsyre (HFA). Den resterende ikke-fulvinsyrefraktion, også kaldet den hydrofile fulvicfraktion (HyFF), fjernes derefter ved at vaske harpiksen med deioniseret H2O, indtil alt ikke-forstyrret materiale er helt fjernet. FA desorberes derefter med 0,1 N NaOH. Den resulterende Na-fulvat protoneres derefter ved at føre den over en stærk H +-udvekslingsharpiks. Den resulterende FA er ovn- eller frysetørret, askeindholdet bestemmes og koncentrationen i prøven beregnes som beskrevet ovenfor for HA.
Introduction
Humane stoffer (HS) er dynamiske restkoncentrationer, der skyldes mikrobiel nedbrydning og omdannelse af døde plantevæv1,2,3 suppleret med mikrobielle biprodukter og biomasse3,4,5 gennem en proces, der betegnes befugtning6. HS er til stede i jordbund, naturlige farvande, søsedimenter, tørv, bløde kul og humiske skifer og udgør anslået 25% af det samlede organiske kulstof på jorden7. Disse stoffer er komplekse blandinger af tusindvis af unikke molekyler, der fraktioneres i tre hovedfraktioner baseret på deres forskellige opløseligheder i stærkt basiske og syre vandige opløsninger. Disse fraktioner er huminsyrer (FA'er), som omfatter den alkaliopløselige, men syreuopløselige fraktion; fulvinsyrer (FA'er), den fraktion, der er opløselig i både alkali og syre; og huminfraktionen, som er uopløselig ved alle pH-værdier6,8. Fulvic fraktionen (FF) er yderligere opdelt i de hydrofobe FA (HFA) og hydrofile (HyFA) fraktioner. Disse fraktioner defineres som den del af FF, der binder til en hydrofob DAX-8-harpiks (HFA) og den del, der ikke binder til harpiksen (HyFA).
HS anvendes i stigende grad i landbruget, hvor de i vid udstrækning anvendes som biostimulanser til afgrøder, i husdyrhold, navnlig som tilsætningsstof til husdyrfoder, i minedrift i boremudder og miljøafhjælpning som elektronbusser. Forskning i brugen af HS i humanmedicinske applikationer er også stigende.
Der findes mange metoder til kvantation af HA og FA. De fleste af disse metoder er dog hverken nøjagtige eller præcise. For eksempel er de to mest anvendte metoder til bestemmelse af HA i USA den kolorimetriske metode9 og California Department of Food and Agriculture (CDFA) -metoden, som begge viste sig at overvurdere mængden af HA i en række malm og ekstraktkilder fra det vestlige USA og Canada10. Den kolorimetriske eller spektrofotometriske metode er unøjagtig, fordi den er afhængig af absorbansen af alkaliske ekstrakter, der ud over HA omfatter FA og andre kromoforer, som alle absorberer ved den anvendte bølgelængde, og standarden er ikke repræsentativ for de materialer, der testes10. CDFA-metoden er ikke nøjagtig, fordi den ikke giver HA-koncentrationer på askefri basis. Fordi forskellige malme har forskellige mængder aske, hvoraf nogle bæres med ekstraktionen, og selve ekstraktionsprocessen tilføjer aske, giver denne metode ikke en nøjagtig værdi for HA-koncentrationer10. Som svar på behovet for en nøjagtig og præcis metode blev der i 2014 offentliggjort en standardiseret gravimetrisk procedure baseret på den, der er beskrevet af11 for at adressere kvantitation af både HA og FA på askefri basis12. Denne metode blev derefter tilpasset, med mindre ændringer, af Den Internationale Standardiseringsorganisation (ISO) i 2018 under Gødning og jordbalstandere som "Bestemmelse af humic og hydrofobe fulvinsyrekoncentrationer i gødningsmaterialer"13.
Dette papir skitserer protokollen for ekstraktion og kvantvantation af humic og hydrofobe fulvinsyrer og giver detaljer om nøjagtigheden og præcisionen af de data, der produceres fra metoden.
Protocol
1. Forberedelse af fast prøve
- Knus ca. 5 g af den prøve, der skal analyseres, ved hjælp af en mørtel og støder, således at 100% af den knuste prøve passerer gennem en amerikansk standard sigtemaskestørrelse nr. 200 (dvs. 74 μm) og sørg for, at pulveret er godt blandet.
- Bestem fugtindholdet i pulveret gravimetrisk.
- Vej en aluminiumsvejebåd, og registrer massen (Wwb).
- Ca. 2 g prøvepulver overføres til vejebåden, og massen registreres (Wws+wb).
- Anbring vejebåden i en tørreovn i 24 timer ved 102 °C (må ikke overstige 102 °C). Efter 24 timer skal du tage vejebåden ud af tørreovnen og anbringe den i en tørremaskine for at afkøle i mindst 1 time.
- Veje og registrere massen af vejebåden og det tørrede prøvepulver (Wds+wb).
- Bestem fugtindholdet ved hjælp af formel 1.1.
Formel 1.1 Fugtindhold i fast prøvepulver
% fugt = (((Wws+wb- Wwb) – (Wds+wb - Wwb))/ (Wws+wb - Wwb)) * 100
2. Ekstraktionsprocedure
- Faste prøver
- Ca. 2,5 g af det sigtede prøvepulver (Wsamp) vejes i en plast- eller aluminiumsvejebåd, og vægten registreres med fire decimaler.
- Læg prøven i en 1 L gradueret cylinder, og fyld cylinderen til 1 L med 0,1 M NaOH (4 g NaOH x L-1).
- Tilsæt en magnetisk omrøringsstang (f.eks. 5 - 7 cm i længden) og rør hurtigt (dvs. 300 - 400 o / min) på en omrøringsplade, indtil prøven er grundigt blandet.
- Hele indholdet af den graduerede cylinder overføres til en 1 L Erlenmeyer-kolbe, kolbens hovedrum evakueres med N2-gas , og kolbeåbningen dækkes med et lufttæt dæksel.
- Anbring Erlenmeyer-kolben på en omrøringsplade og bland ved 300 - 400 o / min i 16 - 18 timer.
- Flydende prøver
- For flydende materialer blandes prøven grundigt ved omrystning for at sikre, at testvæsken blandes homogent. Sørg for, at eventuelle rester, der kan være faldet til bunden af beholderen, blandes grundigt.
- Der tilsættes ca. 5 g af testvæsken, vejet med 4 decimaler (WTL), til en 1 L gradueret cylinder.
- Fyld den graduerede cylinder med 0,1 M NaOH til et endeligt volumen på 1 L.
- Tilsæt en magnetisk omrøringsstang (f.eks. 5 - 7 cm i længden) og rør hurtigt (f.eks. 300 - 400 o / min) på en omrøringsplade, indtil testprøven er helt blandet.
- Blandingen overføres til en 1 L Erlenmeyer-kolbe, afledning af hovedrummet med N2-gas og dæk kolbeåbningen med et lufttæt dæksel.
- Anbring Erlenmeyer-kolben på en omrøringsplade og bland ved 300 - 400 o / min i 1 time.
BEMÆRK: Efter dette punkt er håndteringen af faste og flydende prøver den samme.
3. Fjernelse af uopløselige materialer fra alkaliske ekstrakter
- Når omrøringen er afsluttet, fjernes kolben fra omrøringspladen, blandingen overføres til egnede centrifugerør og centrifugeres hele volumenet med 4,921 x g i 30 minutter.
- Det alkaliske supernatant, der indeholder HA og FA, opsamles i en ren 1 L Erlenmeyer-kolbe indeholdende en magnetisk omrøringsstang. Kassér det uopløselige materiale. Filtrering gennem glasuld eller kvalitativt filterpapir med porestørrelse på 2,5 μm anbefales, hvis resterende partikler ikke udfældes efter centrifugering.
4. Udfældning og adskillelse af HA fra FF
- Under omrøring af det alkaliske ekstrakt ved 300 - 400 o / min på en omrøringsplade indsættes en pH-sonde i den midterste del af opløsningen (lodret) og tilsætte ±s konc.
- Når en pH-værdi på pH 1 er nået og forbliver stabil, fjernes pH-sonden fra kolben, omrørestangen, kolben dækkes med et lufttæt dæksel, og kolben sættes, indtil den udfældede HA har lagt sig til bunden af kolben.
BEMÆRK: Den tid, det tager en HA at udfælde og falde ud af opløsningen, varierer afhængigt af kilden og mængden af HA i prøven. Det tager typisk 1 -6 timer for HA at udfælde og falde ud af opløsningen. - Centrifugering af ekstraktet og udfældet HA ved 4921 x g i 1 time. Efter centrifugering hældes supernatanten FF af i en ren 1 L Erlenmeyer og dækkes med et lufttæt dæksel.
BEMÆRK: En længere centrifugetid kan være nødvendig for at pakke HA'en fast nok ned til at muliggøre dekantering af FF uden at medtage nogen af de udfældede HA. - Centrifugerørene anbrings i en tørreovn, der holdes ved 100 °C i 24 timer.
- Efter tørring skal du fjerne rørene fra tørreovnen og anbringe dem i en ekssikkator for at afkøle til stuetemperatur. Efter afkøling overføres resten kvantitativt fra røret ved at skrabe det fra siderne og bunden af røret med en spatel, overføres til en tjæret vejebåd og registreres massen (WEHA). Denne rest er "Extracted HA".
BEMÆRK: Hvis centrifugerør på over 50 ml er blevet anvendt til adskillelse af HA og FF, er det praktisk at overføre den udfældede HA til temperaturbestandige 50 ml centrifugerør til tørringsprocessen. Hvis der er en frysetørrer til rådighed, kan den udfældede HA også frysetørres. Indsamling af HA i frysetørret tilstand er lettere, fordi HA ikke klæber til siden af plastrørene og ikke skal skrottes.
5. Bestemmelse af askeindhold
BEMÆRK: Proceduren til bestemmelse af askeindholdet i tørrede HA- og FA-prøver er den samme. Fremgangsmåden ved hjælp af notation for HA vises.
- Ca. 30 mg af den tørrede HA (WHA) overføres til et rent, forvejet keramisk fad (WCD), der tidligere er blevet tørret i en tørreovn ved 100 °C og derefter afkølet i en ekssikkator til stuetemperatur. Efter registrering af den kombinerede masse af den vejede HA og fadet (WHA+CD) brændes HA i en lyddæmperovn i 2 timer ved 600 °C.
BEMÆRK: For hver HA-prøve skal der behandles tre replikater, og det gennemsnitlige askeindhold skal anvendes ved beregningen af ren HA. - Efter 2 timer skal du fjerne fadet og indholdet fra lyddæmperovnen og placere det i en tørremaskine for at afkøle. Når det er køligt, skal du veje fadet med aske (WASH + CD) og beregne askeforholdet (Ashrat) ved hjælp af formel 1.2:
Formel 1.2 Ashrat = (WASH + CD - WCD) / (WHA + CD - WCD)
6. Bestemmelse af procentdelen af oprenset ekstraheret HA
- Bestem den endelige masse af den rene HA (WPHA) ved at korrigere for askeindhold ved hjælp af formel 1.3:
Formel 1.3 WPHA = WEHA * (1- Ashrat)
7. Bestemmelse af koncentrationen (%) af ren HA i den oprindelige kildeprøve
- Bestem koncentrationen af ren HA ved hjælp af Formel 1.4 og 1.5:
Formel 1.4: % ren HA i fast prøve = (WPHA/Wsamp) * 100
Formel 1.5: % ren HA i flydende prøve = (WPHA/WTL) * 100
8. Kolonneforberedelse til HFA-rensning
- Forbered en lavtrykskromatografikolonne pakket med polymethylmethacrylat DAX-8-harpiks. Hvis harpiksen ikke tidligere har været anvendt, lægges harpiksen i blød i methanol i 2 timer og skylles derefter grundigt med deioniseret H2O, indtil al methanol er fjernet.
- Fjern små harpikspartikler, der flyder på vandet på dette tidspunkt. Hvis harpiksen tidligere har været anvendt, regenereres den som beskrevet i punkt 10.
- Når harpiksen er skyllet grundigt, hældes harpiksen i en 5 x 25 cm glaskromatografisøjle udstyret med et endestykke med en 10 μm frit til harpikssengsstøtte. Efterlad 2,5 til 5 cm oven på søjlen til harpiksfri opløsning for at muliggøre blanding af FF'en, inden den kommer ind i harpiksbedet. Monter det øverste stykke på søjlen, og pump deioniseret H2O gennem toppen af søjlen for at pakke DAX-8-harpikslejet ved hjælp af en peristaltisk pumpe.
9. Isolering af HFA
- Når harpiksbedet er pakket, skal du lægge FF på søjlen ved hjælp af en peristaltisk pumpe under lavt tryk via toppen af søjlen. Brug en strømningshastighed på 35 – 40 ml/min. Det er afgørende, at toppen af harpiksen i søjlen forbliver dækket af opløsning under hele lastnings- og skylleproceduren for at forhindre tørring af harpiksen og kanalisering af ekstraktet gennem harpiksbedet.
- Når fulvicfraktionen er blevet fuldstændigt belastet på harpiksen, vaskes harpiksen med deioniseret vand for at fjerne den ikke-adsorberede "hydrofile fulvic fraktion" (HyFF) ved at pumpe den gennem toppen af søjlen ved hjælp af den peristaltiske pumpe under lavt tryk. Brug en strømningshastighed på 35 – 40 ml/min. Det HyFF-holdige spildevand kasseres, medmindre det anvendes til analyse.
- Kolonnen vaskes med deioniseret H2O, indtil absorbansen ved 350 nm af kolonnespildevandet er lig med (f.eks. inden for 0,015 absorbansenheder) til den deioniserede H2O, der bruges til at vaske søjlen. Brug deioniseret vand til at nul (dvs. blank) spektrofotometeret.
- Afsorber HFA ved hjælp af rygeluering ved at pumpe 0,1 M NaOH via bunden af søjlen ved hjælp af den peristaltiske pumpe. Brug en strømningshastighed på 35 – 40 ml/min. Optag pumpens spildevand (Na-fulvate i en ren beholder af tilstrækkelig størrelse (f.eks. 2 L Erlenmeyer).
BEMÆRK: De fleste HFA adsorberer helt til toppen af DAX-8 harpiksbedet. Desorption ved at indføre 0,1 M NaOH fra bunden af kolonnen minimerer den mængde på 0,1 M NaOH, der er nødvendig for fuldt ud at desorbere FA. - Al HFA er blevet desorberet, når absorbansen af kolonnespildet er lig med absorbansen på 0,1 M NaOH-influent ved 350 nm. Brug 0,1 M NaOH som det spektrofotometriske emne. Tilsæt det spildevand, der er taget for at kontrollere absorbansen af den desorberede FA-opløsning for at sikre, at al FA fanges.
10. HFA-afaske ved protonering
- Na-fulvate-opløsningen føres gentagne gange ved hjælp af tyngdekraftstilførsel gennem stærk kation H+- udvekslingsharpiks (materialetabel) indeholdt i en kolonne på 5 × 50 cm med glasfrit for at bevare harpiksen, indtil spildevandets elektriske ledningsevne er <120 μS/cm, målt med en elektrisk ledningsevnemåler. Forud for hvert pas kræver H+-udvekslingsharpiksen renovering som beskrevet i afsnit 11.
- For at sikre, at al FA fjernes fra harpiksen efter det endelige pas, vaskes harpiksen med deioniseret vand, indtil absorbansen af spildevand ved 350 nm er den samme (f.eks. inden for 0,015 absorbansenheder) som det deioniserede vand, der bruges til at vaske søjlen. Brug deioniseret H2O som det spektrofotometriske emne. Tilsæt vasken og eventuelle spildevandsdele, der er taget for at kontrollere absorbansen, til den rensede FA-opløsning. For at hjælpe med at fjerne al FA kan harpiksen omrøres (f.eks. Ved hjælp af en lang glas- eller plaststang) flere gange.
- FA'en koncentreres til et volumen på ca. 15 ± 2 ml ved hjælp af en roterende fordamper ved 55 °C.
- Overfør FA-koncentratet på 15 ml helt til et 50 ml plastcentrifugerør og tør det ved 60±,3 °C til konstant tørhed i en tørreovn. Frysetørring er et alternativ til ovntørring. Efter tørring overføres røret til en tørremaskine for at afkøle.
- Fjern FA fra røret ved at skrabe rørsiderne og bunden med en spatel, og vej den opsamlede FA på fortæringet vejepapir. Dette materiale er "Extracted FA" (WEFA).
- Bestem askeforholdet (ASHrat) for ekstraheret FA som beskrevet under trin 6 for HA, og beregn askeforholdet ved hjælp af formel 1.2. Bestem vægten af den ekstraherede FA uden aske (WPFA) ved hjælp af Formel 1.3, der erstatter WEFA med WEHA's vægt. Endelig bestemmes den % rene FA i prøven ved hjælp af Formel 1.4, der erstatter WPHA med WFA.
11. REGENERERING AF DAX-8-harpiks
- Regenerer DAX-8-harpiksen ved at pumpe 0,1 M HCl (8,33 ml koncentreret HCl/1000 ml slutvolumendeioniseret H2O) med en strømningshastighed på 35-40 ml/min gennem bunden af kolonnen, indtil spildevandets pH er lig med pH-værdien for det influente. Brug den peristaltiske pumpe til at pumpe alle reagenser gennem DAX-8-søjlen under regenerering.
- Skyl søjlen med DI-vand ved at pumpe den ind i toppen af søjlen, indtil spildevandets pH er lig med pH-værdien for det influente (dvs. DI-vand).
12. Regenerering af H+-kationbytterharpiks
- Regenerer H+ -kationbytterharpiksen i en batchproces ved at hælde harpiksen i et stort bægerglas (f.eks. 4 L plastbægerglas), skyl flere gange ved at dække harpiksen med DI H2O, bland og hæld derefter vandet af.
- Dæk harpiksen med 1 M HCl (83,3 ml koncentreret HCl/1000 ml slutvolumen DI-vand). Lad stå i mindst 2 timer ved lejlighedsvis omrøring (f.eks. en gang hvert 30. minut).
- Fjern overskydende syre fra harpiksen ved at hælde syren af og dække harpiksen med DI-vand. Rør kraftigt med en omrøringsstang i 15 s, lad derefter harpiksen falde til bunden af kolben og hæld derefter vandet af. Gentag processen, indtil skyllevandets elektriske ledningsevne er ≤ 0,7 μS/cm.
- Læg den regenererede harpiks tilbage i søjlen. Dæk med deioniseret H2O for at sikre, at harpiksen forbliver våd mellem anvendelserne.
Representative Results
Ydelsesdata for metoden findes i tabel 1-5. Præcisionen af metoden til ekstraktion af HA og FAH fra flydende kommercielle prøver med meget forskellige koncentrationer af HA og FHA er angivet i tabel 1.
De relative standardafvigelser (RSD'er) for HA var lavere end for HFA, men den gennemsnitlige HFA RSD for de tre flydende prøver var på 6,83%, hvilket indikerer en høj grad af præcision. Horwitz-forholdet (HorRat) er en normaliseret præstationsparameter, der angiver egnetheden af en analysemetoder vedrørende laboratoriepræcision. Her blev det brugt til intra-laboratorie præcision. Værdien < 0,5 kan indikere et ikke-oplyst gennemsnit eller et højt erfaringsniveau med metoden. Værdier > 2.0 indikerer heterogenitet af testprøver, et behov for metodeoptimering eller mere omfattende træning, der opererer under detektionsgrænsen eller en uanvendelig metode. Til analyse af væskeprøver blev HorRat kun > 2 for en af HFA-analyserne (tabel 1).
Præcisionsdata for ekstraktion af HA og HFA fra tre humic malmprøver er angivet i tabel 2. Igen, med undtagelse af HFA ekstraheret fra malm 2 og HA fra malm 3, var alle HorRat'erne under 2. Dette viser en høj grad af præcision af denne metode til ekstraktion af HA og HFA for humic malmprøver.
Producenter af plantebiostimulerende midler formulerer ofte produkter, der indeholder HS ud over andre ingredienser som tang, uorganisk gødning, kul eller melasse. Tabel 3 viser resultaterne af en analyse af inkluderingen af disse typer tilsætningsstoffer om metodens præcision. Ingen af tilsætningsstofferne påvirkede genvindingen af HA eller HFA væsentligt (tabel 3).
Tabel 4 og tabel 5 viser genvindingerne af henholdsvis HA og HFA fra flydende prøver, der simulerede kommercielle produkter med meget lave koncentrationer. Inddrivelserne var fremragende og varierede mellem 88 % og 97 % for HA (tabel 4) og 92 % og 104 % for HFA (tabel 5). De gennemsnitlige inddrivelser for HA og HFA var henholdsvis 93 % og 97 %, og % RSD for begge HS var mindre end 5 %. Mens præcision er fremragende, indikerer disse data behovet for at udføre laboratoriereplikater. Metodedetektionsgrænsen (MDL) og metodemængdegrænsen var 4,62 og 1,47 mg/l for HA og 4,8 og 1,53 mg/l for HFA.
| Humane stoffer, % | |||||||
| Materiale | L16 | L17 | L2 | ||||
| HFA | HA | HFA | HA | HFA | HA | ||
| Rep 1 | 1.44 | 17 | 6.59 | 7.76 | 0.36 | 4.46 | |
| Rep 2 | 1.39 | 16.03 | 6.25 | 7.79 | 0.42 | 4.93 | |
| Rep 3 | 1.34 | 16.44 | 6.02 | 7.55 | 0.4 | 4.46 | |
| Rep 4 | 1.54 | 16.75 | 6.2 | 7.69 | 0.33 | 4.53 | |
| Betyde | 1.43 | 16.56 | 6.27 | 7.7 | 0.38 | 4.6 | |
| SD | 0.09 | 0.42 | 0 | 0.11 | 0.04 | 0.23 | |
| 24 | |||||||
| RSD, % | 6.29 | 2.53 | 3.8 | 1.39 | 10.4 | 4.91 | |
| Hor Rotte(r) | 1.58 | 0.72 | 1.25 | 0.47 | 2.31 | 1.55 | |
| en Ekstraktionsbetingelserne var 1 g i 1 l 0,1 M NaOH. | |||||||
Tabel 1. Metodens præcision ved ekstraktion og kvantvantation af HA og HFA fra flydende kommercielle prøver. Ekstraktionsbetingelserne var 1 g i 1 l 0,1 M NaOH.
| Humane stoffer, % | ||||||
| Malm 1 | Malm 2 | Malm 3 | ||||
| Materiale | HFA | HA | HFA | HA | HFA | HA |
| Rep 1 | 1.75 | 67.4 | 1.31 | 27.01 | 1.55 | 8.95 |
| Rep 2 | 1.69 | 67.63 | 1.25 | 27.48 | 1.41 | 7.2 |
| Rep 3 | 1.63 | 67.1 | 1.27 | 27.34 | 1.47 | 8.35 |
| Rep 4 | 1.77 | 67.59 | 1.55 | 26.89 | 1.51 | 7.98 |
| Betyde | 1.71 | 67.53 | 1.35 | 27.18 | 1.49 | 8.12 |
| SD | 0.06 | 0.94 | 0.14 | 0.28 | 0.06 | 0.73 |
| RSD, % | 3.7 | 1.39 | 10.33 | 1.02 | 4.02 | 9.02 |
| HorRat(r) | 0.99 | 0.66 | 2.71 | 0.42 | 1.07 | 3.09 |
Tabel 2. Præcision af metoden ved ekstraktion og kvantation af HA og HFA fra humane malme. Ekstraktionsbetingelserne var 1 g prøve i 1 L 0,1 M NaOH. (Data taget fra Lamar et al., 2014)
| Kopiere | Utroskab | HA, % | FA, % | Relativ genopretning HA, % | Relativ genopretning HFA, % |
| 1 | Ingen | 81.61 | 12.86 | ||
| 2 | Ingen | 80.16 | 12.78 | ||
| 1 | Tang | 80.21 | 12.85 | ||
| 2 | Tang | 80.72 | 12.79 | 99.5 | 99.6 |
| 1 | Gødning | 80.25 | 12.98 | ||
| 2 | Gødning | 79.57 | 123.77 | 98.8 | 101.6 |
| 1 | Kul | 78.79 | 12.92 | ||
| 2 | Kul | 81.27 | 12.84 | 98.9 | 101.8 |
| 1 | Melasse | 79.38 | 12.99 | ||
| 2 | Melasse | 81.02 | 12.72 | 99.2 | 100.9 |
| Betyde | 80.3 | 12.85 | |||
| SD | 0.885 | 0.09 | |||
| en endelig koncentration af FA + HA på 2,5 g/l tilsat til 0,1 M NaOH. (data taget fra Lamar et al., 2015) | |||||
Tabel 3. Virkning af forfalskningsmidler på kvantation af HA og HFA fra en Gascoyne leonardit. (Data taget fra Lamar et al., 2015)
| HA | |||
| Eksempel-id | Ekstraheret, mg | Genvundet, mg | Genvundet, % |
| 1 | 24.6 | 23.7 | 96.3 |
| 2 | 22.6 | 19.9 | 88.1 |
| 3 | 25.2 | 23.6 | 93.7 |
| 4 | 22.5 | 21.5 | 95.6 |
| 5 | 23.9 | 21.8 | 91.2 |
| 6 | 23.2 | 20.8 | 89.7 |
| 7 | 24 | 23.2 | 96.7 |
| Betyde | 23.7 | 22.1 | 93 |
| SD | 1.01 | 1.52 | 3.43 |
| RSD, % | 4.35 | 6.88 | 3.67 |
| (data taget fra Lamar et al., 2014) | |||
Tabel 4. Genopretning af HA fra spikede emner. (Data taget fra Lamar et al., 2014)
| FA | |||
| Eksempel-id | Ekstraheret, mg | Genvundet, mg | Genvundet, % |
| 1 | 19.9 | 19 | 95.48 |
| 2 | 23.1 | 22.9 | 99.13 |
| 3 | 20.7 | 19.4 | 93.72 |
| 4 | 20.5 | 19.8 | 96.39 |
| 5 | 20.8 | 21.6 | 103.85 |
| 6 | 21.9 | 20.1 | 91.78 |
| 7 | 22.7 | 22.3 | 98.24 |
| Betyde | 21.37 | 20.73 | 96.94 |
| SD | 1.21 | 1.53 | 3.95 |
| RSD, % | 5.64 | 7.36 | 4.07 |
| (Data taget fra Lamar et al., 2014) | |||
Tabel 5. Gendannelse af HFA fra spikede emner. (Data taget fra Lamar et al., 2014)
Discussion
De indledende trin i ekstraktion og isolering af HA i denne metode er relativt ligetil. Fordi isoleringen af HFA involverer kolonnekromatografi, kommer opnåelse af repeterbare resultater med streng overholdelse af detaljerne i hvert trin og praksis. Især er korrekt fremstilling af harpikserne af største betydning. Det er ekstremt vigtigt, at polymethylmethacrylat DAX-8-harpiksen fremstilles og pakkes korrekt. Korrekt pakning af harpiksen påvirker både udbyttet og kvaliteten af HFA. Hvis der findes kanalisering, vil hverken forbehandling (dvs. forsuring) eller adsorption af HFA være fuldstændig, og adskillelsen vil føre til unøjagtige resultater. Hvis der observeres kanaler eller mellemrum i harpiksen inden prøvepåfyldning, skal kolonnen fjernes og rystes for at omfordele harpiksperlerne ved at lade dem sætte sig uden kanaler og derefter pakkes igen ved at pumpe ren DI H2O gennem harpiksen. Som nævnt i protokollen vil opretholdelse af et volumen væske over harpiksen, når FF'en lægges på harpiksen, desuden gøre det muligt for FF at blande, inden den kommer ind i harpiksen og resultere i mere effektiv adsorption. For den stærke kation H +-udvekslingsharpiks (Tabel over materialer) kan fuldstændig regenerering ikke forhastes. Na+/H+-udvekslingen tager tid, og derfor gøres dette bedst i en bulkbehandling, så harpiksen kan blandes, mens den gensyres. Blanding af harpiksen under skylning med DI H2O hjælper med at fjerne overskydende HCI. Når du hæver den forsurede harpiks for at fjerne overskydende syre, hjælper blanding af harpiksen med at fjerne HCI. Det er ekstremt vigtigt at fjerne syren til det punkt, hvor en elektrisk ledningsevne på ≤ 0,7 μS /cm nås. Hvis ikke, overføres HCL med HFA.
Endelig, når HFA desorberes fra DAX-8-harpiksen, når absorbansen af det influente er lig med spildevandets absorbans, er det en god praksis at lade søjlen sidde i et par timer for at se, om der frigives yderligere HFA. I så fald vil det blive set som en gulfarvning af væsken over harpiksen. Hvis dette sker, kan den ekstra HFA fjernes ved fortsat desorption, indtil influente/spildevandsabsorbenter er ens igen.
En af ulemperne ved HFA-isoleringen er, at hele processen er tidskrævende. Den fuldstændige desorption af HFA fra DAX-8-harpiksen og fuldstændig fjernelse fra H+-udvekslingsharpiksen resulterer begge i et betydeligt volumen HFA, der skal reduceres ved roterende fordampning. Dette er bestemt en flaskehals i analysen. I et forsøg på at reducere denne tid er det blevet foreslået at desorbere HFA fra DAX-8-harpiksen ved hjælp af acetone i stedet for 0,1 M NaOH14. Forfatterne hævdede, at ved at anvende 50% acetone som desorbent i stedet for NaOH blev der opnået et lignende HFA-resultat, og DAX-8 blev tilstrækkeligt regenereret, og dermed kunne H +-udvekslingstrinnet elimineres. Denne ændring resulterede i en stærkt reduceret analysetid som følge af nedsat produceret volumen og hurtigere roterende fordampning af acetone sammenlignet med vand. Denne ændring fortjener yderligere undersøgelse.
Denne metode er begrænset til analysen af organisk materiale, der har gennemgået befugtningsprocessen, og for så vidt angår tørv og bløde kul, de videre processer med tørvning og både tørvning og kulificering. Befugtning er den proces, hvorved døde, primært plantemateriale, nedbrydes af en sekvens af mikrober, der forbruger og modificerer stadig mere genstridige substrater. Abiotiske processer deltager også i nedbrydning og resyntesereaktioner. Befugtning resulterer i sidste ende i produktion af relativt genstridige materialer, der omfatter heterogene blandinger af tusindvis af molekyler, der danner en række molekylvægt og kulstof-, ilt- og hydrogenindhold, der danner HS. HS modificeres yderligere ved tørvning og kuldannelse. Derfor er denne metode ikke egnet til plantematerialer, der er blevet modificeret ved kemiske processer. For eksempel anvendes lignosulfonat i vid udstrækning som et HFA-forfalskningsmiddel. Lignosulfonat er et biprodukt af sulfitmasseprocessen. Derfor er dette materiale ikke blevet produceret ved befugtningsprocessen. Derudover er der mange stoffer, der binder til DAX-8-harpiksen. For eksempel er DAX-8-harpiks blevet brugt til at adsorbere pesticider fra opløsning15. Det er klart, at pesticider ikke er HS. Binding af et materiale til DAX-8-harpiks begrunder således ikke en påstand om, at det er en HFA. Forudsætningerne er både produktion ved befugtning og binding til DAX-8-harpiks.
Efterhånden som man får mere at vide om bidraget fra de forskellige komponenter i HS i forskellige anvendelser, kan det blive en fordel at fraktionere HS yderligere og dermed ændre metoden i overensstemmelse hermed. Som det eksisterer, kvantificerer metoden ikke HYFA. Denne fraktion kan dog også have aktivitet, f.eks. inden for plantebiostimulering, hvor hele FF generelt anvendes i landbrugsbehandlinger snarere end renset HFA.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende Humic Products Trade Association (HPTA) for deres støtte til finansiering af det arbejde, der resulterede i standardisering af de metoder, der er beskrevet i dette papir, og også Lawrence Mayhew og Dr. Dan Olk og Paul Bloom for teknisk support under standardiseringsarbejdet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amberlite IR 120 H+-exchange resin | Sigma-Aldrich | 10322 | H+ form |
| Analytical Balance | Ohaus | PA214 | w/ glass draft shield |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-14 | minimum 4300 rpm |
| Centrifuge tubes | Beckman Coulter | To fit rotor selected | |
| Ceramic Combustion Crucibles | Sigma | Z247103 | |
| Chromatography column for DAX-8 | Diba | Omnifit 006EZ-50-25-FF | |
| Chromatography column for IR 120 | Chemglass | CG-1187-21 2 in. by 24 in. | |
| Dessicator | Capitol Scientic | Kimax 21200-250 | Vacuum type |
| Drying Oven | Fisher Scientific | Isotemp | Precision±3?C |
| Electrical conductivity meter | HM Digital | EC-3 | |
| Erlenmeyer Flasks | Amazon | 1L, 2L | |
| HCl concentrated | Sigma-Aldrich | 320331 | |
| Magnetic Stir Plate | Barnstead-Thermolyne | Dataplate 721 | |
| Magnetic Stir bars | These can be obtained at many outlets | ||
| Muffle Furnace | Fisher scientific | Thermolyne Type 47900 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 795429 | |
| Nitrogen gas | Praxair | UNI1066 | 99.99% purity |
| Peristaltic pump | Cole Parmer | Masterflex 7518-00 | |
| Perstaltic tubing | Cole Parmer | Masterflex Pharmed 06508-17 | |
| pH meter | Oakton Instruments | WD-35618--03 | |
| Rotary Evaporator | Buchi | R-210/R-215 | |
| Spectrophotometer | Healthcare SCiences | Ultrospec II | Dual beam 200 to 900 nm with wavelength accuracy of ±1 nm and reproducibility of ±0.5 nm. |
References
- DiDonato, N., Chen, H., Waggoner, D., Hatcher, P. G. Potential origin and formation for molecular components of humic acids in soils. Geochimica et Cosmochimica Acta. 178, 210-222 (2016).
- Waggoner, D. C., Chen, H., Willoughby, A. S., Hatcher, P. G. Formation of black carbon-like and alicyclic aliphatic compounds by hydroxyl radical initiated degradation of lignin. Organic Geochemistry. 82, 69-76 (2015).
- Baldock, J. A., Skjemstad, J. O. Role of the soil matrix and minerals in protecting natural organic materials against biological attack. Organic Geochemistry. 31 (7-8), 697-710 (2015).
- Kallenbach, C. M., Frey, S. D., Grandy, A. S. Direct evidence for microbial-derived soil organic matter formation and its ecophysiological controls. Nature Communications. 7, 13630 (2016).
- Schaeffer, A., Nannipieri, P., Kastner, M., Schmidt, B., Botterweck, J. From humic substances to soil organic matter-microbial contributions. In honour of Konrad Haider and James P. Martin for their outstanding research contributionns to soil science. Journal of Soils Sediments. 15 (9), 1865-1881 (2015).
- Stevenson, F. J. Humus Chemistry: Genesis, Composition, Reactions. 2e. , Wiley. (1994).
- Weber, J., Chen, Y., Jamroz, E., Miano, T.
- Schnitzer, M. Organic matter characterization. Methods of soil analysis, part 2: Chemical and microbiological properties. Page, A. L., Miller, R. H., Keeny, D. R. , American Society of Agronomy. Madison, Wisc. 581-594 (1982).
- Mehlich, A. Photometric determination of humic matter in soils: A proposed method. Communications in Soil Science and Plant Analysis. 15 (12), 1417-1422 (1984).
- Lamar, R. T., Talbot, K. H. Critical comparison of humid acid test methods. Communications in Soil Science and Plant Analysis. 50 (15-16), 2309-2322 (2009).
- Swift, R. S. Organic matter characterization. Methods of soil analysis, part 3: Chemical methods. Sparks, D. L. , Soil Science Society of America. Madison, WI. 1011-1069 (1996).
- Lamar, R. T., Olk, D. C., Mayhew, L., Bloom, P. R. A new standardized method for quantitation of humic and fulvic acids in humic ores and commercial products. Journal of the AOAC International. 97 (3), 722-731 (2014).
- International Organization of Standards. Fertilizers and soil conditioners-Determination of humic and hydrophobic fulvic acids concentrations in fertilizer materials. International Organization of Standards. , ISO/DIS 19822 (1982).
- Liam, L. E., Serben, T., Cano, M. Gravimetric quantification of hydrophobic filmic acids in lignite material using acetone. Journal of the AOAC International. 102 (6), 1901-1907 (2019).
- House, W. A., Zhmud, B. V., Orr, D. R., Lloyd, G. K., Irons, G. P. Transportation of pesticides by colloids. Final Report. Institute of Freshwater Ecology. National Environment Research Council. , IFE Report No. RL/T11059N1/6 (1998).
