Quantificazione degli acidi umici e fulvici in minerali di umato, DOC, materiali umificati e prodotti commerciali contenenti sostanze umiche

Summary

Questo metodo fornisce una quantificazione gravimetrica di sostanze umiche (ad esempio, acidi umico e fulvico) su base priva di ceneri, in materiali secchi e liquidi da carboni molli (cioè lignite ossidata e non ossidata e carbone sub-bituminoso), minerali e scisti umato, torbe, compost e fertilizzanti commerciali e modifiche del suolo.

Abstract

Lo scopo di questo metodo è quello di fornire una concentrazione accurata e precisa di acidi umici (HA) e/o fulvici (FA) in carboni molli, minerali umici e scisti, torbe, compost e prodotti commerciali contenenti sostanze umiche. Il metodo si basa sull’estrazione alcalina di materiali di prova, utilizzando 0,1 N NaOH come estrattore, e sulla separazione delle sostanze umiche solubili alcaline (HS) da prodotti non solubili mediante centrifugazione. Il pH dell’estratto alcalino centrifugato viene quindi regolato a pH 1 con conc. HCl, che si traduce in precipitazione dell’HA. Gli HA precipitati vengono separati dalla frazione fulvica (FF) (la frazione di HS che rimane in soluzione) mediante centrifugazione. L’HA viene quindi cotto o liofilizzato e viene determinato il contenuto di ceneri dell’HA essiccato. Il peso dell’HA puro (cioè privo di ceneri) viene quindi diviso per il peso del campione e la frazione risultante moltiplicata per 100 per determinare la % HA nel campione. Per determinare il contenuto di FA, l’FF viene caricato su una resina idrofobica DAX-8, che assorbe la frazione FA nota anche come acido fulvico idrofobo (HFA). La restante frazione acida non fulvica, chiamata anche frazione fulvica idrofila (HyFF) viene quindi rimossa lavando la resina con _H2O deionizzato fino a quando tutto il materiale non assorbito viene completamente rimosso. La FA viene quindi desorbita con 0,1 N NaOH. Il Na-fulvato risultante viene quindi protonato passandolo su una forte resina ^{a scambio} H+. Il FA risultante è cotto o liofilizzato, il contenuto di ceneri determinato e la concentrazione nel campione calcolata come descritto sopra per HA.

Introduction

Le sostanze umiche (HS) sono residui dinamici che derivano dalla decomposizione microbica e dalla trasformazione di tessuti vegetali ^morti1,2,3 aumentati con sottoprodotti microbici e biomassa3,4,5 attraverso un processo che viene definito ^{umificazione6}. Gli HS sono presenti nei suoli, nelle acque naturali, nei sedimenti lacustri, nelle torbe, nei carboni molli e negli scisti umici e rappresentano circa il 25% del carbonio organico totale sulla ^terra7. Queste sostanze sono miscele complesse di migliaia di molecole uniche che vengono frazionate in tre frazioni principali in base alle loro diverse solubilità in soluzioni acquose fortemente basiche e acide. Queste frazioni sono acidi umici (HA), che comprendono la frazione solubile in alcali ma acido-insolubile; acidi fulvici (FA), la frazione solubile sia in alcali che in acido; e la frazione di utina, che è insolubile a tutti i valori di ^pH6,8. La frazione fulvica (FF) è ulteriormente suddivisa nelle frazioni idrofoba FA (HFA) e idrofila (HyFA). Queste frazioni sono definite come la parte del FF che si lega a una resina idrofoba DAX-8 (HFA) e la parte che non si lega alla resina (HyFA).

Le HS sono sempre più utilizzate in agricoltura, dove sono ampiamente utilizzate come biostimolanti delle colture, nella zootecnia, in particolare come additivo per mangimi per il bestiame, nell’estrazione mineraria nei fanghi di perforazione e nel risanamento ambientale come navette elettroniche. Anche la ricerca sull’uso dell’HS nelle applicazioni mediche umane è in aumento.

Esistono molti metodi per la quantificazione di HA e FA. Tuttavia, la maggior parte di questi metodi non sono né accurati né precisi. Ad esempio, i due metodi più utilizzati per la determinazione dell’HA negli Stati Uniti sono il metodo ^{colorimetrico9} e il metodo del California Department of Food and Agriculture (CDFA), entrambi i quali hanno dimostrato di sovrastimare la quantità di HA in una gamma di fonti di minerali ed estratti dagli Stati Uniti occidentali e dal ^Canada10. Il metodo colorimetrico o spettrofotometrico è impreciso perché si basa sull’assorbanza di estratti alcalini che includono, oltre a HA, FA e altri cromofori che assorbono tutti alla lunghezza d’onda utilizzata e lo standard non è rappresentativo dei materiali ^testati10. Il metodo CDFA non è accurato perché non fornisce concentrazioni di HA su base priva di ceneri. Poiché minerali diversi hanno quantità diverse di ceneri, alcune delle quali vengono trasportate con l’estrazione e il processo di estrazione stesso aggiunge cenere, questo metodo non fornisce un valore accurato per le concentrazioni di ^HA10. In risposta alla necessità di un metodo accurato e preciso, nel 2014 ^{è stata} pubblicata una procedura gravimetrica standardizzata basata su quella dettagliata di 11 per affrontare la quantificazione sia di HA che di FA su base ash ^free12. Questo metodo è stato poi adattato, con piccole modifiche, dall’Organizzazione internazionale per la standardizzazione (ISO) nel 2018 sotto Fertilizzanti e ammendanti come “Determinazione delle concentrazioni di acidi fulvici umici e idrofobici nei materiali fertilizzanti”¹³.

Questo documento delinea il protocollo per l’estrazione e la quantificazione degli acidi fulvici umici e idrofobici e fornisce dettagli sull’accuratezza e la precisione dei dati prodotti dal metodo.

Protocol

1. Preparazione solida del campione Schiacciare circa 5 g del campione da analizzare, utilizzando un mortaio e un pestello, in modo che il 100% del campione frantumato passi attraverso una dimensione della maglia del setaccio standard degli Stati Uniti n. 200 (cioè 74 μm) assicurandosi che la polvere sia ben miscelata. Determinare gravimetricamente il contenuto di umidità della polvere. Pesare una barca di pesatura in alluminio e registrare la massa (Wwb). Trasferire circa 2 g di polvere campione nella barca di pesatura e registrare la massa (Wws + wb). Mettere la pesata in un forno di essiccazione per 24 ore a 102 °C (non superare i 102 °C). Dopo 24 ore, togliere la barca di pesatura dal forno di essiccazione e metterla in un essiccatore per raffreddare per almeno 1 ora. Pesare e registrare la massa della barca di pesatura e la polvere del campione essiccato (Wds + wb). Determinare il contenuto di umidità utilizzando la formula 1.1.Formula 1.1 Contenuto di umidità della polvere campione solida% umidità = (((Wws+wb- Wwb) – (Wds+wb – Wwb))/ (Wws+wb – Wwb)) * 100 2. Procedura di estrazione Campioni solidi Pesare circa 2,5 g della polvere del campione setacciato (Wsamp) in una barca di plastica o alluminio e registrare il peso a quattro cifre decimali. Caricare il campione in un cilindro graduato da 1 L e riempire il cilindro a 1 L con 0,1 M NaOH (4 g NaOH x L-1). Aggiungere una barra magnetica (ad esempio, 5 – 7 cm di lunghezza) e mescolare rapidamente (cioè 300 – 400 giri / min) su una piastra di agitazione fino a quando il campione non è completamente miscelato. Trasferire l’intero contenuto della bombola graduata in un matraccio Erlenmeyer da 1 L, evacuare lo spazio di testa del matraccio con gas N2 e coprire l’apertura del matraccio con un coperchio ermetico. Posizionare il matraccio Erlenmeyer su una piastra e mescolare a 300 – 400 giri / min per 16 – 18 ore. Campioni liquidi Per i materiali liquidi, mescolare accuratamente il campione agitando per assicurarsi che il liquido di prova sia miscelato in modo omogeneo. Assicurarsi che qualsiasi residuo che potrebbe essere caduto sul fondo del contenitore sia accuratamente miscelato. Aggiungere circa 5 g del liquido di prova, pesato con 4 cifre decimali (WTL), a un cilindro graduato da 1 L. Riempire il cilindro graduato con 0,1 M NaOH fino a un volume finale di 1 L. Aggiungere una barra magnetica (ad esempio, 5 – 7 cm di lunghezza) e mescolare rapidamente (ad esempio, 300 – 400 giri / min) su una piastra di agitazione fino a quando il campione di prova non è completamente miscelato. Trasferire la miscela in un matraccio Erlenmeyer da 1 L, evacuare lo spazio di testa con gas N2 e coprire l’apertura del matraccio con un coperchio ermetico. Posizionare il matraccio Erlenmeyer su una piastra di agitazione e mescolare a 300 – 400 giri / min per 1 ora.NOTA: Dopo questo punto, la gestione dei campioni solidi e liquidi è la stessa. 3. Rimozione di materiali non solubili da estratti alcalini Al termine dell’agitazione, rimuovere il matraccio dalla piastra di agitazione, trasferire la miscela in appositi tubi centrifughi e centrifugare l’intero volume a 4.921 x g per 30 minuti. Raccogliere il surnatante alcalino contenente l’HA e il FA in un matraccio Erlenmeyer pulito da 1 L contenente una barra magnetica. Scartare il materiale insolubile. La filtrazione attraverso lana di vetro o carta da filtro qualitativa da 2,5 μm è consigliata se le particelle residue non vengono precipitate dopo la centrifugazione. 4. Precipitazione e separazione di HA da FF Mentre si mescola l’estratto alcalino a 300 – 400 giri / min su una piastra di agitazione, inserire una sonda di pH nella parte centrale della soluzione (verticalmente) e aggiungere conc. HCl dropwise all’estratto alcalino fino a raggiungere un pH stabile di pH 1,0 ± 0,1. Una volta raggiunto un pH di pH 1 e rimasto stabile, rimuovere la sonda di pH dal matraccio, recuperare la barra di agitazione, coprire il matraccio con un coperchio ermetico e lasciare riposare il matraccio fino a quando l’HA precipitato non si è depositato sul fondo del matraccio.NOTA: il tempo necessario a un HA per precipitare e abbandonare la soluzione varia a seconda della fonte e della quantità di HA nel campione. In genere ci vogliono 1 -6 ore perché l’HA precipiti completamente e lasci cadere la soluzione. Centrifugare l’estratto e precipitato HA a 4921 x g per 1 ora. Dopo la centrifugazione, versare il surnatante FF in un Erlenmeyer pulito da 1 L e coprire con un coperchio ermetico.NOTA: potrebbe essere necessario un tempo di centrifuga più lungo per imballare l’HA abbastanza saldamente da consentire la decantazione del FF senza includere nessuno degli HA precipitati. Posizionare i tubi della centrifuga in un forno di essiccazione tenuto a 100 °C per 24 ore. Dopo l’essiccazione, rimuovere i tubi dal forno di essiccazione e metterli in un essiccatore per raffreddare a temperatura ambiente. Dopo il raffreddamento, trasferire quantitativamente il residuo dal tubo raschiandolo dai lati e dal fondo del tubo con una spatola, trasferirlo su una barca di pesatura asfaltata e registrare la massa (WEHA). Questo residuo è il “HA estratto”.NOTA: Se nella separazione di HA e FF sono stati utilizzati tubi centrifughi superiori a 50 mL, è conveniente trasferire l’HA precipitato in tubi centrifuga da 50 mL resistenti alla temperatura per il processo di essiccazione. Inoltre, se è disponibile un liofilizzatore, l’HA precipitato può essere liofilizzato. La raccolta dell’HA allo stato liofilizzato è più facile perché l’HA non si attacca al lato dei tubi di plastica e non deve essere rottamato. 5. Determinazione del tenore di ceneri NOTA: La procedura per la determinazione del contenuto di ceneri dei campioni essiccati di HA e FA è la stessa. Viene mostrata la procedura che utilizza la notazione per HA. Trasferire circa 30 mg dell’HA essiccato (WHA) in una vasca di ceramica pulita e pre-pesata (WCD) che era stata precedentemente essiccata in un forno di essiccazione a 100 °C e quindi raffreddata in un essiccatore a temperatura ambiente. Dopo aver registrato la massa combinata dell’HA e della parabola pesati (WHA+CD), bruciare l’HA in un forno a muffola per 2 ore a 600°C.NOTA: per ogni campione di HA, devono essere elaborate tre repliche e il contenuto medio di ceneri utilizzato nel calcolo dell’HA puro. Dopo 2 ore, rimuovere il piatto e il contenuto dal forno a muffola e metterlo in un essiccatore per raffreddare. Una volta raffreddato, pesare il piatto con cenere (WASH+ CD) e calcolare il rapporto cenere (Ashrat) utilizzando la formula 1.2:Formula 1.2 Ashrat = (WASH+CD – WCD) / (WHA+CD – WCD) 6. Determinazione della percentuale di HA estratto purificato Determinare la massa finale dell’HA puro (WPHA) correggendo il contenuto di ceneri utilizzando la Formula 1.3:Formula 1.3 WPHA = WEHA * (1- Ashrat) 7. Determinazione della concentrazione (%) di HA puro nel campione originale Determinare la concentrazione di HA puro utilizzando le Formule 1.4 e 1.5:Formula 1.4: % ha puro in campione solido = (WPHA/Wsamp) * 100Formula 1.5: % di HA puro in un campione liquido = (WPHA/WTL) * 100 8. Preparazione della colonna per la purificazione HFA Preparare una colonna per cromatografia a bassa pressione imballata con resina da polimetilmetacrilato DAX-8. Se la resina non è stata utilizzata in precedenza, immergere la resina in metanolo per 2 ore e quindi risciacquare abbondantemente con H2O deionizzato fino a rimuovere tutto il metanolo. Rimuovere le piccole particelle di resina che galleggiano sull’acqua in questo momento. Se la resina è stata utilizzata in precedenza, rigenerarla come descritto al paragrafo 10. Una volta accuratamente risciacquata, versare la resina in una colonna di cromatografia in vetro 5 x 25 cm dotata di un terminale con una fritta da 10 μm per il supporto del letto di resina. Lasciare da 2,5 a 5 cm nella parte superiore della colonna per una soluzione priva di resina per consentire la miscelazione del FF prima di entrare nel letto di resina. Montare il pezzo superiore alla colonna e pompare H2O deionizzato attraverso la parte superiore della colonna per imballare il letto di resina DAX-8 utilizzando una pompa peristaltica. 9. Isolamento dell’HFA Una volta imballato il letto di resina, caricare l’FF sulla colonna utilizzando una pompa peristaltica, a bassa pressione, attraverso la parte superiore della colonna. Utilizzare una portata di 35 – 40 ml/min. È fondamentale che la parte superiore della resina nella colonna rimanga coperta con soluzione durante l’intera procedura di carico e risciacquo per evitare l’essiccazione della resina e la canalizzazione dell’estratto attraverso il letto di resina. Una volta che la frazione fulvica è stata completamente caricata sulla resina, lavare la resina con acqua deionizzata, per rimuovere la “frazione fulvica idrofila” (HyFF) non adsorbita pompandola attraverso la parte superiore della colonna utilizzando la pompa peristaltica a bassa pressione. Utilizzare una portata di 35 – 40 ml/min. Scartare l’effluente contenente HyFF a meno che non venga utilizzato per l’analisi. Lavare la colonna con H2O deionizzato fino a quando l’assorbanza a 350 nm dell’effluente della colonna è uguale (ad esempio, entro 0,015 unità di assorbanza) a quella dell’H2O deionizzato utilizzato per lavare la colonna. Utilizzare l’acqua deionizzata per azzerare (cioè in bianco) lo spettrofotometro. Desorbire l’HFA mediante eluizione posteriore pompando 0,1 M NaOH attraverso il fondo della colonna utilizzando la pompa peristaltica. Utilizzare una portata di 35 – 40 ml/min. Catturare l’effluente della pompa (il Na-fulvato in un contenitore pulito di dimensioni sufficienti (ad esempio, 2 L Erlenmeyer).NOTA: la maggior parte dell’HFA assorbe fino alla sommità del letto di resina DAX-8. Il desorbimento introducendo 0,1 M NaOH dalla parte inferiore della colonna riduce al minimo la quantità di 0,1 M NaOH necessaria per desorbire completamente la FA. Tutto l’HFA è stato desorbito quando l’assorbanza dell’effluente della colonna è uguale all’assorbanza di 0,1 M NaOH influente a 350 nm. Utilizzare 0,1 M NaOH come spazio vuoto spettrofotometrico. Aggiungere l’effluente prelevato per verificare l’assorbanza della soluzione FA desorbita per assicurarsi che tutto il FA venga catturato. 10. De-ashing HFA mediante protonazione Passare la soluzione na-fulvato, ripetutamente, per alimentazione per gravità, attraverso una resina a scambio H+ cationico forte (Table of Materials) contenuta in una colonna di 5 × 50 cm, con fritta di vetro per trattenere la resina, fino a quando la conduttività elettrica dell’effluente è <120 μS/cm, misurata con un conduttimetro elettrico. Prima di ogni passaggio, la resina di scambio H+ richiede una ristrutturazione come descritto nella Sezione 11. Per garantire che tutto il FA venga rimosso dalla resina dopo il passaggio finale, lavare la resina con acqua deionizzata fino a quando l’assorbanza dell’effluente a 350 nm è la stessa (ad esempio, entro 0,015 unità di assorbanza) dell’acqua deionizzata utilizzata per lavare la colonna. Utilizzare H2O deionizzato come spazio vuoto spettrofotometrico. Aggiungere il lavaggio e le eventuali porzioni di effluente assunte per verificare l’assorbanza alla soluzione FA purificata. Per aiutare con la rimozione di tutta la FA, la resina può essere agitata (ad esempio, usando una lunga asta di vetro o plastica) più volte. Concentrare la FA ad un volume di circa 15 ± 2 mL utilizzando un evaporatore rotante a 55 °C. Trasferire completamente il concentrato di FA da 15 mL in un tubo di centrifuga in plastica da 50 mL e asciugare a 60±3 °C a secco costante in un forno di essiccazione. La liofilizzazione è un’alternativa all’essiccazione in forno. Dopo l’asciugatura trasferire il tubo in un essiccatore per raffreddare. Rimuovere FA dal tubo raschiando i lati e il fondo del tubo con una spatola e pesare il FA raccolto su carta di pesatura pre-tarata. Questo materiale è il “Extracted FA” (WEFA). Determinare il rapporto ceneri (ASHrat) della FA estratta come descritto nella fase 6 per HA e calcolare il rapporto ceneri utilizzando la Formula 1.2. Determinare il peso della FA estratta senza ceneri (WPFA) utilizzando la Formula 1.3, sostituendo il WEFA con il peso del WEHA. Infine determinare la % di FA pura nel campione utilizzando la Formula 1.4 sostituendo WPFA con WPHA. 11. Rigenerazione della resina DAX-8 Rigenerare la resina DAX-8 pompando 0,1 M HCl (8,33 mL concentrato HCl/1000 mL volume finale deionizzato H2O) ad una portata di 35 – 40 mL/min attraverso il fondo della colonna fino a quando il pH dell’effluente è uguale al pH dell’influente. Utilizzare la pompa peristaltica per pompare tutti i reagenti attraverso la colonna DAX-8 durante la rigenerazione. Risciacquare la colonna con acqua DI pompandola nella parte superiore della colonna fino a quando il pH dell’effluente è uguale al pH dell’influente (cioè acqua DI). 12. Rigenerazione della resina a scambio H+ -cationico Rigenerare la resina a scambio cationico H+ in un processo batch versando la resina in un grande becher (ad esempio, becher di plastica da 4 L), risciacquare più volte coprendo la resina con DI H2O, mescolando e quindi versando l’acqua. Coprire la resina con 1 M HCl (83,3 mL di HCl concentrato/1000 mL di volume finale di acqua DI). Lasciare riposare per un minimo di 2 ore con agitazione occasionale (ad esempio, una volta ogni 30 minuti). Rimuovere l’acido in eccesso dalla resina versando via l’acido e coprendo la resina con acqua DI. Mescolare energicamente con un’asta di agitazione per 15 s, quindi lasciare cadere la resina sul fondo del pallone e quindi versare l’acqua. Ripetere il processo fino a quando la conduttività elettrica dell’acqua di risciacquo è ≤ 0,7 μS/cm. Caricate nuovamente la resina rigenerata nella colonna. Coprire con H2O deionizzato per assicurarsi che la resina rimanga bagnata tra un utilizzo e l’altro.

Representative Results

I dati sulle prestazioni per il metodo sono forniti nelle tabelle 1 – 5. La precisione del metodo di estrazione di HA e FAH da campioni commerciali liquidi con concentrazioni molto diverse di HA e FHA è riportata nella Tabella 1. Le deviazioni standard relative (RSD) per HA erano inferiori a quelle per HFA, ma l’RSD HFA medio sui tre campioni liquidi era del 6,83%, il che indica un alto grado di precisione. Il rapporto di Horwitz (HorRat) è un parametro di prestazione normalizzato che indica l’idoneità di un metodo di analisi per quanto riguarda la precisione tra i laboratori. Qui è stato utilizzato per la precisione intra-laboratorio. Il valore 2.0 indicano l’eterogeneità dei campioni di prova, la necessità di ottimizzazione del metodo o una formazione più ampia, operando al di sotto del limite di rilevamento o un metodo inapplicabile. Per l’analisi di campioni liquidi, l’HorRat è stato > 2 solo per una delle analisi HFA (Tabella 1). I dati di precisione per l’estrazione di HA e HFA da tre campioni di minerale umico sono riportati nella tabella 2. Anche in questo caso, ad eccezione dell’HFA estratto da Ore 2 e dell’HA di Ore 3, tutti gli HorRat erano inferiori a 2. Ciò dimostra un alto grado di precisione di questo metodo per l’estrazione di HA e HFA per campioni di minerale umico. I produttori di biostimolanti vegetali spesso formulano prodotti che contengono HS oltre ad altri ingredienti come alghe, fertilizzanti inorganici, carboni o melassa. La tabella 3 fornisce i risultati di un’analisi dell’inclusione di questi tipi di additivi sulla precisione del metodo. Nessuno degli additivi ha effettuato in modo significativo il recupero di HA o HFA (tabella 3). La Tabella 4 e la Tabella 5 riportano i recuperi di HA e HFA, rispettivamente, da campioni liquidi che hanno simulato prodotti commerciali con concentrazioni molto basse. I recuperi sono stati eccellenti e variavano tra l’88% e il 97% per l’HA (Tabella 4) e il 92% e il 104% per l’HFA (Tabella 5). I recuperi medi per HA e HFA sono stati rispettivamente del 93% e del 97%, mentre la % RSD per entrambi gli HS è stata inferiore al 5%. Sebbene la precisione sia eccellente, questi dati indicano la necessità di eseguire repliche di laboratorio. Il limite di rilevazione del metodo (MDL) e il limite di quantificazione del metodo erano 4,62 e 1,47 mg/L per l’HA e 4,8 e 1,53 mg/L per l’HFA. Sostanze umiche, % Materiale L16 · L17 · L2 · HFA · HA · HFA · HA · HFA · HA · Rep 1 1.44 17 6.59 7.76 0.36 4.46 Rep 2 1.39 16.03 6.25 7.79 0.42 4.93 Rep 3 · 1.34 16.44 6.02 7.55 0.4 4.46 Rep 4 1.54 16.75 6.2 7.69 0.33 4.53 Significare 1.43 16.56 6.27 7.7 0.38 4.6 SD 0.09 0.42 0 0.11 0.04 0.23 24 RSD, % 6.29 2.53 3.8 1.39 10.4 4.91 Hor Rat(r) 1.58 0.72 1.25 0.47 2.31 1.55 un Le condizioni di estrazione erano 1 g in 1 L 0,1 M NaOH. Tabella 1. Precisione del metodo nell’estrazione e quantificazione di HA e HFA da campioni commerciali liquidi. Le condizioni di estrazione erano 1 g in 1 L 0,1 M NaOH. Sostanze umiche, % Minerale 1 Minerale 2 Ore 3 Materiale HFA · HA · HFA · HA · HFA · HA · Rep 1 1.75 67.4 1.31 27.01 1.55 8.95 Rep 2 1.69 67.63 1.25 27.48 1.41 7.2 Rep 3 · 1.63 67.1 1.27 27.34 1.47 8.35 Rep 4 1.77 67.59 1.55 26.89 1.51 7.98 Significare 1.71 67.53 1.35 27.18 1.49 8.12 SD 0.06 0.94 0.14 0.28 0.06 0.73 RSD, % 3.7 1.39 10.33 1.02 4.02 9.02 HorRat(r) 0.99 0.66 2.71 0.42 1.07 3.09 Tabella 2. Precisione del metodo di estrazione e quantificazione di HA e HFA da minerali umici. Le condizioni di estrazione erano 1 g di campione in 1 L 0,1 M NaOH. (Dati tratti da Lamar et al., 2014) Replicare Adulterante HA, % FA, % Recupero relativo HA, % Recupero relativo HFA, % 1 Nessuno 81.61 12.86 2 Nessuno 80.16 12.78 1 Alga 80.21 12.85 2 Alga 80.72 12.79 99.5 99.6 1 Fertilizzante 80.25 12.98 2 Fertilizzante 79.57 123.77 98.8 101.6 1 Carbone 78.79 12.92 2 Carbone 81.27 12.84 98.9 101.8 1 Melassa 79.38 12.99 2 Melassa 81.02 12.72 99.2 100.9 Significare 80.3 12.85 SD 0.885 0.09 una concentrazione finale di FA + HA di 2,5 g/L aggiunta a 0,1 M NaOH. (dati tratti da Lamar et al., 2015) Tabella 3. Effetto degli adulteranti sulla quantificazione di HA e HFA da una leonardite gascoyne. (Dati tratti da Lamar et al., 2015) HA · ID di esempio Estratto, mg Recuperato, mg Recuperato, % 1 24.6 23.7 96.3 2 22.6 19.9 88.1 3 25.2 23.6 93.7 4 22.5 21.5 95.6 5 23.9 21.8 91.2 6 23.2 20.8 89.7 7 24 23.2 96.7 Significare 23.7 22.1 93 SD 1.01 1.52 3.43 RSD, % 4.35 6.88 3.67 (dati tratti da Lamar et al., 2014) Tabella 4. Recupero di HA da spazi vuoti chiodati. (Dati tratti da Lamar et al., 2014) FA ID di esempio Estratto, mg Recuperato, mg Recuperato, % 1 19.9 19 95.48 2 23.1 22.9 99.13 3 20.7 19.4 93.72 4 20.5 19.8 96.39 5 20.8 21.6 103.85 6 21.9 20.1 91.78 7 22.7 22.3 98.24 Significare 21.37 20.73 96.94 SD 1.21 1.53 3.95 RSD, % 5.64 7.36 4.07 (Dati tratti da Lamar et al., 2014) Tabella 5. Recupero di HFA da spazi vuoti chiodati. (Dati tratti da Lamar et al., 2014)

Discussion

Le fasi iniziali dell’estrazione e dell’isolamento dell’HA in questo metodo sono relativamente semplici. Poiché l’isolamento dell’HFA comporta la cromatografia su colonna, l’ottenimento di risultati ripetibili comporta una stretta aderenza ai dettagli di ogni fase e pratica. In particolare, una corretta preparazione delle resine è di primaria importanza. È estremamente importante che la resina da polimetilmetacrilato DAX-8 sia preparata e imballata correttamente. Il corretto imballaggio della resina influisce sia sulla resa che sulla qualità dell’HFA. Se esiste una canalizzazione, né il pretrattamento (cioè l’acidificazione) né l’adsorbimento dell’HFA saranno completi e la separazione porterà a risultati imprecisi. Se si osservano canali o spazi nella resina prima del caricamento del campione, la colonna deve essere rimossa e agitata per ridistribuire le perle di resina, consentendo loro di depositarsi senza canali, e quindi reimballata pompando DI _H2O pulito attraverso la resina. Inoltre, come indicato nel protocollo, mantenere un volume di liquido sopra la resina quando si carica la FF sulla resina, consentirà alla FF di miscelarsi prima di entrare nella resina e si tradurrà in un adsorbimento più efficace. Per la forte resina a scambio cationico H⁺ (Table of Materials), la rigenerazione completa non può essere affrettata. Lo scambio Na ⁺ / H ⁺ richiede tempo e quindi questo è meglio farlo in un trattamento di massa in modo che la resina possa essere miscelata mentre viene ri-acidificata. Miscelare la resina durante il risciacquo con DI H2O aiuta a rimuovere l’eccesso di HCl. Quando si solleva la resina acidificata per rimuovere l’acido in eccesso, mescolare la resina aiuta a rimuovere l’HCl. È estremamente importante rimuovere l’acido fino al punto in cui viene raggiunta una conduttività elettrica di ≤ 0,7 μS/cm. In caso contrario, l’HCl verrà riportato con l’HFA.

Infine, quando si desorbe l’HFA dalla resina DAX-8, una volta che l’assorbanza dell’influente è uguale all’assorbanza dell’effluente, è buona norma lasciare riposare la colonna per un paio d’ore per vedere se verrà rilasciato un ulteriore HFA. Se è così, sarà visto come un ingiallimento del liquido sopra la resina. Se ciò si verifica, l’HFA aggiuntivo può essere rimosso mediante continuo desorbimento fino a quando gli assorbimenti di influenza/effluente non sono di nuovo uguali.

Uno degli svantaggi dell’isolamento HFA è che l’intero processo richiede molto tempo. Il completo desorbimento dell’HFA dalla resina DAX-8 e la completa rimozione dalla resina A scambio H⁺ si traducono entrambi in un volume significativo di HFA che deve essere ridotto mediante evaporazione rotativa. Questo è sicuramente un collo di bottiglia nell’analisi. Nel tentativo di ridurre questo tempo, è stato suggerito di desorbire l’HFA dalla resina DAX-8 usando acetone anziché 0,1 M ^NaOH14. Gli autori hanno affermato che utilizzando il 50% di acetone come desorbente al posto di NaOH, è stato ottenuto un risultato HFA simile e il DAX-8 è stato adeguatamente rigenerato e quindi la fase di scambio H ⁺ potrebbe essere eliminata. Questa modifica ha comportato un tempo di analisi notevolmente ridotto a causa della diminuzione del volume prodotto e dell’evaporazione rotativa più rapida dell’acetone rispetto all’acqua. Questa modifica merita ulteriori studi.

Questo metodo è limitato all’analisi della materia organica che ha subito il processo di umificazione e, per il caso della torba e dei carboni molli, agli ulteriori processi di torba e sia alla torificazione che alla coalificazione, rispettivamente. L’umificazione è il processo per cui il materiale morto, principalmente vegetale, viene decomposto da una sequenza di microbi che consumano e modificano substrati sempre più recalcitranti. I processi abiotici partecipano anche alle reazioni di decomposizione e risintetizzazione. L’umificazione alla fine si traduce nella produzione di materiali relativamente recalcitranti che comprendono miscele eterogenee di migliaia di molecole che formano una gamma di peso molecolare e contenuti di carbonio, ossigeno e idrogeno che formano HS. Gli HS sono ulteriormente modificati dalla torificazione e dalla coalificazione. Pertanto, questo metodo non è appropriato per i materiali vegetali che sono stati modificati da processi chimici. Ad esempio, il lignosolfonato è ampiamente usato come adulterante HFA. Il lignosolfonato è un sottoprodotto del processo di polpa del solfito. Pertanto, questo materiale non è stato prodotto dal processo di umificazione. Inoltre, ci sono molte sostanze che si legano alla resina DAX-8. Ad esempio, la resina DAX-8 è stata utilizzata per assorbire pesticidi dalla ^soluzione15. Ovviamente, i pesticidi non sono HS. Pertanto, la legatura di un materiale alla resina DAX-8 non giustifica l’affermazione che si tratti di un HFA. I prerequisiti sono sia la produzione mediante umificazione che il legame alla resina DAX-8.

Man mano che si impara di più sul contributo dei vari componenti di HS in diverse applicazioni, può diventare vantaggioso frazionare ulteriormente HS e quindi modificare il metodo di conseguenza. Così com’è, il metodo non quantifica l’HYFA. Tuttavia, questa frazione potrebbe anche avere attività, ad esempio nella biostimolazione delle piante, dove l’intero FF viene generalmente applicato nei trattamenti agricoli piuttosto che nell’HFA purificato.

Materials

Amberlite IR 120 H+-exchange resin	Sigma-Aldrich	10322	H+ form
Analytical Balance	Ohaus	PA214	w/ glass draft shield
Centrifuge	Beckman Coulter	Allegra X-14	minimum 4300 rpm
Centrifuge tubes	Beckman Coulter		To fit rotor selected
Ceramic Combustion Crucibles	Sigma	Z247103
Chromatography column for DAX-8	Diba	Omnifit 006EZ-50-25-FF
Chromatography column for IR 120	Chemglass	CG-1187-21 2 in. by 24 in.
Dessicator	Capitol Scientic	Kimax 21200-250	Vacuum type
Drying Oven	Fisher Scientific	Isotemp	Precision±3˚C
Electrical conductivity meter	HM Digital	EC-3
Erlenmeyer Flasks	Amazon		1L, 2L
HCl concentrated	Sigma-Aldrich	320331
Magnetic Stir Plate	Barnstead-Thermolyne	Dataplate 721
Magnetic Stir bars			These can be obtained at many outlets
Muffle Furnace	Fisher scientific	Thermolyne Type 47900
NaOH	Sigma-Aldrich	795429
Nitrogen gas	Praxair	UNI1066	99.99% purity
Peristaltic pump	Cole Parmer	Masterflex 7518-00
Perstaltic tubing	Cole Parmer	Masterflex Pharmed 06508-17
pH meter	Oakton Instruments	WD-35618–03
Rotary Evaporator	Buchi	R-210/R-215
Spectrophotometer	Healthcare SCiences	Ultrospec II	Dual beam 200 to 900 nm with wavelength accuracy of ±1 nm and reproducibility of ±0.5 nm.