Summary
Loopmedierad isotermisk förstärkning (LAMP) är ett isotermiskt nukleinsyraförstärkningstest (iNAAT) som har väckt stort intresse för patogendetekteringsområdet. Här presenterar vi ett multilaboratorium-validerat Salmonella LAMP-protokoll som en snabb, pålitlig och robust metod för screening av salmonella i djurfoder och bekräftar presumtiv salmonella från kulturisolering.
Abstract
Loop-medierad isotermisk förstärkning (LAMP) har dykt upp som ett kraftfullt nukleinsyraförstärkningstest för snabb upptäckt av många bakteriella, svamp-, parasitiska och virala medel. Salmonella är en bakteriell patogen av globala livsmedelssäkerhetsproblem, inklusive livsmedel för djur. Presenteras här är ett multi-laboratorie-validerat Salmonella LAMP-protokoll som kan användas för att snabbt screena djurfoder för förekomst av salmonellakontaminering och kan också användas för att bekräfta presumtiva salmonellaisolat som återvunnits från alla livsmedelskategorier. LAMP-analysen riktar sig specifikt mot salmonellainvasionsgenen (invA) och är snabb, känslig och mycket specifik. Mall DNAs framställs av anrikningsbuljonger av djurfoder eller rena kulturer av presumtiva salmonellaisolat. LAMP-reagensblandningen framställs genom att kombinera en isotermisk masterblandning, primers, DNA-mall och vatten. LAMP-analysen körs vid en konstant temperatur av 65 °C i 30 min. Positiva resultat övervakas via realtid fluorescens och kan detekteras så tidigt som 5 min. LAMP-analysen uppvisar hög tolerans mot hämmare i djurfoder eller odlingsmedium, som fungerar som en snabb, pålitlig, robust, kostnadseffektiv och användarvänlig metod för screening och bekräftelse av Salmonella. LAMP-metoden har nyligen införlivats i U.S. Food and Drug Administration's Bacteriological Analytical Manual (BAM) Chapter 5.
Introduction
Loop-medierad isotermisk förstärkning (LAMP) är ett nytt isotermiskt nukleinsyraförstärkningstest (iNAAT) som uppfanns 2000 av en grupp japanska forskare1. Genom bildandet av en målspecifik DNA-struktur för stamslinga under de första stegen använder LAMP en dna-polymeras med strängförskjutning för att effektivt förstärka detta utgångsmaterial kvasi-exponentiellt, vilket resulterar i 109 kopior av målet på mindre än 1 timme1. Jämfört med polymeraskedjereaktion (PCR), en allmänt använd NAAT, har LAMP flera fördelar. För det första utförs LAMP-reaktioner under isotermiska förhållanden. Detta undanröviker behovet av ett sofistikerat termiskt cykelinstrument. För det andra är LAMP mycket tolerant mot odlingsmedier och biologiska ämnen2 med robusthet som demonstreras för både kliniska ochlivsmedelsapplikationer 3,4. Detta förenklar provberedningen och minimerar falska negativa resultat5. För det tredje är LAMP mottagligt för flera detekteringsplattformar, såsom grumlighet, kolormetri, bioluminescens, fluorescens och mikrofluidik6. För det fjärde är LAMP mycket specifikt eftersom det använder fyra till sex specialdesignade primers för att rikta in sig på sex till åtta specifikaregioner 1,7. För det femte är LAMP ultrakänslig och många studier har rapporterat sin överlägsna känslighet för PCR eller realtid PCR8. Slutligen är LAMP snabbare med många analyser som nu antar en 30 minuters standardkörningstid medan PCR-typanalyser vanligtvis tar 1−2 h8.
Dessa attraktiva funktioner underblåste tillämpningen av LAMP i breda patogendetekteringsområden, inklusive in vitro-diagnostik 9,djursjukdomsdiagnostik10och livsmedels- och miljötestning11. I synnerhet har en TB-LAMP (LAMP for Mycobacterium tuberculosis)rekommenderats av WHO som ett giltigt ersättningstest för sputum-utstryksmikroskopi för lungtuberkulosdiagnoser i periferamiljöer 12. LAMP-tillämpningen utvidgas också utöver mikrobiell identifiering till att omfatta påvisande av allergener, djurarter, läkemedelsresistens, genetiskt modifierade organismeroch bekämpningsmedel 13.
Nontyphoidal Salmonella är en zoonotisk patogen av betydande livsmedelssäkerhet och folkhälsoproblem över hela världen14. Det har också identifierats som en viktig mikrobiell fara i livsmedel för djur (dvs. djurfoder)15,16. För att förhindra salmonellasjukdomar/utbrott från förorenad mänsklig mat och djurfoder är det absolut nödvändigt att ha snabba, tillförlitliga och robusta metoder för att testa salmonella i en mängd olika matriser. Under det senaste decenniet har betydande ansträngningar gjorts internationellt på utveckling och tillämpning av Salmonella LAMP-analyser i ett brett utbud av matriser, som nyligen sammanfattades i en omfattande översyn8. Flera Salmonella LAMP-analyser, inklusive den som presenteras här, har framgångsrikt slutfört multilaboratorium validering efter väletablerade internationellariktlinjer 17,18,19,20.
Vår Salmonella LAMP-analys riktar sig specifikt mot Salmonella invasion gen invA (GenBank anslutningsnummer M90846)21 och är snabb, pålitlig och robust i flera matriser4,22,23,24,25,26. Metoden har validerats i sex animaliska matriser i en precollaborativ studie26 och i torr hundmat i en multilaboratoriumsamverkanstudie19. Som ett resultat har Salmonella LAMP-metoden som presenteras här nyligen införlivats i U.S. Food and Drug Administration (FDA) Bakteriological Analytical Manual (BAM) Chapter 5 Salmonella27 för att tjäna två syften, en som en snabb screeningmetod för förekomst av salmonella i djurfoder och två som en tillförlitlig bekräftelsemetod för presumtiv salmonella isolerad från alla livsmedel.
Protocol
OBS: En lampreaktionsblandning innehåller DNA-polymeras, buffert, MgSO4, dNTPs, primers, DNA-mall och vatten. De första fyra reagenserna finns i en isotermisk huvudblandning (Table of Materials). Primers är förblandade internt för att bli en primerblandning (10x). DNA-mallar kan beredas av anrikningsbuljonger av djurfoderprover för screeningändamål eller från kulturer av presumtiva salmonellaisolat för bekräftelseändamål. Dessutom ingår en positiv kontroll (DNA som extraherats från salmonellareferensstammar, t.ex. salmonella enterica serovar Typhimurium ATCC 19585 [LT2]) och en icke-mallkontroll (NTC; sterilt dricksvatten) i varje LAMP-körning.
1. Utarbetande av DNA-mallar
- För att förbereda DNA-mallar från djurfoderberikningar, följ dessa steg.
- Väg aseptiskt 25 g djurfoderprov (t.ex. torr kattmat, torr hundmat, djurfoder, hästfoder, fjäderfäfoder och svinfoder) i en steril filterpåse (Materialförteckning) eller motsvarande. Placera påsen i en stor behållare eller rack för stöd vid inkubation.
- Tillsätt 225 ml sterilt buffrat peptonvatten (BPW). Blanda väl genom virvlande och kort handmassage. Låt stå i rumstemperatur i 60 ± 5 min.
- Blanda väl genom att virvla runt och bestäm pH med ett testpapper. Justera vid behov pH till 6,8 ± 0,2 med sterilt 1 N NaOH eller 1 N HCl. Inkubera vid 35 ± 2 °C i 24 ± 2 timmar.
- Blanda väl genom att virvla påsen som innehåller djurfoderberikningsbuljonger. Överför 1 ml från den filtrerade sidan av påsen till ett mikrocentrifugrör. Vortex kort.
- Extrahera DNA med hjälp av ett provberedningsreagens (Table of Materials) enligt följande.
- Centrifugera vid 900 x g i 1 minut för att avlägsna stora partiklar och överföra supernatant till ett nytt mikrocentrifugrör.
- Centrifug vid 16 000 x g i 2 min och kassera supernatant.
- Suspendera pelleten i 100 μL av provberedningsreagenset och värm vid 100 ± 1 °C i 10 minuter i ett torrt värmeblock.
- Kyl till rumstemperatur och lagra DNA-extrakt vid -20 °C.
- Följ dessa steg för att förbereda DNA-mallar från presumtiva salmonellakulturer.
- Få presumtiva salmonellaisolat från odlingsisolering i alla livsmedel efter FDA: s BAM Chapter 5 Salmonella avsnitt D: Isolering av Salmonella27.
- Inokulera presumtiv salmonellaisolat på en icke-elektrisk agarplatta (t.ex. blodagar, näringsagar och trypticase soja agar) och inkubera vid 35 ± 2 °C i 24 ± 2 h.
- Överför flera enstaka kolonier till 5 ml trypticase sojabuljong (TSB) eller hjärnhjärtainfusion (BHI) buljong och inkubera vid 35 ± 2 °C i 16 ± 2 h.
OBS: Detta steg kan vara valfritt om den presumtiva salmonellakulturen är ren. I så fall kan DNA-mallar beredas genom att flera enstaka kolonier suspenderar i 5 ml TSB och värmer 500 μL av suspensionen vid 100 ± 1 °C i 10 min i ett torrt värmeblock. Fortsätt med steg 5 nedan. - Överför 500 μL av nattkulturen till ett mikrocentrifugrör och värm vid 100 ± 1 °C i 10 minuter i ett torrt värmeblock.
- Kyl till rumstemperatur och lagra isolera DNA-extrakt vid -20 °C.
- För att förbereda DNA för positiv kontroll, följ liknande steg som ovan för att förbereda DNA-mallar från presumtiva salmonellakulturer med ett extra utspädningssteg.
- Inokulera s. Typhimurium ATCC 19585 (LT2) eller salmonellareferensstammar på en icke-elektrisk agarplatta (t.ex. blodagar, näringsagar och trypticase soja agar) och inkubera vid 35 ± 2 °C för 24 ± 2 h.
- Överför flera enstaka kolonier till 5 ml TSB- eller BHI-buljong och inkubera vid 35 ± 2 °C i 16 ± 2 h för att nå ~109 CFU/ml.
- Späd ut nattkulturen i 0,1% peptonvatten för att erhålla ~107 CFU/ml.
- Överför 500 μL av denna utspädning till ett mikrocentrifugrör och värm vid 100 ± 1 °C i 10 minuter i ett torrt värmeblock.
- Kyl till rumstemperatur och lagra DNA med positiv kontroll vid -20 °C.
2. Beredning av primerblandning (10x)
- Erhåll kommersiellt syntetiserade LAMP-primers (Sal4-F3, Sal4-B3, Sal4-FIP, Sal4-BIP, Sal4-LF och Sal4-LB) med standardrening av avsaltning(tabell 1).
| Primer namn | Beskrivning | Sekvens (5'-3') | Längd (bp) |
| Sal4-F3 (på andra) | Främre yttre primer | GAACGTGTCGCGGAAGTC | 18 |
| Sal4-B3 | Bakåtvänd yttre primer | CGGCAATAGCGTCACCTT | 18 |
| Sal4-FIP (på alla) | Framåt inre primer | GCGCGGCATCCGCATCAATA-TCTGGATGGTATGCCCGG | 38 |
| Sal4-BIP | Bakåtriktad innerprimer | GCGAACGGCGAAGCGTACTG-TCGCACCGTCAAAGGAAC | 38 |
| Sal4-LF (på andra) | Loop framåt primer | TCAAATCGGCATCAATACTCA-TCTG (TCAAATCGGCATCAATACTCA-TCTG) | 25 |
| Sal4-LB (på)/s. | Slinga bakåt primer | AAAGGGAAAGCCAGCTTTACG (olika) | 21 |
Tabell 1: Lampprimrar för screening av salmonella i djurfoder och bekräftelse av salmonella från kulturisolering. Primersna planas baserat på Salmonella invA-sekvensen (GenBanks anslutningsnummer M90846).
- Förbered lagerlösningar av varje primer (100 μM) genom att återfukta primern med lämplig mängd sterilt molekylvatten. Blanda väl genom att virvla i 10 s och förvara vid -20 °C (-80 °C för långtidslagring).
- Förbered primerblandningen (10x) enligt ett kalkylblad (tabell 2). Tillsätt lämpliga volymer primerstocklösningar och sterilt molekylvatten i ett mikrocentrifugrör. Blanda alla reagenser väl genom att virvla i 10 s.
| Komponent | Lager conc. (μM) | Primer mix conc. (μM) | Volym (μL) |
| Sal4-F3 primer | 100 | 1 | 10 |
| Sal4-B3 primer | 100 | 1 | 10 |
| Sal4-FIP primer | 100 | 18 | 180 |
| Sal4-BIP primer | 100 | 18 | 180 |
| Sal4-LF primer | 100 | 10 | 100 |
| Sal4-LB primer | 100 | 10 | 100 |
| Molekylärt vatten | Ej tillämpligt | Ej tillämpligt | 420 |
| Totala | Ej tillämpligt | Ej tillämpligt | 1000 |
Tabell 2: Kalkylblad för beredning av LAMP-primerblandningen (10x). Primers listas i tabell 1.
- Aliquot 10x primerblandningen till 500 μL per mikrocentrifugrör och förvara vid -20 °C.
3. Montering av en LAMP-reaktion
OBS: För att förhindra korskontaminering rekommenderas det starkt att fysiskt separera de områden som används för att förbereda LAMP-huvudblandningen och lägga till DNA-mallar. Figur 1 är ett LAMP-diagram.
Figur 1: Ett schematiskt diagram över salmonellalampans arbetsflöde. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
- Förbereda och köra inställningar
- Rengör bänken med isopropanol och en DNA- och DNase-förnedrande lösning (Table of Materials). Rengör pipetter och rörlisthållare(Table of Materials)med den DNA- och DNase-förnedrande lösningen.
- Tina den isotermiska mastermixen, primerblandningen (10x), molekylärt vatten, DNA-mallar för positiv kontroll och DNA-mallar vid rumstemperatur.
- Slå på LAMP-instrumentet (Table of Materials) och tryck på öppningsskärmen för att komma åt startskärmen. Följ dessa steg för att skapa en körning.
OBS: En modell av LAMP-instrumentet har 2 block (A och B) med 8 prover i varje block och en annan modell har ett enda block som rymmer 8 prover(Materialförteckning).- Tryck på LAMP+Anneal och välj Redigera för att ange exempelinformation.
OBS: Lampkörningsprofilen består av förstärkning vid 65 °C i 30 min och en glödgfas från 98 °C till 80 °C med en decrement på 0,05 °C per sekund. - Tryck på varje exempelrad för att aktivera markören och ange relevant exempelinformation med hjälp av AB-blockikonen för att växla mellan de två LAMP-instrumentblocken.
- Tryck på ikonen Kontrollera när all exempelinformation har angetts.
Observera: Du kan också spara körningsinställningarna (kallas "Profil", som innehåller exempelinformation tillsammans med standardprofilen för LAMP-körningen) för senare användning. Tryck på ikonen Spara och ge profilen ett unikt namn. När du testar samma uppsättning exempel nästa gång kan en ny körning initieras med hjälp av den sparade profilen. Tryck på mappikonen längst ned till vänster på startskärmen och välj Profil för att läsa in sparade profiler.
- Tryck på LAMP+Anneal och välj Redigera för att ange exempelinformation.
- Lampreaktionsenhet
OBS: När du använder båda LAMP-instrumentblocken (A och B, totalt 16 provexemplar), förbered LAMP-huvudblandningen för 18 prover. Om endast ett LAMP-instrumentblock (totalt 8 provexemplar) används) bereds lampans huvudblandning för 10 provexemplar. För andra exempelnummer justerar du volymen i enlighet därmed för att tillgodose pipettingförlust. Inkludera alltid en positiv kontroll och en NTC i varje LAMP-körning. Duplicerad testning av varje prov i oberoende LAMP-körningar rekommenderas.- Förbered LAMP-originalblandningen enligt ett kalkylblad (tabell 3). Tillsätt lämpliga volymer av den isotermiska huvudblandningen, primerblandningen och molekylvatten i ett mikrocentrifugrör och virvel försiktigt i 3 s. Centrifuge kort.
- Placera rörremsan i bandhållaren och fördela 23 μL av LAMP-huvudblandningen till varje brunn.
- Virvel alla DNA-mallar och centrifugera kort. Tillsätt 2 μL DNA-mall till lämplig brunn och lock tätt.
- Ta bort rörremsan från hållaren och snärta handleden för att säkerställa att alla reagenser har poolat längst ner på röret.
- Ladda rörremsan i LAMP-instrumentblocken och se till att locken sitter fast innan locket stängs.
| Komponent | Arbetar conc. | Slutlig reaktion conc. | Volym per prov (μL) | Volym för 18 prover (μL) | Volym för 10 prover (μL) |
| ISO-001 isotermisk master mix | 1.67x | 1x | 15 | 270 | 150 |
| Primer mix | 10x | 1x | 2.5 | 45 | 25 |
| Molekylärt vatten | Ej tillämpligt | Ej tillämpligt | 5.5 | 99 | 55 |
| Delsumma för originalmix | Ej tillämpligt | Ej tillämpligt | 23 | 414 | 230 |
| DNA-mall | Ej tillämpligt | Ej tillämpligt | 2 | Ej tillämpligt | Ej tillämpligt |
Tabell 3: Kalkylblad för beredning av LAMP-reaktionsblandningen. Primerblandningen (10x) bereds enligt tabell 2 med hjälp av lagerlösningar av primers listade i tabell 1.
4. LAMPKÖRNING
OBS: Under en LAMP-körning förvärvas fluorescensavläsningar med FAM-kanalen. Tids-till-topp-värdena (Tmax; min) bestäms automatiskt av instrumentet för den tidpunkt då fluorescensförhållandet når det maximala värdet för förstärkningshastighetskurvan. Tm (°C) är smältnings-/glödgningstemperaturen för den slutliga förstärkta produkten.
- Klicka på ikonen Kör längst upp till höger på skärmen och välj de block som innehåller rörremsor för att starta LAMP-körningen.
- Alternativt, medan reaktionen pågår, tryck på flikarna Temperatur, Förstärkningoch Glödgning för att se dynamiska förändringar av olika parametrar under LAMP-körningen.
- När körningen är klar trycker du på flikarna Förstärkning och Glödgning för att se fullständig förstärkning och glödgningskurvor och trycker på fliken Resultat för att visa resultaten.
- Om du vill spela in körningsnumret längst upp till vänster på skärmen kan du också spela in körningsnumret längst upp till vänster på skärmen med formatet "instrumentföljetongnummer number_run t.ex. "GEN2-2209_0030".
5. Tolkning av LAMP-resultat
OBS: Lampresultat kan ses direkt på LAMP-instrumentpanelen och/eller med hjälp av en LAMP-programvara (Materialförteckning ).
- För att tolka LAMP-resultaten på instrumentpanelen, följ dessa steg.
- Tryck på mappikonen längst ned till vänster på startskärmen och välj Logga för att navigera till filplatsen för att läsa in LAMP-körningen av intresse.
OBS: LAMP-körningarna organiseras efter datum, från och med år. - Observera de fem flikarna som är associerade med varje körning: Profil, Temperatur , Förstärkning, Glödgningoch Resultat.
OBS: Flikarna Profil och Temperatur visar programmerade respektive faktiska temperaturer i provbrunnarna när LAMP-reaktionen fortskrider. Flikarna Amplification och Anneal visar fluorescensavläsningar och förändringar i fluorescens under förstärknings- respektive glödgningsfaserna. På fliken Resultat visas en tabellvy över LAMP-resultaten. - Tryck på fliken Resultat för att observera LAMP-resultaten för varje brunn.
OBS: Det finns tre kolumner (Tja, Förstärkning och Glödgning). Kolumnen "Förstärkning" visar värdena tid till topp(Tmax; min:sec) för varje prov ("Brunn") och kolumnen "Glödg" visar smältnings-/glödgningstemperaturerna(Tm; °C) för alla förstärkta produkter i brunnen. - Tolka LAMP-resultaten och rapportera slutliga LAMP-resultat enligt följande.
- Undersök kontrollbrunnarna först. NTC-brunnen ska ha tom Tmax medan Tm kan vara antingen tom (båda LAMP-instrumentmodellerna) eller < 83 °C (endast för LAMP-instrumentmodellen med två block). Den positiva kontrollbrunnen ska ha Tmax mellan 5 och 10 min och Tm runt 90 °C.
- Undersök provbrunnarna. Alla prover med rätt Tm (ca 90 °C) och Tmax (mellan 5−30 min) anses vara positiva för Salmonella.
- Rapportera slutliga LAMP-resultat baserat på resultat från duplicerade körningar. Om dubblettkörningarna har konsekventa resultat kan slutliga LAMP-resultat rapporteras. Om duplicerade körningar är inkonsekventa, upprepa båda körningarna oberoende av. Om resultaten fortfarande är inkonsekventa bör provet anses vara presumtivt positivt för salmonella och måste gå igenom kulturbekräftelse.
- Tryck på mappikonen längst ned till vänster på startskärmen och välj Logga för att navigera till filplatsen för att läsa in LAMP-körningen av intresse.
- Så här tolkar du LAMP-resultaten med hjälp av programvaran.
- Klicka på ikonen Dator på den vänstra panelen och navigera till filplatsen för att läsa in LAMP-körningen av intresse.
OBS: Datorn med programvaran installerad behöver inte anslutas till LAMP-instrumentet för att analysera LAMP-resultaten, dvs. fjärråtkomst finns tillgänglig. LAMP-körningarna ordnas efter datum. - Observera de sju flikarna som är associerade med varje körning: Profil, Temperatur, Förstärkning, Förstärkningshastighet, Glödgning, Glödgderivat, och Resultat.
OBS: I likhet med instrumentpanelens vy visar flikarna Profil och Temperatur programmerade respektive faktiska temperaturer i provbrunnarna när LAMP-reaktionen fortskrider. Flikarna Amplification/Amplification Rate och Anneal/Anneal Derivative visar fluorescensavläsningar eller förändringar i fluorescens under förstärknings- respektive glödgningsfaserna. Fliken Resultat visar en tabellvy över LAMP-resultaten som skiljer sig något från instrumentpanelens vy. - Tryck på fliken Förstärkningshastighet för att visa en grafisk visning av fluorescenskvoterna med tiden. Klicka på inställningsikonen längst upp till höger på skärmen och justera tröskelvärdet för toppidentifiering från 0,020 till 0,010.
OBS: Justeringen är nödvändig för att säkerställa att alla giltiga toppar identifieras, och resultaten som erhålls med hjälp av programvaran matchar de som visas på instrumentpanelen. - Tryck på fliken Resultat för att observera LAMP-resultaten för varje brunn.
Det finns fyra kolumner (diagramnamn, brunnsnummer, brunnsnamn och toppvärde). Den övre delen av kolumnen "Toppvärde" visar "Amp Time" (Tmax; min:sec) för varje prov ("Brunnsnamn") medan den nedre delen visar "Glödgderivat" (Tm; °C) för alla förstärkta produkter i brunnen. - Tolka LAMP-resultaten och rapportera slutliga LAMP-resultat enligt liknande steg som vid användning av instrumentpanelen med ett undantag att NTC-brunnen och andra negativa prover bör ha tomma Tm eftersom LAMP-programvaruinställningarna eliminerar dessa Tm < 83 °C-resultat. På samma sätt anses alla prover med rätt Tm (ca 90 °C) och Tmax (mellan 5−30 min) vara positiva för Salmonella.
- Klicka på ikonen Dator på den vänstra panelen och navigera till filplatsen för att läsa in LAMP-körningen av intresse.
Representative Results
Figur 2 och figur 3 visar representativa LAMP-grafer/tabeller som visas på båda plattformarna. I denna LAMP-körning är proverna S1 till S6 10-faldiga seriella utspädningar av S. enterica serovar Infantis ATCC 51741 från 1,1 x 106 CFU till 11 CFU per reaktion. Positiv kontroll är S. enterica serovar Typhimurium ATCC 19585 (LT2) vid 1,7 x 104 CFU per reaktion och NTC är molekylärt vatten.
Som visas i figur 2E och figur 3Gär både NTC- och PC-brunnar giltiga kontroller. NTC-brunnen har tom Tmax medan Tm är < 83 °C på LAMP-instrumentpanelen och tom i LAMP-programvaran, vilket tyder på ett negativt resultat. PC-brunnen har Tmax 7 min 45 sek och Tm ~ 90 °C på båda plattformarna, vilket tyder på ett positivt resultat. Proverna S1 till S6 har Tmax mellan 6 min 30 sek och 12 min 15 sek, alla är salmonellapositiva.
Efter dubbla körningar av samma uppsättning prover rapporteras de slutliga LAMP-resultaten för dessa prover. Denna representativa LAMP-körning visar att LAMP framgångsrikt detekterar Salmonella med ett brett spektrum av koncentrationer i proverna.
Figur 2: Representativa lampresultat som visas på LAMP-instrumentpanelen. (A) Fliken Profil visar den programmerade temperaturprofilen. b)Fliken Temperatur visar faktiska temperaturer i provbrunnarna när LAMP-reaktionen fortskrider. (C) Fliken Förstärkning visar fluorescensavläsningar under LAMPförstärkning. D)Fliken Glödgning visar förändringar i fluorescens (derivat) under glödgningsfasen. (E) Fliken Resultat visar en tabellvy över LAMP-resultaten. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Representativa LAMP-resultat som ses i LAMP-programvaran. (A) Fliken Profil visar den programmerade temperaturprofilen. b)Fliken Temperatur visar faktiska temperaturer i provbrunnarna när LAMP-reaktionen fortskrider. (C) Fliken Förstärkning visar fluorescensavläsningar under LAMPförstärkning. (D) Fliken Förstärkningshastighet visar förändringar i fluorescens (fluorescensförhållande) under LAMP-förstärkning. (E) Fliken Glödgning visar fluorescensavläsningar under glödgningsfasen. F)Fliken Glödgderivat visar förändringar i fluorescens (derivat) under glödgningsfasen. (G) Fliken Resultat visar en tabellvy över LAMP-resultaten. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Discussion
Vi har här presenterat en enkel, snabb, specifik och känslig LAMP-metod för screening respektive bekräftelse av salmonella i djurmat respektive ren kultur. Med bekvämligheten av en isotermisk huvudblandning som innehåller fyra viktiga reagenser och en färdig, in-house förberedd primerblandning kräver montering av en LAMP-reaktion endast några få rörsteg (figur 1). Den totala körtiden inklusive förstärknings- och glödgfaser är mindre än 38 min(figur 2A,B och figur 3A,B). Positiva resultat övervakas via fluorescens i realtid(figur 2C och figur 3C,D)och kan detekteras så tidigt som 5 min26. Glödgningsfasen fungerar som en extra bekräftelse på LAMP-specificiteten, eftersom endast prover med korrekt Tm (cirka 90 °C) rapporteras som positiva (figur 2D,E och figur 3E−G). Känsligheten hos 1 salmonellacell i ren kultur och < 1 CFU/25 g i djurfoder har rapporterats tidigare26.
Eftersom LAMP är ganska effektiv och genererar en stor mängd DNA1är det viktigt att bästa laboratoriepraxis används för att förhindra korskontaminering, vilket kan inkludera att fysiskt separera områdena för att förbereda LAMP-huvudblandningen och lägga till DNA-mallar, undvika att generera aerosoler, använda filterpipettspetsar, byta handskar ofta och avstå från att öppna LAMP-reaktionsrör efter förstärkning.
Specificiteten hos denna Salmonella LAMP-metod har tidigare testats med hjälp av 300 bakteriestammar (247 Salmonella av 185 serovarer och 53 icke-Salmonella)och visat sig vara 100% specifika26. Noterbart var att betydande skillnader i Tmax observerades mellan de två salmonellaarterna, S. enterica och Salmonella bongori, och bland S. enterica underarter, särskilt subsp. arizonae (IIIa)26. Dessa var dock fortfarande giltiga positiva resultat enligt reglerna för tolkning av LAMP-resultat. I vår multi-laboratory collaborative studie i torr hundmat som involverade 14 analytiker19, prover med inkonsekventa resultat i dubbla LAMP körningar observerades ibland. Dessa involverade vanligtvis prover med fördröjda positiva resultat (Tmax > 15 min). Att upprepa båda körningarna självständigt löste vanligtvis problemet. Mer sällan observerade vi prover med korrekta T m meninga eller oregelbundna Tmaxvärden (< 5 min). Detta orsakades vanligtvis av luftbubblor i reaktionsröret.
Under lampmetodens hela livscykelutveckling, utvärdering, precollaborativ studie och multilaboratorium validering har vi observerat hög tolerans för LAMP till hämmare i olika djurmats- eller matriser och odlingsmedier4,19,22,23,24, vilket belyser metodens robusthet och samarbetar många andra studier på global nivå8. Detta är överlägset jämfört med PCR eller PCR i realtid, vilket vanligtvis kräver en intern förstärkningskontroll för att säkerställa att negativa resultat inte beror på matrishämning28. Vidare visade LAMP liknande (eller överlägsen) specificitet och känslighet jämfört med PCR eller PCR i realtid i de allra flesta studier8. Kostnaden för LAMP-reagenser ligger på cirka $ 1 per reaktion. LAMP-instrumenten som används i detta protokoll är små, låga underhåll och bärbara. De kan hantera alla isotermiska förstärkningsmetoder som använder måldetektering genom fluorescensmätning, inklusive LAMP. Med hjälp av LAMP-programvaran kan omfattande rapporter genereras i flera format (pdf, text och bild).
Metodvalidering är ett viktigt steg innan en ny metod kan användas för rutinmässig användning. Det är anmärkningsvärt att LAMP-protokollet som rapporteras här framgångsrikt har slutfört multilaboratorium validering19. Med den senaste införlivandet av detta LAMP-protokoll i den amerikanska FDA: s BAM Chapter 5 Salmonella27, förväntas metoden få mycket bredare användning, både som en snabb screeningmetod i djurfoder och som en pålitlig bekräftelsemetod för presumtiva Salmonella-isolat från alla livsmedelskategorier.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen. De åsikter som uttrycks i detta manuskript är författarnas och återspeglar inte nödvändigtvis den officiella policyn för Department of Health and Human Services, U.S. Food and Drug Administration eller den amerikanska regeringen. Hänvisning till kommersiella material, utrustning eller processer utgör inte på något sätt godkännande, godkännande eller rekommendation från Food and Drug Administration.
Acknowledgments
Författarna tackar medlemmar av FDA: s Microbiology Methods Validation Subcommittee (MMVS) och Bacteriological Analytical Manual (BAM) Council för att kritiskt granska Salmonella LAMP-metodvalideringsstudier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain heart infusion (BHI) broth | BD Diagnostic Systems, Sparks, MD | 299070 | Liquid growth medium used in the cultivation of Salmonella. |
| Buffered peptone water (BPW) | BD Diagnostic Systems, Sparks, MD | 218105 | Preenrichment medium for the recovery of Salmonella from animal food samples. |
| DNA AWAY | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 7010 | Eliminates unwanted DNA and DNase from laboratory bench, glassware, and plasticware without affecting subsequent DNA samples. |
| Genie Explorer software | OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom | Version 2.0.6.3 | Supports remote operation of Genie instruments including LAMP runs and data analysis. |
| Genie II or Genie III (LAMP instrument) | OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom | GEN2-02 or GEN3-02 | A small instrument capable of temperature control up to 100 °C with ± 0.1 °C accuracy and simultaneous fluorescence detection via the FAM channel. Genie II has 2 blocks (A and B) with 8 samples in each block. Genie III has a single block that accommodates 8 samples. |
| Genie strip | OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom | OP-0008 | 8-well microtube strips with integral locking caps and a working volume of 10 to 150 µl. |
| Genie strip holder | OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom | GBLOCK | Used to hold Genie strips when setting up a LAMP reaction, the aluminum holder can also be used as a cool block. |
| Hydrochloric acid (HCl) solution, 1 N | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | SA48-500 | Adjusts pH of animal food samples after adding BPW and prior to overnight enrichment. |
| Heat block | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 88-860-022 | Heats samples at 100 ± 1 oC for DNA extraction. |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 3960 | Standard laboratory incubator. |
| ISO-001 isothermal master mix | OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom | ISO-001 | An optimized master mix to simplify the assembly of a LAMP reaction, containing a strand-displacing GspSSD DNA polymerase large fragment from Geobacillus spp., thermostable inorganic pyrophosphatase, reaction buffer, MgSO4, dNTPs, and a double-stranded DNA binding dye (FAM detection channel). |
| Isopropanol | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | A416 | Disinfects work surfaces. |
| LAMP primers | Integrated DNA Technologies Inc., Coralville, IA | Custom | LAMP primers with detailed information in Table 1. |
| Microcentrifuge | Eppendorf North America, Hauppauge, NY | 22620207 | MiniSpin plus personal microcentrifuge. |
| Microcentrifuge tubes | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 05-408-129 | Standard microcentrifuge tubes. |
| Molecular grade water | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | AM9938 | Used in making primer stocks, primer mix, and LAMP reaction mix. |
| Sodium hydroxide (NaOH) solution, 1 N | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | SS266-1 | Adjusts pH of animal food samples after adding BPW and prior to overnight enrichment. |
| Nonselective agar (e.g., blood agar, nutrient agar, and trypticase soy agar) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | R01202 | Solid growth medium used in the cultivation of Salmonella. |
| Peptone water | BD Diagnostic Systems, Sparks, MD | 218071 | Dilutes overnight Salmonella cultures to make positive control DNA. |
| Pipettes and tips | Mettler-Toledo Rainin LLC, Oakland CA | Pipet Lite LTS series | Standard laboratory pipettes and tips. |
| PrepMan Ultra sample preparation reagent | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 4318930 | A simple kit used for the rapid preparation of DNA templates for use in a LAMP reaction. |
| Salmonella reference strain LT2 | ATCC, Manassas, VA | 700720 | Salmonella reference strain used as positive control. |
| Trypticase soy broth (TSB) | BD Diagnostic Systems, Sparks, MD | 211768 | Liquid growth medium used in the cultivation of Salmonella. |
| Vortex mixer | Scientific Industries, Inc., Bohemia, NY | SI-0236 | Standard laboratory vortex mixer. |
| Whirl-pak filter bag | Nasco Sampling Brand, Fort Atkinson, WI | B01318 | Filter bags to hold animal food samples for preenrichment. |
References
- Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research. 28 (12), 63 (2000).
- Kaneko, H., Kawana, T., Fukushima, E., Suzutani, T. Tolerance of loop-mediated isothermal amplification to a culture medium and biological substances. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 70 (3), 499-501 (2007).
- Francois, P., et al. Robustness of a loop-mediated isothermal amplification reaction for diagnostic applications. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 62 (1), 41-48 (2011).
- Yang, Q., Wang, F., Prinyawiwatkul, W., Ge, B. Robustness of Salmonella loop-mediated isothermal amplification assays for food applications. Journal of Applied Microbiology. 116 (1), 81-88 (2014).
- Nagamine, K., Watanabe, K., Ohtsuka, K., Hase, T., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification reaction using a nondenatured template. Clinical Chemistry. 47 (9), 1742-1743 (2001).
- Zhang, X., Lowe, S. B., Gooding, J. J. Brief review of monitoring methods for loop-mediated isothermal amplification (LAMP). Biosensors & Bioelectronics. 61, 491-499 (2014).
- Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Molecular and Cellular Probes. 16 (3), 223-229 (2002).
- Yang, Q., Domesle, K. J., Ge, B. Loop-mediated isothermal amplification for Salmonella detection in food and feed: Current applications and future directions. Foodborne Pathogens and Disease. 15 (6), 309-331 (2018).
- Mori, Y., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): Expansion of its practical application as a tool to achieve universal health coverage. Journal of Infection and Chemotherapy. 26 (1), 13-17 (2020).
- Mansour, S. M., Ali, H., Chase, C. C., Cepica, A. Loop-mediated isothermal amplification for diagnosis of 18 World Organization for Animal Health (OIE) notifiable viral diseases of ruminants, swine and poultry. Animal Health Research Reviews. 16 (2), 89-106 (2015).
- Kumar, Y., Bansal, S., Jaiswal, P. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A rapid and sensitive tool for quality assessment of meat products. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 16 (6), 1359-1378 (2017).
- WHO. The use of loop-mediated isothermal amplification (TB-LAMP) for the diagnosis of pulmonary tuberculosis: policy guidance. , Available from: http://www.who.int/tb/publications/lamp-diagnosis-molecular/en (2016).
- Kundapur, R. R., Nema, V. Loop-mediated isothermal amplification: Beyond microbial identification. Cogent Biology. 2, 1137110 (2016).
- WHO. Salmonella (non-typhoidal) fact sheet. , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs139/en (2018).
- FAO/WHO. Executive summary report of the joint FAO/WHO expert meeting on hazards associated with animal feed. , Available from: http://www.fao.org/3/a-az851e.pdf (2015).
- FDA. Compliance Policy Guide Sec. 690.800 Salmonella in Food for Animals. , Available from: https://www.fda.gov/downloads/iceci/compliancemanuals/compliancepolicyguidancemanual/ucm361105.pdf (2013).
- Bird, P., et al. Evaluation of the 3M molecular detection assay (MDA) 2 - Salmonella for the detection of Salmonella spp. in select foods and environmental surfaces: collaborative study, first action 2016.01. Journal of AOAC International. 99 (4), 980-997 (2016).
- D'Agostino, M., et al. Validation of a loop-mediated amplification/ISO 6579-based method for analysing soya meal for the presence of Salmonella enterica. Food Analytical Methods. 9 (11), 2979-2985 (2016).
- Ge, B., et al. Multi-laboratory validation of a loop-mediated isothermal amplification method for screening Salmonella in animal food. Frontiers in Microbiology. 10, 562 (2019).
- D'Agostino, M., Diez-Valcarce, M., Robles, S., Losilla-Garcia, B., Cook, N. A loop-mediated isothermal amplification-based method for analysing animal feed for the presence of Salmonella. Food Analytical Methods. 8 (10), 2409-2416 (2015).
- Galan, J. E., Ginocchio, C., Costeas, P. Molecular and functional characterization of the Salmonella invasion gene invA: homology of InvA to members of a new protein family. Journal of Bacteriology. 174 (13), 4338-4349 (1992).
- Chen, S., Wang, F., Beaulieu, J. C., Stein, R. E., Ge, B. Rapid detection of viable salmonellae in produce by coupling propidium monoazide with loop-mediated isothermal amplification. Applied and Environmental Microbiology. 77 (12), 4008-4016 (2011).
- Yang, Q., Chen, S., Ge, B. Detecting Salmonella serovars in shell eggs by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Food Protection. 76 (10), 1790-1796 (2013).
- Yang, Q., et al. Evaluation of loop-mediated isothermal amplification for the rapid, reliable, and robust detection of Salmonella in produce. Food Microbiology. 46, 485-493 (2015).
- Yang, Q., Domesle, K. J., Wang, F., Ge, B. Rapid detection of Salmonella in food and feed by coupling loop-mediated isothermal amplification with bioluminescent assay in real-time. BMC Microbiology. 16 (1), 112 (2016).
- Domesle, K. J., Yang, Q., Hammack, T. S., Ge, B. Validation of a Salmonella loop-mediated isothermal amplification assay in animal food. International Journal of Food Microbiology. 264, 63-76 (2018).
- Andrews, W. H., Jacobson, A., Hammack, T. S. Bacteriological Analytical Manual. Chapter 5: Salmonella. , Available from: http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070149.htm (2020).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).
