Summary
Qui presentiamo un protocollo ottimizzato per misurare rapidamente e semiquantitativamente le interazioni ligando-recettore in trans in un sistema cellulare eterologo utilizzando la microscopia a fluorescenza.
Abstract
Le interazioni proteiche alle interfacce cellulari impongono una moltitudine di risultati biologici che vanno dallo sviluppo dei tessuti e dalla progressione del cancro alla formazione e al mantenimento della sinapsi. Molte di queste interazioni fondamentali si verificano in trans e sono tipicamente indotte da interazioni eterofile o omofile tra cellule che esprimono coppie di legame ancorate a membrana. Chiarire come le mutazioni rilevanti della malattia interrompano queste interazioni proteiche fondamentali può fornire informazioni su una miriade di campi della biologia cellulare. Molti test di interazione proteina-proteina in genere non disambiguano tra cis e interazioni trans, il che potenzialmente porta a una sopravvalutazione dell'estensione di legame che si sta verificando in vivo e comporta una purificazione intensiva del lavoro delle proteine e / o apparecchiature di monitoraggio specializzate. Qui presentiamo un semplice protocollo ottimizzato che consente l'osservazione e la quantificazione di solo interazioni trans senza la necessità di lunghe purificazione proteica o attrezzature specializzate. Il saggio di aggregazione cellulare HEK prevede la miscelazione di due popolazioni indipendenti di cellule HEK, ognuna delle quali esprime ligandi affini legati alla membrana. Dopo un breve periodo di incubazione, i campioni vengono immagine e gli aggregati risultanti vengono quantificati.
Introduction
Le interazioni sinaptiche facilitate dalle molecole di adesione sinaptica sono fondamentali per lo sviluppo, l'organizzazione, le specifiche, il mantenimento e la funzione delle sinapsi e la generazione di reti neurali. L'identificazione di queste molecole di adesione delle cellule transsinaptiche è in rapido aumento; pertanto, è fondamentale identificare partner vincolanti e capire come queste nuove molecole di adesione interagiscono tra loro. Inoltre, il sequenziamento del genoma ha identificato mutazioni in molte di queste molecole di adesione che sono comunemente collegate a una moltitudine di disturbi del neurosviluppo, neuropsichiatrici e della dipendenza1. Mutazioni nei geni che codificano per molecole sinaptiche di adesione cellulare possono alterare negativamente le interazioni trasmissibili e possono contribuire ad alterazioni fisiopatiche nella formazione e o nel mantenimento della sinapsi.
Esistono più saggi per valutare quantitativamente le interazioni proteina-proteina come la calorimetria isotermica, il dicroismo circolare, la risonanza plasmonicasuperficiale 2 e, sebbene di natura quantitativa, hanno diversi limiti. In primo luogo, richiedono proteine ricombinanti, a volte richiedendo lunghi e noiosi passaggi di purificazione. In secondo luogo, richiedono sofisticate attrezzature specializzate e competenze tecniche. In terzo luogo, possono sopravvalutare l'estensione del legame in quanto consentono sia interazioni cis che trans tra proteine che sono naturalmente legate a una membrana in vivo. Qui proponiamo un saggio semplice e relativamente rapido che testa esclusivamente le interazioni trans.
Per aggirare molte delle complicazioni associate ai test proteici purificati, abbiamo ottimizzato un saggio di interazione proteica a base cellulare che riassume le interazioni trans in un sistema di cellule eterologhe ridotto. Questo saggio è stato precedentemente utilizzato in varie forme per studiare le interazioni transcellulari. In questo approccio, le molecole di adesione delle cellule candidate vengono trasfette in cellule HEK293T. In condizioni fisiologiche, le cellule HEK293T non mostrano auto-aggregazione, rendendole modelli esemplari per questo saggio. Tuttavia, quando vengono combinate singole popolazioni di cellule HEK che esprimono recettore e ligando, il legame del recettore e del ligando forza l'aggregazione delle cellule HEK. Questa aggregazione è mediata esclusivamente da interazioni trans ed è solitamente osservabile in decine di minuti. Non sono necessari passaggi di purificazione delle proteine in questo metodo, e l'efficienza del metodo si basa sul paradigma che le popolazioni di cellule HEK che esprimono molecole di adesione affini vengono combinate e quindi immaginiate solo decine di minuti dopo. Inoltre, questo metodo è relativamente economico, in quanto non sono necessari né anticorpi né attrezzature costose. L'unica apparecchiatura necessaria per l'acquisizione dei dati è un microscopio fluorescente standard. Un ulteriore vantaggio di questo saggio basato sulle cellule è la capacità di migliorare rapidamente l'effetto delle mutazioni puntili rilevanti della malattia sulle interazioni trans. Questo può essere eseguito trasfettando le cellule HEK con cDNA delle varianti mutanti della proteina di interesse.
In questo protocollo, presentiamo un esempio in cui studiamo se una mutazione missense in Neurexin3α (Neurexin3αA687T), identificata in un paziente a cui è stata diagnosticata una profonda disabilità intellettiva ed epilessia, altera le interazioni in trans con la proteina transmembrana ripetuta ricca di leucina 2 (LRRTM2). Neurexin3α è un membro della famiglia evolutivamente conservata di molecole di adesione cellulare presinaptica e mentre recenti lavori hanno identificato molteplici ruoli alla sinapsi3,4, 5,6,7, la nostra comprensione sinaptica di questa molecola e di tutti i membri della famiglia delle neuressine rimane incompleta. LRRTM2 è una proteina di adesione a cellule postsinaptiche eccitatorie che partecipa alla formazione e al mantenimento della sinapsi8,9,10. È importante sottolineare che LRRTM2 interagisce esclusivamente con le isoforme di neurexina che mancano dell'esone alternativo del sito di giunzione 4 (SS4-) ma non con isoforme di neuresina contenenti l'esone alternativo del sito di giunzione 4 (SS4+). La mutazione del missense umano (A687T) identificata in Neurexin3α si trova in una regione extracellulare non studiato che è conservata evolutivamente e viene conservata tra tutte le neuressine alfa7. Poiché l'interazione tra queste due molecoleè stata stabilita 8,9,11, abbiamo posto la domanda: la capacità di legame di Neurexin3α SS4- a LRRTM2 è alterata da una mutazione puntile A687T? Questo saggio ha rivelato che la mutazione del punto A687T ha inaspettatamente migliorato l'aggregazione di Neurexin3α a LRRTM2 suggerendo che la regione extracellulare in cui si trova la mutazione puntile, gioca un ruolo nella mediazione delle interazioni transsinattiche.
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Protocol
1. Coltura cellulare e trasfezione
- Rendere i supporti cellulari HEK con DMEM, 1x (Modifica del mezzo dell'aquila di Dulbecco) integrati con 4,5 g/L di glucosio, L-glutammina e piruvato di sodio e FBS al 10%. Filtro sterile.
- Predeterminare ligandi e recettori adatti per il test di aggregazione.
NOTA: Neurexin3α SS4+/- e uno dei suoi ligandi noti, LRRTM2, sono stati utilizzati in questo studio. Ligandi e recettori di interesse sono stati espressi da cDNA in pcDNA3.1. Un assieme Gibson è stato utilizzato per inserire Neurexin3α in pcDNA3.112. Neurexin3α F/R: TTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCGCCATGAGCTTTACCCTCCACTC/
GAGCGGCCGCCACTGTGCTGGATATCTGCAGAATTCTTACACATAATACTCCTTGTCCTT. - Preparare le celle HEK293T.
- Far crescere le cellule HEK293T fino alla confluenza in un pallone T-75.
- Una volta confluente, utilizzare 2 mL di tripina e posizionare in un incubatore a 37 °C per 2 minuti. Aggiungere 6 ml di supporti HEK al pallone per rimospendare le celle e trasferire tutti gli 8 ml in un tubo conico da 15 ml.
- Pellet a 500 x g per 5 min e resuspend in supporti cellulari HEK per un totale di 8 mL.
- Contare le cellule e aggiungere 735.000 celle in ogni pozzo di una piastra a 6 po'. Regolare il volume finale a 2 mL per ogni pozzo utilizzando il supporto cellulare HEK.
- Mettere in incubatrice a 37 °C e lasciare che le cellule crescano durante la notte o fino a raggiungere il 50-60% di confluenza.
- Trasfetto cellule HEK293T utilizzando il metodo del fosfatodi calcio 13.
- Trasfetto bene-1 con 3 μg della proteina di interesse e co-trasfettura con 1 μg di proteina fluorescente (3 μg di pcDNA3.1-Neurexin3αWT SS4- e 1 μg di mCherry).
- Trasfetto bene-2 come nel passaggio 1.4.1. ma con la proteina mutata di interesse (pcDNA3.1-Neurexin3αA687T SS4-).
- Trasfetto bene-3 con 3 μg del ligando di interesse e co-trasfetto con 1 μg di un'altra proteina fluorescente (3 μg di pcDNA3.1 LRRTM2 e 1 μg di GFP).
- Trasfetto bene-4 e ben 5 per servire come controlli negativi: ben-4 con 1 μg di GFP e ben-5 con 1 μg di mCherry.
- Preparare un'altra piastra (come nel passaggio 1.4.1-1.4.4) se si richiedono condizioni o controlli aggiuntivi (Neurexin3αWT/A687T SS4+).
NOTA: L'efficienza della trasfezione viene analizzata 24 ore dopo la trasfezione al microscopio a epifluorescenza e quantificata come il numero di cellule che esprimono la proteina fluorescente con cui sono state trasfette. Un approccio più snello includerebbe la trasfezione delle cellule HEK con una codifica vettoriale bicistronica per una proteina fluorescente e il ligando di interesse ed è altamente raccomandato sopra la co-trasfezione. Nel caso di questo studio, le neuressine alfa sono ~ 4,3 kb e la bassa intensità di fluorescenza è stata osservata usando un sistema bicistronico che richiede la co-trasfezione.
- 48 ore dopo la trasfezione, cellule di raccolta per l'aggregazione.
- Lavare ogni bene due volte con PBS.
- Aggiungere 1 mL di EDTA da 10 mM in PBS in ogni pozzo per dissociare delicatamente le interazioni da cellula a cellula e incubare la piastra a 37 °C per 5 min.
NOTA: La tripsidena non è raccomandata per il passaggio 1.5.2 a causa della potenziale scissione proteolitica delle molecole di adesione in studio. Inoltre, dopo l'aggiunta di EDTA, il protocollo potrebbe non essere interrotto fino al completamento poiché le celle saranno ora esposte a condizioni ambientali. - Toccare delicatamente la piastra per staccare le celle e raccoglierla in tubi conici separati da 15 ml.
- Centrifuga tubi conici a 500 x g e temperatura ambiente per 5 min.
- Mentre le cellule sono in pellettizzazione, preparare 6 tubi di incubazione etichettando la parte superiore di ogni tubo di microcentrifugo ad ogni condizione.
NOTA: Ogni permutazione delle condizioni GFP e mCherry deve essere utilizzata per comprendere tutte le condizioni sperimentali e i controlli adeguati. Ad esempio: 1. GFP/mCherry, 2. mCherry/LRRTM2-GFP 3. GFP/Neurexin3αWT SS4--mCherry, 4. GFP/Neurexin3αA687T SS4- –mCherry, 5. Neurexin3αWT SS4-—mCherry/LRRTM2—GFP, 6. Neurexin3αA687T SS4- –mCherry/LRRTM2-GFP. Crea tubi aggiuntivi per adattarsi a ulteriori condizioni e controlli. - Rimuovere le cellule supernatanti e resuspend in 500 μL di mezzi HEK con CaCl2 da 10 mM e MgCl2 da 10 mM riscaldati a 37 °C.
NOTA: L'aggiunta di CaCl2 e MgCl2 consente alle molecole di adesione di ristabilire il legame ed è necessaria solo se i partner di interazione transcellulare in questione richiedono formazioni divalenti per l'adesione. - Contare le cellule in ogni tubo conico da 15 ml utilizzando un emocitometro e aliquote 200.000 celle di ciascuna condizione in un tubo appropriato dal passo 1.6.1 per una miscela 1:1 in un volume totale di 500 μL.
NOTA: Per contare e aliquota devono essere previsti solo 5 minuti per condizione. - Incubare i tubi a temperatura ambiente in un rotatore a tubo lento.
2. Acquisizione di immagini
- Ottimizzare i parametri di acquisizione del microscopio per campioni specifici. In questo esempio, le immagini sono state scattate su un microscopio a campo largo. Utilizzare un obiettivo 5x air (NA: 0.15; WD: 20000 μm) per ottenere un campo abbastanza grande per l'analisi.
- Valutare l'aggregazione di base immediatamente dopo aver mescolato le due condizioni delle celle HEK nel passaggio 1.8. Queste sono ora le immagini 'time zero'.
- Pipetta 40 μL di ogni miscela di campioni su un vetrino del microscopio caricato e immagine sotto fluorescenza sia nei canali 488 che 561.
- Acquisire tre diversi campi di visualizzazione con un piano di messa a fuoco per goccia di esempio.
- Acquisisci le immagini finali a 60 minuti come immagine "tempo 60".
- Per ottenere l'immagine "tempo 60" della miscela dopo un'incubazione di 60 minuti, prendere un altro campione di 40 μL di ciascuna condizione da tubi rotanti e pipettare ogni campione su uno scivolo carico. Immagine come nel passaggio 2.2.2.
NOTA: l'aggregazione cellulare deve essere controllata ogni 15 minuti fino a quando non si verifica la saturazione. La tempistica dell'aggregazione dipenderà dalle proteine testate.
- Per ottenere l'immagine "tempo 60" della miscela dopo un'incubazione di 60 minuti, prendere un altro campione di 40 μL di ciascuna condizione da tubi rotanti e pipettare ogni campione su uno scivolo carico. Immagine come nel passaggio 2.2.2.
3. Analisi ImageJ/Fiji
- Per quantificare l'estensione dell'aggregazione utilizzando Fiji/ImageJ, salvare i file di analisi.
- Salvare i file di codifica supplementari forniti nella cartella imageJ macros del computer.
- Installare la macro di aggregazione fornita (Plugin, Macro, Installa e selezionare il file "AggregationAssay.txt").
- Determinare le soglie.
- Caricare un 'time zero' .tif file in imageJ e dividere i canali (Image | Colore | Canali divisi).
NOTA: l'immagine 'time zero' viene utilizzata per determinare la soglia e la dimensione minima del puncta per l'intero esperimento. - Maschera ogni canale(plugin | Macro | AggregationAssay_MakeMask). Verrà visualizzata la finestra Crea maschera da immagine. Accanto a Determine Threshold for Image e Determine Cluster Params from Histogram e fare clic su OK.
- Determinare la soglia dell'immagine utilizzando la barra delle diapositive, registrare il numero a destra della barra della diapositiva e fare clic su OK.
- Verrà visualizzato un istogramma delle dimensioni del cluster. Selezionare una dimensione del cluster dall'istogramma adatto all'esperimento, digitare questo numero nella casella Dimensioni cluster minimo: e fare clic su OK. I cluster al di sotto di questa dimensione non verranno analizzati.
- Caricare un 'time zero' .tif file in imageJ e dividere i canali (Image | Colore | Canali divisi).
- Eseguire l'analisi.
- Aprire l'immagine "tempo 60" della condizione 1 in imageJ e dividere i canali come nel passaggio 3.2.1.
- Maschera ogni canale (plugin, macro, AggregationAssay_MakeMask). Utilizzare la stessa soglia e dimensione determinata nel passaggio 3.2.3 e nel passaggio 3.2.4. Deselezionare le caselle accanto a Determina soglia per immagine e Determinare i parametri cluster dall'istogramma e digitare manualmente le dimensioni e le soglie nei campi appropriati, quindi fare clic su OK.
- Calcolare l'indice di aggregazione (Plugins | Macro | AggregationAssay_CalculateOverlap). Selezionare i canali mascherati da confrontare e la directory in cui verranno salvate i file risultanti.
- Ripetere i passaggi da 3.3.1 a 3.3.3 per ogni immagine "tempo 60" in ogni condizione.
NOTA: L'indice di aggregazione è definito come l'area di sovrapposizione totale divisa per la somma delle due aree di canale meno l'area di sovrapposizione moltiplicata per 100 (indice di aggregazione = area di sovrapposizione/[area del canale 1 + area del canale 2 – area di sovrapposizione] x 100). Questa normalizzazione è un'operazione 'OR' tra i due canali mascherati che rappresentano i pixel totali in entrambe le maschere.
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Representative Results
La mutazione A687T aumenta Neurexin3α SS4- legando a LRRTM27
Per indagare come le interazioni intercellulari di due proteine sinaptiche note siano influenzate dall'introduzione di una mutazione puntile riscontrata in un paziente con disabilità intellettiva ed epilessia, abbiamo usato il suddetto saggio di aggregazione cellulare HEK (Figura 1). Le cellule sono state trasfette secondo la sezione 1 e preparate per l'imaging secondo le sezioni 1 e 2 del protocollo. Le celle sono state visualizzate nella linea di base in cui non è stata osservata alcuna aggregazione come previsto (non visualizzata). Le immagini acquisite a 60 minuti sono state analizzate come nella sezione 3 del protocollo. Per ridurre al minimo la distorsione della selezione, le condizioni sono state randomizzate per accecare lo sperimentatore. Per motivi simili l'intero campo visivo di ogni immagine è stato selezionato come ROI.
Le condizioni in cui le cellule non esprimevano ligandi sinaptici (GFP/mCherry) mostravano un'aggregazione minima dopo un'incubazione di 60 minuti (Figura 2). Allo stesso modo, le condizioni in cui solo una delle due popolazioni di cellule esprimevano ligandi sinaptici (mCherry/LRRTM2-GFP o GFP/Neurexin3αWT/A687T SS4- —mCherry) presentavano un'aggregazione minima dopo un'incubazione di 60 minuti(figura 2). Come previsto, le condizioni che contenevano due popolazioni di cellule con molecole di adesioni incompatibili (Neurexin3αWT/A687T SS4+—mCherry/LRRTM2-GFP) non presentavano alcuna aggregazione a 60 minuti(figura 2B). Queste condizioni servivano come controlli negativi critici in quanto LRRTM2 è noto per legarsi esclusivamente a SS4 privo di isoforme (SS4-) di Neurexins ed evidenzia la specificità di questo saggio di aggregazione.
Le condizioni con molecole di adesionecompatibili 8,9,10 (Neurexin3αWT SS4- —mCherry/LRRTM2-GFP) hanno mostrato un'aggregazione significativa dopo un'incubazione di 60 minuti (Figura 2C). L'aggregazione può essere visualizzato come gialla ed è presente nella sovrapposizione tra celle (Figura 1 e Figura 2). Sorprendentemente, la condizione in cui Neurexin3α A687T SS4- è stato co-incubato con LRRTM2 (Neurexin3αA687T SS4- —mCherry/LRRTM2-GFP) ha mostrato un'aggregazione significativamente maggiore rispetto alla sua controparte wildtype (Neurexin3αWT SS4- —mCherry/LRRTM2-GFP; controllo positivo). Ciò suggerisce che la mutazione del punto A687T in Neurexin3α migliora le capacità di legame di Neurexin3α SS4- a LRRTM2.
Figura 1. Flusso di lavoro del test di aggregazione. (A) Le cellule HEK293T vengono trasfette utilizzando una proteina-1/mCherry, o una proteina-2/GFP. (B) Espressione di Neurexin3α prende 48 h. (C) Le cellule vengono raccolte utilizzando EDTA da 10 mM e poi pellettate (D). (E) Le cellule sono mescolate in un rapporto 1:1 e rimescolate in 500 μL di supporti HEK contenenti 10 mM CaCl2 e MgCl2. (F) Le cellule vengono incubate a temperatura ambiente fino a quando non si verifica l'aggregazione e viene acquisita un'immagine finale al 'tempo 60'. L'aggregazione viene visualizzato come il numero di puncta gialli visibili nel campo visivo. Nessuna aggregazione si osserva quando le cellule non esprimono le coppie di ligandi del recettore corrette e sono quindi viste come singole puncta rosse o verdi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Neurexin3αA687T SS4- ha migliorato l'aggregazione con ligando eccitatorio LRRTM2 rispetto a Neurexin3αWT SS4-. (A) Immagini rappresentative dei controlli negativi dopo un'incubazione di 60 minuti di mCherry con GFP, mCherry con LRRTM2, GFP con Neurexin3αWT SS4+/-e GFP con Neurexin3αA687T SS4+/-. L'aggregazione è stata osservata dopo 60 minuti sia in LRRTM2 con Neurexin3αWT SS4-, sia in LRRTM2 con Neurexin3αA687T SS4-. (B) Quantificazione dell'indice di aggregazione in tutte le condizioni SS4+ dopo 60 minuti. Indice di aggregazione = area di sovrapposizione/(area del canale 1 + area del canale 2 – area di sovrapposizione) x 100. (C) Uguale a (B) ma SS4-. I dati mostrati rappresentano la media ± SEM del numero di esperimenti (SEM: GFP/mCherry ± 0,0245, mCherry/LRRTM2 ± 0,02465, GFP/Neurexin3αWT SS4- ± 0,02453, GFP/Neurexin3αA687T SS4- ± 0,0109, Neurexin3αWT SS4-/LRRTM2 ± 0,0538, Neurexin3αA687T SS4-/LRRTM2 ± 0,0174; p= 0,0136). I numeri presentati nelle barre rappresentano il numero di esperimenti indipendenti effettuati. Le linee tratteggiate rappresentano l'aggregazione minima di base o media delle condizioni di controllo. La significatività statistica è stata determinata da ANOVA uni-way, confronti multipli; *p<0,05; p<0.0001.Questa cifra è stata modificata da Restrepo etal. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
File di codifica supplementari. Clicca qui per scaricare questi file.
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Discussion
Sezionare le interazioni proteina-proteina che si verificano in trans durante l'adesione cellulare può portare a una migliore comprensione dei meccanismi molecolari alla base dei processi cellulari di base tra cui la formazione, la funzione e il mantenimento delle sinapsi durante la maturazione e il rimodellamento. Le implicazioni delle interazioni cellula-cellula si espandono oltre la neurobiologia e hanno ruoli più ampi nella trasduzione del segnale, nella migrazione cellulare e nello sviluppo deitessuti 14. Le aberrazioni nell'adesione cellulare possono interrompere i processi cellulari imperativi per una corretta funzione cellulare e possono sottoscrivire una varietà di eziologie come cancro, artrite, dipendenza, autismo e schizofrenia1,15,16. Qui viene fornito un protocollo dettagliato ottimizzato che coinvolge l'aggregazione di celle HEK che consente di testare le interazioni di adesione delle celle in trans.
Con questo protocollo di aggregazione cellulare HEK, possiamo sezionare le differenze di aggregazione per approssimare la capacità di legame tra una proteina presnaptica e il suo ligando postinaptico. Come tale, possiamo porre domande come: l'interazione tra due proteine sinaptiche essenziali è influenzata da una mutazione puntile? Più specificamente, l'interazione trans di Neurexin3α con LRRTM2 è influenzata da A687T? La mutazione missense A687T studiata qui si trova in una regione di linker precedentemente non studiata del dominio extracellulare di Neurexin3α7. I risultati illustrano che la mutazione A687T migliora l'aggregazione delle cellule contenenti Neurexin3αA687T alle cellule contenenti LRRTM2 (Figura 2C). Questa scoperta è significativa perché è stato precedentemente dimostrato che gli LRTM si legano solo alle Neurexins attraverso un dominio di Neurexin chiamato LNS617, e suggerisce inoltre che le sequenze a monte di LNS6 possono esercitare un effetto indipendente sulle interazioni trans tra Neurexin3α SS4- e LRRTM27.
I risultati della figura 2 mostrano la specificità di questo saggio come tutti i controlli negativi (GFP/mCherry; Neurexin3αWT/A687T SS4- —mCherry/GFP o LRRTM-GFP/mCherry) non aveva aggregazione osservabile dopo 60 minuti. Un controllo critico utilizzato in questo studio, Neurexin3αWT/A687T SS4+ — mCherry/LRRTM-GFP, non ha mostrato alcuna aggregazione dopo 60 min perché LRRTM2 è noto per legarsi esclusivamente a SS4 privo (SS4-) isoforme di Neurexin. Questo controllo dimostra che la semplice sovraespressione di molecole legate alla membrana non è sufficiente a forzare l'aggregazione in questo sistema, il che illustra ulteriormente la specificità di questo saggio.
Il saggio di adesione cellulare qui descritto è stato ampiamente utilizzato per testare le interazioni delle molecole di adesione cellulare transsinaptica8,18,19; tuttavia, può essere utilizzato per testare le interazioni adesive da cellula a cellula di proteine tethered a membrana. Questo protocollo, che si è evoluto nel tempo, è stato ottimizzato dal protocollo originale pubblicato e dalle successive variazioni del protocollo modificando tre parametri sperimentali. Uno, la temperatura di incubazione per le cellule è stata cambiata. Il protocollo originale prevede l'incubazione di cellule nella fase 1.9 a 4 °C. Questa bassa temperatura può agire come stressante ambientale e può ridurre la vitalità cellulare portando alla morte cellulare e allalisi. Durante la lisi cellulare, le cellule secernono DNA genomico e detriti cellulari in mezzi che causano l'accumulo di cellule in soluzione che porta a falsi positivi durante l'imaging. In secondo luogo, il numero di cellule per condizione è stato aumentato a 200.000 per popolazione e la dimensione oggettiva è stata cambiata in 5x; ciò consente al ricercatore di visualizzare un maggior numero di interazioni per campo visivo al fine di aumentare il potere statistico all'interno di ogni n. In terzo luogo, l'indice di aggregazione è stato misurato in modo diverso. I precedenti indici di aggregazione erano limitati dalla selezione delle dimensioni del cluster da parte dello sperimentatore che portava all'esclusione dei cluster "subreshold". Al contrario, le soglie sono ora fissate per la dimensione delle singole cellule al 'tempo zero', e l'aggregazione è ora calcolata come l'area sovrapposta divisa per la somma delle due aree del canale meno l'area di sovrapposizione moltiplicata per 100 al 'tempo 60' che consente l'inclusione di cluster positivi più piccoli rendendo il saggio più sensibile ad altre coppie proteina-ligando(Figura 2B,C).
La risoluzione dei problemi e l'ottimizzazione possono essere necessarie a seconda delle proteine interagenti testate. Sebbene il periodo di incubazione fino all'acquisizione finale dell'immagine differirà a seconda delle proteine testate, è fondamentale che non si osservi alcuna aggregazione al 'tempo zero'. Se l'aggregazione viene vista al tempo zero, può implicare che le cellule non erano sane per cominciare. Ciò può essere dovuto a diversi fattori, tra cui l'esposizione improvvisa a temperature inferiori a 37 °C o una procedura sperimentale lenta. È importante sottolineare che il supporto di sospensione per il passaggio 1.7 dovrebbe essere a 37 °C, il che consentirà alle cellule di raggiungere gradualmente la temperatura ambiente senza un improvviso e duro calo di temperatura. Un modo per avere una salute ottimale delle cellule durante l'esperimento è garantire che i passaggi da 1,7 a 1,9 siano completati entro un intervallo di tempo di 25 minuti senza interruzioni nel mezzo. Si raccomanda che il microscopio sia configurato e pronto per l'uso prima delle cellule di raccolta cellulare nel passaggio 1.5; ciò garantisce che una vera immagine "time zero" possa essere scattata immediatamente nel passaggio 2.2.
Se l'aggregazione non viene osservata dopo 60 minuti di incubazione, diversi fattori possono contribuire a questa mancanza di adesione. In primo luogo, le proteine in questione potrebbero non essere partner vincolanti o possono impegnarsi in interazioni a bassa affinità non rilevabili da questo saggio. In questo caso, potrebbe essere necessario un saggio più sensibile. In secondo luogo, le proteine di interesse potrebbero non localizzare la membrana se espresse da sole nelle cellule HEK. In questo caso, confermare che la proteina è membrana localizzata utilizzando tecniche biochimiche (biotinylazione superficiale) o etichettare direttamente la proteina di interesse con un tag fluorescente e un'immagine cellule HEK293T a ingrandimento 40x o superiore per valutare l'espressione superficiale. Tuttavia, dopo la conferma della localizzazione della membrana, si consiglia di utilizzare varianti non registrate per questo test di aggregazione cellulare HEK al fine di valutare più accuratamente la capacità di legame della proteina nativa. In terzo luogo, in questo protocollo abbiamo permesso a Neurexin3α di esprimere per 48 h; tuttavia, il tempo di espressione delle proteine può variare a seconda delle proteine testate. In quarto luogo, è fondamentale integrare i mezzi nella fase 1.7 con MgCl2 e CaCl2 se le proteine in questione dipendono da formazioni divalenti, come nel caso dell'esempio di Neurexins e LRRTM211. Se non si sa se i partner di interazione richiedano formazioni divalenti per l'adesione, aggiungere l'EDTA in una condizione. L'EDTA deve inginominare le formazioni naturalmente presenti in DMEM garantendo una soluzione priva di calcio e magnesio. Se l'adesione viene osservata dopo l'aggiunta di EDTA, le proteine in questione non richiedono formazioni divalenti per l'adesione.
Esistono molti metodi per testare le interazioni proteiche; tuttavia, la maggior parte non è specifica per testare solo le interazioni trans che si verificano da una cellula all'altra e richiedono noiose fasi di purificazione delle proteine. Sebbene il saggio di aggregazione cellulare HEK non sia una misura diretta dell'affinità e non debba essere usato per sostituire un approccio più quantitativo per recuperare costanti di dissociazione, al meglio delle nostre conoscenze, questo saggio rappresenta un approccio per testare le vere interazioni trans in modo semi-quantitativo e relativamente efficiente. Inoltre, a causa della relativa facilità di questo saggio, il saggio di aggregazione cellulare HEK può essere usato in combinazione con questi approcci più quantitativi per ottenere una caratterizzazione più ampia e completa delle interazioni in corso.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni del National Institute of Mental Health (R00MH103531 e R01MH116901 a J.A.), una borsa di formazione pre-dottorato del National Institute of General Medicine (da T32GM007635 a S.R.) e una Lyda Hill Gilliam Fellowship for Advanced Study (GT11021 to S.R.). Ringraziamo il Dr. Kevin Woolfrey per l'aiuto al microscopio, il Dr. K Ulrich Bayer per l'uso del suo microscopio epifluorescente e Thomas Südhof (Stanford University) per il plasmide LRRTM2.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL disposable microtubes with snap caps | VWR | 89000-028 | Incubation of mixed population of HEK cells |
| 1000 mL Rapid—Flow Filter Unit, 0.2 um aPES membrane | Thermo Fisher | 567-0020 | Sterilization of HEK media |
| 15 mL SpectraTube centrifuge tubes | Ward’s Science | 470224-998 | Harvesting HEK cells |
| 6 well sterile tissue culture plates | VWR | 100062-892 | culturing HEK cells |
| Calcium Chloride | Sigma | 223506-500G | Calcium phosphate transfection, HEK cell resuspension |
| Centrifuge- Sorvall Legend RT | Kendro Laboratory Products | 75004377 | Harvesting HEK cells |
| CO2 cell incubator | Thermo Scientific | HERACELL 150i | Incubation of HEK cells during growth |
| DMEM, 1x (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate | Corning | 10-013-CV | HEK cell maintenance |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline PBS (1X) | Gibco | 14190-144 | Passaging/harvesting HEK cell |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | ED-500G | Harvesting HEK cells |
| Falcon Vented culture flasks, 75cm2 growth area | Corning | 9381M26 | Culturing HEK cells |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | 17L184 | HEK cell maintenance |
| HEK293T cells | ATCC | Model system | |
| ImageJ | NIH | V: 2.0.0-rc-69/1.52p | Image analysis |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma | M9272-500G | HEK cell resuspension |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Fisher BioReagents | BP332-500 | Calcium phosphate transfection |
| Trypsin 0.25% (1X) Solution | GE Healthcare Life Sciences | SH30042.01 | Passaging HEK cells |
| Tube rotator | Incubation of mixed population of HEK cells | ||
| UltraClear Microscope slides. White Frosted, Positive Charged | Denville Scientific Inc. | M1021 | Image acquisition |
| Wide-field microscope | Zeiss | Axio Vert 200M | Image acquisition |
References
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