Summary
Ici, nous présentons un protocole optimisé pour mesurer rapidement et semiquantitativement les interactions ligand-récepteur dans trans dans un système cellulaire heterologous utilisant la microscopie de fluorescence.
Abstract
Les interactions protéiques aux interfaces cellulaires dictent une multitude de résultats biologiques allant du développement tissulaire et de la progression du cancer à la formation et à l’entretien de la synapse. Bon nombre de ces interactions fondamentales se produisent en trans et sont généralement induites par des interactions hétérophiliques ou homophiliques entre les cellules exprimant des paires de liaisons ancrées dans la membrane. L’élucidation de la façon dont les mutations pertinentes à la maladie perturbent ces interactions protéiques fondamentales peut donner un aperçu d’une myriade de domaines de biologie cellulaire. De nombreux analyses d’interaction protéine-protéine ne se désambigulent généralement pas entre les interactions cis et trans, ce qui conduit potentiellement à une surestimation de l’étendue de la liaison qui se produit in vivo et impliquent la purification à forte intensité de main-d’œuvre des protéines et / ou de l’équipement de surveillance spécialisée. Ici, nous présentons un protocole simple optimisé qui permet l’observation et la quantification des interactions trans seulement sans avoir besoin de longues purifications de protéines ou d’équipements spécialisés. L’analyse d’agrégation cellulaire HEK implique le mélange de deux populations indépendantes de cellules HEK, chacune exprimant des ligands cognate liés à la membrane. Après une courte période d’incubation, les échantillons sont photographiés et les agrégats qui en résultent sont quantifiés.
Introduction
Les interactions synaptiques facilitées par les molécules d’adhérence synaptique sont fondamentales pour le développement, l’organisation, la spécification, la maintenance et la fonction des synapses et la génération de réseaux neuronaux. L’identification de ces molécules transsynaptiques d’adhérence de cellules augmente rapidement ; il est donc fondamentalement important d’identifier des partenaires contraignants et de comprendre comment ces nouvelles molécules d’adhérence interagissent les unes avec les autres. En outre, le séquençage du génome a identifié des mutations dans beaucoup de ces molécules d’adhérence qui sont généralement liées à une multitude de troubles neurodéveloppementaux, neuropsychiatriques et de toxicomanie1. Les mutations dans les gènes qui codent pour les molécules synaptiques d’adhérence cellulaire peuvent modifier négativement les interactions trans et peuvent contribuer à des altérations pathophysiologiques de la formation et ou de l’entretien de la synapse.
Il existe de multiples analyses pour évaluer quantitativement les interactions protéine-protéine telles que la calorimétrie isotherme, le dichroism circulaire, la résonance plasmonique de surface2 et bien que quantitatives, elles ont plusieurs limites. Tout d’abord, ils nécessitent des protéines recombinantes, exigeant parfois des étapes de purification longues et fastidieuses. Deuxièmement, ils nécessitent un équipement spécialisé sophistiqué et une expertise technique. Troisièmement, ils peuvent surestimer l’étendue de la liaison car ils permettent à la fois cis et interactions trans entre les protéines qui sont naturellement attachés à une membrane in vivo. Ici, nous proposons un test simple et relativement rapide qui teste exclusivement les interactions trans.
Pour contourner bon nombre des complications associées aux analyses de protéines purifiées, nous avons optimisé un test d’interaction protéique à base de cellules qui récapitule les interactions trans dans un système cellulaire héterologique réduit. Cet essai a été précédemment utilisé sous diverses formes pour étudier les interactions transcellulaires. Dans cette approche, les molécules d’adhérence des cellules candidats sont transfectées en cellules HEK293T. Dans des conditions physiologiques, les cellules HEK293T ne présentent pas d’auto-agrégation, ce qui en fait des modèles exemplaires pour cet essai. Cependant, lorsque des populations individuelles de cellules HEK exprimant des récepteurs et des ligands sont combinées, la liaison du récepteur et la ligand force l’agrégation des cellules HEK à se produire. Cette agrégation est médiée exclusivement par des interactions trans et est généralement observable en dizaines de minutes. Aucune étape de purification des protéines n’est requise dans cette méthode, et l’efficacité de la méthode repose sur le paradigme selon laquelle les populations de cellules HEK exprimant des molécules d’adhérence cognate sont combinées, puis photographiées seulement des dizaines de minutes plus tard. En outre, cette méthode est relativement peu coûteuse, car ni anticorps ni équipement coûteux ne sont nécessaires. Le seul équipement nécessaire à l’acquisition de données est un microscope fluorescent standard. Un avantage supplémentaire à cet essai basé sur la cellule est la capacité de dépister rapidement l’effet des mutations de point pertinentes de la maladie sur les interactions trans. Ceci peut être exécuté en transfectant des cellules de HEK avec des CDNAs des variantes mutantes de la protéine d’intérêt.
Dans ce protocole, nous présentons un exemple dans lequel nous étudions si une mutation de missense dans Neurexin3α (Neurexin3αA687T),identifiée dans un patient diagnostiqué avec la déficience intellectuelle profonde et l’épilepsie, modifie des interactions dans trans avec la protéine transmembrane répétée riche en leucine 2 (LRRTM2). Neurexin3α est un membre de la famille evolutionarily conservé des molécules présynaptiques d’adhérence cellulaire et tandis que les travaux récents ont identifié de multiples rôles à la synapse3,4,5,6,7, notre compréhension synaptique de cette molécule et tous les membres de la famille neurexin reste incomplète. LRRTM2 est une protéine excitatrice d’adhérence cellulaire postsynaptique qui participe à la formation et à l’entretien de la synapse8,9,10. Fait important, LRRTM2 interagit exclusivement avec les isoformes de neurexine qui n’ont pas le site d’épissage 4 exon alternatif (SS4-) mais pas avec les isoformes de neurexin contenant le site d’épissage 4 exon alternatif (SS4+). La mutation de missense humaine (A687T) identifiée dans Neurexin3α est située dans une région extracellulaire non étudiée qui est evolutionarily conservée et est conservée entre tous les alpha neurexins7. Comme l’interaction entre ces deux molécules a étéétablie 8,9,11, nous avons posé la question: est la capacité contraignante de Neurexin3α SS4- à LRRTM2 modifié par une mutation point A687T? Cet essai a indiqué que la mutation de point d’A687T a augmenté de façon inattendue l’agrégation de Neurexin3α à LRRTM2 suggérant que la région extracellulaire dans laquelle la mutation ponctuelle est située, joue un rôle dans la médiation des interactions transsynaptiques.
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Protocol
1. Culture cellulaire et transfection
- Faire des médias cellulaires HEK avec DMEM, 1x (Modification de Dulbecco de Eagle’s Medium) complété par 4,5 g/L de glucose, L-glutamine & pyruvate de sodium et 10% FBS. Filtre stérile.
- Prédéterminer les ligands et les récepteurs appropriés pour l’analyse d’agrégation.
REMARQUE : Neurexin3α SS4+/- et l’un de ses ligands connus, LRRTM2, ont été utilisés dans cette étude. Ligands et récepteurs d’intérêt ont été exprimés des CDNA dans pcDNA3.1. Un assemblage Gibson a été utilisé pour insérer Neurexin3α dans pcDNA3.112. Neurexin3α F/R: TTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCGCGCCCCCCATGAGCTTTACCCCACTC/
GAGCGGCCGCCACTGTGCTGGATATCTGCAGAATTCTTACACATAATACTCCTTGTCCTT. - Préparer les cellules HEK293T.
- Faire pousser les cellules HEK293T à la confluence dans un flacon T-75.
- Une fois confluent, utiliser 2 mL de trypsine et placer dans un incubateur de 37 °C pendant 2 min. Ajouter 6 mL de médias HEK au flacon pour résusquer les cellules et transférer les 8 mL dans un tube conique de 15 mL.
- Granulé à 500 x g pendant 5 min et résuspendez dans les médias cellulaires HEK pour un total de 8 mL.
- Comptez les cellules et ajoutez 735 000 cellules dans chaque puits d’une plaque de 6 puits. Réglez le volume final à 2 mL pour chaque puits à l’aide de supports cellulaires HEK.
- Placer dans un incubateur à 37 °C et permettre aux cellules de croître pendant la nuit ou jusqu’à ce qu’elles atteignent une confluence de 50 à 60 %.
- Cellules transfect HEK293T utilisant la méthode de phosphate de calcium13.
- Transfect bien-1 avec 3 μg de la protéine d’intérêt et co-transfect avec 1 μg de protéine fluorescente (3 μg de pcDNA3.1-Neurexin3αWT SS4- et 1 μg de mCherry).
- Transfect bien-2 comme dans l’étape 1.4.1. mais avec la protéine mutée d’intérêt (pcDNA3.1-Neurexin3αA687T SS4-).
- Transfect bien-3 avec 3 μg du ligand d’intérêt et co-transfect avec 1 μg d’une autre protéine fluorescente (3 μg de pcDNA3.1 LRRTM2 et 1 μg de GFP).
- Transfect bien-4 et bien-5 pour servir de contrôles négatifs: bien-4 avec 1 μg de GFP et bien-5 avec 1 μg de mCherry.
- Préparer une autre plaque (comme à l’étape 1.4.1-1.4.4) si vous avez besoin de conditions ou de commandes supplémentaires (Neurexin3αWT/A687T SS4+).
REMARQUE : L’efficacité de transfection est analysée 24 h après transfection sous un microscope d’épifluorescence et quantifiée comme nombre de cellules exprimant la protéine fluorescente avec laquelle elles ont été transfectées. Une approche plus rationalisée comprendrait la transfection des cellules HEK avec un codage vectoriel bicisronique pour une protéine fluorescente et le ligand d’intérêt et est fortement recommandé au-dessus de la co-transfection. Dans le cas de cette étude, les néurexines alpha sont ~4.3 kb et l’intensité de fluorescence basse a été observée utilisant un système bicistronic nécessitant la co-transfection.
- 48 heures après la transfection, récolter les cellules pour l’agrégation.
- Lavez-les deux fois avec du PBS.
- Ajouter 1 mL de 10 mM d’EDTA dans chaque puits pour dissocier délicatement les interactions cellule à cellule et incuber la plaque à 37 °C pendant 5 min.
REMARQUE : La trypsine n’est pas recommandée pour l’étape 1.5.2 en raison du clivage protéolytique potentiel des molécules d’adhérence dans l’étude. En outre, après l’ajout EDTA le protocole ne peut pas être arrêté jusqu’à ce que l’achèvement que les cellules seront maintenant exposés à des conditions ambiantes. - Appuyez doucement sur la plaque pour détacher les cellules et récoltez chacune bien dans des tubes coniques séparés de 15 mL.
- Tubes coniques centrifugeuses à 500 x g et température ambiante pendant 5 min.
- Pendant que les cellules sont granulées, préparez 6 tubes d’incubation en étiquetant le dessus de chaque tube de microcentrifugeuse à chaque condition.
REMARQUE : Chaque permutation des conditions GFP et mCherry doit être utilisée pour englober toutes les conditions expérimentales et les contrôles appropriés. Par exemple: 1. GFP/mCherry, 2. mCherry/LRRTM2-GFP 3. GFP/Neurexin3αWT SS4-—mCherry, 4. GFP/Neurexin3αA687T SS4- -mCherry, 5. Neurexin3αWT SS4-—mCherry/LRRTM2—GFP, 6. Neurexin3αA687T SS4- -mCherry/LRRTM2—GFP. Fabriquer des tubes supplémentaires pour répondre à d’autres conditions et contrôles. - Retirer les cellules supernatantes et résuspendantes dans 500 μL de supports HEK avec 10 mM CaCl2 et 10 mM MgCl2 réchauffés à 37 °C.
REMARQUE : L’ajout de CaCl2 et de MgCl2 permet aux molécules d’adhérence de rétablir la liaison et n’est nécessaire que si les partenaires d’interaction transcellulaire en question nécessitent des cations divalentes pour l’adhérence. - Comptez les cellules dans chaque tube conique de 15 mL à l’aide d’un hémocytomètre et aliquot 200.000 cellules de chaque condition dans le tube approprié de l’étape 1.6.1 pour un mélange 1:1 dans un volume total de 500 μL.
REMARQUE: Il ne devrait prendre que 5 min par condition pour compter et aliquot quantités. - Incuber les tubes à température ambiante dans un rotateur à tube lent.
2. Acquisition d’images
- Optimisez les paramètres d’acquisition du microscope pour des échantillons spécifiques. Dans cet exemple, des images ont été prises sur un microscope à champ large. Utilisez un objectif 5x air (NA: 0.15; DEO: 20000 μm) pour obtenir un champ assez grand pour l’analyse.
- Évaluer l’agrégation de base immédiatement après le mélange des deux conditions des cellules HEK à l’étape 1.8. Ce sont maintenant les images « temps zéro ».
- Pipette 40 μL de chaque mélange d’échantillon sur une lame de microscope chargée et l’image sous fluorescence dans les canaux 488 et 561.
- Acquérir trois champs de vision différents à un seul plan de mise au point par goutte d’échantillon.
- Obtenez des images finales à 60 min sous forme d’image 'time 60'.
- Pour obtenir l’image « temps 60 » du mélange après une incubation de 60 min, prenez un autre échantillon de 40 μL de chaque condition à partir de tubes rotatifs et pipette chaque échantillon sur une diapositive chargée. Image comme dans l’étape 2.2.2.
REMARQUE : L’agrégation cellulaire doit être vérifiée toutes les 15 minutes jusqu’à ce que la saturation se produise. Le moment de l’agrégation dépendra des protéines testées.
- Pour obtenir l’image « temps 60 » du mélange après une incubation de 60 min, prenez un autre échantillon de 40 μL de chaque condition à partir de tubes rotatifs et pipette chaque échantillon sur une diapositive chargée. Image comme dans l’étape 2.2.2.
3. Analyse ImageJ/Fidji
- Pour quantifier l’étendue de l’agrégation à l’aide de Fiji/ImageJ, enregistrez les fichiers d’analyse.
- Enregistrez les fichiers de codage supplémentaires fournis dans le dossier macros imageJ sur l’ordinateur.
- Installez la macro agrégation fournie (Plugins, Macros, Installer et sélectionnez le fichier « AgrégationAssay.txt »).
- Déterminez les seuils.
- Chargez un fichier « time zero » .tif en imageJ et divisez les canaux(Image | Couleur | Canaux fractionnements).
REMARQUE : L’image « temps zéro » est utilisée pour déterminer le seuil et la plus petite taille de ponction pour l’ensemble de l’expérience. - Masquer chaque canal(Plugins | Macros | AggregationAssay_MakeMask). Faire masque de fenêtre d’image apparaîtra. Cochez les cases à côté de Déterminer le seuil d’image et déterminez les params de cluster à partir de l’histogramme et cliquez sur OK.
- Déterminez le seuil de l’image à l’aide de la barre de diapositives, enregistrez le numéro à droite de la barre de diapositives et cliquez sur OK.
- Un histogramme de taille de cluster apparaîtra. Sélectionnez une taille de cluster à partir de l’histogramme qui convient à l’expérience, tapez ce nombre dans la taille min cluster: boîte, et cliquez sur OK. Les grappes inférieures à cette taille ne seront pas analysées.
- Chargez un fichier « time zero » .tif en imageJ et divisez les canaux(Image | Couleur | Canaux fractionnements).
- Exécutez l’analyse.
- Ouvrez l’image « temps 60 » de l’état 1 dans l’imageJ et divisez les canaux comme à l’étape 3.2.1.
- Masquez chaque canal (Plugins, Macros, AggregationAssay_MakeMask). Utilisez le même seuil et la même taille déterminés à l’étape 3.2.3 et à l’étape 3.2.4. Désélectionner les cases à côté de déterminer le seuil d’image et déterminer les params de cluster à partir de l’histogramme et taper manuellement la taille et les seuils dans les champs appropriés, puis cliquez sur OK.
- Calculer l’indice d’agrégation(Plugins | Macros | AggregationAssay_CalculateOverlap). Sélectionnez les canaux masqués à comparer et l’annuaire dans lequel les fichiers résultants enregistreront.
- Répétez les étapes 3.3.1-3.3.3 pour chaque image 'time 60' dans toutes les conditions.
REMARQUE : L’indice d’agrégation est défini comme la zone de chevauchement totale divisée par la somme des deux zones de canal moins la zone de chevauchement multipliée par 100 (indice d’agrégation = zone de chevauchement/[zone du canal 1 + zone du canal 2 – zone de chevauchement] x 100). Cette normalisation est une opération « OR » entre les deux canaux masqués représentant le total des pixels dans l’un ou l’autre masque.
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Representative Results
La mutation A687T augmente Neurexin3α SS4- liaison à LRRTM27
Pour étudier comment les interactions intercellulaires de deux protéines synaptiques connues sont affectées par l’introduction d’une mutation ponctuelle trouvée chez un patient souffrant de déficience intellectuelle et d’épilepsie, nous avons utilisé l’analyse d’agrégation cellulaire HEK ci-dessus (figure 1). Les cellules ont été transfectées selon l’article 1 et préparées pour l’imagerie selon les sections 1 et 2 du protocole. Les cellules ont été photographiées à la ligne de base où aucune agrégation n’a été observée comme prévu (non indiqué). Les images acquises à 60 minutes ont été analysées comme dans la section 3 du protocole. Pour minimiser le biais de sélection, les conditions ont été randomisées pour aveugler l’expérimentateur. Pour des raisons similaires, l’ensemble du champ de vision de chaque image a été sélectionné comme un retour sur investissement.
Les conditions dans lesquelles les cellules n’exprimaient aucun ligand synaptique (GFP/mCherry) ont montré une agrégation minimale après une incubation de 60 minutes (figure 2). De même, les conditions dans lesquelles une seule des deux populations de cellules exprimaient des ligands synaptiques (mCherry/LRRTM2-GFP ou GFP/Neurexin3αWT/A687T SS4- —mCherry) présentaient une agrégation minimale après une incubation de 60 minutes (figure 2). Comme prévu, les conditions qui contenaient deux populations de cellules avec des molécules d’adhérence incompatibles (Neurexin3αWT/A687T SS4+—mCherry/LRRTM2-GFP) n’ont montré aucune agrégation à 60 minutes(figure 2B). Ces conditions ont servi de contrôles négatifs critiques car LRRTM2 est connu pour se lier exclusivement à SS4 manque d’isoformes (SS4-) de Neurexins et met en évidence la spécificité de cet essai d’agrégation.
Les conditions avec des molécules d’adhérence compatibles8,9,10 (Neurexin3αWT SS4- —mCherry/LRRTM2-GFP) ont montré une agrégation significative après une incubation de 60 min ( figure2C). L’agrégation peut être visualisée comme jaune et est présente dans le chevauchement entre les cellules (figure 1 et figure 2). Étonnamment, l’état dans lequel Neurexin3α A687T SS4- a été co-incubé avec LRRTM2 (Neurexin3αA687T SS4- —mCherry/LRRTM2-GFP) présentait beaucoup plus d’agrégation par rapport à son homologue sauvage (Neurexin3αWTS4- —mCherry/LRRTM2-GFP; contrôle positif). Ceci suggère que la mutation de point d’A687T dans Neurexin3α améliore les capacités de liaison de Neurexin3α SS4- à LRRTM2.
Figure 1. Workflow de l’analyse d’agrégation. (A) Les cellules HEK293T sont transfectées à l’aide d’une protéine-1/mCherry, ou d’une protéine-2/GFP. (B) L’expression de Neurexin3α prend 48 h. (C) Les cellules sont récoltées à l’aide de 10 mM EDTA, puis granulés (D). (E) Les cellules sont mélangées dans un rapport de 1:1 et résuspendus dans 500 μL de médias HEK contenant 10 mM CaCl2 et MgCl2. (F) Les cellules sont incubées à température ambiante jusqu’à ce que l’agrégation se produise et qu’une image finale soit acquise au moment 60. L’agrégation est visualisée comme le nombre de ponctions jaunes visibles dans le champ de vision. Aucune agrégation n’est observée lorsque les cellules n’expriment pas les paires de ligands récepteurs correctes et sont donc considérées comme des ponctions rouges ou vertes individuelles. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2. Neurexin3αA687T SS4- a amélioré l’agrégation avec le ligand excitateur LRRTM2 comparé à Neurexin3αWT SS4-. (A) Images représentatives de contrôles négatifs après une incubation de 60 min de mCherry avec GFP, mCherry avec LRRTM2, GFP avec Neurexin3αWT SS4+/-, et GFP avec Neurexin3αA687T SS4+/-. L’agrégation a été observée après 60 minutes dans LRRTM2 avec Neurexin3αWT SS4-, et LRRTM2 avec Neurexin3αA687T SS4-. (B) Quantification de l’indice d’agrégation dans toutes les conditions SS4+ après 60 minutes. Indice d’agrégation = zone de chevauchement/(zone du canal 1 + zone du canal 2 – zone de chevauchement) x 100. (C) Même que (B) mais SS4-. Les données présentées représentent la moyenne ± SEM du nombre d’expériences (SEM : GFP/mCherry ± 0,0245, mCherry/LRRTM2 ± 0,02465, GFP/Neurexin3αWT SS4- ± 0,02453, GFP/Neurexin3αA687T SS4- ± 0,0109, Neurexin3αWT SS4-/LRRTM2 ± 0,0538, Neurexin3αA687T SS4-/LRRTM2 ± 0,0174; p= 0,0136). Les nombres présentés dans les barres représentent le nombre d’expériences indépendantes menées. Les lignes pointillées représentent l’agrégation minimale de base ou moyenne des conditions de contrôle. La signification statistique a été déterminée par ANOVA à sens unique, comparaisons multiples ; *p<0.05; p<0.0001.Ce chiffre a été modifié de Restrepo et coll.7. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Fichiers de codage supplémentaires. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ces fichiers.
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Discussion
Disséquer les interactions protéine-protéine qui se produisent en trans pendant l’adhérence cellulaire peut conduire à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents aux processus cellulaires de base, y compris la formation, la fonction et le maintien des synapses pendant la maturation et le remodelage. Les implications des interactions cellule à cellule s’élargissent au-delà de la neurobiologie et jouent un rôle plus large dans la transduction du signal, la migration cellulaire et le développementtissulaire 14. Les aberrations dans l’adhérence cellulaire peuvent perturber les processus cellulaires impératifs pour la fonction cellulaire appropriée et peuvent sous-être une variété d’étiologies telles que le cancer, l’arthrite, la dépendance, l’autisme et laschizophrénie 1,15,16. Ici, nous fournissons un protocole détaillé optimisé impliquant l’agrégation cellulaire HEK qui permet de tester les interactions cellule-adhérence en trans.
Avec ce protocole d’agrégation cellulaire HEK, nous pouvons disséquer les différences d’agrégation à la capacité de liaison approximative entre une protéine présynaptique et son ligand postsynaptique. En tant que tel, nous pouvons poser des questions telles que: est l’interaction entre deux protéines synaptiques essentielles affectées par une mutation ponctuelle? Plus précisément, l’interaction trans de Neurexin3α avec LRRTM2 est-elle affectée par l’A687T ? La mutation de missense D’A687T étudiée ici est située dans une région précédemment non étudiée de linker du domaine extracellulaire de Neurexin3α7. Les résultats illustrent que la mutation A687T améliore l’agrégation des cellules contenant Neurexin3αA687T aux cellules contenant LRRTM2 (Figure 2C). Cette constatation est significative parce qu’il a été précédemment démontré que les LRRTMs ne se lient qu’aux Neurexins via un domaine Neurexin appelé LNS617, et suggère en outre que les séquences en amont de LNS6 peuvent exercer un effet indépendant sur les interactions trans entre Neurexin3α SS4- et LRRTM27.
Les résultats de la figure 2 montrent la spécificité de cet essai comme tous les contrôles négatifs (GFP/mCherry; Neurexin3αWT/A687T SS4- —mCherry/GFP ou LRRTM-GFP/mCherry) n’a eu aucune agrégation observable après 60 minutes. Un contrôle critique utilisé dans cette étude, Neurexin3αWT/A687T SS4+ —mCherry/LRRTM-GFP, n’a également montré aucune agrégation après 60 min parce que LRRTM2 est connu pour se lier exclusivement aux isoformes manquants de SS4 (SS4-) de Neurexin. Ce contrôle démontre que la simple surexpression des molécules membranaires est insuffisante pour forcer l’agrégation dans ce système, ce qui illustre encore la spécificité de cet essai.
L’analyse d’adhérence cellulaire décrite ici a été largement utilisée pour tester les interactions des molécules transsynaptiques d’adhérencecellulaire 8,18,19; cependant, il peut être utilisé pour tester les interactions adhésives cellule à cellule des protéines attachés à la membrane. Ce protocole, qui a évolué au fil du temps, a été optimisé à partir du protocole publié original et des variations ultérieures du protocole en changeant trois paramètres expérimentaux. Un, la température d’incubation des cellules a été changée. Le protocole original prévoit l’incubation des cellules à l’étape 1.9 à 4 °C. Cette basse température peut agir comme un facteur de stress environnemental et peut diminuer la viabilité cellulaire conduisant à la mort cellulaire et la lyse. Pendant la lyse cellulaire, les cellules sécrètent de l’ADN génomique et des débris cellulaires dans les médias qui provoquent l’agglutiné des cellules dans la solution conduisant à de faux positifs pendant l’imagerie. Deuxièmement, le nombre de cellules par condition a été porté à 200 000 par population et la taille objective a été changée en 5 x; cela permet au chercheur d’imager un plus grand nombre d’interactions par champ de vision afin d’augmenter la puissance statistique dans chaque n. Troisièmement, l’indice d’agrégation a été mesuré différemment. Les indices d’agrégation antérieurs ont été limités par la sélection de la taille du cluster par l’expérimentateur conduisant à l’exclusion des clusters « subthreshold ». En revanche, les seuils sont maintenant fixés pour la taille des cellules individuelles au « temps zéro », et l’agrégation est maintenant calculée comme la zone qui se chevauche divisée par la somme des deux zones de canal moins la zone de chevauchement multipliée par 100 à « temps 60 » qui permet l’inclusion de plus petits groupes positifs rendant l’essai plus sensible à d’autres paires protéine-ligand(figure 2B,C).
Le dépannage et l’optimisation peuvent être nécessaires en fonction des protéines en interaction testées. Bien que la période d’incubation jusqu’à l’acquisition finale de l’image varie selon les protéines testées, il est essentiel qu’aucune agrégation ne soit observée au « moment zéro ». Si l’agrégation est vue à l’heure zéro, cela peut impliquer que les cellules n’étaient pas saines au début. Cela peut être dû à plusieurs facteurs, y compris l’exposition soudaine à des températures inférieures à 37 °C ou la procédure expérimentale lente. Fait important, le supports de resuspension de l’étape 1.7 devrait être à 37 °C, ce qui permettra aux cellules d’atteindre progressivement la température ambiante sans une chute soudaine et dure de la température. Une façon d’avoir une santé cellulaire optimale tout au long de l’expérience est de s’assurer que les étapes 1.7 à 1.9 sont terminées dans un délai de 25 minutes sans pauses entre les deux. Il est recommandé que le microscope soit configuré et prêt à l’emploi avant la récolte cellulaire des cellules à l’étape 1.5; cela garantit qu’une véritable image « temps zéro » peut être prise immédiatement à l’étape 2.2.
Si l’agrégation n’est pas observée après 60 minutes d’incubation, plusieurs facteurs peuvent contribuer à ce manque d’adhérence. Premièrement, les protéines en question peuvent ne pas être des partenaires contraignants ou s’engager dans des interactions de faible affinité non détectables par cet essai. Dans ce cas, un test plus sensible peut être nécessaire. Deuxièmement, les protéines d’intérêt peuvent ne pas se localisér à la membrane lorsqu’elles sont exprimées seules dans les cellules HEK. Dans ce cas, confirmez que la protéine est localisée par membrane en utilisant des techniques biochimiques (biotinylation de surface) ou identifiez directement la protéine d’intérêt avec une étiquette fluorescente et des cellules HEK293T d’image à 40x ou grossissement plus élevé pour évaluer l’expression de surface. Cependant, après que la localisation de membrane soit confirmée, nous recommandons d’utiliser des variantes non étiquetées pour cet essai d’agrégation cellulaire HEK afin d’évaluer plus précisément la capacité de liaison de la protéine indigène. Troisièmement, dans ce protocole, nous avons permis à Neurexin3α de s’exprimer pendant 48 h; cependant, le temps d’expression des protéines peut varier en fonction des protéines testées. Quatrièmement, il est essentiel de compléter les médias à l’étape 1.7 avec MgCl2 et CaCl2 si les protéines en question dépendent de cations divalent comme c’est le cas avec l’exemple de Neurexins et LRRTM211. Si l’on ne sait pas si les partenaires d’interaction ont besoin de cations divalent pour l’adhérence, ajouter EDTA dans une condition. L’EDTA doit chélate remining cations naturellement présents dans DMEM assurant une solution sans calcium et magnésium. Si l’adhérence est observée après l’ajout d’EDTA, les protéines en question ne nécessitent pas de cations divalent pour l’adhérence.
De nombreuses méthodes existent pour tester les interactions protéiques; cependant, la plupart ne sont pas spécifiques pour tester uniquement les interactions trans qui se produisent d’une cellule à l’autre et nécessitent des étapes fastidieuses de purification des protéines. Bien que l’analyse d’agrégation cellulaire HEK ne soit pas une mesure directe de l’affinité et ne devrait pas être utilisée pour remplacer une approche plus quantitative pour récupérer les constantes de dissociation, au meilleur de notre connaissance, cet essai représente une approche pour tester les interactions trans réelles d’une manière semi-quantitative et relativement efficace. En outre, en raison de la facilité relative de cet essai, l’analyse d’agrégation cellulaire HEK peut être utilisée conjointement avec ces approches plus quantitatives pour obtenir une caractérisation plus large et plus complète des interactions en cours.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ces travaux ont été soutenus par des subventions du National Institute of Mental Health (R00MH103531 et R01MH116901 à J.A.), une subvention de formation prédoctorale du National Institute of General Medicine (T32GM007635 à S.R.), et une bourse Lyda Hill Gilliam pour l’étude avancée (GT11021 à S.R.). Nous remercions le Dr Kevin Woolfrey pour son aide au microscope, le Dr K Ulrich Bayer pour l’utilisation de son microscope épifluorescent et Thomas Südhof (Stanford University) pour le plasmide LRRTM2.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL disposable microtubes with snap caps | VWR | 89000-028 | Incubation of mixed population of HEK cells |
| 1000 mL Rapid—Flow Filter Unit, 0.2 um aPES membrane | Thermo Fisher | 567-0020 | Sterilization of HEK media |
| 15 mL SpectraTube centrifuge tubes | Ward’s Science | 470224-998 | Harvesting HEK cells |
| 6 well sterile tissue culture plates | VWR | 100062-892 | culturing HEK cells |
| Calcium Chloride | Sigma | 223506-500G | Calcium phosphate transfection, HEK cell resuspension |
| Centrifuge- Sorvall Legend RT | Kendro Laboratory Products | 75004377 | Harvesting HEK cells |
| CO2 cell incubator | Thermo Scientific | HERACELL 150i | Incubation of HEK cells during growth |
| DMEM, 1x (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate | Corning | 10-013-CV | HEK cell maintenance |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline PBS (1X) | Gibco | 14190-144 | Passaging/harvesting HEK cell |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | ED-500G | Harvesting HEK cells |
| Falcon Vented culture flasks, 75cm2 growth area | Corning | 9381M26 | Culturing HEK cells |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | 17L184 | HEK cell maintenance |
| HEK293T cells | ATCC | Model system | |
| ImageJ | NIH | V: 2.0.0-rc-69/1.52p | Image analysis |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma | M9272-500G | HEK cell resuspension |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Fisher BioReagents | BP332-500 | Calcium phosphate transfection |
| Trypsin 0.25% (1X) Solution | GE Healthcare Life Sciences | SH30042.01 | Passaging HEK cells |
| Tube rotator | Incubation of mixed population of HEK cells | ||
| UltraClear Microscope slides. White Frosted, Positive Charged | Denville Scientific Inc. | M1021 | Image acquisition |
| Wide-field microscope | Zeiss | Axio Vert 200M | Image acquisition |
References
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