Summary
Burada, floresan mikroskopisi kullanarak heterolog bir hücre sisteminde transta ligand-reseptör etkileşimlerini hızlı ve yarı niteliksel olarak ölçmek için optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Hücresel arayüzlerdeki protein etkileşimleri, doku gelişimi ve kanserin ilerlemesinden sinaps oluşumu ve bakımına kadar çok sayıda biyolojik sonucu belirler. Bu temel etkileşimlerin çoğu transta gerçekleşir ve tipik olarak membran bağlantılı bağlama çiftlerini ifade eden hücreler arasındaki heterofilik veya homofilik etkileşimler tarafından indüklenir. Hastalıkla ilgili mutasyonların bu temel protein etkileşimlerini nasıl bozduğunun aydınlatıcı olması, sayısız hücre biyolojisi alanı hakkında fikir verebilir. Birçok protein-protein etkileşim tahlilleri tipik olarak cis ve trans etkileşimleri arasında ayrım yapmaz, bu da potansiyel olarak in vivo olarak meydana gelen ve protein ve / veya özel izleme ekipmanının emek yoğun saflaştırılmasını içeren bağlama kapsamının aşırı tahmin edilmesine yol açar. Burada, uzun protein saflaştırmalarına veya özel ekipmanlara ihtiyaç duymadan sadece trans etkileşimlerin gözlemlenmesine ve ölçülmesine izin veren optimize edilmiş basit bir protokol sunuyoruz. HEK hücre toplama tahlili, her biri membran bağlı konyak ligandlarını ifade eden iki bağımsız HEK hücresi popülasyonunun karıştırılmasıdır. Kısa bir kuluçka süresinden sonra, örnekler görüntülenir ve elde edilen agregalar ölçülür.
Introduction
Sinaptik yapışma molekülleri tarafından kolaylaştırılan sinaptik etkileşimler, sinapsların gelişimi, organizasyonu, spesifikasyonu, bakımı ve işlevi ve sinir ağlarının üretimi için temeldir. Bu transsynaptik hücre yapışma moleküllerinin tanımlanması hızla artmaktadır; bu nedenle, bağlayıcı ortakları tanımlamak ve bu yeni yapışma moleküllerinin birbirleriyle nasıl etkileşime girdiğini anlamak temel olarak önemlidir. Ek olarak, genom dizilimi, yaygın olarak çok sayıda nörogelişimsel, nöropsikiyatrik ve bağımlılık bozukluğu ile bağlantılı olan bu yapışma moleküllerinin çoğunda mutasyonlar tanımlamıştır1. Sinaptik hücre yapışma moleküllerini kodlayan genlerdeki mutasyonlar trans etkileşimlerini zararlı bir şekilde değiştirebilir ve sinaps oluşumunda ve bakımında patofizyolojik değişikliklere katkıda bulunabilir.
İzotermal kalorimetre, dairesel dikroizm, yüzey plazmon rezonansı2 gibi protein-protein etkileşimlerini nicel olarak değerlendirmek için birden fazla tahlil mevcuttur ve doğada nicel olmasına rağmen, birkaç sınırlamaları vardır. İlk olarak, bazen uzun ve sıkıcı saflaştırma adımları gerektiren rekombinant protein gerektirirler. İkincisi, sofistike özel ekipman ve teknik uzmanlık gerektirirler. Üçüncüsü, doğal olarak bir membran in vivo'ya bağlı proteinler arasında hem cis hem de trans etkileşimlerine izin verdikleri için bağlamanın kapsamını abartabilirler. Burada sadece trans etkileşimlerini test eden basit ve nispeten hızlı bir test öneriyoruz.
Saflaştırılmış protein testleriyle ilişkili komplikasyonların çoğunu atlatmak için, azaltılmış heterolog hücre sisteminde trans etkileşimlerini yeniden sağlayan hücre bazlı bir protein etkileşimi testini optimize ettik. Bu test daha önce hücrelerarası etkileşimleri incelemek için çeşitli şekillerde kullanılmıştır. Bu yaklaşımda aday hücre yapışma molekülleri HEK293T hücrelerine aktarılır. Fizyolojik koşullarda, HEK293T hücreleri kendi kendine toplama sergilemez, bu da onları bu test için örnek modeller haline getirir. Bununla birlikte, reseptör ve ligand ifade eden HEK hücrelerinin bireysel popülasyonları birleştirildiğinde, reseptörün bağlanması ve ligand HEK hücrelerinin toplanmasına zorlar. Bu toplama sadece trans etkileşimleri tarafından aracılık edilir ve genellikle onlarca dakika içinde gözlemlenebilir. Bu yöntemde protein saflaştırma adımlarına gerek yoktur ve yöntemin verimliliği, kognate yapışma moleküllerini ifade eden HEK hücrelerinin popülasyonlarının birleştirildiği ve sadece on dakika sonra görüntülandığı paradigmasına dayanır. Ek olarak, bu yöntem nispeten ucuzdur, çünkü ne antikorlar ne de pahalı ekipmanlar gereklidir. Verilerin eldei için gerekli olan tek ekipman standart bir floresan mikroskoptur. Bu hücre bazlı testin ek bir avantajı, hastalıkla ilgili nokta mutasyonlarının trans etkileşimleri üzerindeki etkisini hızlı bir şekilde tarama yeteneğidir. Bu, ilgi çekici proteinin mutant varyantlarının cDNA'ları ile HEK hücrelerinin transfecting ile gerçekleştirilerek gerçekleştirilebilir.
Bu protokolde, derin zihinsel engellilik ve epilepsi tanısı alan bir hastada tanımlanan Neurexin3α'daki (Neurexin3αA687T)bir yanlış beyin mutasyonu,lösin bakımından zengin tekrarlayan transmembran protein 2 (LRRTM2) ile trans etkileşimlerini değiştirip değiştirmediğini araştırdığımız bir örnek sunuyoruz. Neurexin3α, evrimsel olarak korunmuş presinaptik hücre yapışma molekülleri ailesinin bir üyesidir ve son çalışmalar sinaps3, 4,5,6,7'debirden fazla rol belirlemiş olsa da, bu molekül ve neüroksin ailesinin tüm üyelerine ilişkin sinaptik anlayışımız eksik kalır. LRRTM2, sinaps oluşumu ve bakımı 8,9,10'akatılan uyarıcı bir postynaptik hücre yapıştırma proteinidir. Daha da önemlisi, LRRTM2 sadece splice bölgesi 4 alternatif eksondan (SS4-) yoksun neurexin izoformları ile etkileşime girer, ancak splice bölgesi 4 alternatif ekson (SS4 +) içeren neurexin izoformları ile etkileşime girmez. Neurexin3α'da tanımlanan insan missense mutasyonu (A687T), evrimsel olarak korunan ve tüm alfa neurexins7arasında korunan, unstudied hücre dışı bir bölgede bulunur. Bu iki molekül arasındaki etkileşimkurulduğundan 8,9,11, şu soruyu ortaya attık: Neurexin3α SS4- to LRRTM2'nin bağlanma kabiliyeti bir A687T nokta mutasyonu ile mi değiştirildi? Bu tahlil, A687T nokta mutasyonunun beklenmedik bir şekilde Neurexin3α'nın toplanmasını LRRTM2'ye artırdığını ve nokta mutasyonunun bulunduğu hücre dışı bölgenin transsinaptik etkileşimlere aracılık etmede rol oynadığını ortaya koydu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hücre kültürü ve transfeksiyon
- DMEM, 1x (Dulbecco'nun Eagle's Medium Modifikasyonu) ile 4,5 g/L glikoz, L-glutamin ve sodyum piruvat ve %10 FBS ile desteklenmiş HEK hücre ortamı yapın. Steril filtre.
- Toplama tahlilleri için predetermin uygun ligandlar ve reseptörler.
NOT: Bu çalışmada Neurexin3α SS4+/- ve bilinen ligandlarından biri olan LRRTM2 kullanılmıştır. Ligandlar ve ilgi reseptörleri pcDNA3.1'deki cDNA'lardan ifade edildi. Neurexin3α'yı pcDNA3.112'yeyerleştirmek için bir Gibson montajı kullanıldı. Neurexin3α F/R: TTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCGCCACCATGAGCTTTACCCTCCACTC/
GAGCGGCCGCCACTGTGCTGGATCTGCAGAATTCTTACATAATACTCCTTGTCCTT. - HEK293T hücrelerini hazırlayın.
- HEK293T hücrelerini tek bir T-75 şişesinde izdiah etmek için büyütün.
- Birleştiğinde, 2 mL tripsin kullanın ve 2 dakika boyunca 37 °C inkübatöre yerleştirin. Hücreleri yeniden çıkarmak için şişeye 6 mL HEK ortamı ekleyin ve 8 mL'nin tamamını 15 mL konik bir tüpe aktarın.
- 5 dakika boyunca 500 x g'da pelet ve toplam 8 mL için HEK hücre medyasında yeniden dirildi.
- Hücreleri sayın ve 6 kuyulu bir plakanın her kuyusuna 735.000 hücre ekleyin. HEK hücre ortamı kullanarak her kuyu için son ses seviyesini 2 mL'ye ayarlayın.
- 37 °C inkübatöre yerleştirin ve hücrelerin bir gecede veya% 50-60 izdiah edene kadar büyümesine izin verin.
- Kalsiyum fosfat yöntemini kullanarak HEK293T hücrelerini transfect13.
- Well-1'i 3 μg faiz proteini ile transfect ve 1 μg floresan protein (3 μg pcDNA3.1-Neurexin3αWT SS4- ve 1 μg mCherry) ile birlikte transfect.
- 1.4.1 adımında olduğu gibi well-2'ye transfect. ancak mutasyona uğramış ilgi proteini ile (pcDNA3.1-Neurexin3αA687T SS4-).
- 3 μg faizli ligand ile well-3'ü transfect ve 1 μg başka bir floresan protein (3 μg pcDNA3.1 LRRTM2 ve 1 μg GFP).
- Negatif kontroller olarak hizmet etmek için kuyu-4 ve kuyu-5'i transfect: 1 μg GFP ile well-4 ve 1 μg mCherry ile well-5.
- Ek koşullar veya kontroller (Neurexin3αWT/A687T SS4+) gerekiyorsa başka bir plaka hazırlayın (adım 1.4.1-1.4.4'te olduğu gibi).
NOT: Transfeksiyon verimliliği, bir epifluoresans mikroskobu altında transeksiyondan 24 saat sonra analiz edilir ve transektife edildikleri floresan proteini ifade eden hücre sayısı olarak ölçülür. Daha aerodinamik bir yaklaşım, HEK hücrelerinin floresan bir protein ve ilgi alanı için bicistronic vektör kodlaması ile transfectionını içerecektir ve ko-transfection üzerinde şiddetle tavsiye edilir. Bu çalışmada alfa Neurexins ~4.3 kb'dir ve ko-transfeksiyon gerektiren bir bicistronik sistem kullanılarak düşük floresan yoğunluğu gözlenmiştir.
- Transfection'dan 48 saat sonra, toplama için hücreleri toplar.
- PBS ile her kuyuya iki kez yıkayın.
- Hücreden hücreye etkileşimleri nazikçe ayırmak ve plakayı 5 dakika boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırmak için her kuyuya PBS'de 1 mL 10 mM EDTA ekleyin.
NOT: Çalışmada yapışma moleküllerinin potansiyel proteolitik bölünmesi nedeniyle 1.5.2. adım için tripsin önerilmez. Ayrıca, EDTA eklendikten sonra, hücreler artık ortam koşullarına maruz kalacağından, protokol tamamlanana kadar durdurulmayabilir. - Hücreleri ayırmak için plakaya hafifçe dokunun ve her kuyuyu ayrı 15 mL konik tüpler halinde hasat edin.
- 500 x g'da santrifüj konik tüpler ve 5 dakika oda sıcaklığında.
- Hücreler peletlenirken, her mikrosantrifüj tüpünün üstünü her koşulda etiketleyerek 6 kuluçka tüpü hazırlayın.
NOT: GFP ve mCherry koşullarının her permütasyonu, tüm deneysel koşulları ve uygun kontrolleri kapsayacak şekilde kullanılmalıdır. Örneğin: 1. GFP/mCherry, 2. mCherry/LRRTM2-GFP 3. GFP/Neurexin3αWT SS4-—mCherry, 4. GFP/Neurexin3αA687T SS4- –mCherry, 5. Neurexin3αWT SS4-—mCherry/LRRTM2—GFP, 6. Neurexin3αA687T SS4- –mCherry/LRRTM2—GFP. Daha fazla koşul ve kontrole uyum sağlamak için ek tüpler yapın. - 10 mM CaCl 2 ve 10 mM MgCl 2 ile 37 °C'yeısıtılmış 500μL HEK ortamdaki süpernatant ve resuspend hücrelerini çıkarın.
NOT: CaCl2 ve MgCl2'nin eklenmesi, yapışma moleküllerinin bağlamayı yeniden kurmasını sağlar ve yalnızca söz konusu hücrelerarası etkileşim ortakları yapışma için dalgıç katyonları gerektiriyorsa gereklidir. - Her 15 mL konik tüpteki hücreleri bir hemositometre ve aliquot 200.000 hücre kullanarak, toplam 500 μL hacimde 1:1 karışım için adım 1.6.1'den uygun tüpe sayın.
NOT: Saymak ve aliquot miktarları için koşul başına sadece 5 dakika sürmelidir. - Tüpleri oda sıcaklığında yavaş bir tüp rotatorunda kuluçkaya yatırın.
2. Görüntü alımı
- Belirli numuneler için mikroskop alma parametrelerini optimize edin. Bu örnekte, görüntüler geniş alan mikroskopunda alınmıştır. 5x hava hedefi kullanın (NA: 0.15; WD: 20000 μm) analiz için yeterince büyük bir alan elde etmek için.
- 1.8. adımda HEK hücrelerinin iki koşulunun karıştırılmasından hemen sonra taban çizgisi toplamayı değerlendirin. Bunlar artık 'sıfır zamanı' görüntüleri.
- Pipet 40 μL her örnek karışımın yüklü bir mikroskop slayt ve görüntü floresan altında hem 488 hem de 561 kanallarda.
- Örnek bırakma başına bir odak düzleminden üç farklı görüş alanı elde edin.
- 'Time 60' görüntüsü olarak 60 dakikada son görüntüleri elde edin.
- 60 dakikalık bir inkübasyondan sonra karışımın 'time 60' görüntüsünü elde etmek için, dönen tüplerden her durumun 40 μL'lik bir örneğini daha alın ve her numuneyi yüklü bir kaydırağa pipetleyin. Resim adım 2.2.2'deki gibi.
NOT: Doygunluk gerçekleşene kadar hücre toplama her 15 dakikada bir kontrol edilmelidir. Toplamanın zamanlaması test edilen proteinlere bağlı olacaktır.
- 60 dakikalık bir inkübasyondan sonra karışımın 'time 60' görüntüsünü elde etmek için, dönen tüplerden her durumun 40 μL'lik bir örneğini daha alın ve her numuneyi yüklü bir kaydırağa pipetleyin. Resim adım 2.2.2'deki gibi.
3. ImageJ/Fiji Analizi
- Fiji/ImageJ kullanarak toplamanın kapsamını ölçmek için analiz dosyalarını kaydedin.
- Sağlanan Ek kodlama dosyalarını bilgisayardaki imageJ makrolar klasörüne kaydedin.
- Sağlanan toplama makrosunu yükleyin (Eklentiler, Makrolar, Yükle ve "AggregationAssay.txt" dosyasını seçin).
- Eşikleri belirleyin.
- ImageJ'e 'sıfır zaman' .tif dosyası yükleyin ve kanalları bölün (Resim | Renk | Kanalları Böl).
NOT: 'Sıfır süresi' görüntüsü, tüm deneme için eşik ve en küçük nokta boyutunu belirlemek için kullanılır. - Her kanalı maskele (Eklentiler | Makrolar | AggregationAssay_MakeMask). Görüntüden Maske Yap penceresi görünecektir. Görüntü eşiğini belirle ve Histogram'dan Küme Paramlarını Belirle 'nin yanındaki onay kutuları tamam'ı tıklatın.
- Slayt çubuğunu kullanarak görüntünün eşiğini belirleyin, sayıyı slayt çubuğunun sağ kısmına kaydedin ve Tamam 'ıtıklatın.
- Küme Boyutu histogramı görünecektir. Histogramdan denemeye uygun bir küme boyutu seçin, bu sayıyı En Küçük Küme Boyutu: kutusuna yazın ve Tamam 'ıtıklatın. Bu boyutun altındaki kümeler çözümlenmez.
- ImageJ'e 'sıfır zaman' .tif dosyası yükleyin ve kanalları bölün (Resim | Renk | Kanalları Böl).
- Analizi çalıştır.
- ImageJ'de koşul 1'in 'time 60' görüntüsünü açın ve kanalları adım 3.2.1'deki gibi bölün.
- Her kanalı maskeleyin (Eklentiler, Makrolar, AggregationAssay_MakeMask). 3.2.3 ve adım 3.2.4'te belirlenen eşik ve boyutu kullanın. Görüntü eşiğini belirleme ve Histogram'dan Küme Paramlarını Belirleme'nin yanındaki kutuların seçimini kaldırın ve boyutu ve eşikleri uygun alanlara el ile yazın ve Tamam'ı tıklatın.
- Toplama dizinini hesaplama (Eklentiler | Makrolar | AggregationAssay_CalculateOverlap). Karşılaştırılacak maskelenmiş kanalları ve elde edilen dosyaların kaydedileceği dizini seçin.
- Her koşulda her 'zaman 60' görüntüsü için 3.3.1–3.3.3 adımlarını yineleyin.
NOT: Toplama dizini, iki kanal alanının toplamına bölünen toplam çakışma alanı eksi örtüşme alanının 100 ile çarpışması olarak tanımlanır (Toplama indeksi = çakışma alanı/[kanal 1 alanı + kanal 2 alanı – örtüşme alanı] x 100). Bu normalleştirme, her iki maskedeki toplam pikselleri temsil eden iki maskelenmiş kanal arasında bir 'OR' işlemidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A687T mutasyonu Neurexin3α SS4'ü artırır- LRRTM2 7'ye bağlanma
Bilinen iki sinaptik proteinin hücreler arası etkileşimlerinin, zihinsel engelli ve epilepsili bir hastada bulunan bir nokta mutasyonunun ortaya girmesinden nasıl etkilendiğini araştırmak için yukarıdaki HEK hücre toplama testini kullandık (Şekil 1). Hücreler bölüm 1'e göre trans enfekte olmuş ve protokolün 1. ve 2. bölümlerine göre görüntüleme için hazırlanmıştır. Hücreler, beklendiği gibi toplanmanın gözlenmediği (gösterilmeyen) taban çizgisine göre görüntülendi. 60 dakikada elde edilen görüntüler protokolün 3. Seçim önyargısını en aza indirmek için, deneyciyi kör etmek için koşullar randomize edildi. Benzer nedenlerden dolayı, her görüntünün tüm görüş alanı yatırım getirisi olarak seçildi.
Hücrelerin herhangi bir sinaptik ligand (GFP/mCherry) ifade etmediği koşullar, 60 dakikalık bir inkübasyondan sonra minimum toplama gösterdi (Şekil 2). Aynı şekilde, iki hücre popülasyonunun sadece birinin sinaptik ligandları ifade ettiği koşullar (mCherry/LRRTM2-GFP veya GFP/Neurexin3αWT/A687T SS4- —mCherry) 60 dakikalık bir inkübasyondan sonra minimum toplama sergiledi(Şekil 2). Beklendiği gibi, uyumsuz yapışıklık moleküllerine sahip iki hücre popülasyonu içeren koşullar (Neurexin3αWT/A687T SS4+—mCherry/LRRTM2-GFP) 60 dakikada toplama sergilemedi(Şekil 2B). Bu koşullar, LRRTM2'nin yalnızca Neurexins'in izoformlarından (SS4-) yoksun SS4'e bağlanarak kritik negatif kontroller olarak bilinir ve bu toplama testinin özgüllüğünü vurgular.
Uyumlu yapışma molekülleri8,9,10 (Neurexin3αWT SS4- —mCherry/LRRTM2-GFP) ile ilgili koşullar 60 dakikalık bir inkübasyondan sonra önemli toplama sergiledi (Şekil 2C). Toplama sarı olarak görselleştirilebilir ve hücreler arasındaki örtüşmede bulunur (Şekil 1 ve Şekil 2). Şaşırtıcı bir şekilde, Neurexin3α A687T SS4-'ün LRRTM2 (Neurexin3αA687T SS4- —mCherry/LRRTM2-GFP) ile birlikte kuluçkaya yatırıldığı durum, wildtype muadili (Neurexin3αWT SS4- —mCherry/LRRTM2-GFP; pozitif kontrol). Bu, Neurexin3α'daki A687T nokta mutasyonunun Neurexin3α SS4' ün LRRTM2'ye bağlanma yeteneklerini artırdığını göstermektedir.
Şekil 1. Toplama tahlili iş akışı. (A) HEK293T hücreleri bir protein-1/mCherry veya bir protein-2/GFP kullanılarak trans enfekte edilir. (B) Neurexin3α ekspresyârı 48 saat sürer. (C) Hücreler 10 mM EDTA kullanılarak toplanır ve daha sonra peletlenir (D). (E) Hücreler 1:1 oranında karıştırılır ve 10 mM CaCl 2 ve MgCl2 içeren 500 μL HEK ortamına yenidenatlanır. (F) Hücreler toplama gerçekleşene kadar oda sıcaklığında inkübe edilir ve 'zaman 60'ta son bir görüntü elde edilir. Toplama, görünüm alanında görünen sarı nokta sayısı olarak görselleştirilir. Hücreler doğru reseptör ligand çiftlerini ifade etmediklerinde ve bu nedenle bireysel kırmızı veya yeşil puncta olarak görüldüğünde toplama gözlenmez. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2. Neurexin3αA687T SS4- Neurexin3α WT SS4-'e kıyasla uyarıcı ligand LRRTM2 ile toplamayı artırmıştır. (A) GFP ile mCherry, LRRTM2 ile mCherry, Neurexin3αWT SS4 + / - ile GFP ve Neurexin3αA687T SS4 + / - ile GFP'nin 60 dakikalık inkübasyonundan sonra negatif kontrollerin temsili görüntüleri. Neurexin3αWT SS4-ile LRRTM2 ve Neurexin3αA687T SS4-ile LRRTM2'de 60 dakika sonra toplama gözlendi. (B) Toplama indeksinin 60 dakika sonra tüm SS4+ koşullarında nicelemesi. Toplama indeksi = örtüşme alanı/(kanal 1 alanı + kanal 2 alanı – örtüşme alanı) x 100. (C) Aynı (B) ama SS4-. Gösterilen veriler, deney sayısının ortalama ± SEM'ini temsil eder (SEM: GFP/mCherry ± 0.0245, mCherry/LRRTM2 ± 0,02465, GFP/Neurexin3αWT SS4- ± 0,02453, GFP/Neurexin3αA687T SS4- ± 0,0109, Neurexin3αWT SS4-/LRRTM2 ± 0.0538, Neurexin3αA687T SS4-/LRRTM2 ± 0.0174; p= 0.0136). Çubuklarda sunulan sayılar, gerçekleştirilen bağımsız deneylerin sayısını temsil eder. Noktalı çizgiler, denetim koşullarının taban çizgisini veya ortalama minimum toplamayı temsil eder. İstatistiksel önemi tek yönlü ANOVA, çoklu karşılaştırmalar ile belirlendi; *p<0.05; p<0.0001.Bu şekil Restrepo ve ark.7'den değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Kodlama Dosyaları. Bu dosyaları indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hücre yapışması sırasında transta meydana gelen protein-protein etkileşimlerinin parçalanması, olgunlaşma ve yeniden şekillendirme sırasında sinapsların oluşumu, işlevi ve bakımı da dahil olmak üzere temel hücresel süreçlerin altında bulunan moleküler mekanizmaların daha iyi anlaşılmasına neden olabilir. Hücreden hücreye etkileşimlerin etkileri nörobiyolojinin ötesine genişler ve sinyal transdüksiyonunda, hücre göçünde ve doku gelişiminde daha geniş rollere sahiptir14. Hücre yapışmasındaki sapmalar, uygun hücre fonksiyonu için zorunlu hücresel süreçleri bozabilir ve kanser, artrit, bağımlılık, otizm ve şizofreni gibi çeşitli etiyolojilerin altında olabilir1,15,16. Burada, trans hücre yapıştırma etkileşimlerini test etmeyi sağlayan HEK hücre toplamayı içeren optimize edilmiş ayrıntılı bir protokolsunuyoruz.
Bu HEK hücre toplama protokolü ile, toplamadaki farklılıkları presynaptik bir protein ile postynaptik ligand arasındaki yaklaşık bağlama kapasitesine kadar inceleyebilmeliyiz. Bu nedenle, şu gibi sorular sorabiliriz: iki temel sinaptik protein arasındaki etkileşim bir nokta mutasyonundan etkilenir mi? Daha spesifik olarak, Neurexin3α'nın LRRTM2 ile trans etkileşimi A687T'den etkilenir mi? Burada incelenen A687T missense mutasyonu, Neurexin3α7'ninhücre dışı etki alanının daha önce reddedilmemiş bir bağlayıcı bölgesinde bulunur. Sonuçlar, A687T mutasyonunun Neurexin3αA687T içeren hücrelerin LRRTM2 (Şekil 2C) içeren hücrelere toplanmasını artırdığını göstermektedir. Bu bulgu önemlidir, çünkü daha önce LRRTM'lerin neurexins'e yalnızca LNS617adlı bir Neurexin etki alanı üzerinden bağlandığı gösterilmiştir ve ayrıca LNS6'nın yukarı akış dizilerinin Neurexin3α SS4- ve LRRTM27arasındaki trans etkileşimleri üzerinde bağımsız bir etki yaratabileceğini göstermektedir.
Şekil 2'deki sonuçlar, bu tahlilin tüm negatif kontroller olarak özgüllüğünü gösterir (GFP/mCherry; Neurexin3αWT/A687T SS4- —mCherry/GFP veya LRRTM-GFP/mCherry) 60 dakika sonra gözlemlenebilir bir toplama olmadı. Bu çalışmada kullanılan kritik bir kontrol olan Neurexin3αWT/A687T SS4+ —mCherry/LRRTM-GFP, LRRTM2'nin sadece Neurexin'in (SS4-) izoformlarından yoksun SS4'e bağlandığı bilindiğinden, 60 dk'dan sonra hiçbir toplama sergilemedi. Bu kontrol, membranla ilişkili moleküllerin basit bir şekilde aşırı ifade edilmesi, bu sistemde toplanmaya zorlamak için yetersiz olduğunu göstermektedir, bu da bu tahlilin özgüllüğünü daha da göstermektedir.
Burada açıklanan hücre yapışma testi, transsinaptik hücre yapışma molekülleri 8,18,19'unetkileşimlerini test etmek için yaygın olarak kullanılmıştır; bununla birlikte, membran bağlı proteinlerin yapışkan hücreden hücreye etkileşimlerini test etmek için kullanılabilir. Zamanla gelişen bu protokol, yayınlanan orijinal protokolden ve protokolün sonraki varyasyonlarından üç deneysel parametre değiştirerek optimize edilmiştir. Birincisi, hücrelerin kuluçka sıcaklığı değiştirildi. Orijinal protokol, 4 °C'deki 1.9 adımındaki hücrelerin inkübasyonunu gerektirir. Bu düşük sıcaklık çevresel bir stresör görevi görür ve hücre ölümüne ve lizise yol açan hücre canlılığını azaltabilir. Hücre lizisi sırasında, hücreler genomik DNA ve hücre kalıntılarını ortama salgılar ve bu da hücrelerin görüntüleme sırasında yanlış pozitiflere yol açan çözeltide topaklanarak kümelemesine neden olur. İki, durum başına hücre sayısı nüfus başına 200.000'e çıkarıldı ve hedef boyut 5x olarak değiştirildi; bu, araştırmacının her n içindeki istatistiksel gücü artırmak için görüş alanı başına daha fazla sayıda etkileşim görüntülemesini sağlar. Üç, toplama indeksi farklı ölçüldü. Önceki toplama endeksleri, "alt koruma" kümelerinin dışlanmasına yol açan deneyci tarafından küme boyutunun seçilmesiyle sınırlandırıldı. Karşıtlık eşikleri artık tek tek hücre boyutu için 'sıfır zamanı' olarak ayarlanır ve toplama artık üst üste binen alan, iki kanal alanının toplamına bölünürken hesaplanır ve üst üste biniş alanı 'zaman 60'ta 100 ile çarpılır' ve bu da daha küçük pozitif kümelerin dahil edilmesini sağlar ve bu da tahlilleri diğer protein-ligand çiftlerine karşı daha hassas hale getirir (Şekil 2B,C).
Test edilen etkileşime giren proteinlere bağlı olarak sorun giderme ve optimizasyon gerekebilir. Son görüntü alımına kadar olan kuluçka süresi test edilen proteinlere bağlı olarak farklılık gösterecek olsa da, 'sıfır noktasında' toplama gözlenmedilmemeleri kritik öneme sahiptir. Toplama sıfır zamanında görülürse, hücrelerin başlangıçta sağlıklı olmadığı anlamına gelebilir. Bunun nedeni, 37 °C'nin altındaki sıcaklıklara ani maruz kalma veya yavaş deneysel prosedür gibi çeşitli faktörler olabilir. Daha da önemlisi, adım 1.7 için resüspenzyon ortamı 37 ° C'de olmalıdır, bu da hücrelerin sıcaklıkta ani sert bir düşüş olmadan yavaş yavaş oda sıcaklığına ulaşmasını sağlayacaktır. Deney boyunca en iyi hücre sağlığına sahip etmenin bir yolu, 1,7 ile 1,9 arasındaki adımların arada hiçbir mola olmadan 25 dakikalık bir zaman dilimi içinde tamamlanmasını sağlamaktır. Mikroskobun, adım 1.5'teki hücre hasat hücrelerinden önce kurulumu ve kullanıma hazır olması önerilir; bu, 2.2 adımında hemen gerçek bir 'sıfır zamanı' görüntüsü alınabilmesini sağlar.
60 dakikalık inkübasyondan sonra toplama gözlenmezse, bu yapışma eksikliğine çeşitli faktörler katkıda bulunabilir. İlk olarak, söz konusu proteinler bağlayıcı ortaklar olmayabilir veya bu test tarafından tespit edilemeyen düşük benzeşim etkileşimlerine girebilir. Bu durumda, daha hassas bir tahlil gerekebilir. İkincisi, ilgi çekici proteinler HEK hücrelerinde tek başına ifade edildiğinde zara lokalize olmayabilir. Bu durumda, proteinin biyokimyasal teknikler (yüzey biyotinilasyonu) kullanılarak membranın lokalize olduğunu onaylayın veya yüzey ekspresyonunu değerlendirmek için 40x veya daha yüksek büyütmede floresan etiket ve görüntü HEK293T hücreleri ile doğrudan ilgi proteinini etiketleyin. Bununla birlikte, membran lokalizasyonu onaylandıktan sonra, yerel proteinin bağlama kapasitesini daha doğru bir şekilde değerlendirmek için bu HEK hücre toplama tahlili için etiketlenmemiş varyantlar kullanmanızı öneririz. Üçüncüsü, bu protokolde Neurexin3α'nın 48 saat boyunca ifade etmesine izin verdik; bununla birlikte, protein ekspresyon süresi test edilen proteinlere bağlı olarak değişebilir. Dördüncüsü, söz konusu proteinler Neurexins ve LRRTM211 örneğinde olduğu gibi divalent katyonlarına bağlıysa, 1.7adımdaki medyayı MgCl 2 ve CaCl 2 ile tamamlamak önemlidir. Etkileşim ortaklarının yapışma için divalent katyonları gerektirip gerektirmediği bilinmiyorsa, EDTA'yı tek bir koşula ekleyin. EDTA, kalsiyum ve magnezyum içermeyen bir çözelti sağlamak için DMEM'de doğal olarak bulunan reminasyonları şelat etmelidir. EDTA ilavesi sonrası yapışma görülürse, söz konusu proteinler yapışma için divalent katyon gerektirmez.
Protein etkileşimlerini test etmek için birçok yöntem vardır; bununla birlikte, çoğu sadece hücreden hücreye meydana gelen ve sıkıcı protein saflaştırma adımları gerektiren trans etkileşimlerini test etmek için spesifik değildir. HEK hücre toplama testi doğrudan bir benzeşim ölçüsü olmasa ve ayrışma sabitlerini kurtarmak için daha nicel bir yaklaşımın yerini almak için kullanılmaması gerekse de, bu test gerçek trans etkileşimlerini yarı nicel ve nispeten verimli bir şekilde test etme yaklaşımını temsil etmektedir. Ayrıca, bu tahlilin göreceli kolaylığı nedeniyle, HEK hücre toplama tahlili, gerçekleşen etkileşimlerin daha geniş ve eksiksiz bir şekilde nitelendirilmesini elde etmek için bu daha nicel yaklaşımlarla birlikte kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, Ulusal Ruh Sağlığı Enstitüsü'nden (R00MH103531 ve R01MH116901'den J.A.'ya), Ulusal Genel Tıp Enstitüsü'nden (T32GM007635'ten S.R.'ye) doktora öncesi eğitim Hibesi ve Lyda Hill Gilliam İleri Çalışma Bursu (GT11021'den S.R.'a) tarafından desteklendi. Mikroskopla ilgili yardımları için Dr. Kevin Woolfrey'e, epifluoresan mikroskopunun kullanımı için Dr. K Ulrich Bayer'e ve LRRTM2 plazmidi için Thomas Südhof'a (Stanford Üniversitesi) teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL disposable microtubes with snap caps | VWR | 89000-028 | Incubation of mixed population of HEK cells |
| 1000 mL Rapid—Flow Filter Unit, 0.2 um aPES membrane | Thermo Fisher | 567-0020 | Sterilization of HEK media |
| 15 mL SpectraTube centrifuge tubes | Ward’s Science | 470224-998 | Harvesting HEK cells |
| 6 well sterile tissue culture plates | VWR | 100062-892 | culturing HEK cells |
| Calcium Chloride | Sigma | 223506-500G | Calcium phosphate transfection, HEK cell resuspension |
| Centrifuge- Sorvall Legend RT | Kendro Laboratory Products | 75004377 | Harvesting HEK cells |
| CO2 cell incubator | Thermo Scientific | HERACELL 150i | Incubation of HEK cells during growth |
| DMEM, 1x (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate | Corning | 10-013-CV | HEK cell maintenance |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline PBS (1X) | Gibco | 14190-144 | Passaging/harvesting HEK cell |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | ED-500G | Harvesting HEK cells |
| Falcon Vented culture flasks, 75cm2 growth area | Corning | 9381M26 | Culturing HEK cells |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | 17L184 | HEK cell maintenance |
| HEK293T cells | ATCC | Model system | |
| ImageJ | NIH | V: 2.0.0-rc-69/1.52p | Image analysis |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma | M9272-500G | HEK cell resuspension |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Fisher BioReagents | BP332-500 | Calcium phosphate transfection |
| Trypsin 0.25% (1X) Solution | GE Healthcare Life Sciences | SH30042.01 | Passaging HEK cells |
| Tube rotator | Incubation of mixed population of HEK cells | ||
| UltraClear Microscope slides. White Frosted, Positive Charged | Denville Scientific Inc. | M1021 | Image acquisition |
| Wide-field microscope | Zeiss | Axio Vert 200M | Image acquisition |
References
- Südhof, T. C. Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease. Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).
- Lakey, J. H., Raggett, E. M. Measuring protein-protein interactions. Current Opinion in Structural Biology. 8 (1), 119-123 (1998).
- Aoto, J., Martinelli, D. C., Malenka, R. C., Tabuchi, K., Südhof, T. C. Presynaptic neurexin-3 alternative splicing trans-synaptically controls postsynaptic AMPA receptor trafficking. Cell. 154 (1), 75-88 (2013).
- Aoto, J., Földy, C., Ilcus, S. M. C., Tabuchi, K., Südhof, T. C. Distinct circuit-dependent functions of presynaptic neurexin-3 at GABAergic and glutamatergic synapses. Nature Neuroscience. 18 (7), 997-1007 (2015).
- Südhof, T. C. Synaptic Neurexin Complexes: A Molecular Code for the Logic of Neural Circuits. Cell. 171 (4), 745-769 (2017).
- Dai, J., Aoto, J., Südhof, T. C. Alternative Splicing of Presynaptic Neurexins Differentially Controls Postsynaptic NMDA and AMPA Receptor Responses. Neuron. 102 (5), 993-1008 (2019).
- Restrepo, S., Langer, N. J., Nelson, K. A., Aoto, J. Modeling a Neurexin-3α Human Mutation in Mouse Neurons Identifies a Novel Role in the Regulation of Transsynaptic Signaling and Neurotransmitter Release at Excitatory Synapses. The Journal of Neuroscience. 39 (46), 9065-9082 (2019).
- Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., Südhof, T. C. LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64 (6), 791-798 (2009).
- de Wit, J., et al. LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64 (6), 799-806 (2009).
- Linhoff, M. W., et al. An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers. Neuron. 61 (5), 734-749 (2009).
- Siddiqui, T. J., Pancaroglu, R., Kang, Y., Rooyakkers, A., Craig, A. M. LRRTMs and Neuroligins Bind Neurexins with a Differential Code to Cooperate in Glutamate Synapse Development. Journal of Neuroscience. 30 (22), 7495-7506 (2010).
- Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Bacchetti, S., Graham, F. L. Transfer of the gene for thymidine kinase to thymidine kinase-deficient human cells by purified herpes simplex viral DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (4), 1590-1594 (1977).
- Cerchiari, A. E., et al. A strategy for tissue self-organization that is robust to cellular heterogeneity and plasticity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7), 2287-2292 (2015).
- Burdick, M. M., McCarty, O. J. T., Jadhav, S., Konstantopoulos, K. Cell-cell interactions in inflammation and cancer metastasis. IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine. 20 (3), 86-91 (2001).
- Fox, D. A., Gizinski, A., Morgan, R., Lundy, S. K. Cell-cell interactions in rheumatoid arthritis synovium. Rheumatic Diseases Clinics of North America. 36 (2), 311-323 (2010).
- Yamagata, A., et al. Structural insights into modulation and selectivity of transsynaptic neurexin-LRRTM interaction. Nature Communications. 9 (1), 3964 (2018).
- Nguyen, T., Südhof, T. C. Binding properties of neuroligin 1 and neurexin 1beta reveal function as heterophilic cell adhesion molecules. The Journal of Biological Chemistry. 272 (41), 26032-26039 (1997).
- Boucard, A. A., Ko, J., Südhof, T. C. High Affinity Neurexin Binding to Cell Adhesion G-protein-coupled Receptor CIRL1/Latrophilin-1 Produces an Intercellular Adhesion Complex. Journal of Biological Chemistry. 287 (12), 9399-9413 (2012).
