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Neuroscience

एक विषमता कोशिका प्रणाली में प्रोटीन एकत्रीकरण के माध्यम से ट्रांससेलुलर इंटरैक्शन को मापने

Published: May 22, 2020 doi: 10.3791/61237
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Pharmacology, University of Colorado Denver School of Medicine

Summary

यहां, हम फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके एक विषमता कोशिका प्रणाली में ट्रांस में लिगांड-रिसेप्टर इंटरैक्शन को तेजी से और अर्धकंठितकरने के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

सेलुलर इंटरफेस पर प्रोटीन इंटरैक्शन ऊतक विकास और कैंसर प्रगति से लेकर इसके गठन और रखरखाव तक जैविक परिणामों की एक भीड़ तय करते हैं। इनमें से कई मौलिक बातचीत ट्रांस में होती है और आम तौर पर झिल्ली लंगरबद्ध बाध्यकारी जोड़े को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं के बीच हेट्रोफिलिक या होमोफिलिक इंटरैक्शन से प्रेरित होती है। कैसे रोग प्रासंगिक उत्परिवर्तन इन मौलिक प्रोटीन बातचीत को बाधित स्पष्ट सेल जीव विज्ञान क्षेत्रों के असंख्य में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं । कई प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन परखें आमतौर पर सीआईएस और ट्रांस इंटरैक्शन के बीच अस्पष्ट नहीं होती हैं, जो संभावित रूप से वीवो में होने वाली बाध्यकारी की सीमा का अधिक अनुमान लगाते हैं और इसमें प्रोटीन और/या विशेष निगरानी उपकरणों की श्रम गहन शुद्धि शामिल होती है । यहां, हम एक अनुकूलित सरल प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो लंबे प्रोटीन शुद्धिकरण या विशेष उपकरणों की आवश्यकता के बिना केवल ट्रांस इंटरैक्शन के अवलोकन और मात्राकरण के लिए अनुमति देता है। एचईके सेल एकत्रीकरण परख में एचईके कोशिकाओं की दो स्वतंत्र आबादी का मिश्रण शामिल है, प्रत्येक झिल्ली-बाध्य कॉग्नेट लिगांड व्यक्त करता है। एक छोटी इनक्यूबेशन अवधि के बाद, नमूनों को चित्रित किया जाता है और परिणामस्वरूप एकत्रित होते हैं।

Introduction

सिनैप्टिक आसंजन अणुओं द्वारा सुविधाजनक सिनैप्टिक इंटरैक्शन विकास, संगठन, विनिर्देश, रखरखाव और सिनैप्स के कार्य और तंत्रिका नेटवर्क की पीढ़ी के लिए मूलभूत हैं। इन ट्रांससिनैप्टिक कोशिका आसंजन अणुओं की पहचान तेजी से बढ़ रही है; इस प्रकार, बाध्यकारी भागीदारों की पहचान करना और यह समझना मौलिक रूप से महत्वपूर्ण है कि ये नए आसंजन अणु एक दूसरे के साथ कैसे बातचीत करते हैं। इसके अतिरिक्त, जीनोम अनुक्रमण ने इनमें से कई आसंजन अणुओं में उत्परिवर्तनों की पहचान की है जो आमतौर पर न्यूरोडेवलपमेंटल, न्यूरोसाइकियाट्रिक और व्यसन विकारों की एक भीड़ से जुड़े होते हैं1। जीन में उत्परिवर्तन जो सिनैप्टिक सेल-आसंजन अणुओं के लिए कोड हानिकारक रूप से ट्रांस इंटरैक्शन को बदल सकता है और सिनैप्स गठन और या रखरखाव में रोगविज्ञानी परिवर्तन में योगदान दे सकता है।

मात्रात्मक रूप से प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन जैसे आइसोथर्मल कैलोरिमेट्री, परिपत्र डिक्रोमिज्म, सतह प्लाज्मन अनुनाद2 और हालांकि मात्रात्मक प्रकृति में, उनकी कई सीमाएं हैं। सबसे पहले, उन्हें फिर से संयोजन प्रोटीन की आवश्यकता होती है, कभी-कभी लंबे और थकाऊ शुद्धिकरण चरणों की मांग करते हैं। दूसरा, वे परिष्कृत विशेष उपकरण और तकनीकी विशेषज्ञता की आवश्यकता है । तीसरा, वे बाध्यकारी की सीमा को अधिक आंक सकते हैं क्योंकि वे प्रोटीन के बीच सीआईएस और ट्रांस इंटरैक्शन दोनों के लिए अनुमति देते हैं जो स्वाभाविक रूप से वीवो में एक झिल्ली के लिए सीमित होते हैं। यहां हम एक सरल और अपेक्षाकृत तेजी से परख का प्रस्ताव करते हैं जो विशेष रूप से ट्रांस इंटरैक्शन का परीक्षण करता है।

शुद्ध प्रोटीन परख से जुड़ी कई जटिलताओं को दरकिनार करने के लिए, हमने एक सेल-आधारित प्रोटीन इंटरैक्शन परख को अनुकूलित किया है जो कम विषम कोशिका प्रणाली में ट्रांस इंटरैक्शन को पुनः प्राप्त करता है। इस परख का उपयोग पहले विभिन्न रूपों में ट्रांससेलुलर इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए किया गया है। इस दृष्टिकोण में, उम्मीदवार सेल आसंजन अणु एचईके 293T कोशिकाओं में संक्रमित होते हैं। शारीरिक स्थितियों में, HEK293T कोशिकाएं आत्म-एकत्रीकरण का प्रदर्शन नहीं करती हैं, जिससे वे इस परख के लिए अनुकरणीय मॉडल बनाते हैं। हालांकि, जब रिसेप्टर और लिगांड व्यक्त करने वाली एचईके कोशिकाओं की व्यक्तिगत आबादी को संयुक्त किया जाता है, तो रिसेप्टर के बंधन और लिगांड एचईके कोशिकाओं के एकत्रीकरण को होते हैं। यह एकत्रीकरण विशेष रूप से ट्रांस इंटरैक्शन द्वारा मध्यस्थता की जाती है और आमतौर पर दसियों मिनट में नमूदार होती है। इस विधि में कोई प्रोटीन शुद्धिकरण कदम की आवश्यकता नहीं है, और विधि की दक्षता प्रतिमान पर निर्भर करती है कि एचईसी कोशिकाओं की आबादी को अनुग्नक आसंजन अणुओं को व्यक्त किया जा रहा है और फिर बाद में केवल दसियों मिनट की कल्पना की जा रही है। इसके अतिरिक्त, यह विधि अपेक्षाकृत सस्ती है, क्योंकि न तो एंटीबॉडी और न ही महंगे उपकरणों की आवश्यकता होती है। डेटा के अधिग्रहण के लिए आवश्यक एकमात्र उपकरण एक मानक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप है। इस सेल आधारित परख के लिए एक अतिरिक्त लाभ ट्रांस इंटरैक्शन पर रोग प्रासंगिक बिंदु म्यूटेशन के प्रभाव को जल्दी से स्क्रीन करने की क्षमता है। यह ब्याज के प्रोटीन के उत्परिवर्ती वेरिएंट के सीडीएनए के साथ एचईके कोशिकाओं को ट्रांसफेक्ट करके किया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल में, हम एक उदाहरण पेश करते हैं जिसमें हम जांच करते हैं कि क्या गहन बौद्धिक विकलांगता और मिर्गी के साथ निदान किए गए रोगी में पहचाने जाने वाले नेयूरेक्सिन3α (Neurexin3αA687T)में एक मिसेंस उत्परिवर्तन, ल्यूसिन-समृद्ध दोहराने वाले ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन 2 (LRRTM2) के साथ ट्रांस में बातचीत को बदल देता है। Neurexin3α presynaptic सेल-आसंजन अणुओं के विकासवादी संरक्षित परिवार का एक सदस्य है और जबकि हाल के काम ने सिनैप्स3,4,5,6,7में कई भूमिकाओं की पहचान की है, इस अणु की हमारी सिनैप्टिक समझ और नेरेक्सिन परिवार के सभी सदस्य अधूरे रहते हैं। एलआरआरटीएम2 एक उत्तेजक पोस्टसिनैप्टिक सेल आसंजन प्रोटीन है जो 8 ,9,10सिनैप्सगठन और रखरखाव में भाग लेता है। महत्वपूर्ण बात यह है कि LRRTM2 विशेष रूप से नेरेक्सिन आइसोफॉर्म के साथ बातचीत करता है जिसमें स्प्लिस साइट 4 वैकल्पिक एक्सॉन (एसएस 4-) की कमी है, लेकिन स्प्लिस साइट 4 वैकल्पिक एक्सोन (SS4 +) वाले नेयूरेक्सिन आइसोफॉर्म के साथ नहीं। Neurexin3α में पहचाना गया मानव मिसेंसे उत्परिवर्तन (A687T) एक अअयन्डाड एक्सट्रासेलुलर क्षेत्र में स्थित है जो विकासवादी रूप से संरक्षित है और सभी अल्फा नेयूरेक्सिन 7 के बीचसंरक्षितहै। जैसा कि इन दोनों अणुओं के बीच बातचीत8,9,11 स्थापितकी गई है, हमने प्रश्न पूछा: क्या A687T पॉइंट म्यूटेशन द्वारा बदल दिए गए एलआरआरटीएम2 के लिए Neurexin3α SS4 की बाध्यकारी क्षमता है? इस परख से पता चला है कि A687T बिंदु उत्परिवर्तन अप्रत्याशित रूप से Neurexin3α के एकत्रीकरण LRRTM2 को बढ़ाया सुझाव है कि बाह्राश क्षेत्र जिसमें बिंदु उत्परिवर्तन स्थित है, ट्रांससिनैप्टिक बातचीत मध्यस्थता में एक भूमिका निभाता है ।

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Protocol

1. सेल कल्चर और ट्रांसफैक्शन

  1. डीएमईएम, 1x (ईगल के माध्यम का Dulbecco का संशोधन) के साथ एचईके सेल मीडिया बनाएं, जिसमें 4.5 ग्राम/एल ग्लूकोज, एल-ग्लूटामाइन और सोडियम पायरुवेट और 10% एफबीएस के साथ पूरक किया गया है। बाँझ फिल्टर।
  2. एकत्रीकरण परख के लिए पूर्व निर्धारित लिगांड और रिसेप्टर्स।
    नोट: Neurexin3α SS4 +/-और इसके ज्ञात ligands, LRRTM2 में से एक, इस अध्ययन में इस्तेमाल किया गया । पीसीडीएनए3.1 में सीडीएनए से ब्याज के लिगांड और रिसेप्टर्स व्यक्त किए गए थे। एक गिब्सन विधानसभा का उपयोग PcDNA3.112में Neurexin3αα डालने के लिए किया गया था । Neurexin3α F/R: TTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCCCCCACCATGAGCTTTACCCCCCACTC/
    GAGCGGCCGCCACTGTTCTGGATATCTGCAGAATCTTACACATACATAACTCCTTTTTTTTTTTTTTT।
  3. HEK293T कोशिकाओं को तैयार करें।
    1. एक टी-७५ फ्लास्क में विश्वासघात करने के लिए HEK293T कोशिकाओं को बढ़ाएं ।
    2. एक बार एक्फ्लूएंट होने के बाद, 2 मिलियन के लिए ट्राइप्सिन के 2 एमसीएल का उपयोग करें और 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें। कोशिकाओं को फिर से रीसुस्पेंड करने के लिए फ्लास्क में एचईके मीडिया के 6 एमएल जोड़ें और सभी 8 एमएल को 15 एमएल शंकु नली में स्थानांतरित करें।
    3. 5 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर गोली और कुल 8 एमएल के लिए एचईके सेल मीडिया में रिसिपेंड।
    4. कोशिकाओं की गणना करें और 6-अच्छी प्लेट के प्रत्येक कुएं में 735,000 कोशिकाओं को जोड़ें। एचईके सेल मीडिया का उपयोग करके प्रत्येक अच्छी तरह से 2 एमएल के लिए अंतिम मात्रा को समायोजित करें।
    5. 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें और कोशिकाओं को रात भर बढ़ने या 50-60% की आपूर्ति तक पहुंचने तक अनुमति दें।
  4. कैल्शियम फॉस्फेट विधि13का उपयोग करते हुए ट्रांसफेक्ट HEK293T कोशिकाएं ।
    1. ब्याज के प्रोटीन के 3 माइक्रोन के साथ अच्छी तरह से ट्रांसफेक्ट करें और फ्लोरोसेंट प्रोटीन के 1 माइक्रोग्राम के साथ सह-ट्रांसफेक्ट करें (पीसीडीएनए3 के 3 माइक्रोन-न्यूरेक्सिन3αडब्ल्यूटी एसएस 4- और 1 माइक्रोन एमसीएच ऑफ एमसीएच)।
    2. चरण 1.4.1 के रूप में अच्छी तरह से ट्रांसफेक्ट अच्छी तरह से 2। लेकिन ब्याज के उत्परिवर्तित प्रोटीन के साथ (pcDNA3.1-Neurexin3αA687T SS4-) ।
    3. ब्याज के लिगांड के 3 माइक्रोन के साथ अच्छी तरह से ट्रांसफेक्ट करें और एक और फ्लोरोसेंट प्रोटीन के 1 माइक्रोग्राम के साथ सह-ट्रांसफेक्ट करें (पीसीडीएनए3.1 एलआरआरटीएम 2 और जीएफपी के 1 माइक्रोग्राम के 3 माइक्रोन)।
    4. नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए अच्छी तरह से 4 और अच्छी तरह से 5 को पार करें: अच्छी तरह से-4 जीएफपी के 1 माइक्रोग्राम के साथ और अच्छी तरह से-5 1 माइक्रोग्राम के साथ 1 माइक्रोन ऑफ एमसीएच।
    5. अतिरिक्त शर्तों या नियंत्रण (Neurexin3α WT/A687T SS4 +) की आवश्यकता होने पर एक और प्लेट (चरण1.4.1-1.4.4) तैयार करें।
      नोट: ट्रांसफैक्शन दक्षता का विश्लेषण एक एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के तहत ट्रांसफैक्शन के बाद 24 घंटे किया जाता है और फ्लोरोसेंट प्रोटीन को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं की संख्या के रूप में निर्धारित किया जाता है। एक अधिक सुव्यवस्थित दृष्टिकोण में फ्लोरोसेंट प्रोटीन और ब्याज के लिगामेंट के लिए एक बायोसिस्ट्रोनिक वेक्टर कोडिंग के साथ एचईके कोशिकाओं का ट्रांसफैक्शन शामिल होगा और सह-ट्रांसफैक्शन के ऊपर अत्यधिक सिफारिश की जाती है। इस अध्ययन के मामले में, अल्फा न्यूयूरेक्सिन ~ 4.3 किलोब हैं और कम फ्लोरेसेंस तीव्रता को सह-ट्रांसफेक्शन की आवश्यकता वाले बायोस्ट्रोनिक सिस्टम का उपयोग करके देखा गया था।
  5. ट्रांसफैक्शन के 48 घंटे बाद, एकत्रीकरण के लिए फसल कोशिकाएं।
    1. प्रत्येक को पीबीएस के साथ दो बार अच्छी तरह से धोएं।
    2. पीबीएस में 10 m M EDTA के 1 ml जोड़ें धीरे सेल-टू-सेल इंटरैक्शन और 5 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट प्लेट को अलग करने के लिए ।
      नोट: अध्ययन में आसंजन अणुओं के संभावित प्रोटियोलिटिक दरार के कारण ट्रिप्सिन को चरण 1.5.2 के लिए अनुशंसित नहीं किया जाता है। इसके अतिरिक्त, EDTA के बाद इसके अलावा प्रोटोकॉल को पूरा होने तक नहीं रोका जा सकता है क्योंकि कोशिकाएं अब परिवेश की स्थितियों के संपर्क में होंगी।
    3. धीरे-धीरे कोशिकाओं को अलग करने के लिए प्लेट टैप करें, और प्रत्येक को अलग 15 एमएल शंकु ट्यूबों में अच्छी तरह से फसल करें।
    4. 500 x ग्राम पर सेंट्रलाइज शंकु ट्यूब और 5 मिनट के लिए कमरे का तापमान।
  6. जबकि कोशिकाएं पेलेटिंग कर रही हैं, प्रत्येक माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब के शीर्ष को प्रत्येक स्थिति के साथ लेबल करके 6 इनक्यूबेशन ट्यूब तैयार करें।
    नोट: जीएफपी और रीचेरी स्थितियों के प्रत्येक क्रमपरिवर्तन का उपयोग सभी प्रायोगिक स्थितियों और उचित नियंत्रणों को शामिल करने के लिए किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए: 1. GFP/mCherry, 2. mCherry/LRRTM2-GFP 3 । GFP/Neurexin3αWT SS4--mCherry, 4 । GFP/Neurexin3αA687T SS4--mCherry, 5 । Neurexin3αWT SS4--mCherry/LRRTM2-GFP, 6 । Neurexin3αA687T SS4--mCherry/LRRTM2-GFP । आगे की स्थितियों और नियंत्रण को समायोजित करने के लिए अतिरिक्त ट्यूब बनाएं।
  7. एचईके मीडिया के 500 माइक्रोन में सुपरनैंट और रिसिपेंड कोशिकाओं को हटा दें जिसमें 10 एमएमएम सीसीएल2 और 10 एमएमएम एमजीसीएल2 गर्म होकर 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म हो गया।
    नोट: सीएसीएल2 और एमजीसीएल2 के अलावा आसंजन अणुओं को बाध्यकारी फिर से स्थापित करने की अनुमति देता है और केवल तभी आवश्यक होता है जब प्रश्न में पारकोशिकीय बातचीत भागीदारों को आसंजन के लिए डिवेलेंट cations की आवश्यकता होती है।
  8. प्रत्येक 15 एमएल शंकु नली में कोशिकाओं को एक हीमोसाइटोमीटर और एलिकोट का उपयोग करके प्रत्येक स्थिति की 200,000 कोशिकाओं को उचित ट्यूब में 1.6.1 चरण से 500 माइक्रोन की कुल मात्रा में 1:1 मिश्रण के लिए गिनें।
    नोट: यह केवल गिनती और aliquot मात्रा में प्रति शर्त 5 मिनट लेना चाहिए ।
  9. एक धीमी ट्यूब रोटेटर में कमरे के तापमान पर ट्यूबों को इनक्यूबेट करें।

2. छवि अधिग्रहण

  1. विशिष्ट नमूनों के लिए माइक्रोस्कोप अधिग्रहण मापदंडों को अनुकूलित करें। इस उदाहरण में, छवियों को एक व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोप पर लिया गया था। 5x एयर ऑब्जेक्टिव (एनए: 0.15; WD: 20000 μm) विश्लेषण के लिए एक बड़ा पर्याप्त क्षेत्र पाने के लिए।
  2. चरण 1.8 में एचईके कोशिकाओं की दो स्थितियों को मिलाने के तुरंत बाद बेसलाइन एकत्रीकरण का आकलन करें। ये अब 'टाइम जीरो' छवियां हैं।
    1. 488 और 561 दोनों चैनलों में फ्लोरेसेंस के तहत एक चार्ज माइक्रोस्कोप स्लाइड और छवि पर प्रत्येक नमूना मिश्रण का पिपेट 40 माइक्रोन।
    2. नमूना ड्रॉप प्रति एक फोकस विमान में देखने के तीन अलग-अलग क्षेत्रों का अधिग्रहण करें।
  3. 'समय 60' छवि के रूप में 60 मिनट पर अंतिम छवियों का अधिग्रहण करें।
    1. 60 मिनट इनक्यूबेशन के बाद मिश्रण की 'समय 60' छवि प्राप्त करने के लिए, घूर्णन ट्यूबों से प्रत्येक स्थिति का एक और 40 μL नमूना लें और प्रत्येक नमूने को चार्ज स्लाइड पर पिपेट करें। चरण 2.2.2 में छवि।
      नोट: सेल एकत्रीकरण हर 15 मिनट की जांच की जानी चाहिए जब तक संतृप्ति होती है । एकत्रीकरण का समय प्रोटीन का परीक्षण किया जा रहा पर निर्भर करेगा।

3. ImageJ/फिजी विश्लेषण

  1. फिजी/इमेजजे का उपयोग करके एकत्रीकरण की सीमा की मात्रा निर्धारित करने के लिए, विश्लेषण फ़ाइलों को सहेजें।
    1. प्रदान की गई पूरक कोडिंग फ़ाइलों को कंप्यूटर पर इमेजजे मैक्रो फ़ोल्डर में सहेजें।
    2. प्रदान किए गए एकत्रीकरण मैक्रो (प्लगइन्स, मैक्रो, इंस्टॉल, और "एकत्रीकरण .txt" फ़ाइल का चयन करें) स्थापित करें।
  2. थ्रेसहोल्ड निर्धारित करें।
    1. इमेजजे में फाइल .tif 'टाइम जीरो' लोड करें और चैनलों को विभाजित करें(इमेज | रंग | स्प्लिट चैनल)।
      नोट: पूरे प्रयोग के लिए थ्रेसहोल्डिंग और सबसे छोटा समयकां आकार निर्धारित करने के लिए 'टाइम ज़ीरो' छवि का उपयोग किया जाता है।
    2. प्रत्येक चैनल को मास्क करें(प्लगइन्स | मैक्रोन | AggregationAssay_MakeMask)। छवि खिड़की से मुखौटा बनाओ दिखाई देगा। छवि के लिए सीमा निर्धारित करने और हिस्टोग्राम से क्लस्टर परम निर्धारित करने और ओकेपर क्लिक करने के लिए अगले बॉक्स की जांच करें।
    3. स्लाइड बार का उपयोग करके छवि की सीमा निर्धारित करें, स्लाइड बार के दाईं ओर नंबर रिकॉर्ड करें और ओकेपर क्लिक करें।
    4. क्लस्टर साइज का हिस्टोग्राम दिखाई देगा। प्रयोग के अनुरूप हिस्टोग्राम से क्लस्टर आकार चुनें, मिन क्लस्टर आकार में इस नंबर को टाइप करें: बॉक्स, और ओकेपर क्लिक करें। इस आकार के नीचे के समूहों का विश्लेषण नहीं किया जाएगा।
  3. विश्लेषण चलाएं।
    1. इमेजजे में कंडीशन 1 की 'टाइम 60' इमेज खोलें और चैनलों को स्टेप 3.2.1 में विभाजित करें।
    2. प्रत्येक चैनल (प्लगइन्स, मैक्रो, AggregationAssay_MakeMask) को मास्क करें। चरण 3.2.3 और चरण 3.2.4 में निर्धारित समान सीमा और आकार का उपयोग करें। छवि के लिए सीमा निर्धारित करने और हिस्टोग्राम से क्लस्टर परम निर्धारित करने के लिए अगले बक्से का चयन न करें और उचित क्षेत्रों में आकार और थ्रेसहोल्ड को मैन्युअल रूप से टाइप करें तो ओकेक्लिक करें।
    3. एकत्रीकरण सूचकांक की गणना करें(प्लगइन्स | मैक्रोन | AggregationAssay_CalculateOverlap)। तुलना और निर्देशिका में जिसमें परिणामी फ़ाइलें सहेजेगीं, नकाबपोश चैनलों का चयन करें।
    4. हर स्थिति में हर 'समय 60' छवि के लिए 3.3.1-3.3.3 दोहराएं।
      नोट: एकत्रीकरण सूचकांक को दो चैनल क्षेत्रों की राशि से विभाजित कुल ओवरलैप क्षेत्र के रूप में परिभाषित किया गया है, जो ओवरलैप क्षेत्र को 100 से गुणा करता है (एकत्रीकरण सूचकांक = ओवरलैप क्षेत्र / चैनल 2 के चैनल 1 + क्षेत्र का क्षेत्र - ओवरलैप क्षेत्र] x 100)। यह सामान्यीकरण दो नकाबपोश चैनलों के बीच एक 'या' ऑपरेशन है जो या तो मास्क में कुल पिक्सेल का प्रतिनिधित्व करता है।

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Representative Results

A687T उत्परिवर्तन बढ़ जाती है Neurexin3α SS4-LRRTM27 के लिए बाध्यकारी
यह जांचने के लिए कि बौद्धिक विकलांगता और मिर्गी के रोगी में पाए जाने वाले बिंदु उत्परिवर्तन की शुरूआत से दो ज्ञात सिनैप्टिक प्रोटीन की अंतरकोशिकीय बातचीत कैसे प्रभावित होती है, हमने उपरोक्त एचईके सेल एकत्रीकरण परख(चित्रा 1)का उपयोग किया। कोशिकाओं को धारा 1 के अनुसार संक्रमित किया गया था और प्रोटोकॉल की धारा 1 और 2 के अनुसार इमेजिंग के लिए तैयार किया गया था। कोशिकाओं को बेसलाइन पर चित्रित किया गया था जहां अपेक्षित के रूप में कोई एकत्रीकरण नहीं देखा गया था (नहीं दिखाया गया था)। 60 मिनट पर प्राप्त छवियों प्रोटोकॉल की धारा 3 के रूप में विश्लेषण किया गया। चयन पूर्वाग्रह को कम करने के लिए, प्रयोगकर्ता को अंधा करने के लिए शर्तों को यादृच्छिक किया गया था। इसी तरह के कारणों से हर छवि को देखने के पूरे क्षेत्र को आरओआई के रूप में चुना गया था।

जिन स्थितियों में कोशिकाएं किसी भी सिनैप्टिक लिगांड्स (जीएफपी/एमचेरी) को व्यक्त नहीं कर रही थीं, उन्होंने ६० मिनट की इनक्यूबेशन(चित्रा 2)के बाद न्यूनतम एकत्रीकरण दिखाया । समान रूप से, जिन स्थितियों में कोशिकाओं की दो आबादी में से केवल एक सिनैप्टिक लिगांड्स (mCherry/LRRTM2-GFP या GFP/Neurexin3αWT/A687T SS4--mCherry) एक ६० मिनट इनक्यूबेशन(चित्रा 2)के बाद ंयूनतम एकत्रीकरण प्रदर्शित कर रहे थे । जैसा कि अपेक्षित था, ऐसी स्थितियां जिनमें असंगत आसंजन अणुओं (Neurexin3αWT/A687T SS4+-mCherry/LRRTM2-GFP) के साथ कोशिकाओं की दो आबादी निहित थी, ने ६० मिनट(चित्रा 2B)पर कोई एकत्रीकरण नहीं किया । इन स्थितियों के रूप में महत्वपूर्ण नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा की LRRTM2 SS4 कमी Isoforms (SS4-) Neurexins के लिए विशेष रूप से बांध करने के लिए जाना जाता है और इस एकत्रीकरण परख की विशिष्टता पर प्रकाश डाला गया ।

संगत आसंजन अणुओं के साथ शर्तों8,9,10 (Neurexin3αWT SS4--mCherry/LRRTM2-GFP) एक ६० मिनट इनक्यूबेशन(चित्रा 2C)के बाद महत्वपूर्ण एकत्रीकरण का प्रदर्शन किया । एकत्रीकरण को पीले रंग के रूप में कल्पना की जा सकती है और कोशिकाओं(चित्र 1 और चित्र 2)के बीच ओवरलैप में मौजूद है। आश्चर्य की बात है, जिस स्थिति में Neurexin3α A687T SS4-LRRTM2 (Neurexin3αA687T SS4--mCherry/LRRTM2-GFP) के साथ सह-इनक्यूबेटेड किया गया था, इसके वाइल्डटाइप समकक्ष (Neurexin3αWT SS4-mCherry/LRRTM2-GFP; सकारात्मक नियंत्रण की तुलना में काफी अधिक एकत्रीकरण का प्रदर्शन किया गया। इससे पता चलता है कि Neurexin3α में A687T पॉइंट उत्परिवर्तन Neurexin3α SS4-से LRRTM2 की बाध्यकारी क्षमताओं को बढ़ाता है।

Figure 1
चित्रा 1. एकत्रीकरण परख का कार्यप्रवाह। (क)HEK293T कोशिकाओं को प्रोटीन-1/mCherry, या एक प्रोटीन-2/GFP का उपयोग कर संक्रमित कर रहे हैं । (ख)एन्क्स ऑफ Neurexin3α 48 h लेता है।(C)कोशिकाओं को 10 एमएम ईडीटीए का उपयोग करके काटा जाता है और फिर गोली(डी)। (ई) कोशिकाओं को 1:1 अनुपात में मिलाया जाता है और एचईसी मीडिया के 500 माइक्रोन में पुनः निलंबित किया जाता है जिसमें 10 एमसीएम सीएसीएल2 और एमजीसीएल2होते हैं । (च)कोशिकाओं को कमरे के तापमान पर तब तक इनक्यूबेटेड किया जाता है जब तक एकत्रीकरण नहीं होता और एक अंतिम छवि 'समय 60' पर प्राप्त की जाती है। एकत्रीकरण को देखने के क्षेत्र में दिखाई देने वाले पीले विराम की संख्या के रूप में कल्पना की जाती है। कोई एकत्रीकरण तब नहीं देखा जाता है जब कोशिकाएं सही रिसेप्टर लिगामेंट जोड़े को व्यक्त नहीं कर रही होती हैं और इस प्रकार व्यक्तिगत लाल या हरे रंग के समय्ता के रूप में देखी जाती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2। Neurexin3αA687T SS4- ने Neurexin3α WT SS4-की तुलना में उत्तेजक लिगांड एलआरटीएम 2 के साथ एकत्रीकरण को बढ़ाया है। (A)जीएफपी के साथ 10 मिनट की इनक्यूबेशन के बाद नकारात्मक नियंत्रणों की प्रतिनिधि छवियां, LRRTM2 के साथ mCherry, Neurexin3αWT SS4 +/-के साथ GFP, और Neurexin3αA687T SS4 + के साथ GFP 60 मिनट के बाद दोनों LRRTM2 में Neurexin3αWT SS4-, और LRRTM2 के साथ Neurexin3αA687T SS4-के साथ एकत्रीकरण मनाया गया था। (ख)60 मिनट के बाद सभी एसएस 4 + स्थितियों में एकत्रीकरण सूचकांक का परिमाणीकरण। एकत्रीकरण सूचकांक = ओवरलैप क्षेत्र/ (चैनल 1 + चैनल 2 का क्षेत्रफल - ओवरलैप क्षेत्र) x 100। (C)के रूप में ही(बी)लेकिन SS4-। दिखाए गए डेटा प्रयोगों की संख्या के मतलब ± एसईएम का प्रतिनिधित्व करते हैं (एसईएम: जीएफपी/mCherry ± ०.०२४५, mCherry/LRRTM2 ± ०.०२४६५, GFP/Neurexin3αWT SS4-± ०.०२४५३, GFP/Neurexin3αA687T SS4-± ०.०१०९, Neurexin3αWT SS4-/LRRTM2 ± ०.०५३८, Neurexin3αA687T SS4-/LRRTM2 ± ०.०१७४; पी = = 0.0136) । सलाखों में प्रस्तुत किए गए नंबर स्वतंत्र प्रयोगों की संख्या का प्रतिनिधित्व करते हैं। बिंदीदार रेखाएं नियंत्रण स्थितियों के आधारभूत या औसत न्यूनतम एकत्रीकरण का प्रतिनिधित्व करते हैं। सांख्यिकीय महत्व एक तरह से ANOVA, कई तुलना द्वारा निर्धारित किया गया था; *पीएंड लेफ्टिनेंट;0.05; पी &0.0001. यह आंकड़ा Restrepo एट अलसेसंशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक कोडिंग फ़ाइलें। इन फाइलों को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

सेल आसंजन के दौरान ट्रांस में होने वाले प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन को विच्छेदन करने से परिपक्वता और पुनर्मॉडलिंग के दौरान सिनेप्स के गठन, कार्य और रखरखाव सहित बुनियादी सेलुलर प्रक्रियाओं में अंतर्निहित आणविक तंत्र की बेहतर समझ हो सकती है। सेल-टू-सेल इंटरैक्शन के निहितार्थ न्यूरोबायोलॉजी से परे विस्तार करते हैं और सिग्नल ट्रांसडक्शन, सेल माइग्रेशन और ऊतक विकास14में व्यापक भूमिकाएं होती हैं। कोशिका आसंजन में विपथन उचित कोशिका कार्य के लिए अनिवार्य सेलुलर प्रक्रियाओं को बाधित कर सकते हैं और अंतर्निहित रूप से कैंसर, गठिया, व्यसन,आत्मकेंद्रित और सिजोफ्रेनिया1,15,16जैसे विभिन्न ओंटियोलॉजी कर सकते हैं। यहां, हम एचईके सेल एकत्रीकरण को शामिल करते हुए एक अनुकूलित विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं जो ट्रांस में सेल-आसंजन इंटरैक्शन का परीक्षण करने की अनुमति देताहै।

इस एचईके सेल एकत्रीकरण प्रोटोकॉल के साथ, हम एक प्रेसिनैप्टिक प्रोटीन और इसके पोस्टसिनैप्टिक लिगांड के बीच अनुमानित बाध्यकारी क्षमता के एकत्रीकरण में अंतर को विच्छेदन कर सकते हैं। इस प्रकार, हम इस तरह के रूप में सवाल पूछ सकते हैं: दो आवश्यक सिनैप्टिक प्रोटीन के बीच बातचीत एक बिंदु उत्परिवर्तन से प्रभावित है? अधिक विशेष रूप से, A687T से प्रभावित LRRTM2 के साथ Neurexin3α की ट्रांस इंटरैक्शन है? यहां अध्ययन किया गया A687T मिसेंसे उत्परिवर्तन Neurexin3α7के बाह्य डोमेन के पहले से अपरीक्षित लिंकर क्षेत्र में स्थित है। परिणाम यह दर्शाते हैं कि A687T उत्परिवर्तन LRRTM2(चित्रा 2C)युक्त कोशिकाओं के लिए Neurexin3αA687T युक्त कोशिकाओं के एकत्रीकरण को बढ़ाता है। यह निष्कर्ष महत्वपूर्ण है क्योंकि यह पहले दिखाया गया था कि एलआरआरटीएम केवल एनयूरेक्सिन डोमेन के माध्यम से न्यूरेक्सिन से बांधते हैं जिसे एलएनएस 617कहा जाता है, और आगे पता चलता है कि एलएनएस6 के ऊपर के दृश्य Neurexin3α SS4-और LRRTM27के बीच ट्रांस इंटरैक्शन पर एक स्वतंत्र प्रभाव डाल सकते हैं।

चित्रा 2 में परिणाम सभी नकारात्मक नियंत्रण (GFP/mCherry) के रूप में इस परख की विशिष्टता प्रदर्शित; Neurexin3αWT/A687T SS4-mCherry/GFP या LRRTM-GFP/mCherry) ६० मिनट के बाद कोई नमूदार एकत्रीकरण था । इस अध्ययन में उपयोग किया जाने वाला एक महत्वपूर्ण नियंत्रण, Neurexin3αWT/A687T SS4 + -mCherry/LRRTM-GFP, 60 मिनट के बाद कोई एकत्रीकरण प्रदर्शित नहीं किया गया क्योंकि LRRTM2 को विशेष रूप से SS4 कमी (SS4-) नेयूरेक्सिन के आइसोफॉर्म्स को बांधने के लिए जाना जाता है। यह नियंत्रण दर्शाता है कि झिल्ली से बंधे अणुओं का सरल अतिव्यवहार इस प्रणाली में एकत्रीकरण को मजबूर करने के लिए अपर्याप्त है, जो इस परख की विशिष्टता को और दिखाता है।

यहां वर्णित कोशिका आसंजन परख का व्यापक रूप से ट्रांससिनैप्टिक सेल-आसंजन अणुओं की बातचीत का परीक्षण करने के लिए किया गया है8,18,19. हालांकि, इसका उपयोग झिल्ली सीमित प्रोटीन के चिपकने वाले सेल-टू-सेल इंटरैक्शन का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल, जो समय के साथ विकसित हुआ है, को तीन प्रयोगात्मक मापदंडों को बदलकर मूल प्रकाशित प्रोटोकॉल और प्रोटोकॉल के बाद की विविधताओं से अनुकूलित किया गया था। एक, कोशिकाओं के लिए इनक्यूबेशन तापमान बदल गया था । मूल प्रोटोकॉल 4 डिग्री सेल्सियस पर चरण 1.9 में कोशिकाओं के इनक्यूबेशन के लिए कहते हैं। यह कम तापमान एक पर्यावरण तनाव के रूप में कार्य कर सकते हैं और सेल की व्यवहार्यता को कम कर सकते हैं जिससे सेल मृत्यु और लाइसिस हो सकता है। सेल लाइसिस के दौरान, कोशिकाएं जीनोमिक डीएनए और सेल मलबे को मीडिया में स्रावित करती हैं जो कोशिकाओं को समाधान में झुरमुट करने का कारण बनती हैं जिससे इमेजिंग के दौरान झूठी सकारात्मकता होती है। दो, प्रति स्थिति कोशिकाओं की संख्या को बढ़ाकर 200,000 प्रति जनसंख्या कर दिया गया था और उद्देश्य आकार को 5x में बदल दिया गया था; यह शोधकर्ता को प्रत्येक एन के भीतर सांख्यिकीय शक्ति को बढ़ाने के लिए देखने के क्षेत्र में अधिक से अधिक संख्या में बातचीत की छवि बनाने की अनुमति देता है। तीन, एकत्रीकरण सूचकांक अलग ढंग से मापा गया था । पिछले एकत्रीकरण सूचकांक प्रयोगकर्ता द्वारा क्लस्टर आकार के चयन द्वारा सीमित थे जिससे "उपथरेहोल्ड" समूहों का बहिष्कार किया गया था। इसके विपरीत थ्रेसहोल्ड अब 'समय शून्य' पर व्यक्तिगत सेल आकार के लिए निर्धारित किए जाते हैं, और एकत्रीकरण की गणना अब दो चैनल क्षेत्रों के योग से विभाजित ओवरलैप क्षेत्र के रूप में की जाती है जो 'समय 60' पर 100 से गुणा होता है जो छोटे सकारात्मक समूहों को शामिल करने की अनुमति देता है जो परख को अन्य प्रोटीन-लिगांड जोड़े(चित्रा 2B, सी)के प्रति अधिक संवेदनशील बना देता है।

जांच प्रोटीन परीक्षण के आधार पर समस्या निवारण और अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। यद्यपि अंतिम छवि अधिग्रहण तक इनक्यूबेशन अवधि परीक्षण किए गए प्रोटीन के आधार पर भिन्न होगी, यह महत्वपूर्ण है कि 'समय शून्य' पर कोई एकत्रीकरण नहीं मनाया जाता है। यदि एकत्रीकरण शून्य समय पर देखा जाता है, तो इसका मतलब यह हो सकता है कि कोशिकाएं शुरू करने के लिए स्वस्थ नहीं थीं। यह 37 डिग्री सेल्सियस से नीचे के तापमान के अचानक संपर्क या धीमी प्रायोगिक प्रक्रिया सहित कई कारकों के कारण हो सकता है। महत्वपूर्ण बात, चरण 1.7 के लिए पुनर्पंप मीडिया 37 डिग्री सेल्सियस पर होना चाहिए, जो कोशिकाओं को तापमान में अचानक कठोर गिरावट के बिना कमरे के तापमान तक पहुंचने की अनुमति देगा। पूरे प्रयोग में इष्टतम सेल स्वास्थ्य का एक तरीका यह सुनिश्चित करना है कि 1.9 के बीच में कोई ब्रेक के साथ 25 मिनट की समय सीमा के भीतर चरण 1.7 पूरे हो जाएं। यह सिफारिश की जाती है कि माइक्रोस्कोप सेटअप है और चरण 1.5 में सेल हार्वेस्ट कोशिकाओं से पहले उपयोग करने के लिए तैयार है; यह सुनिश्चित करता है कि एक सच्चे 'टाइम जीरो' छवि को चरण 2.2 में तुरंत लिया जा सकता है।

यदि इनक्यूबेशन के 60 मिनट के बाद एकत्रीकरण नहीं मनाया जाता है, तो कई कारक आसंजन की कमी में योगदान दे सकते हैं। सबसे पहले, प्रश्न में प्रोटीन बाध्यकारी भागीदार नहीं हो सकता है या इस परख से पता लगाने योग्य नहीं कम आत्मीयता बातचीत में संलग्न हो सकता है । इस मामले में, अधिक संवेदनशील परख की आवश्यकता हो सकती है।  दूसरा, ब्याज की प्रोटीन (ओं) एचईके कोशिकाओं में अकेले व्यक्त किए जाने पर झिल्ली का स्थानीयकरण नहीं कर सकती है। इस मामले में, पुष्टि करें कि प्रोटीन जैव रासायनिक तकनीकों (सतह बायोटिनिलेशन) का उपयोग करके स्थानीयकृत है या सतह अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए 40x या उच्च आवर्धन पर फ्लोरोसेंट टैग और छवि HEK293T कोशिकाओं के साथ ब्याज के प्रोटीन को सीधे टैग करता है। हालांकि, झिल्ली स्थानीयकरण की पुष्टि होने के बाद, हम देशी प्रोटीन की बाध्यकारी क्षमता का अधिक सटीक आकलन करने के लिए इस एचईके सेल एकत्रीकरण परख के लिए बिना बतर वेरिएंट का उपयोग करने की सलाह देते हैं। तीसरा, इस प्रोटोकॉल में हमने Neurexin3α को 48 घंटे के लिए व्यक्त करने की अनुमति दी; हालांकि, प्रोटीन अभिव्यक्ति का समय परीक्षण किए गए प्रोटीन के आधार पर भिन्न हो सकता है। चौथा, एमजीसीएल 2 और सीएसीएल2 के साथ चरण 1.7 में मीडिया को पूरक करना महत्वपूर्ण हैयदि प्रश्न में प्रोटीन डिवेलेंट cations पर निर्भर हैं जैसा कि न्यूरेक्सिन और एलआरआरटीएम2 11के उदाहरण के साथ है। यदि यह अज्ञात है कि क्या इंटरैक्शन भागीदारों को आसंजन के लिए डिवेलेंट cations की आवश्यकता होती है, तो ईडीटीए को एक शर्त में जोड़ें। ईडीए को कैल्शियम और मैग्नीशियम मुक्त समाधान सुनिश्चित करने के लिए डीएमईएम में स्वाभाविक रूप से मौजूद पुन: रीमाइनिंग cations को शामिल करना चाहिए। यदि एडीटीए जोड़ के बाद आसंजन मनाया जाता है, तो प्रश्न में प्रोटीन को आसंजन के लिए डिवेलेंट cations की आवश्यकता नहीं होती है।

प्रोटीन इंटरैक्शन का परीक्षण करने के लिए कई तरीके मौजूद हैं; हालांकि, अधिकांश केवल ट्रांस इंटरैक्शन के परीक्षण के लिए विशिष्ट नहीं हैं जो सेल से सेल तक होते हैं और थकाऊ प्रोटीन शुद्धिकरण चरणों की आवश्यकता होती है। यद्यपि एचईके सेल एकत्रीकरण परख आत्मीयता का प्रत्यक्ष उपाय नहीं है और इसका उपयोग हमारे ज्ञान के सर्वोत्तम के लिए वियोजन स्थिरांक को ठीक करने के लिए अधिक मात्रात्मक दृष्टिकोण को प्रतिस्थापित करने के लिए नहीं किया जाना चाहिए, यह परख अर्ध-मात्रात्मक और अपेक्षाकृत कुशल तरीके से सच्चे ट्रांस इंटरैक्शन का परीक्षण करने के लिए एक दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करती है। इसके अलावा, इस परख की सापेक्ष आसानी के कारण, एचईके सेल एकत्रीकरण परख का उपयोग इन अधिक मात्रात्मक दृष्टिकोणों के साथ मिलकर किया जा सकता है ताकि बातचीत का व्यापक और अधिक पूर्ण लक्षण वर्णन प्राप्त किया जा सके।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ मेंटल हेल्थ (R00MH103531 और R01MH116901 से जेए) तक अनुदान, नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ जनरल मेडिसिन (T32GM007635 से एसआर) तक एक प्रीडॉक्टोरल ट्रेनिंग ग्रांट और एडवांस्ड स्टडी (GT11021 से S.R.) के लिए एक Lyda हिल गिलम फैलोशिप (GT11021 से S.R.) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था । हम माइक्रोस्कोप के साथ मदद के लिए डॉ केविन वूलफ्रे, डॉ के उलरिच बायर को उनके एपिफ्लोर्सेंट माइक्रोस्कोप के उपयोग के लिए धन्यवाद देते हैं, और थॉमस Südhof (स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय) LRRTM2 plasmid के लिए ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL disposable microtubes with snap caps VWR 89000-028 Incubation of mixed population of HEK cells
1000 mL Rapid—Flow Filter Unit, 0.2 um aPES membrane Thermo Fisher 567-0020 Sterilization of HEK media
15 mL SpectraTube centrifuge tubes Ward’s Science 470224-998 Harvesting HEK cells
6 well sterile tissue culture plates VWR 100062-892 culturing HEK cells
Calcium Chloride Sigma 223506-500G Calcium phosphate transfection, HEK cell resuspension
Centrifuge- Sorvall Legend RT Kendro Laboratory Products 75004377 Harvesting HEK cells
CO2 cell incubator Thermo Scientific HERACELL 150i Incubation of HEK cells during growth
DMEM, 1x (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate Corning 10-013-CV HEK cell maintenance
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline PBS (1X) Gibco 14190-144 Passaging/harvesting HEK cell
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma ED-500G Harvesting HEK cells
Falcon Vented culture flasks, 75cm2 growth area Corning 9381M26 Culturing HEK cells
Fetal Bovine Serum Sigma 17L184 HEK cell maintenance
HEK293T cells ATCC Model system
ImageJ NIH V: 2.0.0-rc-69/1.52p Image analysis
Magnesium Chloride hexahydrate Sigma M9272-500G HEK cell resuspension
Sodium phosphate dibasic anhydrous Fisher BioReagents BP332-500 Calcium phosphate transfection
Trypsin 0.25% (1X) Solution GE Healthcare Life Sciences SH30042.01 Passaging HEK cells
Tube rotator Incubation of mixed population of HEK cells
UltraClear Microscope slides. White Frosted, Positive Charged Denville Scientific Inc. M1021 Image acquisition
Wide-field microscope Zeiss Axio Vert 200M Image acquisition

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 159 एकत्रीकरण सिनैप्टिक लिगांड्स HEK293T ट्रांस प्रोटीन इंटरैक्शन न्यूयूरेक्सिन एलआरआरटीएम सेल-आसंजन
एक विषमता कोशिका प्रणाली में प्रोटीन एकत्रीकरण के माध्यम से ट्रांससेलुलर इंटरैक्शन को मापने
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Restrepo, S., Schwartz, S. L., Kennedy, M. J., Aoto, J. Measuring Transcellular Interactions through Protein Aggregation in a Heterologous Cell System. J. Vis. Exp. (159), e61237, doi:10.3791/61237 (2020).

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