Summary
Aquí, presentamos un protocolo optimizado para medir rápida y semicuantitativamente las interacciones ligando-receptor en trans en un sistema celular heterologoso utilizando microscopía de fluorescencia.
Abstract
Las interacciones proteicas en las interfaces celulares dictan una multitud de resultados biológicos que van desde el desarrollo de tejidos y la progresión del cáncer hasta la formación y mantenimiento de sinapsis. Muchas de estas interacciones fundamentales ocurren en trans y suelen ser inducidas por interacciones heterofílicas u homofílicas entre células que expresan pares de unión anclados por membrana. Dilucidar cómo las mutaciones relevantes para la enfermedad interrumpen estas interacciones proteicas fundamentales puede proporcionar una visión de una miríada de campos de biología celular. Muchos ensayos de interacción proteína-proteína no suelen desambiguar entre las interacciones cis y trans, lo que potencialmente conduce a una sobreestimación del grado de unión que se está produciendo in vivo e implican la purificación intensiva de proteínas y/o equipos de monitoreo especializados. Aquí, presentamos un protocolo simple optimizado que permite la observación y cuantificación de sólo interacciones trans sin necesidad de largas purificaciones de proteínas o equipos especializados. El ensayo de agregación celular HEK implica la mezcla de dos poblaciones independientes de células HEK, cada una expresando ligandos de cognato unidos a membrana. Después de un breve período de incubación, las muestras se muestran en imágenes y se cuantifican los agregados resultantes.
Introduction
Las interacciones sinápticas facilitadas por moléculas de adhesión sináptica son fundamentales para el desarrollo, la organización, la especificación, el mantenimiento y la función de las sinapsis y la generación de redes neuronales. La identificación de estas moléculas de adhesión celular transsináptica está aumentando rápidamente; por lo tanto, es fundamental identificar socios de unión y entender cómo estas nuevas moléculas de adhesión interactúan entre sí. Además, la secuenciación del genoma ha identificado mutaciones en muchas de estas moléculas de adhesión que comúnmente están relacionadas con una multitud de trastornos neurodesarrollo, neuropsiquiátrico y de adicción1. Las mutaciones en genes que codifican para moléculas sinápticas de adhesión celular pueden alterar perjudicialmente las interacciones trans y pueden contribuir a alteraciones fisiológicas en la formación y el mantenimiento de sinapsis.
Existen múltiples ensayos para evaluar cuantitativamente las interacciones proteína-proteínas como calorimetría isotérmica, dichroismo circular, resonancia de plasmón superficial2 y aunque de naturaleza cuantitativa, tienen varias limitaciones. En primer lugar, requieren proteínas recombinantes, a veces exigiendo pasos de purificación largos y tediosos. En segundo lugar, requieren sofisticados equipos especializados y conocimientos técnicos. En tercer lugar, pueden sobreestimar el grado de unión, ya que permiten interacciones cis y trans entre proteínas que están naturalmente atadas a una membrana in vivo. Aquí proponemos un ensayo simple y relativamente rápido que prueba exclusivamente las interacciones trans.
Para eludir muchas de las complicaciones asociadas con los ensayos de proteínas purificadas, hemos optimizado un ensayo de interacción proteica basado en células que recapitula las interacciones trans en un sistema celular heterologoso reducido. Este ensayo se ha utilizado previamente en varias formas para estudiar interacciones transcelulares. En este enfoque, las moléculas de adhesión celular candidatas se transfectan en células HEK293T. En condiciones fisiológicas, las células HEK293T no exhiben autoagregación, por lo que son modelos ejemplares para este ensayo. Sin embargo, cuando se combinan poblaciones individuales de células HEK que expresan receptor y ligando, la unión del receptor y el ligando obliga a que se produzca la agregación de células HEK. Esta agregación se media exclusivamente mediante interacciones trans y suele ser observable en decenas de minutos. No se requieren pasos de purificación de proteínas en este método, y la eficiencia del método se basa en el paradigma de que las poblaciones de células HEK que expresan moléculas de adherencia de cognato se están combinando y luego se tienen imágenes sólo decenas de minutos más tarde. Además, este método es relativamente barato, ya que no se requieren anticuerpos ni equipos costosos. El único equipo necesario para la adquisición de datos es un microscopio fluorescente estándar. Una ventaja adicional a este ensayo basado en células es la capacidad de examinar rápidamente el efecto de las mutaciones puntuales relevantes de la enfermedad en las interacciones trans. Esto se puede realizar mediante la transfectación de células HEK con CDNAs de las variantes mutantes de la proteína de interés.
En este protocolo, presentamos un ejemplo en el que investigamos si una mutación de missense en Neurexin3α (Neurexin3αA687T),identificada en un paciente diagnosticado con profunda discapacidad intelectual y epilepsia, altera las interacciones en trans con la proteína transmembrana repetida rica en leucina 2 (LRRTM2). Neurexin3α es miembro de la familia evolutivamente conservada de moléculas presintáticas de adhesión celular y aunque el trabajo reciente ha identificado múltiples roles en la sinapsis3,4,5,6,7,nuestra comprensión sináptica de esta molécula y todos los miembros de la familia de la neurexina sigue incompleta. LRRTM2 es una proteína de adherencia de células postsinápticas excitatorias que participa en la formación y mantenimiento de sinapsis8,9,10. Es importante destacar que LRRTM2 interactúa exclusivamente con isoformes de neurexina que carecen del sitio de empalme 4 exones alternativos (SS4-) pero no con isoformes de neurexina que contienen el sitio de empalme 4 exones alternativos (SS4+). La mutación de missense humano (A687T) identificada en Neurexin3α se encuentra en una región extracelular no auditada que se conserva evolutivamente y se conserva entre todas las neurexinas alfa7. Como la interacción entre estas dos moléculas se ha establecido8,9,11, planteamos la pregunta: ¿la capacidad de unión de Neurexin3α SS4- a LRRTM2 alterada por una mutación de punto A687T? Este ensayo reveló que la mutación del punto A687T mejoró inesperadamente la agregación de Neurexin3α a LRRTM2, lo que sugiere que la región extracelular en la que se encuentra la mutación de puntos desempeña un papel en la mediación de las interacciones transsintápticas.
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Protocol
1. Cultivo celular y transfección
- Hacer medios celulares HEK con DMEM, 1x (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) complementado con glucosa de 4,5 g/L, piruvato de L-glutamina y sodio y 10% FBS. Filtro estéril.
- Predeterminar ligandos y receptores adecuados para el ensayo de agregación.
NOTA: Neurexin3α SS4+/- y uno de sus ligandos conocidos, LRRTM2, fueron utilizados en este estudio. Ligandos y receptores de interés se expresaron a partir de CDNAs en pcDNA3.1. Se utilizó un conjunto Gibson para insertar Neurexin3α en pcDNA3.112. Neurexin3α F/R: TTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCGCCACCATGAGCTTTACCCTCCACTCTC/
GAGCGGCCGCCACTGTGCTGGATATCTGCAGAATTCTTACACATAATACTCCTTGTCCTT. - Prepare las células HEK293T.
- Cultivar células HEK293T a la confluencia en un matraz T-75.
- Una vez confluente, utilice 2 ml de trypsin y colóquelo en una incubadora de 37 °C durante 2 min. Agregue 6 ml de soporte HEK al matraz para volver a usar las células y transferir los 8 ml a un tubo cónico de 15 ml.
- Pellet a 500 x g durante 5 min y resuspend en medios celulares HEK para un total de 8 mL.
- Contar células y añadir 735.000 células en cada pozo de una placa de 6 pozos. Ajuste el volumen final a 2 ml para cada pozo utilizando medios de celda HEK.
- Colocar en incubadora de 37 °C y permitir que las células crezcan durante la noche o hasta que alcancen el 50-60% de confluencia.
- Transfectar células HEK293T utilizando el método de fosfato de calcio13.
- Transfectar bien-1 con 3 μg de la proteína de interés y co-transfecto con 1 μg de proteína fluorescente (3 μg de pcDNA3.1-Neurexin3αWT SS4- y 1 μg de mCherry).
- Transfecto bien-2 como en el paso 1.4.1. pero con la proteína mutada de interés (pcDNA3.1-Neurexin3αA687T SS4-).
- Transfectar bien-3 con 3 μg del ligando de interés y co-transfecto con 1 μg de otra proteína fluorescente (3 μg de pcDNA3.1 LRRTM2 y 1 μg de GFP).
- Transfecto bien-4 y bien-5 para servir como controles negativos: bueno-4 con 1 μg de GFP y bien-5 con 1 μg de mCherry.
- Preparar otra placa (como en el paso 1.4.1-1.4.4) si requiere condiciones o controles adicionales (Neurexin3αWT/A687T SS4+).
NOTA: La eficiencia de transfección se analiza 24 h después de la transfección bajo un microscopio de epifluorescencia y cuantificada como el número de células que expresan la proteína fluorescente con la que fueron transfectadas. Un enfoque más simplificado incluiría la transfección de células HEK con una codificación vectorial bicistrónica para una proteína fluorescente y el ligando de interés y es muy recomendable por encima de la co-transfección. En el caso de este estudio, las neurexinas alfa son ~4.3 kb y se observó baja intensidad de fluorescencia utilizando un sistema bicistrónico que requiere co-transfección.
- 48 horas después de la transfección, cosechar células para la agregación.
- Lave cada pozo dos veces con PBS.
- Agregue 1 ml de EDTA de 10 mM en PBS en cada pozo para disociar suavemente las interacciones de célula a célula e incubar la placa a 37 °C durante 5 minutos.
NOTA: Trypsin no se recomienda para el paso 1.5.2 debido a un posible escote proteolítico de moléculas de adhesión en estudio. Además, después de la adición de EDTA, es posible que el protocolo no se detenga hasta su finalización, ya que las celdas ahora estarán expuestas a condiciones ambientales. - Toque suavemente la placa para separar las células y cosechar cada pozo en tubos cónicos separados de 15 ml.
- Centrífuga tubos cónicos a 500 x g y temperatura ambiente durante 5 min.
- Mientras las células están peletizando, prepare 6 tubos de incubación etiquetando la parte superior de cada tubo de microcentrífuga con cada condición.
NOTA: Cada permutación de las condiciones GFP y mCherry debe utilizarse para abarcar todas las condiciones experimentales y controles adecuados. Por ejemplo: 1. GFP/mCherry, 2. mCherry/LRRTM2-GFP 3. GFP/Neurexin3αWT SS4-—mCherry, 4. GFP/Neurexin3αA687T SS4- –mCherry, 5. Neurexin3αWT SS4-—mCherry/LRRTM2—GFP, 6. Neurexin3αA687T SS4- –mCherry/LRRTM2—GFP. Haga tubos adicionales para adaptarse a otras condiciones y controles. - Retire las células sobrenadantes y resuspend en 500 μL de medios HEK con 10 mM CaCl2 y 10 mM MgCl2 calentado a 37 °C.
NOTA: La adición de CaCl2 y MgCl2 permite que las moléculas de adhesión restablezcan la unión y sólo es necesaria si los socios de interacción transcelular en cuestión requieren cationes divalentes para la adhesión. - Cuente las células de cada tubo cónico de 15 ml utilizando un hemociclo y aliquot 200.000 células de cada condición en el tubo apropiado desde el paso 1.6.1 para una mezcla de 1:1 en un volumen total de 500 μL.
NOTA: Solo se debe tomar 5 minutos por condición para contar y alicuar cantidades. - Incubar tubos a temperatura ambiente en un rotador de tubo lento.
2. Adquisición de imágenes
- Optimice los parámetros de adquisición de microscopios para muestras específicas. En este ejemplo, las imágenes se tomaron en un microscopio de campo ancho. Utilice un objetivo de aire 5x (NA: 0.15; WD: 20000 μm) para obtener un campo lo suficientemente grande para su análisis.
- Evalúe la agregación basal inmediatamente después de mezclar las dos condiciones de las células HEK en el paso 1.8. Estas son ahora las imágenes de "tiempo cero".
- Pipeta 40 μL de cada mezcla de muestra en una diapositiva de microscopio cargada e imagen bajo fluorescencia en los canales 488 y 561.
- Adquiera tres campos de visión diferentes en un plano de enfoque por caída de muestra.
- Adquiere imágenes finales a 60 min como la imagen de 'time 60'.
- Para obtener la imagen de "tiempo 60" de la mezcla después de una incubación de 60 minutos, tome otra muestra de 40 μL de cada condición de tubos giratorios y pipeta cada muestra en una diapositiva cargada. Imagen como en el paso 2.2.2.
NOTA: La agregación celular debe comprobarse cada 15 minutos hasta que se produzca la saturación. El momento de la agregación dependerá de las proteínas que se prueben.
- Para obtener la imagen de "tiempo 60" de la mezcla después de una incubación de 60 minutos, tome otra muestra de 40 μL de cada condición de tubos giratorios y pipeta cada muestra en una diapositiva cargada. Imagen como en el paso 2.2.2.
3. Análisis de ImageJ/Fiji
- Para cuantificar el alcance de la agregación mediante Fiji/ImageJ, guarde los archivos de análisis.
- Guarde los archivos de codificación suplementarios proporcionados en la carpeta de macros imageJ del equipo.
- Instale la macro de agregación proporcionada (plugins, macros, install y seleccione el archivo "AggregationAssay.txt").
- Determinar umbrales.
- Cargue un archivo de .tif 'time zero' en imageJ y divida los canales(Image | Color | Canales divididos).
NOTA: La imagen 'time zero' se utiliza para determinar el umbral y el tamaño de puncta más pequeño para todo el experimento. - Enmascarar cada canal(Plugins | Macros | AggregationAssay_MakeMask). Aparecerá la ventana Crear máscara desde imagen. Marque las casillas situadas junto a Determinar umbral para la imagen y determinar parámetros de clúster a partir de histograma y haga clic en Aceptar.
- Determine el umbral de la imagen mediante la barra de diapositivas, registre el número a la derecha de la barra de diapositivas y haga clic en Aceptar.
- Aparecerá un histograma de tamaño de clúster. Seleccione un tamaño de clúster en el histograma que se adapte al experimento, escriba este número en el cuadro Tamaño mínimo del clúster: y haga clic en Aceptar. Los clústeres por debajo de este tamaño no se analizarán.
- Cargue un archivo de .tif 'time zero' en imageJ y divida los canales(Image | Color | Canales divididos).
- Ejecute el análisis.
- Abra la imagen 'time 60' de la condición 1 en imageJ y divida los canales como en el paso 3.2.1.
- Enmascara cada canal (Plugins, Macros, AggregationAssay_MakeMask). Utilice el mismo umbral y tamaño determinados en los pasos 3.2.3 y 3.2.4. Anule la selección de los cuadros situados junto a Determinar umbral para imagen y Determinar parámetros de clúster a partir de Histograma y escriba manualmente el tamaño y los umbrales en los campos adecuados y, a continuación, haga clic en Aceptar.
- Calcular el índice de agregación (Plugins | Macros | AggregationAssay_CalculateOverlap). Seleccione los canales enmascarados que desea comparar y el directorio en el que se guardarán los archivos resultantes.
- Repita los pasos 3.3.1–3.3.3 por cada imagen de "tiempo 60" en cada condición.
NOTA: El índice de agregación se define como el área de superposición total dividida por la suma de las dos áreas de canal menos el área de superposición multiplicada por 100 (Índice de agregación = área de superposición/[área del canal 1 + área del canal 2 – área de superposición] x 100). Esta normalización es una operación 'OR' entre los dos canales enmascarados que representan el total de píxeles de cualquiera de las máscaras.
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Representative Results
La mutación A687T aumenta la unión de Neurexin3α SS4 a LRRTM27
Para investigar cómo las interacciones intercelulares de dos proteínas sinápticas conocidas se ven afectadas por la introducción de una mutación puntual encontrada en un paciente con discapacidad intelectual y epilepsia, utilizamos el ensayo de agregación celular HEK anterior (Figura 1). Las células fueron transfectadas de acuerdo con la sección 1 y preparadas para la toma de imágenes de acuerdo con las secciones 1 y 2 del protocolo. Las celdas se imágenes en la línea base donde no se observó ninguna agregación como se esperaba (no se muestra). Las imágenes adquiridas a los 60 minutos fueron analizadas como en la sección 3 del protocolo. Para minimizar el sesgo de selección, las condiciones se aleatorizaron para cegar al experimentador. Por razones similares, todo el campo de visión de cada imagen se seleccionó como roi.
Las condiciones en las que las células no expresaban ningún ligando sináptico (GFP/mCherry) mostraban una agregación mínima después de una incubación de 60 minutos(Figura 2). Igualmente, las condiciones en las que sólo una de las dos poblaciones de células expresaba ligandos sinápticos (mCherry/LRRTM2-GFP o GFP/Neurexin3αWT/A687T SS4- —mCherry) presentaban una agregación mínima después de una incubación de 60 minutos (Figura 2). Como era de esperar, las condiciones que contenían dos poblaciones de células con moléculas de adherencia incompatibles (Neurexin3αWT/A687T SS4+—mCherry/LRRTM2-GFP) no presentaban agregación a 60 minutos(Figura 2B). Estas condiciones sirvieron como controles negativos críticos, ya que se sabe que LRRTM2 se une exclusivamente a las isoformas faltantes de SS4 (SS4-) de Neurexins y pone de relieve la especificidad de este ensayo de agregación.
Las condiciones con moléculas de adhesión compatibles8,9,10 (Neurexin3αWT SS4- —mCherry/LRRTM2-GFP) mostraron una agregación significativa después de una incubación de 60 minutos(Figura 2C). La agregación se puede visualizar como amarilla y está presente en la superposición entre celdas (Figura 1 y Figura 2). Sorprendentemente, la condición en la que Neurexin3α A687T SS4- fue co-incubada con LRRTM2 (Neurexin3αA687T SS4- —mCherry/LRRTM2-GFP) exhibió significativamente más agregación en comparación con su contraparte de wildtype (Neurexin3αWT SS4- —mCherry/LRRTM2-GFP; control positivo). Esto sugiere que la mutación del punto A687T en Neurexin3α mejora las capacidades de unión de Neurexin3α SS4- a LRRTM2.
Figura 1. Flujo de trabajo de ensayo de agregación. (A) Las células HEK293T se transfectan utilizando una proteína-1/mCherry, o una proteína-2/GFP. (B) La expresión de Neurexin3α toma 48 h. (C) Las células se cosechan utilizando 10 mM EDTA y luego se peletizan (D). (E) Las células se mezclan en una relación 1:1 y se resuspended en 500 μL de medios HEK que contienen 10 mM CaCl2 y MgCl2. (F) Las células se incuban a temperatura ambiente hasta que se produce la agregación y se adquiere una imagen final en 'tiempo 60'. La agregación se visualiza como el número de puncta amarilla visible en el campo de visión. No se observa ninguna agregación cuando las células no expresan los pares de ligando receptor correctos y por lo tanto se ven como puncta rojo o verde individual. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Neurexin3αA687T SS4- ha mejorado la agregación con ligando excitatorio LRRTM2 en comparación con Neurexin3αWT SS4-. (A) Imágenes representativas de controles negativos después de una incubación de 60 minutos de mCherry con GFP, mCherry con LRRTM2, GFP con Neurexin3αWT SS4+/-, y GFP con Neurexin3αA687T SS4+/-. La agregación se observó después de 60 minutos en LRRTM2 con Neurexin3αWT SS4-, y LRRTM2 con Neurexin3αA687T SS4-. (B) Cuantificación del índice de agregación en todas las condiciones SS4+ después de 60 minutos. Índice de agregación = área de superposición/(área del canal 1 + área del canal 2 – área de superposición) x 100. (C) Igual que (B) pero SS4-. Los datos mostrados representan la media ± SEM del número de experimentos (SEM: GFP/mCherry ± 0,0245, mCherry/LRRTM2 ± 0,02465, GFP/Neurexin3αWT SS4- ± 0,02453, GFP/Neurexin3αA687T SS4- ± 0,0109, Neurexin3αWT SS4-/LRRTM2 ± 0,0538, Neurexin3αA687T SS4-/LRRTM2 ± 0,0174; p= 0,0136). Los números presentados en las barras representan el número de experimentos independientes llevados a cabo. Las líneas punteadas representan la agregación mínima de líneas base o media de las condiciones de control. La importancia estadística fue determinada por ANOVA unidireccional, múltiples comparaciones; *p<0.05; p<0.0001.Esta cifra ha sido modificada desde Restrepo et al.7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Archivos de codificación suplementarios. Haga clic aquí para descargar estos archivos.
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Discussion
La disección de las interacciones proteína-proteínas que se producen en trans durante la adhesión celular puede conducir a una mejor comprensión de los mecanismos moleculares subyacentes a los procesos celulares básicos, incluyendo la formación, función y mantenimiento de sinapsis durante la maduración y remodelación. Las implicaciones de las interacciones de célula a célula se expanden más allá de la neurobiología y tienen un papel más amplio en la transducción de la señal, la migración celular y el desarrollo de tejidos14. Las aberraciones en la adherencia celular pueden interrumpir los procesos celulares imperativos para la función celular adecuada y pueden subestimar una variedad de etiologías como cáncer, artritis, adicción, autismo y esquizofrenia1,15,16. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado optimizado que implica la agregación de células HEK que permite probar interacciones de adhesión celular en trans.
Con este protocolo de agregación celular HEK, podemos diseccionar las diferencias en la agregación para aproximar la capacidad de unión entre una proteína presináptica y su ligando postsináptico. Como tal, podemos hacer preguntas tales como: ¿la interacción entre dos proteínas sinápticas esenciales se ve afectada por una mutación puntual? Más específicamente, ¿la interacción trans de Neurexin3α con LRRTM2 se ve afectada por A687T? La mutación de missense A687T estudiada aquí se encuentra en una región enlazadora previamente no estudiada del dominio extracelular de Neurexin3α7. Los resultados ilustran que la mutación A687T mejora la agregación de células que contienen Neurexin3αA687T a las células que contienen LRRTM2 (Figura 2C). Esta constatación es significativa porque anteriormente se demostró que los LRTMs sólo se unen a Neurexins a través de un dominio Neurexin llamado LNS617, y sugiere además que las secuencias aguas arriba de LNS6 pueden ejercer un efecto independiente sobre las interacciones trans entre Neurexin3α SS4- y LRRTM27.
Los resultados de la Figura 2 presentan la especificidad de este ensayo como todos los controles negativos (GFP/mCherry; Neurexin3αWT/A687T SS4- —mCherry/GFP o LRRTM-GFP/mCherry) no tenía agregación observable después de 60 minutos. Un control crítico utilizado en este estudio, Neurexin3αWT/A687T SS4+ —mCherry/LRRTM-GFP, tampoco exhibió agregación después de 60 minutos porque se sabe que LRRTM2 se une exclusivamente a isoformas SS4 lacking (SS4-) de Neurexin. Este control demuestra que la simple sobreexpresión de moléculas unidas a membranas es insuficiente para forzar la agregación en este sistema, lo que ilustra aún más la especificidad de este ensayo.
El ensayo de adhesión celular descrito aquí ha sido ampliamente utilizado para probar las interacciones de moléculas transsintápticas de adhesión celular8,18,19; sin embargo, se puede utilizar para probar las interacciones adhesivas de célula a célula de proteínas atadas por membrana. Este protocolo, que ha evolucionado con el tiempo, fue optimizado a partir del protocolo publicado original y las variaciones posteriores del protocolo mediante el cambio de tres parámetros experimentales. Uno, se cambió la temperatura de incubación de las células. El protocolo original requiere la incubación de células en el paso 1.9 a 4 °C. Esta baja temperatura puede actuar como un factor de estrés ambiental y puede disminuir la viabilidad celular que conduce a la muerte celular y lisis. Durante la lisis celular, las células secretan ADN genómico y restos celulares en medios que hacen que las células se agrupen en solución, lo que conduce a falsos positivos durante la toma de imágenes. Dos, el número de células por condición se incrementó a 200.000 por población y el tamaño objetivo se cambió a un 5x; esto permite al investigador crear imágenes de un mayor número de interacciones por campo de visión con el fin de aumentar el poder estadístico dentro de cada n. Tres, el índice de agregación se midió de manera diferente. Los índices de agregación anteriores estaban limitados por la selección del tamaño del clúster por parte del experimentador, lo que llevó a la exclusión de clústeres de "subtención". Por el contraste, los umbrales ahora se establecen para el tamaño de las células individuales en "tiempo cero", y la agregación ahora se calcula como el área superpuesta dividida por la suma de las dos áreas de canal menos el área de superposición multiplicada por 100 en "tiempo 60" que permite la inclusión de grupos positivos más pequeños que hacen que el ensayo sea más sensible a otros pares de ligando de proteínas (Figura 2B,C).
Es posible que sea necesario solucionar problemas y optimizar en función de las proteínas que interactúan probadas. Aunque el período de incubación hasta la adquisición final de la imagen variará dependiendo de las proteínas probadas, es fundamental que no se observe ninguna agregación en 'tiempo cero'. Si la agregación se ve en el momento cero, puede implicar que las células no estaban sanas para empezar. Esto puede deberse a varios factores, incluyendo la exposición repentina a temperaturas inferiores a 37 °C o un procedimiento experimental lento. Es importante destacar que el medio de resuspensión para el paso 1.7 debe estar a 37 °C, lo que permitirá que las células alcancen gradualmente la temperatura ambiente sin un descenso bruso y repentino de la temperatura. Una manera de tener una salud celular óptima durante todo el experimento es asegurarse de que los pasos 1.7 a 1.9 se completen dentro de un período de tiempo de 25 minutos sin pausas en el medio. Se recomienda que el microscopio esté configurado y listo para usar antes de las células de recolección celular en el paso 1.5; esto garantiza que una verdadera imagen 'time zero' se pueda tomar inmediatamente en el paso 2.2.
Si no se observa la agregación después de 60 minutos de incubación, varios factores pueden estar contribuyendo a esta falta de adherencia. En primer lugar, las proteínas en cuestión pueden no ser parejas de unión o pueden participar en interacciones de baja afinidad no detectables por este ensayo. En este caso, puede ser necesario un ensayo más sensible. En segundo lugar, las proteínas de interés pueden no localizarse en la membrana cuando se expresan solas en las células HEK. En este caso, confirme que la proteína se localiza mediante técnicas bioquímicas (biotinilación superficial) o etiqueta directamente la proteína de interés con una etiqueta fluorescente y una imagen de células HEK293T a 40x o más de aumento para evaluar la expresión superficial. Sin embargo, después de confirmar la localización de membranas, recomendamos utilizar variantes sin etiquetar para este ensayo de agregación celular HEK con el fin de evaluar con mayor precisión la capacidad de unión de la proteína nativa. En tercer lugar, en este protocolo permitimos que Neurexin3α expresara durante 48 h; sin embargo, el tiempo de expresión de proteínas puede variar dependiendo de las proteínas analizadas. En cuarto lugar, es fundamental complementar los medios en el paso 1.7 con MgCl2 y CaCl2 si las proteínas en cuestión dependen de cationes divalentes como es el caso del ejemplo de Neurexins y LRRTM211. Si se desconoce si los interlocutores de interacción requieren cationes divalentes para la adhesión, agregue EDTA en una condición. El EDTA debe quelatar cationes de reminado naturalmente presentes en DMEM asegurando una solución libre de calcio y magnesio. Si se observa adhesión después de la adición de EDTA, las proteínas en cuestión no requieren cationes divalentes para la adhesión.
Existen muchos métodos para probar las interacciones proteicas; sin embargo, la mayoría no son específicos para probar sólo las interacciones trans que ocurren de una célula a otra y requieren tediosas medidas de purificación de proteínas. Aunque el ensayo de agregación de células HEK no es una medida directa de afinidad y no debe utilizarse para reemplazar un enfoque más cuantitativo para recuperar constantes de disociación, hasta donde sabemos, este ensayo representa un enfoque para probar las interacciones trans verdaderas de una manera semicuantitativa y relativamente eficiente. Además, debido a la relativa facilidad de este ensayo, el ensayo de agregación de células HEK se puede utilizar junto con estos enfoques más cuantitativos para obtener una caracterización más amplia y completa de las interacciones que tienen lugar.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Instituto Nacional de Salud Mental (R00MH103531 y R01MH116901 a J.A.), una beca de capacitación predoctoral del Instituto Nacional de Medicina General (T32GM007635 a S.R.), y una Beca Lyda Hill Gilliam de Estudio Avanzado (GT11021 a S.R.). Agradecemos al Dr. Kevin Woolfrey la ayuda con el microscopio, el Dr. K Ulrich Bayer por el uso de su microscopio epifluorescente, y Thomas Südhof (Universidad de Stanford) por el plásmido LRRTM2.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL disposable microtubes with snap caps | VWR | 89000-028 | Incubation of mixed population of HEK cells |
| 1000 mL Rapid—Flow Filter Unit, 0.2 um aPES membrane | Thermo Fisher | 567-0020 | Sterilization of HEK media |
| 15 mL SpectraTube centrifuge tubes | Ward’s Science | 470224-998 | Harvesting HEK cells |
| 6 well sterile tissue culture plates | VWR | 100062-892 | culturing HEK cells |
| Calcium Chloride | Sigma | 223506-500G | Calcium phosphate transfection, HEK cell resuspension |
| Centrifuge- Sorvall Legend RT | Kendro Laboratory Products | 75004377 | Harvesting HEK cells |
| CO2 cell incubator | Thermo Scientific | HERACELL 150i | Incubation of HEK cells during growth |
| DMEM, 1x (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate | Corning | 10-013-CV | HEK cell maintenance |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline PBS (1X) | Gibco | 14190-144 | Passaging/harvesting HEK cell |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | ED-500G | Harvesting HEK cells |
| Falcon Vented culture flasks, 75cm2 growth area | Corning | 9381M26 | Culturing HEK cells |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | 17L184 | HEK cell maintenance |
| HEK293T cells | ATCC | Model system | |
| ImageJ | NIH | V: 2.0.0-rc-69/1.52p | Image analysis |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma | M9272-500G | HEK cell resuspension |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Fisher BioReagents | BP332-500 | Calcium phosphate transfection |
| Trypsin 0.25% (1X) Solution | GE Healthcare Life Sciences | SH30042.01 | Passaging HEK cells |
| Tube rotator | Incubation of mixed population of HEK cells | ||
| UltraClear Microscope slides. White Frosted, Positive Charged | Denville Scientific Inc. | M1021 | Image acquisition |
| Wide-field microscope | Zeiss | Axio Vert 200M | Image acquisition |
References
- Südhof, T. C. Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease. Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).
- Lakey, J. H., Raggett, E. M.
- Aoto, J., Martinelli, D. C., Malenka, R. C., Tabuchi, K., Südhof, T. C. Presynaptic neurexin-3 alternative splicing trans-synaptically controls postsynaptic AMPA receptor trafficking. Cell. 154 (1), 75-88 (2013).
- Aoto, J., Földy, C., Ilcus, S. M. C., Tabuchi, K., Südhof, T. C. Distinct circuit-dependent functions of presynaptic neurexin-3 at GABAergic and glutamatergic synapses. Nature Neuroscience. 18 (7), 997-1007 (2015).
- Südhof, T. C. Synaptic Neurexin Complexes: A Molecular Code for the Logic of Neural Circuits. Cell. 171 (4), 745-769 (2017).
- Dai, J., Aoto, J., Südhof, T. C. Alternative Splicing of Presynaptic Neurexins Differentially Controls Postsynaptic NMDA and AMPA Receptor Responses. Neuron. 102 (5), 993-1008 (2019).
- Restrepo, S., Langer, N. J., Nelson, K. A., Aoto, J. Modeling a Neurexin-3α Human Mutation in Mouse Neurons Identifies a Novel Role in the Regulation of Transsynaptic Signaling and Neurotransmitter Release at Excitatory Synapses. The Journal of Neuroscience. 39 (46), 9065-9082 (2019).
- Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., Südhof, T. C. LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64 (6), 791-798 (2009).
- de Wit, J., et al. LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64 (6), 799-806 (2009).
- Linhoff, M. W., et al. An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers. Neuron. 61 (5), 734-749 (2009).
- Siddiqui, T. J., Pancaroglu, R., Kang, Y., Rooyakkers, A., Craig, A. M. LRRTMs and Neuroligins Bind Neurexins with a Differential Code to Cooperate in Glutamate Synapse Development. Journal of Neuroscience. 30 (22), 7495-7506 (2010).
- Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Bacchetti, S., Graham, F. L. Transfer of the gene for thymidine kinase to thymidine kinase-deficient human cells by purified herpes simplex viral DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (4), 1590-1594 (1977).
- Cerchiari, A. E., et al. A strategy for tissue self-organization that is robust to cellular heterogeneity and plasticity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7), 2287-2292 (2015).
- Burdick, M. M., McCarty, O. J. T., Jadhav, S., Konstantopoulos, K. Cell-cell interactions in inflammation and cancer metastasis. IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine. 20 (3), 86-91 (2001).
- Fox, D. A., Gizinski, A., Morgan, R., Lundy, S. K. Cell-cell interactions in rheumatoid arthritis synovium. Rheumatic Diseases Clinics of North America. 36 (2), 311-323 (2010).
- Yamagata, A., et al. Structural insights into modulation and selectivity of transsynaptic neurexin-LRRTM interaction. Nature Communications. 9 (1), 3964 (2018).
- Nguyen, T., Südhof, T. C. Binding properties of neuroligin 1 and neurexin 1beta reveal function as heterophilic cell adhesion molecules. The Journal of Biological Chemistry. 272 (41), 26032-26039 (1997).
- Boucard, A. A., Ko, J., Südhof, T. C. High Affinity Neurexin Binding to Cell Adhesion G-protein-coupled Receptor CIRL1/Latrophilin-1 Produces an Intercellular Adhesion Complex. Journal of Biological Chemistry. 287 (12), 9399-9413 (2012).
