Summary
Deze methode biedt een gravimetrische kwantificering van humusstoffen (bijv. humus- en fulvinezuren) op asvrije basis, in droge en vloeibare materialen uit zachte steenkool (d.w.z. geoxideerde en niet-geoxideerde bruinkool en subbitumineuze steenkool), humate-ertsen en schalies, turf, compost en commerciële meststoffen en bodemaanpassingen.
Abstract
Het doel van deze methode is te zorgen voor een nauwkeurige en nauwkeurige concentratie humus (HA) en/of fulvinezuren (FA) in zachte kolen, humusertsen en leisteen, turf, compost en humussubstantiehoudende handelsproducten. De methode is gebaseerd op de alkalische extractie van testmaterialen, met behulp van 0,1 N NaOH als extractiemiddel, en scheiding van de alkalische oplosbare humusstoffen (HS) van niet-oplosbare producten door centrifugering. De pH van het gecentrifugeerde alkalische extract wordt vervolgens aangepast tot pH 1 met conc. HCl, wat resulteert in precipitatie van de HA. De neergeslagen HA worden gescheiden van de fulvinefractie (FF) (de fractie van HS die in oplossing achterblijft) door centrifugatie. De HA wordt vervolgens in de oven of gevriesdroogd en het asgehalte van de gedroogde HA bepaald. Het gewicht van het zuivere (d.w.z. asvrije) HA wordt vervolgens gedeeld door het gewicht van het monster en de resulterende fractie vermenigvuldigd met 100 om het ha-ƒ%-ha in het monster te bepalen. Om het FA-gehalte te bepalen, wordt de FF geladen op een hydrofobe DAX-8-hars, die de FA-fractie adsorbeert, ook wel het hydrofobe fulvinezuur (HFA) genoemd. De resterende niet-fulvinezuurfractie, ook wel de hydrofiele fulvinefractie (HyFF) genoemd, wordt vervolgens verwijderd door de hars te wassen met gedeïoniseerd H2O totdat al het niet-geabsorbeerde materiaal volledig is verwijderd. De FA wordt vervolgens gedesorbeerd met 0,1 N NaOH. Het resulterende Na-fulvate wordt vervolgens geprotoneerd door het over een sterke H + -uitwisselingshars te laten gaan. De resulterende FA is oven- of gevriesdroogd, het asgehalte bepaald en de concentratie in het monster berekend zoals hierboven beschreven voor HA.
Introduction
Humusstoffen (HS) zijn dynamische residuen die het gevolg zijn van de microbiële afbraak en transformatie van dode plantenweefsels1,2,3 aangevuld met microbiële bijproducten en biomassa3,4,5 via een proces dat humificatie wordt genoemd6. HS zijn aanwezig in bodems, natuurlijke wateren, meersedimenten, turf, zachte kolen en humusschalie en vertegenwoordigen naar schatting 25% van de totale organische koolstof op aarde7. Deze stoffen zijn complexe mengsels van duizenden unieke moleculen die worden gefractioneerd in drie hoofdfracties op basis van hun verschillende oplosbaarheid in sterk basische en zure waterige oplossingen. Deze fracties zijn humuszuren (HAs), die de alkali oplosbare maar in zuur onoplosbare fractie vormen; fulvinezuren (VA's), de fractie oplosbaar in zowel alkali als zuur; en de huminefractie, die bij alle pH-waarden onoplosbaar is6,8. De fulvinefractie (FF) wordt verder onderverdeeld in de hydrofobe FA (HFA) en hydrofiele (HyFA) fracties. Deze fracties worden gedefinieerd als het deel van de FF dat bindt aan een hydrofobe DAX-8 hars (HFA) en het deel dat niet bindt aan de hars (HyFA).
HS wordt steeds vaker gebruikt in de landbouw, waar ze op grote schaal worden gebruikt als biostimulanten voor gewassen, in de veehouderij, met name als toevoegingsmiddel voor veevoer, in de mijnbouw in boorslib en milieusanering als elektronenshuttles. Ook het onderzoek naar het gebruik van HS in medische toepassingen bij mensen neemt toe.
Er bestaan veel methoden voor de kwantificering van HA en FA. De meeste van deze methoden zijn echter niet nauwkeurig of nauwkeurig. De twee meest gebruikte methoden voor de bepaling van HA in de VS zijn bijvoorbeeld de colorimetrische methode9 en de methode van het California Department of Food and Agriculture (CDFA), waarvan beide de hoeveelheid HA in een reeks erts- en extractbronnen uit het westen van de VS en Canada hebben overschat10. De colorimetrische of spectrofotometrische methode is onnauwkeurig omdat deze afhankelijk is van de absorptie van alkalische extracten die, naast HA, FA en andere chromoforen omvatten die allemaal absorberen op de gebruikte golflengte en de standaard is niet representatief voor de materialen die worden getest10. De CDFA-methode is niet nauwkeurig omdat deze geen HA-concentraties op een asvrije basis levert. Omdat verschillende ertsen verschillende hoeveelheden as hebben, waarvan sommige worden meegevoerd met de extractie en het extractieproces zelf as toevoegt, levert deze methode geen nauwkeurige waarde op voor HA-concentraties10. Als antwoord op de behoefte aan een nauwkeurige en nauwkeurige methode, werd in 2014 een gestandaardiseerde gravimetrische procedure gepubliceerd op basis van de door11 beschreven procedure om de kwantificering van zowel HA als FA op een asvrije basis aan te pakken12. Deze methode werd vervolgens, met kleine wijzigingen, in 2018 door de International Organization for Standardization (ISO) aangepast onder Meststoffen en bodemverbeteraars als "Bepaling van humus- en hydrofobe fulvinezurenconcentraties in kunstmestmaterialen"13.
Dit artikel schetst het protocol voor extractie en kwantificering van humus- en hydrofobe fulvinezuren en geeft details over de nauwkeurigheid en precisie van de gegevens die uit de methode worden geproduceerd.
Protocol
1. Voorbereiding van vaste monsters
- Plet ongeveer 5 g van het te analyseren monster, met behulp van een vijzel en stamper, zodat 100% van het gemalen monster door een Amerikaanse standaardzeefmaaswijdte nr. 200 (d.w.z. 74 μm) gaat en ervoor zorgt dat het poeder goed gemengd is.
- Bepaal gravimetrisch het vochtgehalte van het poeder.
- Weeg een aluminium weegboot en noteer de massa (Wwb).
- Breng ongeveer 2 g monsterpoeder over in de weegboot en noteer de massa (Wws+wb).
- Plaats de weegboot gedurende 24 uur in een droogoven bij 102 °C (niet meer dan 102 °C). Haal na 24 uur de weegboot uit de droogoven en plaats deze in een exsiccator om minstens 1 uur af te koelen.
- Weeg en noteer de massa van de weegboot en het gedroogde monsterpoeder (Wds+wb).
- Bepaal het vochtgehalte met formule 1.1.
Formule 1.1 Vochtgehalte van poeder met vaste monsters
% vocht = (((Wws+wb- Wwb) – (Wds+wb - Wwb))/ (Wws+wb - Wwb)) * 100
2. Extractieprocedure
- Vaste monsters
- Weeg ongeveer 2,5 g van het gezeefde monsterpoeder (Wsamp) in een plastic of aluminium weegboot en noteer het gewicht tot op vier decimalen.
- Laad het monster in een maatcilinder van 1 L en vul de cilinder tot 1 L met 0,1 M NaOH (4 g NaOH x L-1).
- Voeg een magneetroerstaaf (bijv. 5 - 7 cm lang) toe en roer snel (d.w.z. 300 - 400 rpm) op een roerplaat totdat het monster grondig is gemengd.
- Breng de volledige inhoud van de maatcilinder over in een Erlenmeyer van 1 L, maak de kopruimte van de kolf vrij met N2-gas en dek de opening van de kolf af met een luchtdicht deksel.
- Leg de Erlenmeyer op een roerplaat en meng bij 300 - 400 rpm gedurende 16 - 18 uur.
- Vloeibare monsters
- Meng het monster bij vloeibare materialen grondig door te schudden om ervoor te zorgen dat de testvloeistof homogeen wordt gemengd. Zorg ervoor dat eventuele resten die op de bodem van de container zijn gevallen, grondig worden gemengd.
- Voeg ongeveer 5 g van de testvloeistof, gewogen tot op 4 decimalen (WTL), toe aan een maatcilinder van 1 L.
- Vul de gegradueerde cilinder met 0,1 M NaOH tot een eindvolume van 1 L.
- Voeg een magneetroerstaaf (bijv. 5 – 7 cm lang) toe en roer snel (bijv. 300 - 400 rpm) op een roerplaat totdat het testmonster volledig gemengd is.
- Breng het mengsel over in een Erlenmeyer van 1 L, maak de kopruimte vrij met N2-gas en dek de opening van de kolf af met een luchtdicht deksel.
- Leg de Erlenmeyer op een roerplaat en meng gedurende 1 uur bij 300 - 400 rpm.
OPMERKING: Na dit punt is de behandeling van vaste en vloeibare monsters hetzelfde.
3. Verwijdering van niet-oplosbare materialen uit alkalische extracten
- Verwijder na het roeren de kolf van de roerplaat, breng het mengsel over in geschikte centrifugebuizen en centrifugeer het volledige volume bij 4.921 x g gedurende 30 minuten.
- Verzamel het alkalische supernatant met de HA en FA in een schone Erlenmeyer van 1 L met een magneetroerstaaf. Gooi het onoplosbare materiaal weg. Filtratie door glaswol of kwalitatief filterpapier met een poriegrootte van 2,5 μm wordt aanbevolen als restdeeltjes na centrifugeren niet worden neergeslagen.
4. Neerslag en scheiding van HA van FF
- Terwijl u het alkalische extract met 300 - 400 rpm op een roerplaat roert, plaatst u een pH-sonde in het middelste gedeelte van de oplossing (verticaal) en voegt u conc. HCl druppelsgewijs toe aan het alkalische extract totdat een stabiele pH van pH 1,0 ± 0,1 is bereikt.
- Zodra een pH van pH 1 is bereikt en stabiel blijft, verwijdert u de pH-sonde uit de kolf, haalt u de roerstaaf op, dekt u de kolf af met een luchtdicht deksel en laat u de kolf zitten totdat de neergeslagen HA op de bodem van de kolf is beland.
OPMERKING: De tijd die een HA nodig heeft om neer te slaan en de oplossing te laten vallen, zal variëren afhankelijk van de bron en de hoeveelheid HA in het monster. Het duurt meestal 1 -6 uur voordat de HA volledig neerslaat en uit de oplossing valt. - Centrifugeer het extract en neergeslagen HA bij 4921 x g gedurende 1 uur. Giet na het centrifugeren de supernatant FF af in een schone 1 L Erlenmeyer en dek af met een luchtdichte hoes.
OPMERKING: Een langere centrifugetijd kan nodig zijn om de HA stevig genoeg in te pakken om de FF te kunnen decanteren zonder toevoeging van een van de neergeslagen HA. - Plaats de centrifugebuizen in een droogoven die gedurende 24 uur op 100 °C wordt gehouden.
- Haal na het drogen de buizen uit de droogoven en plaats ze in een exsiccator om af te koelen tot kamertemperatuur. Breng na afkoeling het residu kwantitatief over van de buis door het met een spatel van de zijkanten en bodem van de buis te schrapen, over te brengen naar een geteerde weegboot en de massa (WEHA) te registreren. Dit residu is de "Geëxtraheerde HA".
OPMERKING: Als centrifugebuizen van meer dan 50 ml zijn gebruikt bij de scheiding van HA en FF, is het handig om de neergeslagen HA over te brengen naar temperatuurbestendige centrifugebuizen van 50 ml voor het droogproces. Ook als er een vriesdroger beschikbaar is, kan de neergeslagen HA worden gevriesdroogd. Het verzamelen van de HA in een gevriesdroogde staat is gemakkelijker omdat de HA niet aan de zijkant van de plastic buizen blijft plakken en niet gesloopt hoeft te worden.
5. Bepaling van het asgehalte
OPMERKING: De procedure voor de bepaling van het asgehalte van gedroogde HA- en FA-monsters is dezelfde. De procedure met notatie voor HA wordt weergegeven.
- Breng ongeveer 30 mg van de gedroogde HA (WHA) over in een schone, vooraf gewogen keramische schaal (WCD) die eerder in een droogoven bij 100 °C was gedroogd en vervolgens in een exsiccator tot kamertemperatuur was afgekoeld. Na registratie van de gecombineerde massa van de gewogen HA en schotel (WHA+CD), verbrandt u de HA in een dempingsoven gedurende 2 uur bij 600°C.
OPMERKING: Voor elk HA-monster moeten drie duplo's worden verwerkt en moet het gemiddelde asgehalte worden gebruikt bij de berekening van zuivere HA. - Haal na 2 uur de schaal en de inhoud uit de moffeloven en plaats in een exsiccator om af te koelen. Weeg na het afkoelen de schaal met as (WASH+CD) en bereken de asverhouding (Ashrat) met formule 1.2:
Formule 1.2 Ashrat = (WASH+CD - WCD) / (WHA+CD - WCD)
6. Bepaling van het percentage gezuiverd geëxtraheerd HA
- Bepaal de uiteindelijke massa van de zuivere HA (WPHA) door te corrigeren voor asgehalte met formule 1.3:
Formule 1.3 WPHA = WEHA * (1- Ashrat)
7. Bepaling van de concentratie (%) van zuiver HA in het oorspronkelijke bronmonster
- Bepaal de concentratie van zuivere HA met behulp van Formule 1.4 en 1.5:
Formule 1.4: % zuivere HA in vaste stof = (WPHA/Wsamp) * 100
Formule 1,5: % zuivere HA in vloeibaar monster = (WPHA/WTL) * 100
8. Kolomvoorbereiding voor HFA-zuivering
- Bereid een lagedrukchromatografiekolom voor die vol zit met polymethylmethacrylaat DAX-8-hars. Als de hars nog niet eerder is gebruikt, weekt u de hars gedurende 2 uur in methanol en spoelt u vervolgens grondig met gedeïoniseerd H2O totdat alle methanol is verwijderd.
- Verwijder kleine harsdeeltjes die op dit moment op het water drijven. Als de hars eerder is gebruikt, regenereer deze dan zoals beschreven in rubriek 10.
- Na grondig gespoeld, giet u de hars in een glazen chromatografiekolom van 5 x 25 cm, voorzien van een eindstuk met een frit van 10 μm voor harsbedondersteuning. Laat 2,5 tot 5 cm boven aan de kolom voor een harsvrije oplossing om het mengen van de FF mogelijk te maken voordat u het harsbed binnengaat. Plaats het bovenste stuk op de kolom en pomp gedeïoniseerde H2O door de bovenkant van de kolom om het DAX-8 harsbed te verpakken met behulp van een peristaltische pomp.
9. Isolatie van HFA
- Zodra het harsbed is verpakt, laadt u de FF op de kolom met behulp van een peristaltische pomp, onder lage druk, via de bovenkant van de kolom. Gebruik een debiet van 35 – 40 ml/min. Het is van cruciaal belang dat de bovenkant van de hars in de kolom gedurende de gehele laad- en spoelprocedure bedekt blijft met oplossing om te voorkomen dat de hars uitdroogt en het extract door het harsbed wordt geleid.
- Zodra de fulvinefractie volledig op de hars is geladen, wast u de hars met gedeïoniseerd water om de niet-geadsorbeerde "hydrofiele fulvinefractie" (HyFF) te verwijderen door deze door de bovenkant van de kolom te pompen met behulp van de peristaltische pomp onder lage druk. Gebruik een debiet van 35 – 40 ml/min. Gooi het HyFF-bevattende effluent weg, tenzij het voor analyse wordt gebruikt.
- Was de kolom met gedeïoniseerd H2O totdat de absorptie bij 350 nm van het kolomafval gelijk is (bijvoorbeeld binnen 0,015 absorptie-eenheden) aan die van de gedeïoniseerde H2O die wordt gebruikt om de kolom te wassen. Gebruik gedeïoniseerd water tot nul (d.w.z. leeg) de spectrofotometer.
- Desorbeer de HFA door back-elutie door 0,1 M NaOH via de onderkant van de kolom te pompen met behulp van de peristaltische pomp. Gebruik een debiet van 35 – 40 ml/min. Vang het pompafval (de Na-fulvate in een voldoende grote schone container (bijv. 2 L Erlenmeyer).
OPMERKING: De meeste HFA-adsorbeert aan de bovenkant van het DAX-8 harsbed. Desorptie door de 0,1 M NaOH vanaf de onderkant van de kolom in te brengen, minimaliseert de hoeveelheid van 0,1 M NaOH die nodig is om de FA volledig te desorberen. - Alle HFA is gedesorbeerd wanneer de absorptie van het kolom-effluent gelijk is aan de absorptie van 0,1 M NaOH-influent bij 350 nm. Gebruik 0,1 M NaOH als spectrofotometrische blanco. Voeg het ingenomen effluent toe om de absorptie van de gedesorbeerde FA-oplossing te controleren om ervoor te zorgen dat alle FA wordt opgevangen.
10. HFA-ontsteven door protonering
- Passeer de Na-fulvate-oplossing herhaaldelijk, door zwaartekrachttoevoer, door sterke kation H+-uitwisselingshars (Materiaaltafel) in een kolom van 5 × 50 cm, met glazen frit om de hars vast te houden, totdat de elektrische geleidbaarheid van het effluent is <120 μS/cm, zoals gemeten met een elektrische geleidbaarheidsmeter. Voorafgaand aan elke pas moet de H+-wisselhars worden opgeknapt zoals beschreven in sectie 11.
- Om ervoor te zorgen dat alle FA na de einddoorgang uit de hars wordt verwijderd, wast u de hars met gedeïoniseerd water totdat de absorptie van effluent bij 350 nm hetzelfde is (bijvoorbeeld binnen 0,015 absorptie-eenheden) als het gedeïoniseerde water dat wordt gebruikt om de kolom te wassen. Gebruik gedeïoniseerde H2O als spectrofotometrische blanco. Voeg de was en eventuele effluentporties toe om de absorptie aan de gezuiverde FA-oplossing te controleren. Om te helpen bij het verwijderen van alle FA, kan de hars meerdere keren worden geroerd (bijvoorbeeld met behulp van een lange glazen of plastic staaf).
- Concentreer de FA tot een volume van ongeveer 15 ± 2 ml met behulp van een roterende verdamper bij 55 °C.
- Breng het 15 ml FA-concentraat volledig over in een plastic centrifugebuis van 50 ml en droog bij 60±3 °C tot een constante droogheid in een droogoven. Vriesdrogen is een alternatief voor ovendrogen. Breng na het drogen de buis over op een exsiccator om af te koelen.
- Verwijder FA uit de buis door de zijkanten en bodem van de buis met een spatel te schrapen en weeg de verzamelde FA op voorgehard weegpapier. Dit materiaal is de "Extracted FA" (WEFA).
- Bepaal de asverhouding (ASHrat) van geëxtraheerde FA zoals beschreven in stap 6 voor HA en bereken de asverhouding met formule 1.2. Bepaal het gewicht van de geëxtraheerde FA zonder as (WPFA) met behulp van Formule 1.3, waarbij de WEFA wordt vervangen door het gewicht van WEHA. Bepaal ten slotte het % zuivere FA in het monster met behulp van Formule 1.4 ter vervanging van WPHA door WPFA.
11. DAX-8 harsregeneratie
- Regenereereer de DAX-8-hars door 0,1 M HCl (8,33 ml geconcentreerd HCl / 1000 ml gedeïoniseerd H2O) met een stroomsnelheid van 35 - 40 ml / min door de bodem van de kolom te pompen totdat de pH van het effluent gelijk is aan de pH van het influent. Gebruik de peristaltische pomp om alle reagentia door de DAX-8 kolom te pompen tijdens de regeneratie.
- Spoel de kolom met DI-water door deze in de bovenkant van de kolom te pompen totdat de pH van het effluent gelijk is aan de pH van het influent (d.w.z. DI-water).
12. H+-kationenuitwisseling harsregeneratie
- Regenereer de H+ kationenuitwisselingshars in een batchproces door de hars in een groot bekerglas (bijv. 4 L plastic bekerglas) te gieten, meerdere keren te spoelen door de hars te bedekken met DI H2O, te mengen en vervolgens het water af te gieten.
- Bedek de hars met 1 M HCl (83,3 ml geconcentreerd HCl/1000 ml eindvolume DI-water). Laat minimaal 2 uur staan met af en toe roeren (bijvoorbeeld eens in de 30 minuten).
- Verwijder het overtollige zuur uit de hars door het zuur af te gieten en de hars te bedekken met DI-water. Roer krachtig met een roerstaaf gedurende 15 s, laat de hars dan op de bodem van de kolf vallen en giet dan het water af. Herhaal het proces totdat de elektrische geleidbaarheid van het spoelwater is ≤ 0,7 μS/cm.
- Laad de geregenereerde hars terug in de kolom. Dek af met gedeïoniseerd H2O om ervoor te zorgen dat de hars nat blijft tussen gebruik.
Representative Results
Prestatiegegevens voor de methode zijn opgenomen in de tabellen 1 – 5. De precisie van de methode voor extractie van HA en FAH uit vloeibare commerciële monsters met zeer verschillende concentraties HA en FHA is weergegeven in tabel 1.
De relatieve standaarddeviaties (RSD's) voor HA waren lager dan die voor HFA, maar de gemiddelde HFA RSD over de drie vloeistofmonsters was op 6,83%, wat wijst op een hoge mate van precisie. De Horwitz-ratio (HorRat) is een genormaliseerde prestatieparameter die de geschiktheid aangeeft van een analysemethode met betrekking tot laboratoriumprecisie. Hier werd het gebruikt voor intra-laboratorium precisie. Waarde < 0,5 kan wijzen op een niet nader genoemde gemiddelde of een hoge mate van ervaring met de methode. Waarden > 2.0 duiden op heterogeniteit van testmonsters, de noodzaak van methodeoptimalisatie of uitgebreidere training, het werken onder de detectiegrens of een niet-toepasselijke methode. Voor de analyse van vloeistofmonsters werd de HorRat slechts > 2 voor een van de HFA-analyses (tabel 1).
Nauwkeurige gegevens voor de extractie van HA en HFA uit drie humusertsmonsters zijn opgenomen in tabel 2. Nogmaals, met uitzondering van de HFA gewonnen uit Erts 2 en de HA uit Erts 3, waren alle HorRat's onder de 2. Dit toont een hoge mate van precisie van deze methode voor extractie van HA en HFA voor humusertsmonsters.
Fabrikanten van biostimulanten voor planten formuleren vaak producten die HS bevatten naast andere ingrediënten zoals zeewier, anorganische meststoffen, kolen of melasse. Tabel 3 geeft de resultaten weer van een analyse van de opname van dit soort additieven op de precisie van de methode. Geen van de additieven heeft de terugwinning van HA of HFA significant beïnvloed (tabel 3).
Tabel 4 en tabel 5 rapporteren de terugvorderingen van respectievelijk HA en HFA uit vloeibare monsters die commerciële producten met zeer lage concentraties simuleerden. De terugvorderingen waren uitstekend en varieerden van 88% tot 97% voor HA (tabel 4) en 92% en 104% voor HFA (tabel 5). De gemiddelde terugvorderingen voor HA en HFA waren respectievelijk 93% en 97%, en % RSD voor beide HS was minder dan 5%. Hoewel de precisie uitstekend is, geven deze gegevens de noodzaak aan om laboratoriumreplicaties uit te voeren. De methodedetectiegrens (MDL) en de methodekwantificeringsgrens waren 4,62 en 1,47 mg/l voor HA en 4,8 en 1,53 mg/l voor HFA.
| Humusstoffen, % | |||||||
| Materiaal | L16 | L17 | L2 | ||||
| HFA | HA | HFA | HA | HFA | HA | ||
| Rep 1 | 1.44 | 17 | 6.59 | 7.76 | 0.36 | 4.46 | |
| Rep 2 | 1.39 | 16.03 | 6.25 | 7.79 | 0.42 | 4.93 | |
| Rep 3 | 1.34 | 16.44 | 6.02 | 7.55 | 0.4 | 4.46 | |
| Rep 4 | 1.54 | 16.75 | 6.2 | 7.69 | 0.33 | 4.53 | |
| Bedoelen | 1.43 | 16.56 | 6.27 | 7.7 | 0.38 | 4.6 | |
| SD | 0.09 | 0.42 | 0 | 0.11 | 0.04 | 0.23 | |
| 24 | |||||||
| RSD, % | 6.29 | 2.53 | 3.8 | 1.39 | 10.4 | 4.91 | |
| Hor Rat(r) | 1.58 | 0.72 | 1.25 | 0.47 | 2.31 | 1.55 | |
| een De extractiecondities waren 1 g in 1 L 0,1 M NaOH. | |||||||
Tabel 1. Precisie van de methode bij extractie en kwantificering van HA en HFA uit vloeibare commerciële monsters. De extractiecondities waren 1 g in 1 L 0,1 M NaOH.
| Humusstoffen, % | ||||||
| Erts 1 | Erts 2 | Erts 3 | ||||
| Materiaal | HFA | HA | HFA | HA | HFA | HA |
| Rep 1 | 1.75 | 67.4 | 1.31 | 27.01 | 1.55 | 8.95 |
| Rep 2 | 1.69 | 67.63 | 1.25 | 27.48 | 1.41 | 7.2 |
| Rep 3 | 1.63 | 67.1 | 1.27 | 27.34 | 1.47 | 8.35 |
| Rep 4 | 1.77 | 67.59 | 1.55 | 26.89 | 1.51 | 7.98 |
| Bedoelen | 1.71 | 67.53 | 1.35 | 27.18 | 1.49 | 8.12 |
| SD | 0.06 | 0.94 | 0.14 | 0.28 | 0.06 | 0.73 |
| RSD, % | 3.7 | 1.39 | 10.33 | 1.02 | 4.02 | 9.02 |
| HorRat(r) | 0.99 | 0.66 | 2.71 | 0.42 | 1.07 | 3.09 |
Tabel 2. Precisie van de methode bij extractie en kwantificering van HA en HFA uit humusertsen. De extractiecondities waren 1 g monster in 1 L 0,1 M NaOH. (Gegevens afkomstig van Lamar et al., 2014)
| Nabootsen | Overspelige | HA, % | F.F., % | Relatieve terugwinning HA, % | Relatieve terugwinning HFA, % |
| 1 | Geen | 81.61 | 12.86 | ||
| 2 | Geen | 80.16 | 12.78 | ||
| 1 | Zeewier | 80.21 | 12.85 | ||
| 2 | Zeewier | 80.72 | 12.79 | 99.5 | 99.6 |
| 1 | Mest | 80.25 | 12.98 | ||
| 2 | Mest | 79.57 | 123.77 | 98.8 | 101.6 |
| 1 | Steenkool | 78.79 | 12.92 | ||
| 2 | Steenkool | 81.27 | 12.84 | 98.9 | 101.8 |
| 1 | Melasse | 79.38 | 12.99 | ||
| 2 | Melasse | 81.02 | 12.72 | 99.2 | 100.9 |
| Bedoelen | 80.3 | 12.85 | |||
| SD | 0.885 | 0.09 | |||
| een eindconcentratie van FA + HA van 2,5 g/l toegevoegd aan 0,1 M NaOH. (gegevens afkomstig van Lamar et al., 2015) | |||||
Tabel 3. Effect van overspeligen op kwantificering van HA en HFA van een Gascoyne leonardiet. (Gegevens afkomstig van Lamar et al., 2015)
| HA | |||
| Voorbeeld-ID | Geëxtraheerd, mg | Teruggewonnen, mg | Teruggewonnen, % |
| 1 | 24.6 | 23.7 | 96.3 |
| 2 | 22.6 | 19.9 | 88.1 |
| 3 | 25.2 | 23.6 | 93.7 |
| 4 | 22.5 | 21.5 | 95.6 |
| 5 | 23.9 | 21.8 | 91.2 |
| 6 | 23.2 | 20.8 | 89.7 |
| 7 | 24 | 23.2 | 96.7 |
| Bedoelen | 23.7 | 22.1 | 93 |
| SD | 1.01 | 1.52 | 3.43 |
| RSD, % | 4.35 | 6.88 | 3.67 |
| (gegevens afkomstig van Lamar et al., 2014) | |||
Tabel 4. Herstel van HA van spiked blanks. (Gegevens afkomstig van Lamar et al., 2014)
| FA | |||
| Voorbeeld-ID | Geëxtraheerd, mg | Teruggewonnen, mg | Teruggewonnen, % |
| 1 | 19.9 | 19 | 95.48 |
| 2 | 23.1 | 22.9 | 99.13 |
| 3 | 20.7 | 19.4 | 93.72 |
| 4 | 20.5 | 19.8 | 96.39 |
| 5 | 20.8 | 21.6 | 103.85 |
| 6 | 21.9 | 20.1 | 91.78 |
| 7 | 22.7 | 22.3 | 98.24 |
| Bedoelen | 21.37 | 20.73 | 96.94 |
| SD | 1.21 | 1.53 | 3.95 |
| RSD, % | 5.64 | 7.36 | 4.07 |
| (Gegevens afkomstig van Lamar et al., 2014) | |||
Tabel 5. Herstel van HFA van spiked blanks. (Gegevens afkomstig van Lamar et al., 2014)
Discussion
De eerste stappen van extractie en isolatie van de HA in deze methode zijn relatief eenvoudig. Omdat de isolatie van de HFA kolomchromatografie omvat, gaat het verkrijgen van herhaalbare resultaten gepaard met strikte naleving van de details van elke stap en oefening. Met name een juiste bereiding van de harsen is van primair belang. Het is uiterst belangrijk dat de polymethylmethacrylaat DAX-8 hars goed wordt bereid en verpakt. De juiste verpakking van de hars heeft invloed op zowel de opbrengst als de kwaliteit van de HFA. Als channeling bestaat, zal noch de voorbehandeling (d.w.z. verzuring) noch de adsorptie van HFA volledig zijn en zal de scheiding tot onnauwkeurige resultaten leiden. Als kanalen of ruimtes in de hars worden waargenomen voordat het monster wordt geladen, moet de kolom worden verwijderd en geschud om de harsparels opnieuw te verdelen, door ze zonder kanalen te laten bezinken, en vervolgens opnieuw worden verpakt door schone DI H2O door de hars te pompen. Bovendien, zoals vermeld in het protocol, zal het handhaven van een volume vloeistof boven de hars bij het laden van de FF op de hars, de FF in staat stellen om te mengen voordat de hars wordt binnengedrongen en resulteren in een effectievere adsorptie. Voor de sterke kation H+-uitwisselingshars (Table of Materials) kan volledige regeneratie niet worden overhaast. De Na+/H+ uitwisseling kost tijd en daarom kan dit het beste in een bulkbehandeling worden gedaan, zodat de hars kan worden gemengd terwijl deze opnieuw wordt aangezuurd. Het mengen van de hars tijdens het spoelen met DI H2O helpt de overtollige HCl te verwijderen. Bij het optrekken van de aangezuurde hars om overtollig zuur te verwijderen, helpt het mengen van de hars bij het verwijderen van de HCl. Het is uiterst belangrijk om het zuur te verwijderen tot het punt waar een elektrische geleidbaarheid van ≤ 0,7 μS / cm wordt bereikt. Zo niet, dan wordt de HCl overgedragen met de HFA.
Ten slotte, bij het desorberen van de HFA uit de DAX-8-hars, zodra de absorptie van het influent gelijk is aan de absorptie van het effluent, is het een goede gewoonte om de kolom een paar uur te laten zitten om te zien of er extra HFA vrijkomt. Als dat zo is, zal het worden gezien als een vergeling van de vloeistof boven de hars. Als dit gebeurt, kan de extra HFA worden verwijderd door voortdurende desorptie totdat de absorpties van influent/effluent weer gelijk zijn.
Een van de nadelen van de HFA-isolatie is dat het hele proces tijdrovend is. De volledige desorptie van HFA uit de DAX-8-hars en volledige verwijdering uit de H+-uitwisselingshars resulteren beide in een aanzienlijk volume HFA dat moet worden verminderd door roterende verdamping. Dit is zeker een knelpunt in de analyse. In een poging om deze tijd te verkorten, is voorgesteld om de HFA uit de DAX-8-hars te desorberen met aceton in plaats van 0,1 M NaOH14. De auteurs beweerden dat door 50% aceton als desorbent te gebruiken in plaats van NaOH, een vergelijkbaar HFA-resultaat werd verkregen en de DAX-8 voldoende werd geregenereerd en dus de H + -uitwisselingsstap kon worden geëlimineerd. Deze modificatie resulteerde in een sterk kortere analysetijd als gevolg van een verminderd geproduceerd volume en een snellere roterende verdamping van aceton in vergelijking met water. Deze wijziging deservers verder bestuderen.
Deze methode is beperkt tot de analyse van organisch materiaal dat het proces van humificatie heeft ondergaan, en voor het geval van turf en zachte steenkool, de verdere processen van turfvorming en zowel turfvorming als coalificatie, respectievelijk. Humificatie is het proces waarbij dood, voornamelijk plantaardig materiaal, wordt afgebroken door een opeenvolging van microben die steeds recalcitrantere substraten consumeren en modificeren. Abiotische processen nemen ook deel aan ontledings- en hersynthesereacties. Humificatie resulteert uiteindelijk in de productie van relatief recalcitrante materialen bestaande uit heterogene mengsels van duizenden moleculen die een reeks molecuulgewicht vormen en koolstof-, zuurstof- en waterstofgehalten die HS vormen. GS worden verder aangepast door turfvorming en coalificatie. Daarom is deze methode niet geschikt voor plantaardige materialen die zijn gemodificeerd door chemische processen. Lignosulfonaat wordt bijvoorbeeld veel gebruikt als een HFA-overspelig middel. Lignosulfonaat is een bijproduct van het sulfietpulpproces. Daarom is dit materiaal niet geproduceerd door het proces van humificatie. Daarnaast zijn er veel stoffen die binden aan de DAX-8 hars. DAX-8-hars is bijvoorbeeld gebruikt om pesticiden uit oplossing te adsorberen15. Het is duidelijk dat pesticiden geen HS zijn. Het binden van een materiaal aan DAX-8-hars rechtvaardigt dus niet de bewering dat het een HFA is. De vereisten zijn zowel productie door humificatie als binding aan DAX-8-hars.
Naarmate er meer wordt geleerd over de bijdrage van de verschillende componenten van GS in verschillende toepassingen, kan het voordelig worden om GS verder te fractioneren en zo de methode dienovereenkomstig aan te passen. Zoals die bestaat, kwantificeert de methode de HYFA niet. Deze fractie kan echter ook actief zijn, bijvoorbeeld in de biostimulatie van planten, waarbij de hele FF over het algemeen wordt toegepast in landbouwbehandelingen in plaats van gezuiverde HFA.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Acknowledgments
De auteurs willen graag de Humic Products Trade Association (HPTA) bedanken voor hun steun bij het financieren van het werk dat resulteerde in de standaardisatie van de methoden die in dit artikel worden beschreven en ook Lawrence Mayhew en Drs. Dan Olk en Paul Bloom voor technische ondersteuning tijdens het standaardisatiewerk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amberlite IR 120 H+-exchange resin | Sigma-Aldrich | 10322 | H+ form |
| Analytical Balance | Ohaus | PA214 | w/ glass draft shield |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-14 | minimum 4300 rpm |
| Centrifuge tubes | Beckman Coulter | To fit rotor selected | |
| Ceramic Combustion Crucibles | Sigma | Z247103 | |
| Chromatography column for DAX-8 | Diba | Omnifit 006EZ-50-25-FF | |
| Chromatography column for IR 120 | Chemglass | CG-1187-21 2 in. by 24 in. | |
| Dessicator | Capitol Scientic | Kimax 21200-250 | Vacuum type |
| Drying Oven | Fisher Scientific | Isotemp | Precision±3?C |
| Electrical conductivity meter | HM Digital | EC-3 | |
| Erlenmeyer Flasks | Amazon | 1L, 2L | |
| HCl concentrated | Sigma-Aldrich | 320331 | |
| Magnetic Stir Plate | Barnstead-Thermolyne | Dataplate 721 | |
| Magnetic Stir bars | These can be obtained at many outlets | ||
| Muffle Furnace | Fisher scientific | Thermolyne Type 47900 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 795429 | |
| Nitrogen gas | Praxair | UNI1066 | 99.99% purity |
| Peristaltic pump | Cole Parmer | Masterflex 7518-00 | |
| Perstaltic tubing | Cole Parmer | Masterflex Pharmed 06508-17 | |
| pH meter | Oakton Instruments | WD-35618--03 | |
| Rotary Evaporator | Buchi | R-210/R-215 | |
| Spectrophotometer | Healthcare SCiences | Ultrospec II | Dual beam 200 to 900 nm with wavelength accuracy of ±1 nm and reproducibility of ±0.5 nm. |
References
- DiDonato, N., Chen, H., Waggoner, D., Hatcher, P. G. Potential origin and formation for molecular components of humic acids in soils. Geochimica et Cosmochimica Acta. 178, 210-222 (2016).
- Waggoner, D. C., Chen, H., Willoughby, A. S., Hatcher, P. G. Formation of black carbon-like and alicyclic aliphatic compounds by hydroxyl radical initiated degradation of lignin. Organic Geochemistry. 82, 69-76 (2015).
- Baldock, J. A., Skjemstad, J. O. Role of the soil matrix and minerals in protecting natural organic materials against biological attack. Organic Geochemistry. 31 (7-8), 697-710 (2015).
- Kallenbach, C. M., Frey, S. D., Grandy, A. S. Direct evidence for microbial-derived soil organic matter formation and its ecophysiological controls. Nature Communications. 7, 13630 (2016).
- Schaeffer, A., Nannipieri, P., Kastner, M., Schmidt, B., Botterweck, J. From humic substances to soil organic matter-microbial contributions. In honour of Konrad Haider and James P. Martin for their outstanding research contributionns to soil science. Journal of Soils Sediments. 15 (9), 1865-1881 (2015).
- Stevenson, F. J. Humus Chemistry: Genesis, Composition, Reactions. 2e. , Wiley. (1994).
- Weber, J., Chen, Y., Jamroz, E., Miano, T.
- Schnitzer, M. Organic matter characterization. Methods of soil analysis, part 2: Chemical and microbiological properties. Page, A. L., Miller, R. H., Keeny, D. R. , American Society of Agronomy. Madison, Wisc. 581-594 (1982).
- Mehlich, A. Photometric determination of humic matter in soils: A proposed method. Communications in Soil Science and Plant Analysis. 15 (12), 1417-1422 (1984).
- Lamar, R. T., Talbot, K. H. Critical comparison of humid acid test methods. Communications in Soil Science and Plant Analysis. 50 (15-16), 2309-2322 (2009).
- Swift, R. S. Organic matter characterization. Methods of soil analysis, part 3: Chemical methods. Sparks, D. L. , Soil Science Society of America. Madison, WI. 1011-1069 (1996).
- Lamar, R. T., Olk, D. C., Mayhew, L., Bloom, P. R. A new standardized method for quantitation of humic and fulvic acids in humic ores and commercial products. Journal of the AOAC International. 97 (3), 722-731 (2014).
- International Organization of Standards. Fertilizers and soil conditioners-Determination of humic and hydrophobic fulvic acids concentrations in fertilizer materials. International Organization of Standards. , ISO/DIS 19822 (1982).
- Liam, L. E., Serben, T., Cano, M. Gravimetric quantification of hydrophobic filmic acids in lignite material using acetone. Journal of the AOAC International. 102 (6), 1901-1907 (2019).
- House, W. A., Zhmud, B. V., Orr, D. R., Lloyd, G. K., Irons, G. P. Transportation of pesticides by colloids. Final Report. Institute of Freshwater Ecology. National Environment Research Council. , IFE Report No. RL/T11059N1/6 (1998).
