Summary
Loop-mediert isotermisk forsterkning (LAMP) er en isotermisk nukleinsyreforsterkningstest (iNAAT) som har tiltrukket seg bred interesse for patogendeteksjonsfeltet. Her presenterer vi en multi-laboratorie-validert Salmonella LAMP-protokoll som en rask, pålitelig og robust metode for screening av Salmonella i animalsk mat og bekrefter presumptiv Salmonella fra kulturisolasjon.
Abstract
Loop-mediert isotermisk forsterkning (LAMP) har dukket opp som en kraftig nukleinsyreforsterkningstest for rask påvisning av mange bakterielle, sopp- og parasittiske og virale midler. Salmonella er et bakteriell patogen av verdensomspennende matsikkerhetsbekymring, inkludert mat til dyr. Presentert her er en multi-laboratorie-validert Salmonella LAMP protokoll som kan brukes til å raskt screene animalsk mat for tilstedeværelse av Salmonella forurensning og kan også brukes til å bekrefte presumptive Salmonella isolater utvinnes fra alle matkategorier. LAMP-analysen retter seg spesifikt mot Salmonella-invasjonsgenet (invA) og er rask, følsom og svært spesifikk. Mal dnAs er utarbeidet av berikelse buljonger av animalsk mat eller rene kulturer av presumptive Salmonella isolater. LAMP reagensblandingen tilberedes ved å kombinere en isotermisk masterblanding, primere, DNA-mal og vann. LAMP-analysen går ved en konstant temperatur på 65 °C i 30 min. Positive resultater overvåkes via sanntidsfluorescens og kan oppdages så tidlig som 5 min. LAMP-analysen viser høy toleranse for hemmere i animalsk mat eller kulturmedium, og fungerer som en rask, pålitelig, robust, kostnadseffektiv og brukervennlig metode for screening og bekreftelse av Salmonella. LAMP-metoden har nylig blitt innlemmet i US Food and Drug Administration's Bacteriological Analytical Manual (BAM) Kapittel 5.
Introduction
Loop-mediert isotermisk forsterkning (LAMP) er en roman isotermisk nukleinsyre forsterkning test (iNAAT) oppfunnet i 2000 av en gruppe japanske forskere1. Gjennom dannelsen av en målspesifikk stilk-loop DNA-struktur under de første trinnene, bruker LAMP en strand-fortrengende DNA polymerase for å effektivt forsterke dette startmaterialet kvasi-eksponentielt, noe som resulterer i 109 kopier av målet på mindre enn 1 t1. Sammenlignet med polymerase kjedereaksjon (PCR), en mye brukt NAAT, lamp har flere fordeler. For det første utføres LAMP-reaksjoner under isotermiske forhold. Dette hindrer behovet for et sofistikert termisk sykkelinstrument. For det andre er LAMP svært tolerant overfor kulturmedier og biologiskestoffer 2 med robusthet demonstrert for både kliniske og matapplikasjoner3,4. Dette forenkler prøveklargjøring og minimerer falske negative resultater5. For det tredje er LAMP mottagelig for flere deteksjonsplattformer, for eksempel turbiditet, kolorimetri, bioluminescens, fluorescens og mikrofluidics6. Fjerde, LAMP er svært spesifikk som den bruker fire til seks spesialdesignede primere å målrette seks til åtte bestemteregioner 1,7. Femte, LAMP er ultrafølsom og mange studier har rapportert sin overlegne følsomhet for PCR eller sanntid PCR8. Endelig er LAMP raskere med mange analyser som nå vedtar en 30 min standard kjøretid mens PCR-type analyser vanligvis tar 1-2 t8.
Disse attraktive funksjonene drevet anvendelsen av LAMP i brede patogendeteksjonsområder, inkludert in vitro diagnostikk9,dyresykdomdiagnostikk10,og mat- og miljøtesting11. Spesielt har en TB-LAMP (LAMP for Mycobacterium tuberculosis) blitt anbefalt av WHO som en gyldig erstatningstest for sputum-smøremikroskopi for lungetuberkulosediagnoser i perifere innstillinger12. LAMP søknad utvider også utover mikrobiell identifikasjon for å omfatte påvisning av allergener, dyrearter, narkotikaresistens, genmodifiserte organismer, og plantevernmidler13.
Ikke-oidal Salmonella er et zoonotisk patogen av betydelig matsikkerhet og folkehelsebekymring over hele verden14. Det har også blitt identifisert som en viktig mikrobiell fare i mat for dyr (det vil si animalsk mat)15,16. For å forhindre salmonellasykdommer/utbrudd fra forurenset mat og animalsk mat, er det viktig å ha raske, pålitelige og robuste metoder for testing av Salmonella i en rekke matriser. I løpet av det siste tiåret har det blitt gjort en betydelig innsats internasjonalt på utvikling og anvendelse av Salmonella LAMP-analyser i et bredt spekter av matmatriser, som nylig ble oppsummert i en omfattende gjennomgang8. Flere Salmonella LAMP-analyser, inkludert den som presenteres her, har fullført multilaboratorivalidering etter veletablerte internasjonaleretningslinjer 17,18,19,20.
Vår Salmonella LAMP analyse spesifikt rettet mot Salmonella invasjon genet invA (GenBank tiltredelse nummer M90846)21 og er rask, pålitelig og robust i flere mat matriser4,22,23,24,25,26. Metoden er validert i seks dyrematmat matriser i en precollaborativstudie 26 og i tørr hundemat i en multi-laboratorie samarbeidsstudie19. Som et resultat har Salmonella LAMP-metoden presentert her nylig blitt innlemmet i US Food and Drug Administration (FDA) bakteriologisk analytisk manual (BAM) Kapittel 5 Salmonella27 for å tjene to formål, en som en rask screeningmetode for tilstedeværelse av Salmonella i animalsk mat og to som en pålitelig bekreftelsesmetode for presumptiv Salmonella isolert fra alle matvarer.
Protocol
MERK: En LAMP-reaksjonsblanding inneholder DNA-polymerase, buffer, MgSO4,dNTPer, primere, DNA-mal og vann. De fire første reagensene finnes i en isotermisk hovedblanding (Materialse ). Primere er premixed internt for å bli en primer blanding (10x). DNA-maler kan tilberedes fra berikelse buljonger av animalske matprøver for screeningformål eller fra kulturer av presumptive Salmonella isolerer for bekreftelse formål. I tillegg er en positiv kontroll (DNA hentet fra alle Salmonella referansestammer, for eksempel Salmonella enterica serovar Typhimurium ATCC 19585 [LT2]) og en ingen malkontroll (NTC; sterilt molekylært vann) inkludert i hvert LAMP-løp.
1. Utarbeidelse av DNA-maler
- Følg disse trinnene for å forberede DNA-maler fra berikelser av animalsk mat.
- Veie aseptisk 25 g dyrematprøve (f.eks. tørr kattemat, tørr hundemat, storfefôr, hestefôr, fjørfefôr og svinefôr) inn i en steril filterpose (Materialsekk) eller tilsvarende. Plasser posen i en stor beholder eller et stativ for støtte under inkubasjon.
- Tilsett 225 ml sterilt bufret peptonvann (BPW). Bland godt ved virvlende og kort håndmassasje. La stå ved romtemperatur i 60 ± 5 min.
- Bland godt ved å virvle og bestemme pH med et testpapir. Juster om nødvendig pH til 6,8 ± 0,2 med steril 1 N NaOH eller 1 N HCl. Inkuber ved 35 ± 2 °C i 24 ± 2 timer.
- Bland godt ved å virvle posen som inneholder animalsk mat berikelse buljonger. Overfør 1 ml fra den filtrerte siden av posen til et mikrocentrifugerør. Vortex kort.
- Trekk ut DNA ved hjelp av en prøve klargjøringsreagens (Materialsekk) som følger.
- Sentrifuge ved 900 x g i 1 min for å fjerne store partikler og overføre supernatant til et nytt mikrocentrifugerør.
- Sentrifuge ved 16 000 x g i 2 min og kast supernatant.
- Suspender pelleten i 100 μL av prøvens reagens og varme ved 100 ± 1 °C i 10 min i en tørr varmeblokk.
- Avkjøl til romtemperatur og lagre prøve DNA ekstrakter ved -20 °C.
- Følg disse trinnene for å utarbeide DNA-maler fra presumptive Salmonella-kulturer.
- Få presumptive Salmonella isolerer fra kulturisolasjon i alle matvarer etter FDAs BAM kapittel 5 Salmonella seksjon D: Isolering av Salmonella27.
- Inokulert presumptive Salmonella isolerer på en ikke-selektiv agarplate (f.eks. blodgar, næringsgar og trypticase soy agar) og inkubere ved 35 ± 2 °C i 24 ± 2 timer.
- Overfør flere enkeltkolonier til 5 ml trypticase soy buljong (TSB) eller hjernehjerteinfusjon (BHI) buljong og inkuber ved 35 ± 2 °C i 16 ± 2 timer.
MERK: Dette trinnet kan være valgfritt hvis den presumptive Salmonella-kulturen er ren. I så fall kan DNA-maler tilberedes ved å suspendere flere enkeltkolonier i 5 ml TSB og varme 500 μL av suspensjonen ved 100 ± 1 °C i 10 min i en tørr varmeblokk. Fortsett med trinn 5 nedenfor. - Overfør 500 μL av nattkulturen til et mikrocentrifugerør og varme ved 100 ± 1 °C i 10 min i en tørr varmeblokk.
- Avkjøl til romtemperatur og oppbevar isolere DNA-ekstrakter ved -20 °C.
- For å forberede positivt kontroll-DNA, følg lignende trinn som ovenfor for å forberede DNA-maler fra presumptive Salmonella-kulturer med ett ekstra fortynningstrinn.
- InokulerE S. Typhimurium ATCC 19585 (LT2) eller salmonellareferansestammer på en ikke-selektiv agarplate (f.eks. blodgar, næringsgar og trypticase soy agar) og inkuber ved 35 ± 2 °C for 24 ± 2 h.
- Overfør flere enkeltkolonier til 5 ml TSB eller BHI kjøttkraft og inkuber ved 35 ± 2 °C i 16 ± 2 timer for å nå ~ 109 CFU / ml.
- Serially fortynne natten kultur i 0,1% pepton vann for å få ~ 107 CFU / ml.
- Overfør 500 μL av denne fortynningen til et mikrocentrifugerør og varme ved 100 ± 1 °C i 10 min i en tørr varmeblokk.
- Avkjøl til romtemperatur og lagre positivt kontroll DNA ved -20 °C.
2. Tilberedning av primer mix (10x)
- Få kommersielt syntetiserte LAMP primere (Sal4-F3, Sal4-B3, Sal4-FIP, Sal4-BIP, Sal4-LF og Sal4-LB) med standard desalting rensing (tabell 1).
| Primer navn | Beskrivelse | Sekvens (5'-3') | Lengde (bp) |
| Sal4-F3 | Fremre ytre primer | GAACGTGTCGCGGAAGTC | 18 |
| Sal4-B3 | Bakover ytre primer | CGGCAATAGCGTCACCTT | 18 |
| Sal4-FIP | Forover indre primer | GCGCGGCATCCGCATCAATA-TCTGGATGGTATGCCCGG | 38 |
| Sal4-BIP | Bakover indre primer | GCGAACGGCGAAGCGTACTG-TCGCACCGTCAAAGGAAC | 38 |
| Sal4-LF | Loop fremover primer | TCAAATCGGCATCAATACTCA-TCTG | 25 |
| Sal4-LB | Loop bakover primer | AAAGGGAAAGCCAGCTTTACG | 21 |
Tabell 1: LAMP primere for screening salmonella i animalsk mat og bekrefter Salmonella fra kulturisolasjon. Primerne er designet basert på Salmonella invA-sekvensen (GenBank tiltredelsesnummer M90846).
- Klargjør lagerløsninger for hver primer (100 μM) ved å rehydrere primeren med riktig mengde sterilt molekylært vann. Bland godt ved å virvle i 10 s og oppbevares ved -20 °C (-80 °C for langtidslagring).
- Klargjør primerblandingen (10x) i henhold til et regneark (tabell 2). Tilsett passende volumer av primer lagerløsninger og sterilt molekylært vann i et mikrocentrifugerør. Bland alle reagenser godt ved å virvle i 10 s.
| Komponent | Lagerkonk. (μM) | Primer mix conc. (μM) | Volum (μL) |
| Sal4-F3 primer | 100 | 1 | 10 |
| Sal4-B3 primer | 100 | 1 | 10 |
| Sal4-FIP primer | 100 | 18 | 180 |
| Sal4-BIP primer | 100 | 18 | 180 |
| Sal4-LF primer | 100 | 10 | 100 |
| Sal4-LB primer | 100 | 10 | 100 |
| Molekylært vann | N/a | N/a | 420 |
| Totalt | N/a | N/a | 1000 |
Tabell 2: Regneark for klargjøring av LAMP primer mix (10x). Primerne er oppført i tabell 1.
- Aliquot 10x primer blanding til 500 μL per mikrocentrifuge rør og lagre ved -20 °C.
3. Montering av en LAMP-reaksjon
MERK: For å unngå krysskontaminering anbefales det på det sterkeste å fysisk skille områdene som brukes til å klargjøre LAMP-hovedblandingen og legge til DNA-maler. Figur 1 er et LAMP-diagram.
Figur 1: Et skjematisk diagram over Salmonella LAMP-arbeidsflyten. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Klargjøre og kjøre installasjonsprogrammet
- Rengjør benken med isopropanol og en DNA- og DNase-nedbrytende løsning (Materialse ). Rengjør pipetter og rørlister (Materials table) med DNA- og DNase-nedbrytningsløsningen.
- Tin den isotermiske masterblandingen, primerblandingen (10x), molekylært vann, positivt kontroll-DNA og DNA-maler ved romtemperatur.
- Slå på LAMP-instrumentet (Materials table) og trykk på åpningsskjermen for å få tilgang til startskjermen. Følg disse trinnene for å opprette en kjøring.
MERK: En modell av LAMP-instrumentet har 2 blokker (A og B) med 8 prøver i hver blokk, og en annen modell har en enkelt blokk som har plass til 8 prøver (Materialsekk).- Trykk på LAMP+Anneal, og velg Rediger for å angi eksempelinformasjon.
MERK: Standard LAMP-kjøreprofil består av forsterkning ved 65 °C i 30 min og en glødefase fra 98 °C til 80 °C med 0,05 °C reduksjon per sek. - Trykk på hver eksempelrad for å aktivere markøren og angi relevant eksempelinformasjon ved hjelp av AB-blokkikonet for å bytte mellom de to LAMP-instrumentblokkene.
- Trykk på Kontroller-ikonet når all eksempelinformasjon er angitt.
Merk: Eventuelt kan kjøreoppsettet (kalt "Profil", som inneholder eksempelinformasjon sammen med standard LAMP-kjøreprofil) lagres for senere bruk. Trykk på Lagre-ikonet, og gi profilen et unikt navn. Når du tester det samme settet med eksempler neste gang, kan en ny kjøring startes ved hjelp av den lagrede profilen. Trykk mappeikonet nederst til venstre på startskjermen, og velg Profil for å laste inn lagrede profiler.
- Trykk på LAMP+Anneal, og velg Rediger for å angi eksempelinformasjon.
- LAMP reaksjonsenhet
MERK: Når du bruker begge LAMP-instrumentblokkene (A og B, totalt 16 prøver), klargjør du LAMP-hovedblandingen for 18 prøver. Hvis du bare bruker én LAMP-instrumentblokk (totalt 8 prøver), klargjør du LAMP-hovedblandingen for 10 prøver. For andre prøvenumre justerer du volumet tilsvarende for å imøtekomme pipetteringstap. Ta alltid med en positiv kontroll og en NTC i hver LAMP-kjøring. Duplikattesting av hver prøve i uavhengige LAMP-kjøringer anbefales.- Klargjør LAMP-hovedblandingen i henhold til et regneark (tabell 3). Tilsett passende volumer av isotermisk masterblanding, primerblanding og molekylært vann i et mikrocentrifugerør og virvel forsiktig i 3 s. Sentrifuge kort.
- Plasser rørstrimmelen i stavholderen og fordel 23 μL av LAMP-hovedblandingen til hver brønn.
- Vortex alle DNA-maler og sentrifuger kort. Tilsett 2 μL DNA-mal til riktig brønn og hette tett.
- Fjern rørstripen fra holderen og knips håndleddet for å sikre at alle reagenser har samlet seg nederst på røret.
- Legg rørstrimmelen inn i LAMP-instrumentblokken(e), og pass på at hettene sitter fast før du lukker lokket.
| Komponent | Arbeider conc. | Endelig reaksjon conc. | Volum per prøve (μL) | Volum for 18 prøver (μL) | Volum for 10 prøver (μL) |
| ISO-001 erotermisk masterblanding | 1,67 x 1,67 x 1,67 x 1 | 1x (andre) | 15 | 270 | 150 |
| Primer blanding | 10x (andre) | 1x (andre) | 2.5 | 45 | 25 |
| Molekylært vann | N/a | N/a | 5.5 | 99 | 55 |
| Delsum for hovedblanding | N/a | N/a | 23 | 414 | 230 |
| DNA-mal | N/a | N/a | 2 | N/a | N/a |
Tabell 3: Regneark for klargjøring av LAMP-reaksjonsblandingen. Primermiksen (10x) er utarbeidet i henhold til tabell 2 ved hjelp av lagerløsninger av primere oppført i tabell 1.
4. LAMPE Kjør
MERK: Under en LAMP-kjøring anskaffes fluorescensavlesninger ved hjelp av FAM-kanalen. Tid-til-topp-verdiene (Tmaks;min) bestemmes automatisk av instrumentet for tidspunktet når fluorescensforholdet når maksimumsverdien av forsterkningshastighetskurven. Tm (°C) er smelte-/glødetemperaturen til det endelige forsterkede produktet.
- Klikk på Kjør-ikonet øverst til høyre på skjermen og velg blokken(e) som inneholder rørstripen(e) for å starte LAMP-løpet.
- Du kan eventuelt trykke på kategoriene Temperatur, Forsterkning og Anneal for å se dynamiske endringer av ulike parametere under LAMP-kjøringen.
- Når løpet er fullført, trykker du på forsterknings- og Anneal-fanene for å se fullstendige forsterknings- og glødekurver og trykker på Resultater-fanen for å vise resultatene.
- Du kan eventuelt registrere løpenummeret øverst til venstre på skjermen ved hjelp av formatet "instrumentserie number_run number", for eksempel "GEN2-2209_0030.".
5. Tolkning av LAMP-resultater
MERK: LAMPEresultater kan vises på LAMP-instrumentpanelet direkte og/eller ved hjelp av en LAMP-programvare (Materialse tabell).
- Hvis du vil tolke LAMP-resultater på instrumentpanelet, følger du denne fremgangsmåten.
- Trykk mappeikonet nederst til venstre på startskjermen, og velg Logg for å navigere til filplasseringen for å laste inn LAMP-kjøringen av interesse.
MERK: LAMP-løypene er organisert etter dato fra og med år. - Vær oppmerksom på de fem kategoriene som er knyttet til hverkjøring: Profil, Temperatur , Forsterkning, Annealog Resultater.
MERK: Kategoriene Profil og Temperatur viser henholdsvis programmerte og faktiske temperaturer i prøvebrønnene etter hvert som LAMP-reaksjonen fortsetter. Kategoriene Forsterkning og Anneal viser fluorescensavlesninger og endringer i fluorescens under amplifiserings- og glødefasene. Kategorien Resultater viser en tabellvisning av LAMP-resultatene. - Trykk på Resultater-fanen for å observere LAMP-resultater for hver brønn.
MERK: Det er tre kolonner (Vel, Forsterkning og Anneal). "Forsterkning"-kolonnen viser tid-til-topp-verdiene (Tmaks; min:sek) for hver prøve ("Vel") og "Anneal" -kolonnen viser smelte-/glødetemperaturene (Tm; °C) for ethvert forsterket produkt i den brønnen. - Tolke LAMP-resultatene og rapporter endelige LAMP-resultater som følger.
- Undersøk kontrollbrønnene først. NTC-brønnen skal ha tom Tmaks, mens Tm kan enten være tom (begge LAMP-instrumentmodellene) eller < 83 °C (kun for LAMP-instrumentmodellen med to blokker). Den positive kontrollbrønnen bør ha Tmaks mellom 5 og 10 min og Tm rundt 90 °C.
- Undersøk prøvebrønnene. Alle prøver med riktig Tm (ca. 90 °C) og Tmaks (mellom 5–30 min) anses som positive for Salmonella.
- Rapporter endelige LAMP-resultater basert på resultater fra dupliserte kjøringer. Hvis duplikatkjøringene har konsistente resultater, kan endelige LAMP-resultater rapporteres. Hvis dupliserte kjøringer er inkonsekvente, gjentar du begge kjøringene uavhengig. Hvis resultatene fortsatt er inkonsekvente, bør prøven betraktes som presumptiv positiv for Salmonella og må gå gjennom kulturbekreftelse.
- Trykk mappeikonet nederst til venstre på startskjermen, og velg Logg for å navigere til filplasseringen for å laste inn LAMP-kjøringen av interesse.
- Hvis du vil tolke LAMP-resultater ved hjelp av programvaren, følger du denne fremgangsmåten.
- Klikk på Datamaskin-ikonet på venstre panel og naviger til filplasseringen for å laste inn LAMP-løpet av interesse.
MERK: Datamaskinen med programvaren som er installert, trenger ikke å være koblet til LAMP-instrumentet for å analysere LAMP-resultater, det vil si at ekstern tilgang er tilgjengelig. LAMP-løpene er organisert etter dato. - Vær oppmerksom på de syv fanene som er knyttet til hvert løp: Profil, Temperatur, Forsterkning, Forsterkningshastighet, Anneal, Anneal Derivativeog Resultat.
MERK: I likhet med instrumentpanelvisningen viser kategoriene Profil og Temperatur henholdsvis programmerte og faktiske temperaturer i prøvebrønnene etter hvert som LAMP-reaksjonen fortsetter. Kategoriene Forsterkning/forsterkningshastighet og Anneal/AnnealDerivative viser fluorescensavlesninger eller endringer i fluorescens under amplifiserings- og glødefasene. Kategorien Resultater viser en tabellvisning av LAMP-resultatene som avviker noe fra instrumentpanelvisningen. - Trykk kategorien Forsterkningshastighet for å vise en grafisk visning av fluorescensforholdene etter tid. Klikk på Innstilling-ikonet øverst til høyre på skjermen og juster "Peak Detection Threshold Ratio" fra 0,020 til 0,010.
MERK: Justeringen er nødvendig for å sikre at alle gyldige topper identifiseres, og resultatene som oppnås ved hjelp av programvaren samsvarer med de som vises på instrumentpanelet. - Trykk på Resultat-fanen for å observere LAMP-resultater for hver brønn.
MERK: Det er fire kolonner (Grafnavn, Brønnnummer, Brønnnavn og Toppverdi). Den øverste delen av "Peak Value" -kolonnen viser "Amp Time" (Tmax; min:sek) for hver prøve ("Velnavn") mens den nederste delen viser "Anneal Derivative" (Tm; °C) for ethvert forsterket produkt i den brønnen. - Tolke LAMP-resultatene og rapporter endelige LAMP-resultater etter lignende trinn som når du bruker instrumentpanelet med ett unntak om at NTC-brønnen og andre negative prøver skal ha tomme Tm som LAMP-programvareinnstillingene eliminerer disse T m < 83 °C-resultatene. På samme måte anses alle prøver med riktig Tm (ca. 90 °C) og Tmaks (mellom 5–30 min) som positive for Salmonella.
- Klikk på Datamaskin-ikonet på venstre panel og naviger til filplasseringen for å laste inn LAMP-løpet av interesse.
Representative Results
Figur 2 og Figur 3 viser representative LAMP-grafer/tabeller som vises på begge plattformene. I denne LAMP-kjøringen er prøver S1 til S6 10 ganger seriell fortynning av S. enterica serovar Infantis ATCC 51741 fra 1,1 x 106 CFU til 11 CFU per reaksjon. Positiv kontroll er S. enterica serovar Typhimurium ATCC 19585 (LT2) ved 1,7 x 104 CFU per reaksjon og NTC er molekylært vann.
Som vist i figur 2E og figur 3Ger både NTC- og PC-brønner gyldige kontroller. NTC-brønnen har tom Tmaks, mens Tm er < 83 °C på LAMP-instrumentpanelet og tomt i LAMP-programvaren, noe som tyder på et negativt resultat. PC-brønnen har Tmaks 7 min 45 sek og Tm av ~ 90 ° C på begge plattformene, noe som tyder på et positivt resultat. Prøver S1 til S6 har Tmaks mellom 6 min 30 sek og 12 min 15 sek, alt er Salmonella-positiv.
Etter dupliserte kjøringer av samme sett med eksempler rapporteres de endelige LAMP-resultatene for disse eksemplene. Denne representative LAMP-kjøringen viser at LAMP påviser Salmonella med et bredt spekter av konsentrasjoner i prøvene.
Figur 2: Representative LAMP-resultater som vises på LAMP-instrumentpanelet. (A) Kategorien Profil viser den programmerte temperaturprofilen. (B) Temperatur-fanen viser faktiske temperaturer i prøvebrønnene etter hvert som LAMP-reaksjonen fortsetter. (C) Amplification-fanen viser fluorescensavlesninger under LAMP-forsterkning. (D) Anneal-fanen viser endringer i fluorescens (derivat) i glødefasen. (E) Kategorien Resultater viser en tabellvisning av LAMP-resultatene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representative LAMP-resultater som vises i LAMP-programvaren. (A) Kategorien Profil viser den programmerte temperaturprofilen. (B) Temperatur-fanen viser faktiske temperaturer i prøvebrønnene etter hvert som LAMP-reaksjonen fortsetter. (C) Amplification-fanen viser fluorescensavlesninger under LAMP-forsterkning. (D) Kategorien Forsterkningshastighet viser endringer i fluorescens (fluorescensforhold) under LAMP-forsterkning. (E) Anneal-fanen viser fluorescensavlesninger i glødefasen. (F)Kategorien Anneal Derivat viser endringer i fluorescens (derivat) i glødefasen. (G) Kategorien Resultat viser en tabellvisning av LAMP-resultatene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Vi har presentert her en enkel, rask, spesifikk og følsom LAMP-metode for screening og bekreftelse av Salmonella i henholdsvis animalsk mat og ren kultur. Med bekvemmeligheten av en isotermisk masterblanding som inneholder fire viktige reagenser, og en klar til bruk, in-house forberedt primer blanding, montering av en LAMP reaksjon krever bare noen få pipettering trinn (Figur 1). Den totale kjøretiden inkludert forsterkning og glødefaser er mindre enn 38 min (figur 2A, B og figur 3A, B). Positive resultater overvåkes via sanntidsfluorescens (figur 2C og figur 3C,D) og kan oppdages så tidlig som 5 min26. Glødefasen fungerer som en ekstra bekreftelse på LAMP spesifisitet siden bare prøver med riktig Tm (rundt 90 °C) rapporteres som positive (figur 2D,E og figur 3E−G). Sensitiviteter av 1 Salmonellacelle i ren kultur og < 1 CFU/25 g i animalsk mat er rapportert tidligere26.
Siden LAMP er ganske effektiv og genererer en stor mengde DNA1,er det avgjørende at beste laboratoriepraksis brukes til å forhindre krysskontaminering, som kan omfatte fysisk å skille områdene for å forberede LAMP-hovedblandingen og legge til DNA-maler, unngå å generere aerosoler, bruke filterpipettespisser, bytte hansker ofte og avstå fra å åpne LAMP-reaksjonsrør etter forsterkning.
Spesifisiteten til denne Salmonella LAMP-metoden ble tidligere testet ved hjelp av 300 bakteriestammer (247 Salmonella av 185 serovars og 53ikke-Salmonella)og viste seg å være 100%spesifikke 26. Spesielt ble det observert betydelige forskjeller i Tmax mellom de to Salmonella-artene, S. enterica og Salmonella bongori,og blant S. enterica underarter, spesielt subsp. arizonae (IIIa)26. Likevel var disse fortsatt gyldige positive resultater i henhold til reglene for tolkning av LAMP-resultater. I vår multi-laboratorie samarbeidsstudie i tørr hundemat som involverte 14 analytikere19,ble prøver som hadde inkonsekvente resultater i dupliserte LAMP-løp av og til observert. Disse involverte vanligvis prøver med forsinkede positive resultater (Tmaks > 15 min). Gjentatte kjøringer uavhengig av hverandre løste vanligvis problemet. Mer sjelden observerte vi prøver med riktige Tm, men ingen eller uregelmessige Tmaksverdier (< 5 min). Dette var vanligvis forårsaket av luftbobler i reaksjonsrøret.
Gjennom hele livssyklusen til LAMP-metodeutvikling, evaluering, precollaborativ studie og multilaborativ validering har vi observert høy toleranse for LAMP til hemmere i ulike dyremat- eller matmatriker ogkulturmedier 4,19,22,23,24, som fremhever metodens robusthet og samarbeider en rekke andre studier på global skala8. Dette er overlegen sammenlignet med PCR eller sanntid PCR, som vanligvis krever en intern forsterkningskontroll for å sikre at negative resultater ikke skyldes matrisehemming28. Videre viste LAMP lignende (eller overlegen) spesifisitet og følsomhet sammenlignet med PCR eller sanntids-PCR i de aller fleste studier8. Kostnaden for LAMP reagenser er på ca $ 1 per reaksjon. LAMP-instrumentene som brukes i denne protokollen er små, lite vedlikehold og bærbare. De kan håndtere alle isotermiske forsterkningsmetode som bruker måldeteksjon ved fluorescensmåling, LAMP inkludert. Ved hjelp av LAMP-programvaren kan omfattende rapporter genereres i flere formater (pdf, tekst og bilde).
Metodevalidering er et kritisk trinn før en ny metode kan tas i bruk for rutinemessig bruk. Det er bemerkelsesverdig at LAMP-protokollen som rapporteres her, har fullført multilaboratorivalidering19. Med den nylige inkorporeringen av denne LAMP-protokollen i USDAs BAM kapittel 5 Salmonella27,forventes det at metoden vil få mye bredere bruk, både som en rask screeningmetode i animalsk mat og som en pålitelig bekreftelsesmetode for presumptive Salmonella isolerer fra alle matkategorier.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser. Synspunktene som uttrykkes i dette manuskriptet er forfatternes og gjenspeiler ikke nødvendigvis den offisielle politikken til Department of Health and Human Services, US Food and Drug Administration eller den amerikanske regjeringen. Referanse til kommersielle materialer, utstyr eller prosesser utgjør ikke på noen måte godkjenning, godkjenning eller anbefaling fra Food and Drug Administration.
Acknowledgments
Forfatterne takker medlemmer av FDAs mikrobiologi metoder validering subcommittee (MMVS) og Bakteriological Analytical Manual (BAM) Council for kritisk gjennomgang Salmonella LAMP metode validering studier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain heart infusion (BHI) broth | BD Diagnostic Systems, Sparks, MD | 299070 | Liquid growth medium used in the cultivation of Salmonella. |
| Buffered peptone water (BPW) | BD Diagnostic Systems, Sparks, MD | 218105 | Preenrichment medium for the recovery of Salmonella from animal food samples. |
| DNA AWAY | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 7010 | Eliminates unwanted DNA and DNase from laboratory bench, glassware, and plasticware without affecting subsequent DNA samples. |
| Genie Explorer software | OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom | Version 2.0.6.3 | Supports remote operation of Genie instruments including LAMP runs and data analysis. |
| Genie II or Genie III (LAMP instrument) | OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom | GEN2-02 or GEN3-02 | A small instrument capable of temperature control up to 100 °C with ± 0.1 °C accuracy and simultaneous fluorescence detection via the FAM channel. Genie II has 2 blocks (A and B) with 8 samples in each block. Genie III has a single block that accommodates 8 samples. |
| Genie strip | OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom | OP-0008 | 8-well microtube strips with integral locking caps and a working volume of 10 to 150 µl. |
| Genie strip holder | OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom | GBLOCK | Used to hold Genie strips when setting up a LAMP reaction, the aluminum holder can also be used as a cool block. |
| Hydrochloric acid (HCl) solution, 1 N | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | SA48-500 | Adjusts pH of animal food samples after adding BPW and prior to overnight enrichment. |
| Heat block | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 88-860-022 | Heats samples at 100 ± 1 oC for DNA extraction. |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 3960 | Standard laboratory incubator. |
| ISO-001 isothermal master mix | OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom | ISO-001 | An optimized master mix to simplify the assembly of a LAMP reaction, containing a strand-displacing GspSSD DNA polymerase large fragment from Geobacillus spp., thermostable inorganic pyrophosphatase, reaction buffer, MgSO4, dNTPs, and a double-stranded DNA binding dye (FAM detection channel). |
| Isopropanol | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | A416 | Disinfects work surfaces. |
| LAMP primers | Integrated DNA Technologies Inc., Coralville, IA | Custom | LAMP primers with detailed information in Table 1. |
| Microcentrifuge | Eppendorf North America, Hauppauge, NY | 22620207 | MiniSpin plus personal microcentrifuge. |
| Microcentrifuge tubes | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 05-408-129 | Standard microcentrifuge tubes. |
| Molecular grade water | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | AM9938 | Used in making primer stocks, primer mix, and LAMP reaction mix. |
| Sodium hydroxide (NaOH) solution, 1 N | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | SS266-1 | Adjusts pH of animal food samples after adding BPW and prior to overnight enrichment. |
| Nonselective agar (e.g., blood agar, nutrient agar, and trypticase soy agar) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | R01202 | Solid growth medium used in the cultivation of Salmonella. |
| Peptone water | BD Diagnostic Systems, Sparks, MD | 218071 | Dilutes overnight Salmonella cultures to make positive control DNA. |
| Pipettes and tips | Mettler-Toledo Rainin LLC, Oakland CA | Pipet Lite LTS series | Standard laboratory pipettes and tips. |
| PrepMan Ultra sample preparation reagent | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 4318930 | A simple kit used for the rapid preparation of DNA templates for use in a LAMP reaction. |
| Salmonella reference strain LT2 | ATCC, Manassas, VA | 700720 | Salmonella reference strain used as positive control. |
| Trypticase soy broth (TSB) | BD Diagnostic Systems, Sparks, MD | 211768 | Liquid growth medium used in the cultivation of Salmonella. |
| Vortex mixer | Scientific Industries, Inc., Bohemia, NY | SI-0236 | Standard laboratory vortex mixer. |
| Whirl-pak filter bag | Nasco Sampling Brand, Fort Atkinson, WI | B01318 | Filter bags to hold animal food samples for preenrichment. |
References
- Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research. 28 (12), 63 (2000).
- Kaneko, H., Kawana, T., Fukushima, E., Suzutani, T. Tolerance of loop-mediated isothermal amplification to a culture medium and biological substances. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 70 (3), 499-501 (2007).
- Francois, P., et al. Robustness of a loop-mediated isothermal amplification reaction for diagnostic applications. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 62 (1), 41-48 (2011).
- Yang, Q., Wang, F., Prinyawiwatkul, W., Ge, B. Robustness of Salmonella loop-mediated isothermal amplification assays for food applications. Journal of Applied Microbiology. 116 (1), 81-88 (2014).
- Nagamine, K., Watanabe, K., Ohtsuka, K., Hase, T., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification reaction using a nondenatured template. Clinical Chemistry. 47 (9), 1742-1743 (2001).
- Zhang, X., Lowe, S. B., Gooding, J. J. Brief review of monitoring methods for loop-mediated isothermal amplification (LAMP). Biosensors & Bioelectronics. 61, 491-499 (2014).
- Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Molecular and Cellular Probes. 16 (3), 223-229 (2002).
- Yang, Q., Domesle, K. J., Ge, B. Loop-mediated isothermal amplification for Salmonella detection in food and feed: Current applications and future directions. Foodborne Pathogens and Disease. 15 (6), 309-331 (2018).
- Mori, Y., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): Expansion of its practical application as a tool to achieve universal health coverage. Journal of Infection and Chemotherapy. 26 (1), 13-17 (2020).
- Mansour, S. M., Ali, H., Chase, C. C., Cepica, A. Loop-mediated isothermal amplification for diagnosis of 18 World Organization for Animal Health (OIE) notifiable viral diseases of ruminants, swine and poultry. Animal Health Research Reviews. 16 (2), 89-106 (2015).
- Kumar, Y., Bansal, S., Jaiswal, P. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A rapid and sensitive tool for quality assessment of meat products. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 16 (6), 1359-1378 (2017).
- WHO. The use of loop-mediated isothermal amplification (TB-LAMP) for the diagnosis of pulmonary tuberculosis: policy guidance. , Available from: http://www.who.int/tb/publications/lamp-diagnosis-molecular/en (2016).
- Kundapur, R. R., Nema, V. Loop-mediated isothermal amplification: Beyond microbial identification. Cogent Biology. 2, 1137110 (2016).
- WHO. Salmonella (non-typhoidal) fact sheet. , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs139/en (2018).
- FAO/WHO. Executive summary report of the joint FAO/WHO expert meeting on hazards associated with animal feed. , Available from: http://www.fao.org/3/a-az851e.pdf (2015).
- FDA. Compliance Policy Guide Sec. 690.800 Salmonella in Food for Animals. , Available from: https://www.fda.gov/downloads/iceci/compliancemanuals/compliancepolicyguidancemanual/ucm361105.pdf (2013).
- Bird, P., et al. Evaluation of the 3M molecular detection assay (MDA) 2 - Salmonella for the detection of Salmonella spp. in select foods and environmental surfaces: collaborative study, first action 2016.01. Journal of AOAC International. 99 (4), 980-997 (2016).
- D'Agostino, M., et al. Validation of a loop-mediated amplification/ISO 6579-based method for analysing soya meal for the presence of Salmonella enterica. Food Analytical Methods. 9 (11), 2979-2985 (2016).
- Ge, B., et al. Multi-laboratory validation of a loop-mediated isothermal amplification method for screening Salmonella in animal food. Frontiers in Microbiology. 10, 562 (2019).
- D'Agostino, M., Diez-Valcarce, M., Robles, S., Losilla-Garcia, B., Cook, N. A loop-mediated isothermal amplification-based method for analysing animal feed for the presence of Salmonella. Food Analytical Methods. 8 (10), 2409-2416 (2015).
- Galan, J. E., Ginocchio, C., Costeas, P. Molecular and functional characterization of the Salmonella invasion gene invA: homology of InvA to members of a new protein family. Journal of Bacteriology. 174 (13), 4338-4349 (1992).
- Chen, S., Wang, F., Beaulieu, J. C., Stein, R. E., Ge, B. Rapid detection of viable salmonellae in produce by coupling propidium monoazide with loop-mediated isothermal amplification. Applied and Environmental Microbiology. 77 (12), 4008-4016 (2011).
- Yang, Q., Chen, S., Ge, B. Detecting Salmonella serovars in shell eggs by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Food Protection. 76 (10), 1790-1796 (2013).
- Yang, Q., et al. Evaluation of loop-mediated isothermal amplification for the rapid, reliable, and robust detection of Salmonella in produce. Food Microbiology. 46, 485-493 (2015).
- Yang, Q., Domesle, K. J., Wang, F., Ge, B. Rapid detection of Salmonella in food and feed by coupling loop-mediated isothermal amplification with bioluminescent assay in real-time. BMC Microbiology. 16 (1), 112 (2016).
- Domesle, K. J., Yang, Q., Hammack, T. S., Ge, B. Validation of a Salmonella loop-mediated isothermal amplification assay in animal food. International Journal of Food Microbiology. 264, 63-76 (2018).
- Andrews, W. H., Jacobson, A., Hammack, T. S. Bacteriological Analytical Manual. Chapter 5: Salmonella. , Available from: http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070149.htm (2020).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).
