Summary
Her presenterer vi en optimalisert protokoll for raskt og semiquantitativt måle ligand-reseptor interaksjoner i trans i et heterologisk cellesystem ved hjelp av fluorescens mikroskopi.
Abstract
Proteininteraksjoner ved cellulære grensesnitt dikterer en rekke biologiske resultater som spenner fra vevsutvikling og kreftprogresjon til synapsedannelse og vedlikehold. Mange av disse grunnleggende interaksjonene forekommer i trans og induseres vanligvis av heterofile eller homofile interaksjoner mellom celler som uttrykker membran forankrede bindingspar. Belyse hvordan sykdomsrelevante mutasjoner forstyrrer disse grunnleggende proteininteraksjonene, kan gi innsikt i et mylder av cellebiologifelt. Mange protein-protein interaksjonsanalyser ikke vanligvis disambiguate mellom cis og trans interaksjoner, noe som potensielt fører til en overestimering av omfanget av binding som forekommer in vivo og involverer arbeidsintensiv rensing av protein og / eller spesialisert overvåkingsutstyr. Her presenterer vi en optimalisert enkel protokoll som muliggjør observasjon og kvantifisering av bare transinteraksjoner uten behov for lange proteinrensinger eller spesialisert utstyr. HEK-celleaggregasjonsanalysen innebærer blanding av to uavhengige populasjoner av HEK-celler, som hver uttrykker membranbundne kognatligander. Etter en kort inkubasjonsperiode blir prøvene avbildet og de resulterende aggregatene kvantifiseres.
Introduction
Synaptiske interaksjoner tilrettelagt av synaptiske vedheftmolekyler er grunnleggende for utvikling, organisasjon, spesifikasjon, vedlikehold og funksjon av synapser og generering av nevrale nettverk. Identifiseringen av disse transsynaptiske celleadhesjonsmolekylene øker raskt; Dermed er det fundamentalt viktig å identifisere bindende partnere og forstå hvordan disse nye vedheftmolekylene samhandler med hverandre. I tillegg har genomsekvensering identifisert mutasjoner i mange av disse vedheftmolekylene som vanligvis er knyttet til en rekke nevroutviklings-, nevropsykiatriske og avhengighetsforstyrrelser1. Mutasjoner i gener som kode for synaptiske celle-vedheftmolekyler kan endre transinteraksjoner negativt og kan bidra til patofysilogiske endringer i synapsedannelse og eller vedlikehold.
Flere analyser eksisterer for å kvantitativt vurdere protein-protein interaksjoner som isotermisk kalorimetri, sirkulær diktoisme, overflateplasmon resonans2 og selv om kvantitative i naturen, de har flere begrensninger. Først krever de rekombinant protein, noen ganger krevende lange og kjedelige rensetrinn. For det andre krever de sofistikert spesialisert utstyr og teknisk ekspertise. For det tredje kan de overvurdere omfanget av binding, da de tillater både cis og transinteraksjoner mellom proteiner som er naturlig bundet til en membran in vivo. Her foreslår vi en enkel og relativt rask analyse som utelukkende tester transinteraksjoner.
For å omgå mange av komplikasjonene forbundet med rensede proteinanalyser, har vi optimalisert en cellebasert proteininteraksjonsanalyse som rekafulerer transinteraksjoner i et redusert heterologcellesystem. Denne analysen har tidligere blitt brukt i ulike former for å studere transcellulære interaksjoner. I denne tilnærmingen blir kandidatcelleadhesjonsmolekyler transfisert til HEK293T-celler. Ved fysiologiske forhold viser HEK293T-celler ikke selvaggregering, noe som gjør dem eksemplariske modeller for denne analysen. Men når individuelle populasjoner av HEK-celler som uttrykker reseptor og ligand kombineres, binder reseptoren og ligand aggregering av HEK-celler til å forekomme. Denne aggregeringen medieres utelukkende av transinteraksjoner og kan vanligvis observeres om titalls minutter. Ingen proteinrensingstrinn er nødvendig i denne metoden, og effektiviteten av metoden er avhengig av paradigmet om at populasjoner av HEK-celler som uttrykker cognate adhesjonsmolekyler blir kombinert og deretter avbildet bare titalls minutter senere. I tillegg er denne metoden relativt billig, da verken antistoffer eller kostbart utstyr er nødvendig. Det eneste utstyret som kreves for innhenting av data er et standard fluorescerende mikroskop. En ekstra fordel med denne cellebaserte analysen er evnen til raskt å screene effekten av sykdomsrelevante punktmutasjoner på transinteraksjoner. Dette kan utføres ved å transfecting HEK celler med cDNAs av mutant varianter av protein av interesse.
I denne protokollen presenterer vi et eksempel der vi undersøker om en missense mutasjon i Neurexin3α (Neurexin3αA687T), identifisert hos en pasient diagnostisert med dyp utviklingshemming og epilepsi, endrer interaksjoner i trans med leucinrikt gjentatt transmembraneprotein 2 (LRRTM2). Neurexin3α er medlem av den evolusjonære bevarte familien av presynaptiske celle-adhesjonmolekyler, og mens nylig arbeid har identifisert flere roller på synapse3,4,5,6,7, vår synaptiske forståelse av dette molekylet og alle medlemmer av neurexinfamilien forblir ufullstendige. LRRTM2 er et ekstiende postsynaptisk celleadhesjonsprotein som deltar i synapsedannelseog vedlikehold 8,9,10. Viktigere, LRRTM2 samhandler utelukkende med neurexin isoformer som mangler skjøte området 4 alternativ exon (SS4-), men ikke med neurexin isoformer som inneholder skjøte området 4 alternativ exon (SS4 +). Den menneskelige missense mutasjon (A687T) identifisert i Neurexin3α ligger i en uprudert ekstracellulær region som er evolusjonært bevart og bevares mellom alle alfa neurexins7. Som samspillet mellom disse to molekylene eretablert 8,9,11, stilte vi spørsmålet: er bindingsevnen til Neurexin3α SS4- til LRRTM2 endret av en A687T punkt mutasjon? Denne analysen viste at A687T-punktmutasjonen uventet forbedret aggregeringen av Neurexin3α til LRRTM2 som tyder på at den ekstracellulære regionen der punktmutasjonen ligger, spiller en rolle i å mediere transsynaptiske interaksjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellekultur og transinfeksjon
- Lag HEK cellemedier med DMEM, 1x (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) supplert med 4,5 g / L glukose, L-glutamin og natrium pyruvat og 10% FBS. Sterilt filter.
- Forhåndsbestemt egnede ligands og reseptorer for aggregering analyse.
MERK: Neurexin3α SS4+/- og en av de kjente ligandene, LRRTM2, ble brukt i denne studien. Ligands og reseptorer av interesse ble uttrykt fra cDNAs i pcDNA3.1. En Gibson-montering ble brukt til å sette Neurexin3α inn i pcDNA3.112. Neurexin3α F/R: TTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCGCCACCATGAGCTTTACCCTCCACTC/
GAGCGGCCGCCACTGTGCTGGATATCTGCAGAATTCTTACACATAATACTCCTTGTCCTT. - Forbered HEK293T-celler.
- Vokse HEK293T celler til samløpet i en T-75 kolbe.
- Når det er samløpet, bruk 2 ml trypsin og plasser i 37 °C inkubator i 2 min. Tilsett 6 ml HEK-medier i kolben for å bruke celler på nytt og overføre alle 8 ml til et konisk rør på 15 ml.
- Pellet på 500 x g i 5 min og resuspend i HEK celle medier for totalt 8 ml.
- Telle celler og legge til 735.000 celler i hver brønn av en 6-brønns plate. Juster det endelige volumet til 2 ml for hver brønn ved hjelp av HEK-cellemedier.
- Plasser i 37 °C inkubator og la cellene vokse over natten eller til de når 50-60% samløpet.
- Transfekt HEK293T-celler ved hjelp av kalsiumfosfatmetoden13.
- Transfect godt-1 med 3 μg av protein av interesse og samtidig transfekt med 1 μg fluorescerende protein (3 μg av pcDNA3.1-Neurexin3αWT SS4- og 1 μg av mCherry).
- Transfect godt-2 som i trinn 1.4.1. men med mutert protein av interesse (pcDNA3.1-Neurexin3αA687T SS4-).
- Transfect godt-3 med 3 μg av ligand av interesse og samtidig transfect med 1 μg av et annet fluorescerende protein (3 μg av pcDNA3.1 LRRTM2 og 1 μg GFP).
- Transfect godt-4 og godt-5 for å tjene som negative kontroller: godt-4 med 1 μg GFP og godt-5 med 1 μg av mCherry.
- Forbered en annen plate (som i trinn 1.4.1-1.4.4) hvis det krever ytterligere forhold eller kontroller (Neurexin3αWT/A687T SS4+).
MERK: Transfection effektivitet analyseres 24 timer etter transfection under et epifluorescence mikroskop og kvantifisert som antall celler som uttrykker fluorescerende protein de ble transfected med. En mer strømlinjeformet tilnærming vil omfatte transfection av HEK-celler med en bicistronic vektorkoding for et fluorescerende protein og ligand av interesse og anbefales sterkt over samtidig transfection. I tilfelle av denne studien, alfa Neurexins er ~ 4,3 kb og lav fluorescens intensitet ble observert ved hjelp av et bicistronic system nødvendiggjør co-transfection.
- 48 timer etter transfection, høste celler for aggregering.
- Vask hver brønn to ganger med PBS.
- Tilsett 1 ml 10 mM EDTA i PBS i hver brønn for å forsiktig dissosiere celle-til-celle interaksjoner og inkubere plate ved 37 °C i 5 min.
MERK: Trypsin anbefales ikke for trinn 1.5.2 på grunn av potensiell proteolytisk spalting av vedheftmolekyler i studien. I tillegg, etter EDTA tillegg protokollen kan ikke stoppes før ferdigstillelse som celler vil nå bli utsatt for omgivelsesforhold. - Trykk forsiktig plate for å løsne cellene, og høst hver godt inn i separate 15 ml koniske rør.
- Sentrifuge koniske rør ved 500 x g og romtemperatur i 5 min.
- Mens cellene er pelleting, forberede 6 inkubasjonsrør ved å merke toppen av hvert mikrocentrifuge rør med hver tilstand.
MERK: Hver permutasjon av GFP- og mCherry-forhold bør brukes til å omfatte alle eksperimentelle forhold og riktige kontroller. For eksempel: 1. GFP/mCherry, 2. mCherry/LRRTM2-GFP 3. GFP/Neurexin3αWT SS4-–mCherry, 4. GFP/Neurexin3αA687T SS4- –mCherry, 5. Neurexin3αWT SS4-–mCherry/LRRTM2 –GFP, 6. Neurexin3αA687T SS4- –mCherry/LRRTM2–GFP. Lag ekstra rør for å imøtekomme ytterligere forhold og kontroller. - Fjern de overnaturante og resuspendcellene i 500 μL HEK-medier med 10 mM CaCl2 og 10 mM MgCl2 oppvarmet til 37 °C.
MERK: Tilsetningen av CaCl2 og MgCl2 gjør det mulig for vedheftsmolekyler å gjenopprette bindingen og er bare nødvendig hvis de transcellulære samhandlingspartnerne det gjelder krever divalente formasjoner for vedheft. - Telle cellene i hver 15 ml konisk rør ved hjelp av en hemocytometer og aliquot 200.000 celler av hver tilstand i passende rør fra trinn 1.6.1 for en 1:1 blanding i et totalt volum på 500 μL.
MERK: Det bør bare ta 5 min per betingelse å telle og aliquot beløp. - Inkuber rør ved romtemperatur i en langsom rørrotator.
2. Bildeanskaffelse
- Optimaliser parametere for mikroskopanskaffelse for bestemte prøver. I dette eksemplet ble bilder tatt på et bredfeltsmikroskop. Bruk et 5x luftmål (NA: 0,15; WD: 20000 μm) for å få et stort nok felt for analyse.
- Vurder aggregasjon ved baseline umiddelbart etter blanding av de to betingelsene for HEK-celler i trinn 1.8. Dette er nå "time zero" -bildene.
- Pipette 40 μL av hver prøveblanding på et ladet mikroskop lysbilde og bilde under fluorescens i både 488 og 561 kanaler.
- Få tre forskjellige synsfelt på ett fokusplan per prøvefall.
- Få endelige bilder på 60 min som "tid 60" bilde.
- For å få "tid 60" bildet av blandingen etter en 60 min inkubasjon, ta en annen 40 μL prøve av hver tilstand fra roterende rør og pipette hver prøve på en ladet lysbilde. Bilde som i trinn 2.2.2.
MERK: Celleaggregering bør kontrolleres hver 15. Tidspunktet for aggregering vil avhenge av proteinene som testes.
- For å få "tid 60" bildet av blandingen etter en 60 min inkubasjon, ta en annen 40 μL prøve av hver tilstand fra roterende rør og pipette hver prøve på en ladet lysbilde. Bilde som i trinn 2.2.2.
3. ImageJ/Fiji analyse
- Lagre analysefiler for å kvantifisere omfanget av aggregering ved hjelp av Fiji/ImageJ.
- Lagre de angitte tilleggskodingsfilene i imageJ-makromappen på datamaskinen.
- Installer aggregeringsmakroen (Plugins, Macros, Install, og velg filen "AggregationAssay.txt").
- Bestem terskler.
- Last inn en "time zero" .tif-fil i imageJ og delkanalene ( | Farge | Delte kanaler).
MERK: "Time zero"-bildet brukes til å bestemme terskelen og den minste punktpunktstørrelsen for hele eksperimentet. - Masker hver kanal (Plugins | Makroer | AggregationAssay_MakeMask). Vinduet Lag maske fra bilde vises. Merk av for Bestem terskel for bilde og Bestem klyngeparamer fra Histogram, og klikk OK.
- Bestem terskelen for bildet ved hjelp av lysbildelinjen, registrer nummeret til høyre for glidebryteren og klikk OK.
- Et Histogramme av klyngestørrelse vises. Velg en klyngestørrelse fra histogrammet som passer til eksperimentet, skriv inn dette tallet i boksen Min klyngestørrelse: , og klikk OK. Klynger under denne størrelsen vil ikke bli analysert.
- Last inn en "time zero" .tif-fil i imageJ og delkanalene ( | Farge | Delte kanaler).
- Kjør analysen.
- Åpne "time 60"-bildet av betingelse 1 i imageJ og del kanalene som i trinn 3.2.1.
- Masker hver kanal (Plugins, makroer, AggregationAssay_MakeMask). Bruk samme terskel og størrelse som er bestemt i trinn 3.2.3 og trinn 3.2.4. Fjern merket for Bestem terskel for bilde og Bestem klyngeparamer fra Histogram, og skriv inn størrelsen og tersklerene manuelt i de aktuelle feltene, og klikk deretter OK.
- Beregn aggregasjonsindeksen (Plugins | Makroer | AggregationAssay_CalculateOverlap). Velg de maskerte kanalene som skal sammenlignes, og katalog som de resulterende filene skal lagres i.
- Gjenta trinn 3.3.1–3.3.3 for hvert bilde av 60 hver gang 60 i alle tilstander.
MERK: Aggregasjonsindeksen er definert som det totale overlappingsområdet delt på summen av de to kanalområdene minus overlappingsområdet multiplisert med 100 (aggregasjonsindeks = overlappingsområde/[område av kanal 1 + område av kanal 2 – overlappingsområde] x 100). Denne normaliseringen er en OR-operasjon mellom de to maskerte kanalene som representerer de totale pikslene i en av maskene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A687T-mutasjonen øker Neurexin3α SS4- binding til LRRTM27
For å undersøke hvordan intercellulære interaksjoner mellom to kjente synaptiske proteiner påvirkes av innføringen av en punktmutasjon som finnes hos en pasient med utviklingshemming og epilepsi, brukte vi ovennevnte HEK-celleaggregasjonsanalyse (figur 1). Celler ble transfisert i henhold til avsnitt 1 og forberedt for avbildning i henhold til avsnitt 1 og 2 i protokollen. Celler ble avbildet ved baseline der ingen aggregering ble observert som forventet (ikke vist). Bilder som ble innhentet etter 60 minutter ble analysert som i avsnitt 3 i protokollen. For å minimere utvalgsbias ble forholdene randomisert til å blinde eksperimentereren. Av lignende årsaker ble hele synsfeltet for hvert bilde valgt som en avkastning.
Forhold der celler ikke uttrykte noen synaptiske ligander (GFP/mCherry) viste minimal aggregering etter en 60-minutters inkubasjon (figur 2). På samme måte viste forhold der bare én av de to cellepopulasjonene uttrykte synaptiske ligander (mCherry/LRRTM2-GFP eller GFP/Neurexin3αWT/A687T SS4- —mCherry) minimal aggregering etter en 60 min inkubasjon (figur 2). Som forventet viste forhold som inneholdt to populasjoner av celler med inkompatible adhesjoner molekyler (Neurexin3αWT/A687T SS4+-mCherry/LRRTM2-GFP) ingen aggregering på 60 minutter (figur 2B). Disse forholdene fungerte som kritiske negative kontroller som LRRTM2 er kjent for å binde utelukkende til SS4 mangler isoformer (SS4-) av Neurexins og fremhever spesifisiteten av denne aggregering analysen.
Forhold med kompatible vedheftmolekyler8,9,10 (Neurexin3αWT SS4- -mCherry/ LRRTM2-GFP) viste betydelig aggregering etter en 60 min inkubasjon ( figur2C). Aggregering kan visualiseres som gul og finnes i overlappingen mellom celler (figur 1 og figur 2). Overraskende, tilstanden der Neurexin3α A687T SS4- ble co-inkubert med LRRTM2 (Neurexin3αA687T SS4- -mCherry / LRRTM2-GFP) viste betydelig mer aggregering sammenlignet med sin wildtype motstykke (Neurexin3αWT SS4- -mCherry / LRRTM2-GFP; positiv kontroll). Dette tyder på at A687T punkt mutasjon i Neurexin3α forbedrer bindende evner Neurexin3α SS4- til LRRTM2.
Figur 1. Arbeidsflyt for aggregasjonsanalyse. (A) HEK293T celler er transfected ved hjelp av en protein-1/mCherry, eller en protein-2/GFP. (B) Uttrykk for Neurexin3α tar 48 h. (C) Celler høstes ved hjelp av 10 mM EDTA og deretter pelleted (D). (E) Celler blandes i et forhold på 1:1 og brukes på nytt i 500 μL HEK-medier som inneholder 10 mM CaCl2 og MgCl2. (F) Celler inkuberes ved romtemperatur til aggregering oppstår og et endelig bilde er anskaffet på "tid 60". Aggregering visualiseres som antall gul punktpunkt synlig i synsfeltet. Ingen aggregering observeres når celler ikke uttrykker de riktige reseptorligandparene og blir dermed sett på som individuell rød eller grønn punktpunkt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. Neurexin3αA687T SS4- har forbedret aggregering med excitatory ligand LRRTM2 sammenlignet med Neurexin3αWT SS4-. (A) Representative bilder av negative kontroller etter en 60 min inkubasjon av mCherry med GFP, mCherry med LRRTM2, GFP med Neurexin3αWT SS4 +/-, og GFP med Neurexin3αA687T SS4 +/-. Aggregering ble observert etter 60 minutter i både LRRTM2 med Neurexin3αWT SS4-, og LRRTM2 med Neurexin3αA687T SS4-. (B) Kvantifisering av aggregeringsindeksen under alle SS4 + forhold etter 60 minutter. Aggregeringsindeks = overlappingsområde/(område av kanal 1 + område av kanal 2 – overlappingsområde) x 100. (C) Samme som (B) men SS4-. Data som vises representerer gjennomsnittlig ± SEM av antall eksperimenter (SEM: GFP/mCherry ± 0,0245, mCherry/LRRTM2 ± 0,02465, GFP/Neurexin3αWT SS4- ± 0,02453, GFP/Neurexin3αA687T SS4- ± 0,0109, Neurexin3αWT SS4-/LRRTM2 ± 0,0538, Neurexin3αA687T SS4-/LRRTM2 ± 0,0174; p= 0,0136). Tall presentert i barer representerer antall uavhengige eksperimenter utført. Stiplede linjer representerer opprinnelig plan eller gjennomsnittlig minimal aggregering av kontrollbetingelser. Statistisk signifikans ble bestemt av enveis ANOVA, flere sammenligninger; *p<0,05; p<0.0001.Dette tallet er endret fra Restrepo et al.7. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende kodefiler. Vennligst klikk her for å laste ned disse filene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dissekere protein-protein interaksjoner som oppstår i trans under celle vedheft kan føre til en bedre forståelse av molekylære mekanismer underliggende grunnleggende cellulære prosesser inkludert dannelse, funksjon og vedlikehold av synapser under modning og ombygging. Implikasjonene av celle-til-celle interaksjoner utvide utover nevrobiologi og har bredere roller i signaltransduksjon, cellemigrasjon og vev utvikling14. Avvik i celleamhesjon kan forstyrre cellulære prosesser som er avgjørende for riktig cellefunksjon og kan underligvis en rekke etiologier som kreft, leddgikt, avhengighet, autisme og schizofreni1,15,16. Her gir vi en optimalisert detaljert protokoll som involverer HEK-celleaggregering som gjør det mulig å teste celle-vedheftsamhandlinger i trans.
Med denne HEK-celleaggregasjonsprotokollen kan vi dissekere forskjeller i aggregering til omtrentlig bindingskapasitet mellom et presynaptisk protein og dens postsynaptiske ligand. Som sådan kan vi stille spørsmål som: er samspillet mellom to essensielle synaptiske proteiner påvirket av en punktmutasjon? Mer spesifikt, er transinteraksjonen av Neurexin3α med LRRTM2 påvirket av A687T? A687T missense mutasjon studert her ligger i en tidligere ikke-studiert linker region av det ekstracellulære domenet neurexin3α7. Resultatene illustrerer at A687T mutasjonen forbedrer aggregeringen av celler som inneholder Neurexin3αA687T til celler som inneholder LRRTM2 (figur 2C). Dette funnet er betydelig fordi det tidligere ble vist at LRRTMs bare binder seg til Neurexins via et Neurexin-domene kalt LNS617, og antyder videre at sekvenser oppstrøms av LNS6 kan utøve en uavhengig effekt på transinteraksjonene mellom Neurexin3α SS4- og LRRTM27.
Resultatene i figur 2 viser spesifisiteten av denne analysen som alle negative kontroller (GFP/mCherry; Neurexin3αWT/A687T SS4- -mCherry/GFP eller LRRTM-GFP/mCherry) hadde ingen observerbar aggregering etter 60 minutter. En kritisk kontroll som brukes i denne studien, Neurexin3αWT/A687T SS4+ -mCherry/LRRTM-GFP, viste heller ingen aggregering etter 60 min fordi LRRTM2 er kjent for å binde utelukkende til SS4 mangler (SS4-) isoformer av Neurexin. Denne kontrollen viser at enkel overuttrykk av membranbundne molekyler ikke er tilstrekkelig til å tvinge aggregering i dette systemet, noe som ytterligere illustrerer spesifisiteten til denne analysen.
Celleadhesjonsanalysen beskrevet her har blitt mye brukt til å teste interaksjonene mellom transsynaptiske celle-vedheftmolekyler8,18,19; Det kan imidlertid brukes til å teste selvklebende celle-til-celle interaksjoner av membran bundet proteiner. Denne protokollen, som har utviklet seg over tid, ble optimalisert fra den opprinnelige publiserte protokollen og påfølgende variasjoner av protokollen ved å endre tre eksperimentelle parametere. For det første ble inkubasjonstemperaturen for cellene endret. Den opprinnelige protokollen krever inkubasjon av celler i trinn 1,9 ved 4 °C. Denne lave temperaturen kan fungere som en miljømessig stressor og kan redusere celle levedyktighet fører til celledød og lysis. Under cellelyse utskiller cellene genomisk DNA og celleavfall i medier som får celler til å klumpe seg i løsning som fører til falske positiver under avbildning. To, antall celler per tilstand ble økt til 200.000 per befolkning og den objektive størrelsen ble endret til en 5x; Dette gjør det mulig for forskeren å bilde av et større antall interaksjoner per synsfelt for å øke statistisk kraft innen hver n. Tre, ble aggregeringsindeksen målt annerledes. Tidligere aggregeringsindekser var begrenset av valg av klyngestørrelse av eksperimentereren som førte til utelukkelse av "undergrenseshold"-klynger. Derimot er terskler nå satt for individuell cellestørrelse på "time zero", og aggregeringen beregnes nå som det overlappende området delt på summen av de to kanalområdene minus overlappingsområdet multiplisert med 100 på "tid 60", noe som gjør det mulig å inkludere mindre positive klynger som gjør analysen mer følsom for andre protein-ligand par (Figur 2B, C).
Feilsøking og optimalisering kan være nødvendig avhengig av de interagerende proteinene som er testet. Selv om inkubasjonsperioden til endelig bildeoppkjøp vil variere avhengig av de testede proteinene, er det avgjørende at ingen aggregering observeres ved "time zero". Hvis aggregering ses på tidspunktet null, kan det innebære at cellene ikke var sunne til å begynne med. Dette kan skyldes flere faktorer, inkludert plutselig eksponering for temperaturer under 37 °C eller langsom eksperimentell prosedyre. Viktigere, resuspension media for trinn 1.7 bør være ved 37 ° C, noe som vil tillate cellene å gradvis nå romtemperatur uten en plutselig hard temperaturfall. En måte å ha optimal cellehelse gjennom hele eksperimentet er å sikre at trinn 1,7 til 1,9 fullføres innen en 25 min tidsramme uten pauser i mellom. Det anbefales at mikroskopet er satt opp og klar til bruk før cellehøstingsceller i trinn 1.5; Dette sikrer at et ekte "time zero"-bilde kan tas umiddelbart i trinn 2.2.
Hvis aggregering ikke observeres etter 60 minutters inkubasjon, kan flere faktorer bidra til denne mangelen på vedheft. For det første kan proteinene det gjelder ikke være bindende partnere eller kan engasjere seg i lav affinitetinteraksjoner som ikke kan oppdages av denne analysen. I dette tilfellet kan det være nødvendig med en mer sensitiv analyse. For det andre kan proteinet(e) av interesse ikke lokalisere til membranen når det uttrykkes alene i HEK-celler. I dette tilfellet, bekreft at proteinet er membran lokalisert ved hjelp av biokjemiske teknikker (overflate biotinylering) eller direkte merke protein av interesse med en fluorescerende tag og bilde HEK293T celler på 40x eller høyere forstørrelse for å vurdere overflateuttrykk. Men etter at membran lokalisering er bekreftet, anbefaler vi å bruke ukodede varianter for denne HEK celle aggregeringsanalysen for å mer nøyaktig vurdere bindingskapasiteten til det opprinnelige proteinet. For det tredje, i denne protokollen tillot vi Neurexin3α å uttrykke for 48 h; Proteinuttrykkstiden kan imidlertid variere avhengig av proteinene som er testet. For det fjerde er det viktig å supplere media i trinn 1.7 med MgCl2 og CaCl2 hvis de aktuelle proteinene er avhengige av divalente cations som det er tilfelle med eksempel på Neurexins og LRRTM211. Hvis det er ukjent om samhandlingspartnerne krever divalente kasjoner for vedheft, legger du til EDTA i én betingelse. EDTA bør chelate remining cations naturlig tilstede i DMEM sikre en kalsium og magnesiumfri løsning. Hvis vedheft observeres etter EDTA-tillegg, krever de aktuelle proteinene ikke divalente cations for adhesjon.
Mange metoder finnes for å teste proteininteraksjoner; De fleste er imidlertid ikke spesifikke for testing bare trans interaksjoner som oppstår fra celle til celle og krever kjedelig protein rensing trinn. Selv om HEK-celleaggregasjonsanalysen ikke er et direkte mål på affinitet og ikke bør brukes til å erstatte en mer kvantitativ tilnærming for å gjenopprette dissosiasjonskonstanter, så vidt vi vet, representerer denne analysen en tilnærming for å teste sanne transinteraksjoner på en semi-kvantitativ og relativt effektiv måte. Videre, på grunn av den relative lettheten i denne analysen, kan HEK-celleaggregasjonsanalysen brukes sammen med disse mer kvantitative tilnærmingene for å oppnå en bredere og mer fullstendig karakterisering av interaksjonene som finner sted.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Grants fra National Institute of Mental Health (R00MH103531 og R01MH116901 til J.A.), en predoktorisk opplæring Stipend fra National Institute of General Medicine (T32GM007635 til S.R.), og en Lyda Hill Gilliam Fellowship for Advanced Study (GT11021 til S.R.). Vi takker Dr. Kevin Woolfrey for hjelp med mikroskopet, Dr. K Ulrich Bayer for bruk av hans epifluorescent mikroskop, og Thomas Südhof (Stanford University) for LRRTM2 plasmid.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL disposable microtubes with snap caps | VWR | 89000-028 | Incubation of mixed population of HEK cells |
| 1000 mL Rapid—Flow Filter Unit, 0.2 um aPES membrane | Thermo Fisher | 567-0020 | Sterilization of HEK media |
| 15 mL SpectraTube centrifuge tubes | Ward’s Science | 470224-998 | Harvesting HEK cells |
| 6 well sterile tissue culture plates | VWR | 100062-892 | culturing HEK cells |
| Calcium Chloride | Sigma | 223506-500G | Calcium phosphate transfection, HEK cell resuspension |
| Centrifuge- Sorvall Legend RT | Kendro Laboratory Products | 75004377 | Harvesting HEK cells |
| CO2 cell incubator | Thermo Scientific | HERACELL 150i | Incubation of HEK cells during growth |
| DMEM, 1x (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate | Corning | 10-013-CV | HEK cell maintenance |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline PBS (1X) | Gibco | 14190-144 | Passaging/harvesting HEK cell |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | ED-500G | Harvesting HEK cells |
| Falcon Vented culture flasks, 75cm2 growth area | Corning | 9381M26 | Culturing HEK cells |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | 17L184 | HEK cell maintenance |
| HEK293T cells | ATCC | Model system | |
| ImageJ | NIH | V: 2.0.0-rc-69/1.52p | Image analysis |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma | M9272-500G | HEK cell resuspension |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Fisher BioReagents | BP332-500 | Calcium phosphate transfection |
| Trypsin 0.25% (1X) Solution | GE Healthcare Life Sciences | SH30042.01 | Passaging HEK cells |
| Tube rotator | Incubation of mixed population of HEK cells | ||
| UltraClear Microscope slides. White Frosted, Positive Charged | Denville Scientific Inc. | M1021 | Image acquisition |
| Wide-field microscope | Zeiss | Axio Vert 200M | Image acquisition |
References
- Südhof, T. C. Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease. Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).
- Lakey, J. H., Raggett, E. M.
- Aoto, J., Martinelli, D. C., Malenka, R. C., Tabuchi, K., Südhof, T. C. Presynaptic neurexin-3 alternative splicing trans-synaptically controls postsynaptic AMPA receptor trafficking. Cell. 154 (1), 75-88 (2013).
- Aoto, J., Földy, C., Ilcus, S. M. C., Tabuchi, K., Südhof, T. C. Distinct circuit-dependent functions of presynaptic neurexin-3 at GABAergic and glutamatergic synapses. Nature Neuroscience. 18 (7), 997-1007 (2015).
- Südhof, T. C. Synaptic Neurexin Complexes: A Molecular Code for the Logic of Neural Circuits. Cell. 171 (4), 745-769 (2017).
- Dai, J., Aoto, J., Südhof, T. C. Alternative Splicing of Presynaptic Neurexins Differentially Controls Postsynaptic NMDA and AMPA Receptor Responses. Neuron. 102 (5), 993-1008 (2019).
- Restrepo, S., Langer, N. J., Nelson, K. A., Aoto, J. Modeling a Neurexin-3α Human Mutation in Mouse Neurons Identifies a Novel Role in the Regulation of Transsynaptic Signaling and Neurotransmitter Release at Excitatory Synapses. The Journal of Neuroscience. 39 (46), 9065-9082 (2019).
- Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., Südhof, T. C. LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64 (6), 791-798 (2009).
- de Wit, J., et al. LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64 (6), 799-806 (2009).
- Linhoff, M. W., et al. An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers. Neuron. 61 (5), 734-749 (2009).
- Siddiqui, T. J., Pancaroglu, R., Kang, Y., Rooyakkers, A., Craig, A. M. LRRTMs and Neuroligins Bind Neurexins with a Differential Code to Cooperate in Glutamate Synapse Development. Journal of Neuroscience. 30 (22), 7495-7506 (2010).
- Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Bacchetti, S., Graham, F. L. Transfer of the gene for thymidine kinase to thymidine kinase-deficient human cells by purified herpes simplex viral DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (4), 1590-1594 (1977).
- Cerchiari, A. E., et al. A strategy for tissue self-organization that is robust to cellular heterogeneity and plasticity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7), 2287-2292 (2015).
- Burdick, M. M., McCarty, O. J. T., Jadhav, S., Konstantopoulos, K. Cell-cell interactions in inflammation and cancer metastasis. IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine. 20 (3), 86-91 (2001).
- Fox, D. A., Gizinski, A., Morgan, R., Lundy, S. K. Cell-cell interactions in rheumatoid arthritis synovium. Rheumatic Diseases Clinics of North America. 36 (2), 311-323 (2010).
- Yamagata, A., et al. Structural insights into modulation and selectivity of transsynaptic neurexin-LRRTM interaction. Nature Communications. 9 (1), 3964 (2018).
- Nguyen, T., Südhof, T. C. Binding properties of neuroligin 1 and neurexin 1beta reveal function as heterophilic cell adhesion molecules. The Journal of Biological Chemistry. 272 (41), 26032-26039 (1997).
- Boucard, A. A., Ko, J., Südhof, T. C. High Affinity Neurexin Binding to Cell Adhesion G-protein-coupled Receptor CIRL1/Latrophilin-1 Produces an Intercellular Adhesion Complex. Journal of Biological Chemistry. 287 (12), 9399-9413 (2012).
