Summary
אנו מתארים שיטות פוטואקטיביות פלואורסצינטיות כדי לנתח את ההובלה האקסונלית של neurofilaments באקסונים מינרטיים בודדים של עצבים היקפיים מעכברים טרנסגניים המבטאים חלבון neurofilament פוטואקטיבי.
Abstract
פולימרים חלבון Neurofilament לנוע לאורך אקסונים ברכיב איטי של תחבורה אקסונלית במהירויות ממוצעות של ~ 0.35-3.5 מ"מ ליום. עד לאחרונה המחקר של תנועה זו ב situ היה אפשרי רק באמצעות תיוג דופק רדיואיזוטופי, המאפשר ניתוח של תחבורה אקסונלית בעצבים שלמים עם רזולוציה זמנית של ימים ורזולוציה מרחבית של מילימטרים. כדי ללמוד תחבורה neurofilament בסיטו עם רזולוציה זמנית ומרחבית גבוהה יותר, פיתחנו עכבר טרנסגני hThy1-paGFP-NFM המבטא חלבון neurofilament M מתויג עם GFP פוטואקטיבית בנוירונים. כאן אנו מתארים פלואורסץ פוטו-הפעלה פולס-לברוח ושיטות התפשטות דופק לנתח תחבורה neurofilament באקסונים מיאליים יחיד של עצבי השוקה מעכברים אלה ex vivo. קטעי עצב מבודדים נשמרים על שלב המיקרוסקופ על ידי עירוי עם תמיסת מלח מחומצנת ותמונה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנס דיסק ספינוד ספינוד. אור סגול משמש להפעלת הפלואורסצנס בחלון קצר. הפלואורסצינטיות באזורים הפעילים והמאגפים מנותחת לאורך זמן, מה המאפשר את המחקר של תעבורת נוירופילמנט עם רזולוציה זמנית ומרחבית בסדר של דקות ומיקרונים, בהתאמה. מידול מתמטי יכול לשמש כדי לחלץ פרמטרים קינטיים של תעבורת neurofilament כולל המהירות, הטיה כיוונית והתנהגות ההשהיה מהנתונים המתווברים. שיטות הבריחה הדופק והתפשטות הדופק ניתן גם להתאים כדי לדמיין את התחבורה neurofilament בעצבים אחרים. עם התפתחותם של עכברים טרנסגניים נוספים, שיטות אלה יכול לשמש גם כדי למצוא תמונה ולנתח את ההובלה האקסונלית של חלבונים ציטוסקאלטיים וציטוסוליים אחרים באקסונים.
Introduction
הטרנספורט האקסונלי של neurofilaments הוכח לראשונה בשנות ה-70 על ידי תיוג דופק רדיואיזוטופי1. גישה זו הניבה שפע של מידע על תחבורה neurofilament ב vivo, אבל יש לו רזולוציה מרחבית וזמנית נמוכה יחסית, בדרך כלל על סדר של מילימטרים וימים במקרההטוב 2. יתר על כן, תיוג דופק רדיואיזוטופי היא גישה עקיפה הדורשת הזרקה והקרבה של בעלי חיים מרובים כדי ליצור קורס זמן יחיד. עם הגילוי של חלבוני פלורסנט והתקדמות במיקרוסקופ פלואורסצנטי בשנות ה-90, לאחר מכן זה הפך להיות אפשרי לתעבורת neurofilament תמונה ישירות נוירונים תרבותיים בקנה מידה של שניות או דקות עם רזולוציה מרחבית תת מיקרומטר, מתן תובנה הרבה יותר גדולה לתוך מנגנוןתנועה 3. מחקרים אלה גילו כי פולימרים neurofilament באקסונים לנוע במהירות לסירוגין הן anterograde ו לאחור כיוונים לאורך מסלולים microtubule, מונע על ידי חלבונים מוטוריים microtubule. עם זאת, neurofilaments הם מבנים מוגבלים iffraction רק 10 ננומטר קוטר כי הם בדרך כלל רווחים מלבד שכניהם על ידי עשרות ננומטר בלבד; לכן, הפולימרים ניתן לעקוב רק נוירונים תרבותיים המכילים neurofilaments מופץ דלילה, כך פולימרים נעים ניתן לפתור משכניהם4. לכן, זה לא אפשרי כיום לעקוב אחר neurofilaments יחיד באקסונים המכילים פולימרים neurofilament בשפע, כגון אקסונים מילינציה.
כדי לנתח את התחבורה האקסונלית של neurofilaments באקסונים עשירים neurofilament באמצעות מיקרוסקופית פלואורסצנטית, אנו משתמשים בשיטת פלומת פעולה פלואורסצנטית שפיתחנו כדי ללמוד את התנהגות השהיה לטווח ארוך של neurofilamentsבתאי עצב מתואורים 4,,5. Neurofilaments מתויג עם חלבון היתוך נוירופילמנט פלואורסצנטי פוטואקטיבי מופעלים בקטע קצר של axon, ולאחר מכן קצב היציאה של נטים אלה מהאזור הפעיל הוא מכמת על ידי מדידת ריקבון פלואורסצנטי לאורך זמן. היתרון של גישה זו הוא שזה ניתוח ברמת האוכלוסייה של תחבורה neurofilament שניתן להחיל על זמן בקנה מידה של דקות או שעות ללא צורך לעקוב אחר התנועה של פולימרים neurofilament בודדים. לדוגמה, השתמשנו בשיטה זו כדי לנתח את הקינטיקה של תעבורת neurofilament בתרבויות מדליה6.
לאחרונה, תיארנו את הפיתוח של עכבר טרנסגני hThy1-paGFP-NFM המבטא רמות נמוכות של חלבון neurofilament מתויג paGFP M (paGFP-NFM) בנוירונים תחת שליטתו של הנוירון האנושי ספציפי Thy1מקדם 7. עכבר זה מאפשר ניתוח של תחבורת neurofilament בסיטו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסץ. במאמר זה, אנו מתארים את הגישות הניסיוניות לניתוח תעבורת neurofilament באקסונים מיאליים של עצבי טיביים מעכברים אלה באמצעות שתי גישות. הראשונה של גישות אלה היא שיטת הבריחה הדופק המתואר לעיל. שיטה זו יכולה ליצור מידע על התנהגות ההשהיה של neurofilaments, אבל הוא עיוור לכיוון שבו הנינים לעזוב את האזור מופעל, ולכן אינו מאפשר מדידה של כיווניות נטו ומהירותתחבורה 8. השנייה של גישות אלה היא שיטת התפשטות פולסים חדשה שבה אנו מנתחים לא רק את אובדן הפלואורסצנטי מהאזור הפעיל, אלא גם את העלייה ארעית בפלואורסצנטיות בשני חלונות איגוף שדרכה נעים הניאורים הפלואורסצנטיים כשהם יוצאים מהאזור הפעיל הן בכיוון אנטרולוגי והן בכיוון הנסיגה. בשתי הגישות, ניתן להשיג פרמטרים של תעבורת נוירופילמנט כגון המהירות הממוצעת, כיווניות נטו והתנהגות השהיה באמצעות ניתוח מתמטי ומידול של השינויים בפלואורסצנטיות בחלונות המדידה. איור 3 ממחיש את שתי הגישות הללו.
פרוטוקול זה מדגים את הניתוח וההכנה של העצב, ההפעלה וההדמיה של הפלואורסצנטיות paGFP, וכמת של תעבורת neurofilament מהתמונות שנרכשו באמצעות חבילת ההפצה FIJI של ImageJ9. אנו משתמשים בעצב הטיבי כי הוא ארוך (כמה ס"מ) ואינו מסתעף; עם זאת, באופן עקרוני כל עצב המביע paGFP-NFM מתאים לשימוש עם טכניקה זו אם ניתן לנתח אותו de-נדן מבלי לפגוע האקסונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) של אוניברסיטת אוהיו.
1. הכנת תמיסת מלח עצבית
- הפוך 100 מ"ל של תמיסתמלח של ברויר 10: 98 מ"מ NaCl, 1 mM KCl, 2 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4, 1.5 מ"מ CaCl2, 5.6% D-גלוקוז, 23.8 mM NaHCO3 במים מזוקקים כפול.
- בועה 95% חמצן / 5% פחמן דו חמצני (קרבוגן) דרך תמיסת מלח לפחות 30 דקות לפני השימוש. ניתן לעשות בהן תמיסת מלח שאריות בתוך שבוע אחד; עם זאת, יש להוקסין אותו מחדש לפני כל שימוש.
- יוצקים תמיסת מלח מחומצן למזרק של 60 מ"ל ומוודאים שנותר אוויר מינימלי במזרק.
2. הרכבה ראשונית של תא עירוי עצבי
- חברו את המזרק ואת הצינורות כפי שמצג באות 1A, והניחת צינור הזרימה לתוך בקבוקון פסולת.
- מניחים את האטם התחתון לתוך הדיור של תא ההתזות, כדי להבטיח שכנס הזרימה ועמדות העודף מיושרים עם החורים באם.
- מניחים את האטם הפנימי (סיליקון, 100 μm עבה) על כיסוי עגול #1.5 (40 מ"מ קוטר), בזהירות להחליק את כל הקמטים באטום כדי להבטיח אטם הדוק. כדי להקל על הרכבה מאוחרת יותר, מניחים את הכיסוי והטם על מגבת נייר או על מגבון משימה כשהטם פונה כלפי פנים כלפי פנים.
3. פירוק והכנה של עצב התריס
- להקריב את החיה על ידי שאיפת פחמן דו חמצני או שיטה אחרת שאושרה על ידי מוסד. התחל טיימר כאשר החיה מפסיקה תנועה / נשימה, כמו ניסויים יש לערך רק בתוך 3 שעות של הקרבה7.
- מרססים את הפרווה ב-70% אתנול ומסירים כמה שיותר מהרגליים והגב של החיה בעזרת סכין גילוח חשמלי.
- באמצעות זוג מספריים ניתוח גדול, לעשות חתך גב בעור ליד אמצע עמוד השדרה ולהמשיך את החתך סביב ההיבט החנוני של החיה. החל מחתך זה, לאט לשקף את העור מהרגליים על ידי בעדינות מושך אותו מן השריר וחיתוך fascia.
- מניחים את החיה בתמונת עליונות על מגש פירוק ומצמידים את כל ארבע כפות הרגליים. לחלופין, הצמד את הזנב כדי להפחית את התנועה עוד יותר.
- באמצעות מספריים microdissection, לעשות חתך בשרירי הירך באמצע הדרך בין הזנב והברך כדי לחשוף את עצב הירך. ודא כי העצב, אשר נראה דרך השריר, לא לחתוך.
- להאריך את החתך גב גב ובפתח כדי להסיר את השריר. באופן דומה, להסיר את שרירי השוק, שמירה על חתכים רדודים וקצרים כדי למנוע פגיעה בעצב.
- הסר את השרירים עד שעצב השוקה נחשף במלואו מהנומה שבה הוא מסתעף מעצב הירך (בברך) לעקב(איור 2א).
הערה: בכל השלבים, כולל ובעקבות ניתוח של עצב השוקה, הימנע מחשיפה מיותרת לאור הסביבה כדי למזער הפעלה מקרית אפשרית של paGFP בעצב. - אחז בעצב הטיבי בקצה עמוד השדרה-פרוקסימלי עם זוג מלקות וחתוך את העצב באמצעות זוג מספריים מיקרו-דיסציה. לדאוג לא לשים מתח על העצב, להרים אותו מהשריר, חיתוך כל החזקות.
- חותכים את הקצה הדיסטלי של עצב הטיבי והעבר לצלחת פטרי קטנה של תמיסת מלח מחומצן בטמפרטורת החדר. מנודה זו על ההליך, תמיד להיות בטוח כדי לעקוב אחר הקצוות הפרוקסימליים והדיסטליים של העצב.
הערה: דרך אחת לעשות זאת היא לסמן את הקצה הדיסטלי של העצב עם חתך זוויתי כך שהתחדד יהיה גלוי. - החל מהקצה הפרוקסימלי של העצב, לתפוס בעדינות את האקסון החשוף מסתיים עם זוג מלקות עדינות מאוד.
- עם זוג מפסים שני, אחז בננדן העצבי במהירות, ומשוך באיטיות לעבר הקצה הדיסטלי של העצב. נדן העצב יחליק לאורך האקסונים בהתנגדות מינימלית. ודא כי אין מתח מיותר מוחל על העצב במהלך תהליך זה.
4. הרכבה סופית של תא עירוי עצבי
- תופס את הקצה הפרוקסימלי של העצב, להסיר אותו מהתמיסת מלח ולהניח אותו באיטיות על הכיסוי של תא התסיסה בתוך הפתח המלבני של האטם הפנימי, שמירה על מתח עדין על העצב כפי שאתה מניח אותו, כך שהוא שוכב ישר.
- מניחים את החלקה מיקרו-מים מעל העצב כאשר הצד החריץ פונה לעצב, ואת כיוון הזרימה במקביל לעצב. הפוך את כיסויי הכיסוי ואת מכלול microaqueduct מעל, ולמקם אותו בתוך הדיור תא התזתוב עם מגלשת microaqueduct התפייסות לאוטם החוץ. העצב והטם הפנימי שמסביב יהיו כעת כריך בין כיסוי הגלישה ואת מגלשת microaqueduct, אשר מופרדים על ידי האטם, עם כיסוי פונהכלפי למעלה (איור 1B).
- אבטחו את תא ההזתה על-ידי הצבתו בבית המתכת וסיבוב טבעת הנעילה. ודא כי דיור פלסטיק הוא באופן מלא תחת כל קליפי מתכת להדק היטב כדי למנוע דליפת תמיסת מלח. לחץ יתר עלול לפצח את מגלשת המיקרו-מים או את כיסוי הכיסוי. הפוך את התא כך כיסוי הוא פונה כלפי מטה.
- לדכא לאט את בוכנה מזרק תמיסת מלח כדי למלא את תא התבעוב. שמור את הצינורות שקע ושקע, בקבוקון שקע ומזרק מוגבה מעל התא עצמו בכל עת במהלך ההתקנה וההדמיה. זה מונע שאיבת, אשר יכול להציג בועות או לגרום לחוסר יציבות פוקוס בשל לחץ שלילי בתא.
- מעבירים את מכלול ההתזות לשלב מיקרוסקופ הפוך והניבו את המזרק המסתור לתוך משאבת המזרק. הפעל את המנוע במהירות מתאימה לקצב זרימה של 0.25 מ"ל/דקה. לאחר מכן התחבר והפעיל את דוד הפתרון ההתירמוכן ל- 37°C.
- חבר את התנור האובייקטיבי והגדר ל-37°C, החל שמן על המטרה והכנס את תא הזבות להרכבה על הבמה.
- מורחת שמן על משטח התנור התא וצורפים לתא התפר. חבר והפעיל את דוד התא; הגדר ל- 37 °C.
הערה: שינויים בטמפרטורה עלולים לגרום בועות להיווצר בתא התועבת עקב outgassing של הפתרון. אם נוצרות בועות, הגדל לזמן קצר את קצב זרימת הפתרון ב-5-10x עד שהבועות יתבהרו. - נעל את תא התסיסה לתוך מתאם הבמה ומביא את השמן האובייקטיבי במגע עם הכיסוי בצד התחתון של התא.
הערה: תא הביוטק עם מתאם שלב ASI המשמש כאן מיועד לתצורת מיקרוסקופ הפוכה.
5. הפעלת פלואורסנס ורכישת תמונה
- באמצעות תאורת brightfield, התמקד בשכבת האקסונים על פני השטח התחתון של העצב הקרוב ביותר למשטח כיסוי(איור 2B). אקסונים מילינים (בדרך כלל 1 - 6 μm קוטר בעכברים בוגרים) ניתן לזהות על ידי הנוכחות של נדן מילין, אשר נראה תחת תאורת אור שידור brightfield ללא שיפור ניגודיות. שכך גם שצועצוצוץ וצמהונים של רנביר ניכרים. אקסונים לא מומינליים דקים יותר (בדרך כלל <1 μm קוטר) והם בדרך כלל נוכחים בחבילות (חבילות Remak), שם הם בדרך כלל קרוב מדי apposed כדי להיפתר אחד מהשני.
- אם זמין במיקרוסקופ, הפעל את מערכת המיקוד האוטומטי כדי לשמור על מיקוד במהלך הדמיית זמן.
- רכש תמונת הפניה של Brightfield. הקלט את הכיוון של העצב (עמוד השדרה-proximal וקצוות דיסטליים) ביחס לתמונות.
- רכש תמונה מדבקת באמצעות לייזר של 488 ננ"מ ומסנן פליטה המתאים ל-paGFP (לדוגמה, 525/50 ננ"מ) כדי לתעד את שפעת טרום האקונומיקה האוטומטית. שמור על כוח הלייזר נמוך כדי למזער את ההתכה, כאשר זמן החשיפה מותאם בהתאם כדי לזהות את האות הקלוש. כדוגמה, נתונים מייצגים נרכשו ב-5% כוח לייזר ו-4 חשיפות. רטוט את הגדרות הרכישה לשימוש בכל הניסויים העתידיים.
הערה: לאחר הפעלה פוטואקטיבית, הגדרות ההדמיה האידיאליות ייצרו יחס אות לרעש > 8 וצילום של פחות מ-25% מהאות המקורי במהלך 20 תמונות. האקסונים יכולים להיות גם בתמונה על ידי מיקרוסקופ אפיפלואורסץ רחב כפישעשינו במקור 7, אבל איכות התמונה תהיה נחותה בשל חוסר הקונסוליות. - הגדר את כוח הלייזר כ-5x כוח הדמיה רגיל ורכוש תמונה עם זמן חשיפה של 3-4 דקות. למרות לא חיוני, צעד זה מומלץ להלבין autofluorescence ומקורות אחרים של פלואורסץ לא רצויים על מנת להפחית את אות הרקע ובכך למקסם את האות לרעש של פלואורסץ פוטואקטיבי.
- רכוש תמונה עם ההגדרות המשמשות בשלב 5.4 כדי להקליט את קדם-הפעלה אוטומטית לאחר שלב הלבנה זה.
- בתדמית brightfield, צייר קו מקביל לאקסונים באורך השווה לגודל חלון ההפעלה הרצוי. אורכו של חלון זה ישתנה בהתאם למטרה הניסיונית ולפרמטרים, אך אורכים אופייניים הם 5 μm עבור פרדיגמת הבריחה דופק ו 40 μm עבור פרדיגמת התפשטות הדופק.
- באמצעות קו זה כמדריך, צייר אזור מלבני של עניין (ROI) על-פני שדה התצוגה בניצב אל האקסונים. האזור חייב להקיף את כל האקסונים כדי להיות פוטואקטיבי.
- הפעל את הפלואורסצנציה paGFP האזור נמשך בשלב 5.8 על ידי דוגמאות של תדר עם אור 405 צפון צפון. ודא שתמונה נרכשת ממש לפני ההפעלה ובדיוק לאחר ההפעלה.
הערה: הפעלת paGFP האידיאלית תייצר אזור מוגדר בבירור של פלואורסצנס עם גבולות חדים הכלולים ב-ROI. - התחל שעה של דקה אחת עם סיום ההפעלה. בתום דקה אחת, התחילו ברכישה של סדרת זמן.
הערה: העיכוב של דקה אחת יש צורך לאפשר את העלייה בפלואורסצנס שנצפה לאחר פוטו-הפעלה של paGFP11. עבור שיטת התפשטות הדופק, תקופת רכישה של 5-10 דקות עם מרווחי זמן של 30 שניות מספיקה למדידת המדרונות הראשוניים בחלונות המרכזיים והמאגפים כדי למדוד מהירות וכיוון. עבור שיטת הבריחה דופק, תקופת רכישה של 30-150 דקות עם 5 או 10 דקות מרווחי זמן מאפשר ניתוח של התנהגות ההשהיה לטווח ארוך של התיים - שמור את כל התמונות שנרכשו, כמו גם את ההחזר על ההשקעה המשמש להפעלת פלואורסצית.
- עבור לאזור חדש של העצב וחזור על שלבים 5.1-5.11. אם האזור החדש הוא לאורך אותו axon, זה חייב להיות לפחות 500 μm מהאזור שהופעל בעבר כדי למנוע זיהוי של neurofilaments פלורסנט שעברו מהאזור הפעיל האחר. רכישת הזמן הסופי חייבת להסתיים לפני סוף חלון ה-3 שעות.
הערה: ייתכן שההכנה עשויה להיות בת קיימא למשך יותר מ- 3 שעות, אך לא אישרנו זאת. עם ניתוק והכנה מיומנים, בין חמש לשמונה ערכות תמונה של 10 דקות ניתן לרכוש בתוך חלון זה של 3 שעות. - לאחר רכשה סדרת התמונה האחרונה, הפסק את זרימת תמיסת מלח, נתק את התמיסה ואת תנורי התא, והסר את אפליקציית הסבז'ן לשלב המיקרוסקופ.
6. רכישת תמונות פלאטפילד ו- Darkfield
- להפוך פתרון של פלואורסצ'ין על ידי הוספת 250 מ"ג של אבקת פלואורסצ'ין 0.5 מ"ל של מים מזוקקים כפולים. מערבבים עד שאין חלקיקים גלויים ומסובבים את הפתרון למשך 30 שניות צנטריפוגה על השולחן כדי לחשמל כל חומר לא פתור. ניתן לאחסן פתרון זה במשך מספר חודשים ב- 4 °C אם מוגן מפני חשיפה לאור.
- הוסף 8 μL של פתרון פלואורסצ'ין לשקופית ולהחיל #1.5. כתם נוזל עודף, לאטום עם לק, ולאפשר לייבוש.
הערה: בריכוז גבוה זה, הספיגה החזקה של צבע הפלואורסגין מכבה את הקרן המאירה בתוך הפתרון, ומייצרת מישור דק של פלואורסצנטיות על פני השטח של כיסוי הכיסוי, כי הוא גם אחיד ועמיד בפני פוטו-בליךעקב חילופי מפזר מהיר 12. - מקם את החלקה הפלואורסצ'ין מכסה-צד כלפי מטה על שלב מיקרוסקופ הפוך ולהתאים את המיקוד על המישור הדק של פלואורסצסצט על פני השטח של כיסוי. לנוע סביב השקופית כדי למצוא שדה תצוגה שאינו מכיל בועות אוויר (כתמים כהים) או חלקיקי פלואורסן גדולים (נקודות בהירות).
- לרכוש z-stack המשתרע על פני 6 μm במרווחי 0.2 μm כך התמונה האמצעית היא מישור המיקוד המקורי. השתמש בזמן חשיפה קצר (לדוגמה, 40 ms) מכיוון שהפלואורסוצנס יהיה בהיר מאוד. רכישת z-stack זה הכרחי כדי ללכוד את הפלואורסצנטיות המקסימלית על פני שדה התצוגה כמו כיסוי הוא לעתים רחוקות אופקי בצורה מושלמת ומישור פלואורסצנטיות פלורסין הוא צר מאוד. חזור על פעולה זו עבור סך של 25 שדות תצוגה, הזזת השלב על-ידי לפחות 20 μm בכל כיוון בין שדות.
- סגור את כל תריסי נתיב האור, כולל תריס המצלמה, והגדר את כוח הלייזר ואת זמן החשיפה לאפס. רכוש ערימה של 100 תמונות עם הגדרות אלה. תמונות אלה יהיו בממוצע כדי ליצור את התמונה darkfield, אשר ישמש לתיקון עבור זרם כהה ואת היסט הטיה על שבב המצלמה.
הערה: רכישת זרימה היא דרך אידיאלית ללכוד תמונות אלה.
7. הדמיה גליקולית מעוכבת עצבים לתיקון אקונומיקה
- להפוך ולחמצן תמיסת מלח כמו בשלב 1; עם זאת תחליף 2-deoxy-D-גלוקוז עבור D-גלוקוז ולהוסיף 0.5 mM נתרן iodoacetate לעכב גליקוליזה13. אנחנו קוראים לזה "תמיסת מלח מעכבת".
- חזור על שלבים 2-5 באמצעות תמיסת מלח מעכבת, עם תמונה של 10-30 דקות של זמן מוגדר בשלב 5.11. אפשר 40-50 דקות לאחר היישום של תמיסת מלח מעכבת לפני ההדמיה כדי להבטיח עיכוב מלא של תחבורת neurofilament.
הערה: עיכוב גליקוליטיק בסופו של דבר יהרוג את האקסונים כך שיש חלון צר של זמן לאחר עיכוב שבו להשיג נתונים, בדרך כלל על 30 דקות. אינדיקטור של רמת העיכוב חילוף החומרים הוא הפלבין autofluorescence של המיטוכונדריה אקסורציה, אשר ניתן לזהות בסדרת timelapse בשל החשיפות הארוכות בהן אנו משתמשים כדי למצוא את הפלואורסצנציה paGFP14. בדרך כלל, מיטוכונדריה autofluorescence יגדל במהלך הטיפול עם תמיסת מלח מעכבת. אם המיטוכונדריה מתחילה לאסוף או לרסיס, אז להפסיק את ההדמיה.
8. עיבוד וניתוח תמונה באמצעות ImageJ
- תיקון שטוחפילד ושדה אפל
- פתח את מחסנית התמונות Darkfield וממוצע התמונות על-ידי לחיצה על תמונה | ערימות | Z Project ובחירה בעוצמה ממוצעת בתפריט הנפתח כדי ליצור את תמונת Darkfield.
- פתח את ערימות התמונה flatfield פלואורסצ'ין וליצור הקרנת עוצמה מרבית של כל (25 בסך הכל) על ידי לחיצה על תמונה | ערימות | Z Project ובחירה בעוצמה מרה בתפריט הנפתח.
- שלב את 25 תמונות ההקרנה המרביות לתוך מחסנית אחת על-ידי לחיצה על תמונה | ערימות | תמונות לערימה. צור הקרנת עוצמה ממוצעת של מחסנית זו על-ידי לחיצה על תמונה | ערימות | Z Project ובחירה בעוצמה ממוצעת מהתפריט הנפתח כדי ליצור את תמונת השד השטוח.
- הפחת את תמונת השדה האפל מתדמית השד השטוח על-ידי לחיצה על 'הפוך ל'תהליך' | מחשבון תמונה, בחירה באפשרות חיסור כפעולה. ודא שאפשרות התוצאה של 32 סיביות (ציפה) מסומן. התוצאה היא תמונת השד השטוח התוקנה.
- מדוד את עוצמת הפיקסל הממוצעת של תמונת השד השטוח התוקנת על-ידי לחיצה ראשונה על נתח | הגדר מדידות ובדוק את התיבה ערך אפור ממוצע ולאחר מכן הקש על מקש 'm'.
- חלק את תמונת השד השטוח ההתקן בעוצמה הממוצעת שלה על-ידי לחיצה על '22' | מתמטיקה | חלק והזן את הערך האפור הממוצע שהושג בשלב 7.1.5. כך תפיק תמונת רווח הפוכה.
- פתח את התמונות שלפני ההפעלה ולאחר ההפעלה יחד עם מחסנית התמונות של timelapse. שלב את התמונות בערימה בודדת על-ידי לחיצה על תמונה | ערימות | כלים ומידע | תסנכרןובחר את התמונות בסדר כרונולוגי מהתפריטים הנפתחים. ודא שהאפשרות פתח כתדמית 4D לא נבחרה. המחסנית שנוצרה היא סט התמונה המלא.
- חזור על שלב 8.1.4 בסדרת התמונה המלאהולאחר מכן חלק את התוצאה בתדמית ההברך על-ידי לחיצה על תהליך | מחשבון תמונה ובחירה באפשרות חלק כפעולה. פעולה זו תייצר את סט התמונההמלא התוקן , שבו תוקנה כל תמונה עבור אי-אחידות בתחום התאורה ועל הגלאי.
- יישור מחסנית תמונות
- כדי לתקן אי התאמה של מישורים תמונה בסדרת timelapse עקב שלב או סחיפה לדוגמה, להתקין את היישור על ידי תוסף אזור קבוע (קובץ משלים 1) על ידי לחיצה על תוספים | התקן אתה- Plug-In , ניווט לתיקיה המכילה את קובץ התוסף ובחר את התוסף. הפעל מחדש את ImageJ לאחר התקנת התוסף.
הערה: תוסף זה מיישר תמונות בהתבסס על עקרון "הכי פחות ריבועים מתנוונים"15. - צייר החזר השקעה על סט התמונה המלאה מתוקנת המשתרעת על פני מספר אקסונים ואינה משתרעת מעבר לגבולות הפרוקסימליים והדיסטליים של הפלואורסצנציה המופעלת בתוך כל אחד מהאקסונים. הגיאומטריה של האזור אינה חשובה, אולם לא כולל אזורים שבהם מבנים לשנות צורה או גודל ישפרו את היישור.
- הפעל את תוסף היישור על-ידי לחיצה על תוספים | יישור לפי אזור קבוע. התוסף ממקם ברירת מחדל של 2 פיקסלים לכל היותר על העקירה בין מסגרות, אולם ניתן להתאים זאת בחלון המוקפץ הראשוני אם יש סחיפה משמעותית של הדגימה. היישור עשוי להימשך מספר דקות, בהתאם לגודל מחסנית התמונה.
- בדוק באופן חזותי את המחסנית המיושרת כדי להעריך את איכות היישור. ייתכן שמסגרות מסוימות יצטרכו להיות מיושרות באופן ידני, מכיוון שהיישור האוטומטי עשוי שלא לתפקד היטב עבור תנודות גדולות בפלואורסצנטיות בין מסגרות. ניתן לבצע אפשרות זו בעת הצגת מסגרת שיש להזיזה על-ידי לחיצה על תמונה | שינוי צורה | תרגם. לחץ על לא ברשימה הה מוקפץ הבאה השואלת אם יש לתרגם את המחסנית כולה. השתמשו רק בערכי פיקסלים שלמים בתרגום וודאו שתפריט האינטרפולציה הנפתח מוגדר כ'ללא'- מכיוון ששינויי פיקסלים חלקיים או אינטרפולציה ישנו את הנתונים עקב גמילה מחדש של עוצמת הפיקסלים.
- שמור זאת כערכת התמונה המלאה המיושרת.
- כדי לתקן אי התאמה של מישורים תמונה בסדרת timelapse עקב שלב או סחיפה לדוגמה, להתקין את היישור על ידי תוסף אזור קבוע (קובץ משלים 1) על ידי לחיצה על תוספים | התקן אתה- Plug-In , ניווט לתיקיה המכילה את קובץ התוסף ובחר את התוסף. הפעל מחדש את ImageJ לאחר התקנת התוסף.
- מדידה של עוצמות פלואורס
- צייר ROI באמצעות הכלי זווית במסגרת הראשונה של סט התמונה המלאה המיושרת עם הזרוע הראשונה לאורך קצה אחד של האזור הפעיל, ניצב לאקסונים והזרוע השנייה אנכית. הקש על מקש 'm' כדי למדוד את הזווית, המתארת את כיוון האקסונים בשדה התצוגה.
- הגדר את קנה המידה של התמונות כך שממדים נמדדים במיקרון על-ידי לחיצה על נתח | הגדר קנה מידה והזן את הערכים המתאימים.
- פתח את מנהל ההחזר על ההשקעה על-ידי לחיצה על נתח | כלים ומידע | מנהל ROI. לפפרדיגמה של בריחת הדופק, דלג לשלב 8.3.7. להתפשטות הדופק, המשך לשלב 8.3.4.
- צייר ROI מרובע של ממדים כלשהם ולאחר מכן לחץ על ערוך | בחירה | ציין. ודא שהאפשרות יחידות עם קנה מידה מסומן ולאחר מכן הגדר את ההחזר על ההשקעה לרוחב של 15μm וגובה השווה לגובה התמונה או גדול מהם.
- סובב את ההחזר על ההשקעה בזווית הנמדדת בשלב 8.3.1 על-ידי לחיצה על ערוך | בחירה | סובב כדי להפוך אותו בניצב לאקסונים, והצב את ההחזר על ההשקעה עם צד אחד לאורך הקצה הפרוקסימלי של האזור המופעל. הוסף החזר השקעה זה, אותו נתייחס אליו כמדריך הפרוקסימלי ROI, למנהל על-ידי הקשה על מקש 't'.
- גרור את ההחזר על ההשקעה כדי ליישר עם הקצה הדיסטלי של האזור המופעל והוסף שוב למנהל ההחזר על ההשקעה על-ידי הקשה על מקש 't'. אנו נתייחס לזה כאל מדריך דיסטל ROI. המדריך הפרוקסימלי והדיסטלי ROIs ישמש מאוחר יותר כדי לצייר את המדידה איגוף ROIs.
- בחר אקסונים לכמת, באמצעות רצף התמונה של timelapse שנרכש בשלב 5.11 לעיל. רצף תמונה זה מועיל למטרה זו מכיוון שהוא לוכד את הפלואורסנציה האוטומטית החלשה של האקסונים, וחושף את המורפולוגיה שלהם מחוץ לאזור הפעיל.
הערה: אקסונים שאינם עומדים בקריטריונים הבאים אינם נכללים בניתוח:- על האקסונים להיות בפוקוס לאורך כל חלונות המדידה.
- האקסונים חייבים להיות בטווח של 5° בניצב לקצוות הפרוקסימליים והדיסטליים של אזור ההפעלה.
- לאקסון אסור יהיו תמורות בטווח של 5μm מהקצוות הפרוקסימליים והדיסטליים של אזור ההפעלה.
- אל תכלול אקסונים המ משנים צורה באופן ניכר במהלך ההדמיה.
- אל תכלול אקסונים שנראים לא בריאים כפי שמעיד היעדר אזור דיסקרטי המופעל בתדמית שלאחרההפעלה (איור 2C,למטה), מכיוון שזה מעיד על פיזור מפוזר של הפלואורסצסצנה המופעלת, מה שקורה כאשר האקסון מת.
- צפה בתדמית הלבנה בחשיפה ארוכה ממדרגה 5.5 למבנים בעלי שפעת אוטומטית בתוך האקסונים. פלואורסצנס זה נובע מפלווינס בתוך המיטוכונדריה16. אל תכלול אקסונים מניתוח אם המיטוכונדריה הזומופיעה מעוגלת או מפוצלת (איור 2D, למטה), בניגוד למבנים ליניאריים מורחבים(איור 2D, למעלה), מכיוון שזו אינדיקציה לירידה מטבולית.
- באמצעות המדריך הפרוקסימלי והדיסטלי ROIs שנוצר לעיל, לצייר שלוש ROIs מדידה לכל axon להיות מנותח: חלון מרכזי המקיף את האקסון בתוך האזור מופעל 40 μm, ושני חלונות איגוף עם רוחב מוגבל על ידי חלון איגוף 15 μm ROIs וגובה מוגבל על ידי הקוטר של האקסון בגבול אזור ההפעלה. הוסף את כל שלושת האזורים למנהל ההחזר על ההשקעה. עבור אקסונים מעוכבים גליקולית, צייר אזור אחד כי הוא לא יותר מ 5 μm רחב באמצע האזור מופעל, כי אינו משתרע מחוץ לאקסון. עבור פרדיגמת פעימה לברוח, האזור הפעיל הוא רק 5 μm רחב, כך החלון כולו חייב לשמש.
- חזור על שלב 8.3.9 עבור כל האקסונים התועדים לקריטריונים של שלבים 8.3.7 ו- 8.3.8.
- הגדר מידות פעילות לעוצמת פיקסלים ממוצעת על-ידי לחיצה על נתח | הגדר מידות ובחר באפשרות ערך אפור ממוצע. ודא שלא נבדקו אפשרויות מדידה אחרות.
- בחר את כל ROIs בחלון ROI Manager על-ידי בחירת החלון והקשה על 'Ctrl' + 'a'. בחלון מנהל ROI, לחץ על עוד | רב מידה כדי למדוד את עוצמת הפלואורסס העתק את הנתונים מחלון התוצאות בגיליון אלקטרוני לצורך ניתוח נוסף.
- הגדר מידות פעילות לאזור על-ידי לחיצה על נתח | הגדר מידות ובחר באפשרות אזור. ודא שלא נבדקו אפשרויות מדידה אחרות.
- חזור על שלב 8.3.12. יש צורך להעתיק רק שורה אחת של התוצאות עבור האזור, מכיוון שהזמן אינו משתנה.
9. תיקון פוטובלאך
- בגיליון האלקטרוני של הנתונים עבור אקסונים מעוכבים גליקוליטיקה, להפחית את הפלואורסציה ממוצעת של מסגרת 1 (מסגרת טרום ההפעלה) מן הפלואורסציה ממוצעת של כל מסגרת החל במסגרת 3 (מסגרת הזמן הראשונה) עבור החזר השקעה נתון. התוצאות הן אמצעי חיסור ברקע.
- התווה את הנתונים כעלילת פיזור עם מספרי המסגרות כמו האבסיסה. התאם קו מגמה מעריכי לנתונים מכל ROI (לרוב תוכניות הגיליון האלקטרוני יש פונקציה זו) עם משוואה בצורת Ae-bx. משוואה זו שווה ערך לפונקציית ההתפכה Ft = F0 * e-tɣ כאשר F0 הוא הפלואורסצנציה במסגרת הראשונה של הזמן, ɣ הוא קצב ההלבנה המעריכי, t הוא הזמן, ו- e הוא בסיס הלוגאריתם הטבעי.
- חזור על שלבים 9.1.1-9.1.2 עבור כל ROIs של כל האקסונים מן העצבים המעוכבים גליקוליטיקה. להערכה המדויקת ביותר של קצב ההתפתלות, השתמשו בלפחות 15 אקסונים בסך הכל מ-5 עצבים נפרדים לפחות. השתמש בממוצע של שיעורי הלבנה אקספוננציאליים (ɣ) מכל האקסונים המעוכבים כדי לתקן את הנתונים הניסיוניים עבור פוטו-בליך. כיול הלבנה חדש חייב להתבצע עבור כל ניסוי או מחקר, מכיוון שצילום-בליח תלוי בהגדרות רכישת התמונה ובכוח הלייזר, שיכולים להשתנות עם הזמן.
- חזור על שלב 9.1.1 עבור כל אזורי האקסונים התמונה עם תמיסת מלח רגילה (כלומר לא מעוכב גליקולית).
- חלק כל נקודת נתונים ב- e-tɣ, תוך שימוש בזמן עבור t ɣ נמצא בשלב 9.1.3. אלה האמצעים פוטובלאך מתוקן.
- הכפל כל נקודת נתונים לפי האזור כדי שאזור עניין זה ימצא את הפלואורסץ הכולל באזור זה בכל פעם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 3 מציג תמונות מייצגות מניסויים בפעימה והתפשטות פולסים. פרסמנו מספר מחקרים המתארים נתונים שהושגו בשיטת הבריחה מהדופק והשיטות שלנו לניתוחנתונים אלה 5,,6,,7,,8,,17. להלן, אנו מראים כיצד נתוני התפשטות הדופק יכולים להניב מידע על הכיווניות והמהירות של תעבורת נוירופילמנט, שלא דיווחנו על כך בעבר.
תעבורת נוירופילציה באקסון היא לסירוגין דו-כיוונית. תחבורה זו יכולה להיות מתוארת על ידי שבריר של נסיסים הנעים בכל זמן נתון בanterograde וכיוון 
נסיגה, ובהתחשב, ואת המהירות שלהם בanterograde וכיוון לאחור, מסומן על ידי 
ו 
. אם ניקח את הכמות הכוללת של פולימר neurofilament לכל יחידת אורך של axon להיות 
, אז השטף בanterograde והוראות לאחור דרך אזור נתון ניתנים על ידי
ו-
,
בהתאמה, והכשף הכולל 
ניתן על-ידי
,
כאשר 
יש יחידות μm-1, 
יש יחידות ויש לו 
יחידות. מאז השטף במיקום נתון לאורך האקסון הוא כמות פולימר neurofilament שעובר את המיקום הזה ביחידת זמן, זה קשור למהירות הממוצעת 
דרך 
. לכן, אנו יכולים לכתוב
.
בניסוי התפשטות הדופק ניתן לקבוע את השטף מקצב היציאה של הנוירופילמנטים הפלואורסצנטיים מהאזור הפעיל, שאנו מכנים "החלון המרכזי". האובדן הכולל של פולימר נוירופילמנט פלורסנט מחלון מרכזי זה לשנייה הוא סכום ההפסדים 
בשל פולימרים נוירופילמנט פלורסנט עוזב בanterograde והנחיות לאחור, כלומר.
מנורמל לתוכן הראשוני של פולימר נוירופילמנט פלורסנט בחלון המרכזי, 
כלומר, איפה 
אורך החלון המרכזי, שיעור זה של אובדן לאחר מכן הופך
כאשר 
נמצא השיפוע של הירידה בפלואורסץ בחלון המרכזי, שהוא בתחילה ליניארי לתקופה שניתנה על ידי 
8. עבור חלון מרכזי של 40 μm, זה משווה רק עשרות שניות. עם זאת, עבור חלונות כה גדולים, המעבר לשלב הריקבון המעריכי הוא הדרגתי והמדרון ליניארי למשך מספר דקות או יותר8.
בזמנים מוקדמים, החלונות המאגפים ללכוד את כל neurofilaments היוצאים מהחלון המרכזי כי אלה filaments אין מספיק זמן כדי לעבור דרך החלונות האגפים ולצאת מהם בצד השני. במקרה זה, הכמויות של פולימר נוירופילמנט פלורסנטיות העוזבות את החלון המרכזי באופן אנטרולוגי ובנסיגה לשנייה, כלומר השטף, ניתנות על ידי העלייה 
בתכולת הנוירופילמנט 
ובחלונות האגפים. מנורמל לתוכן הראשוני של פולימר נוירופילמנט פלורסנט בחלון המרכזי, שיעורי העלייה בחלונות האגפים הופכים
היכן 
והם מורדות העלייה בפלואורסצנס בחלונות האגף הפרוקסימליים והדיסטליים, בהתאמה.
לכן, אנו יכולים לבטא את המהירות הממוצעת במונחים של המדרונות בחלונות האגפים, כלומר.
(Eq. 1)
והיחס בין מספר anterograde ונסיגה נע neurofilaments במונחים של היחס של מדרונות אלה, כלומר.
(Eq. 2)
כאשר 
וציין את התעריפים שבהם neurofilaments להפוך מanterogradely לתנועה לאחור ולהיפך8. הערכים של 
ותו לא ניתן לקבוע על ידי מדידת התנועה של neurofilaments בודדים בנוירונים תרבותיים, כפי שדווח בעבר17. חשוב לציין, הביטוי למהירות ב Eq. 1 חל רק בזמנים קצרים לאחר ההפעלה שבמהלכו neurofilaments פלורסנט להיכנס לחלון האגף אבל לא לעזוב. משך הזמן של חלון זמן קצר זה יהיה תלוי באורך החלונות האגפים ואת הקינטיקה של תנועת neurofilament. ככל שהחלונות האגפים ארוכים יותר, באופן עקרוני, כך חלון הזמן ארוך יותר. תיאורטית, אפשר לבדוק שהקריטריון הזה מתענה על ידי אישור
(Eq. 3)
בניגוד לביטוי המהירות ב-Eq. 1, הנותן על ידי ההבדל בין המדרונות בחלונות האגפים, הביטוי לכיוון ב-Eq. 2 הוא חזק לאגף את גודל החלון משום שהוא ניתן על ידי היחס בין המדרונות בחלונות האגפים.
איור 3 מראה תוצאות מייצגות מניסויים בפעימה-בריחה והתפשטות פולסים על אקסונים מיאליים בעצב הבירה של עכבר זכר בן 8 שבועות משורת ה-hThy1 paGFP-NFM שלנו על רקע C57Bl/6J, תוך שימוש בגדלי חלונות של 5 ו-40 μm, בהתאמה. עכברים בני שבועיים לפחות, גברים ונשים, שימשו לפ פרדיגמים ניסיוניים אלה. הגיל והמין המתאימים צריכים להיקבע על ידי החוקר בהתאם למה שנבדק במחקר. לאורך זמן, ניתן לראות כי הקצוות של האזורים הפעילים לטשטש עקב עזיבת neurofilaments הן כיוונים anterograde ונסיגה, וכתוצאה מכך אובדן פלואורסצנטי מהחלון המרכזי.
עבור שיטת הבריחה דופק (איור 3A, C, E), קינטיקה ריקבון פלואורסצנטי באזור מופעל יכול להניב מידע על התנהגות השהיה לטווח ארוך וקצר טווח8,18. עבור ניסויים אלה, האזור המופעל יכול להיות קצר (אנו משתמשים בדרך כלל 5 μm; ראה תיבה צהובה באות 3A). עבור שיטת התפשטות הדופק(איור 3B, D, F),אנו משתמשים באזור מופעל ארוך יותר (40 μm כאן; ראה תיבה צהובה בדמות 3B)כדי לספק מאגר גדול יותר של neurofilaments פלורסנט. זה מאריך את הזמן שבו הפלואורסציה גדלה באזורי האגפים נשאר ליניארי (ראה לעיל). התחום ליניארי של עלייה זו פלואורסצית בחלונות האגפים ניתן גם להגדיל על ידי הגדלת אורך של חלונות אלה, עם זאת זה מוגבל על ידי גודל שדה התצוגה. השתמשנו 15 μm איגוף חלונות, מוצג באדום וירוק, עבור הנתונים המוצגים איור 3D.
איור 3E,3F מציג את הכימות של עוצמת הפלואורסצנטיות הכוללת (כלומר, סכום עוצמת הפיקסלים) עבור חלונות המדידה המוצגים באיור 3C,3D בהתאמה. לשיטת הבריחה מהדופק הריקבון הוא דו-פאזי, עם ריקבון אקספוננציאלי ראשוני המייצג את עזיבתם של נוירופילמנטים על המסלול. זה עובר בסביבות 10-20 דקות לריקבון אקספוננציאלי איטי שני המייצג את ההתגייסות והיציאה של נרים מחוץ למסלול8. לשם השוואה לשיטת התפשטות הדופק, אנו מציגים קורס זמן של 12 דקות בלבד באות 3E, אך בדרך כלל משך הניתוח צריך להיות ארוך יותר (בדרך כלל 30-120 דקות) כדי ללכוד את הקינטיות הארוכות של ההשעיה5,6,18. עבור אסטרטגיית התפשטות הדופק, החישובים של המהירות והכיוון של התנועה תלויים רק במדרונות בחלונות האגפים. עבור אורכי החלון המשמשים כאן, השלב ליניארי משתרע למשך כ- 5 דקות. יש להעריך את משך חלון הזמן הזה של הליניאריות על-ידי קיצור הזמן המשמש למדד המדרון, וקביעת הנקודה שבה המדרון אינו עולה עוד. ניתן להגדיל משך זה על-ידי הגדלת אורכי החלון אם שדה התצוגה של המצלמה מאפשר, אם כי אורכי החלון צריכים להיות קבועים עבור כל האקסונים בניסוי נתון. כדוגמה, השתמשנו ב-5 הדקות הראשונות של נתונים כדי למדוד את המדרונות עבור נתוני התפשטות הדופקים באיון 3F. התוצאה היא מדרונות של 72 A.U./min, -594 A.U./min, ו- 111 A.U./min עבור החלונות הפרוקסימליים, המרכזיים והדיסטליים, בהתאמה (A.U. = יחידות שרירותיות). כדי לנרמל ערכים אלה, הם מחולקים על ידי הפלואורסצנה הראשונית של החלון המרכזי, וכתוצאה מכך שיעורים של 0.108 %F0/min, -0.962 %F0/min ו- 0.173 %F0/min. החלת Eq. 3 אנו מוצאים כי קריטריון השימור אינו עומד, המציין כי אנחנו לא לוכדים את כל הפלואורסצנה בחלונות האגפים. זוהי מגבלה טכנית בשל שדה התצוגה של מצלמת EMCCD שלנו (82 μm x 82 μm). מצלמות עם שבבי sCMOS, אשר יכול להיות שדות תצוגה הרבה יותר גדולים, יכול לאפשר את השימוש בגדלים גדולים יותר של חלון איגוף. עם זאת, איננו יכולים לשלול את האפשרות כי פער זה בין המדרונות המרכזיים והמאגפים יכול להיות גם בשל, לפחות בחלקו, להמעיט בהיקף של פוטו-בליה (ראה דיון), אשר תהיה השפעה של חוסר השפעה של מדרונות חיוביים בחלונות האגפים והערכת יתר של המדרון השלילי בחלון המרכזי.
מהתעריפים בחלונות האגפים (%F0/min) ו- Eq. 2 לעיל, ובשימוש בערכים 
של ו- 17, אנו מחשבים את 
היחס = 2.12. זה מצביע על כך ש-68% מהנינים נעו באנטרוגרד ו-32% נסיגה. באמצעות אותם תעריפים ו- Eq. 1 לעיל, אנו מחשבים את מהירות האוכלוסייה נטו 
הממוצעת = 40*(0.00173-0.00108) = 0.026 μm/min, או 0.037 מ"מ/יום. מחקרים רדיואיזוטופיים תיוג דופק בעכברים בגיל דומה דיווחו על מהירות אוכלוסיית neurofilament של כ 0.6 מ"מ ליום בחלקים הפרוקסימליים ביותר של עצב הירך, האטה ל 0.12 מ"מ ליום על פני מרחק של שניסנטימטרים 19,20. נתוני התפשטות הדופק שלנו נאספו בעצב הטיבי, בערך עוד 2-3 ס"מ לאמצעים אלה. מהסיבות שהוזכרו לעיל, אנו מאמינים כי ההערכה של 0.037 מ"מ ליום היא זלזול במהירות האמיתית. עם זאת, מעריכים את ההאטה המרחבית שנצפתה על ידי תיוג דופק רדיואיזוטופי לתוך עצב הטיבי, הערכה זו אינה בלתי סבירה, במיוחד כאשר אנו רואים כי היא נקבעה באמצעות מתודולוגיה שונה מאוד בקנה מידה מרחבי וזמני שונה מאוד.
כדי להדגים את היכולת של שיטת התפשטות הדופק לזהות הבדלים משמעותיים בין אוכלוסיות, השווינו את מדרונות החלון הפרוקסימליים והדיסטליים שנמדדו מעצבים הספוגים בתמיסת תמיסת דם רגילה ומעכבת. עיכוב של גליקוליזה חוסם תנועה של neurofilaments, כפי שדיווחנו בעבר5,,6,,7. נדון מאוחר יותר את הבחירה של גדלי מדגם לניסויים, אולם כאן השתמשנו בעצב אחד בתמיסת מלח רגילה ושניים בתמיסת מלח מעכבת, בשל המגבלה של שדה רכישה אחד לכל עצב במהלך עיכוב. איור 4א מציג מעידה על זמן לדוגמה של עצב מעוכב גליקולית, המדגים ירידה ניכרת בתחבורה אל מחוץ לאזור הפעיל. ואכן, אנו מוצאים מדרונות דיסטליים ופרוקסימליים נמוכים משמעותית (איור 4B, p = 0.00000639 ו- 0.0121, בהתאמה, השוואה pairwise של Tukey בעקבות ANOVA) בעצבים שטופלו בתמיסת מלח מעכבת לעומת אלה עם תמיסת מלח רגילה. כמו כן, אנו מוצאים ירידה משמעותית במהירות האוכלוסייה בין שני תנאים אלה (איור 4C, p = 0.0232, t-מבחן עם שונות לא שוויונית, לאחר בדיקת F לשונות שווה עם p = 0.0190).
איור 1: תא ההתנוון. (א)דיאגרמה המציגה את הרכבת תא התזתות ואת האטם החיצוני, עם צינורות המחוברים למזרק תמיסת מלח ולבוקון פסולת. (ב)דיאגרמה המציגה את הרכבת התא עצמו. האטם הפנימי מונח שטוח על גבי מכסה #1.5. העצב מונח על הכיסוי בבאר שנוצרה על ידי הפתח המלבני של האטם הפנימי. מגלשת המיקרו-מים ממוקמת מעל העצב כדי לכריך את העצב בין #1.5 לשקופית המיקרו-מים. לבסוף, הכריך מתהפך לפני הרכבה על גבי האטם החלקי של ההרכבה המוצגת ב (A) ומאובטח עם טבעת נעילה (לא מוצג). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: הכנת עצב הטיבי. (A)תמונה המציגה את המיקום של עצב השוקה בתוך רגלו של עכבר, שבו superficialis gluteus, שרירי femoris, semitendinosus, popliteus, טיביאלי caudalis ו שרירי flexor digitorum longus הוסרו. ניתן לראות את עצב השיכר כאחד משלושה ענפים עיקריים של עצב הירך הנובע בברך. (ב)סכמטי של העצב ברוחב החדר המורכב, מראה את מטרת טבילה בשמן מתחת לסיכות. האיכות האופטית הטובה ביותר מתקבלת על ידי הפעלה והדמיה של שכבת האקסונים המפוזרים אל פני השטח של הכיסוי; איכות התמונה יורדת עמוק יותר לתוך העצב בשל פיזור אור. (ג)דוגמאות של אקסון בריא (למעלה), של אקסון לא בריא (למטה) מיד לאחר ההפעלה. הקו הצהוב המקומק מסמן את האזור המופעל. לפלואורסץ המופעל יש גבולות חדים באקסון הבריא ואילו באקסון הלא בריא הפלואורסץ המופעל מתפשט במהירות מהאזור הפעיל, וממלא את האקסון בתוך שניות. סרגל קנה מידה = 10 μm. (ד)דוגמאות למראה המיטוכונדריאלי באקסון בריא (למעלה) ואקסון לא בריא (למטה). המיטוכונדריה ניכרת בשל הפלואורסצנציה האוטומטית פלבין16. הם מופיעים ליניאריים (ראשי חץ מוצקים) באקסונים בריאים. באקסונים לא בריאים, המיטוכונדריה תחילה הופכת לדייקן (ראשי חץ פתוחים) ולאחר מכן להתעלף לאורך זמן, מתן אינדיקטור של בריאות האקסון. ראש החץ הפתוח המקושח באקסון הבריא מצביע על מיטוכונדריון שעובר מליניארי לדייקן. סרגל קנה מידה = 10 μm. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: ניסויי פעימה והתפשטות דופק. דוגמה לטרום הפעלה, לאחר הפעלה ותמונות של אקסונים מיאליים בעצב הטיבי של עכבר בן 8 שבועות ב- (A) ניסוי בריחת פולסים ו-(ב)ניסוי בהתפשטות הדופק. תמונת טרום ההפעלה היא החלונית העליונה, עם התמונות שלאחר ההפעלה שלהלן. חותמות הזמן מראות את הזמן שחלף לאחר ההפעלה. הקופסאות הצהובות מייצגות את האזור המופעל. הפעלות אלה בוצעו באמצעות 5 סריקות עם פיקסל 40 μs להתעכב זמן ו 5% כוח לייזר. קנה מידה של פסים = 10 μm. (ג)המדידה ROIs (צהוב) עבור שלושה אקסונים בניסוי בריחת דופק. (ד)ה-ROIs הפרוקסימלי (אדום), המרכזי (הצהוב) והדיסטלי (הירוק) לשלושה אקסונים בניסוי התפשטות דופק. ROIs מדידה עבור כל axon מוצגים באדום מלא (פרוקסימלי), צהוב מלא (חלון מרכזי) וירוק מלא (חלון דיסטלי). (ה)התוויית הפלואורסצנט הממוצע לעומת הזמן, הממוצע של 3 האקסונים בקו C. Dashed הוא פונקציה מעריכית המתאימה לנתונים, של הטופס Ft = Ae-τt, כמתוארקודם לכן 7. ו) חלקות של הפלואורסצנס במרכז, ROIs דיסטלי ופרוקסלי לעומת זמן, ממוצע של 14 אקסונים כולל שלושת האקסונים ב D. המדרון מחושב מקווי מגמה המתאימים ל-5 הדקות הראשונות של הנתונים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: ההשפעה של מעכבי חילוף החומרים על הובלת נוירופילמנט. (א)דוגמה של תמונות timelapse של עצב מטופל מראש עם 5.6% (w / v) 2-deoxy-גלוקוז ו 0.5 mM נתרן iodoacetate לעכב גליקוליזה ולרוקן ATP הסלולר. שים לב כי הגבולות הדיסטליים והפרוקסימליים של האזורים הפעילים נשארים חדים, מה שמצביע על עיכוב של תעבורת neurofilament. סרגל קנה מידה = 10 μm. (ב)כימות של המדרונות דיסטל (D) וproximal (P) איגוף חלונות (anterograde ונסיגה, בהתאמה), מבוטא כ אחוז של פלואורסצנטיות ראשונית בחלון המרכזי (%F0/min), מעצב אחד (14 אקסונים) באמצעות תמיסת מלח סטנדרטית משני עצבים (8 אקסונים) מטופלים מראש עם תמיסת מלח המכילה מעכבי גליקולית. (ג)מהדקים אוכלוסיית Neurofilament מחושב ממדרונות בחלונות האגף, מראה ירידה משמעותית במהירות בעקבות טיפול מעכב. - p < 0.005; ** - p < 0.01; * p < 0.05. הנתונים מראים ליקוי משמעותי של תחבורה neurofilament בנוכחות המעכבים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
וידאו משלים. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
יש לנקוט טיפול בניתוח של ניסויי פעימה-בריחה והתפשטות פולסים, כי יש פוטנציאל משמעותי להקדמה של שגיאה במהלך העיבוד שלאחר העיבוד, בעיקר במהלך תיקון שדה שטוח, יישור תמונה ותיקון אקונומיקה. תיקון שדה שטוח הכרחי כדי לתקן את אי אחידות התאורה, מה שופך לירידה בעוצמה על פני שדה הראייה ממרכז לפריפריה. היקף אי-אחידות תלוי אורך הגל ולכן, תמיד צריך להתבצע באורך הגל כי הוא לשמש לרכישת הנתונים הניסיוניים. חשוב לוודא כי אי אחידות בתדמית השדה השטוח מייצגת באמת את אי-אחידות בתמונות שיש לתקן. ניסויי התפשטות הדופק פגיעים במיוחד לטעויות מתיקון שדה שטוח לא תקין מכיוון שה-ROIs המדידה משתרעת לעבר הפריפריה של התמונה שבה עוצמת הנפילה היא הגדולה ביותר.
הגדרות ההפעלה האופטימליות של paGFP ישתנו בהתאם לשיטת ההפעלה ולפרמטרים של לייזר, ויש לקבוען באופן אמפירי לפני הפעלת ההדמיה הראשונה. הפעלה מועטה מדי תגרום ליחס נמוך של אות לרעש עבור הפלואורסצסצנציה המופעלת, בעוד שיותר מדי יגרום להלבנה של הפלואורסצנציה המופעלת, מכיוון שגם paGFP הלא מופעל וגם מופעל יכול להתרגש על ידי אור סגול. כדי להאיר באופן סלקטיבי אזור עניין בתמונה, אנו משתמשים בסורק גלבו לייזר של Andor FRAPPA, המייצר אזור מוגדר בבירור של פלואורסץ' עם גבולות חדים, כפי שמוצג בתוצאות המייצגות. יש לנו גם הצלחה באמצעות דיאפרגמה דיגיטלית פסיפס אנדור, שהוא מכשיר micromirror דיגיטלי, עם מנורת קשת כספית כמקור תאורה7. אפשרויות אחרות זמינות באופן מסחרי. אתגר בעת עבודה עם paGFP הוא העלייה המעוכבת בעוצמת הפלואורסצנס שמתרחשת בתוך דקה אחת לאחר שלב הפעולה הפותואקטיבית. עלייה זו מתרחשת מכיוון שתאורה עם אור סגול גורמת לכך ששיעור מולקולות paGFP המופעלות ייכנסו ל"מצב אפל" שממנו הן יכולות להירגע בחזרה במסלול זמן שלעשרות שניות ו-11. מניסיון שלנו, העלייה היא בדרך כלל פחות מ 5% עם ריזור שדה רחב אבל יכול לעלות על 20% עם לייזר excitation, אשר יכול להוביל לירידה משמעותית של הפלואורסציה מופעלת. אנו מסבירים זאת על-ידי רכישת תמונה שנייה של "לאחר ההפעלה" של הפלואורסצנציה paGFP דקה אחת לאחר הפעלה פוטואקטיבית, ולאחר מכן שימוש בתמונה זו כנקודות התייחסות עבור הזמן הבא. עם זאת, חשוב להכיר בכך שזה מציג מקור פוטנציאלי נוסף של טעות בקביעת הפלואורסץ הראשוני ואת קינטיקה ריקבון בזמנים מוקדמים.
יש לשלם תשומת לב נוספת ליישור ערימות התמונה. המקור העיקרי של אי-יישור הוא סחיפה או תנועה אחרת של הדגימה במהלך רכישת תמונה בזמן. ניתן למזער זאת באמצעות אטמים פנימיים בעובי המתאים ומאפשרים את ההכנה ל"התמקם" לפני ההדמיה. עם זאת, כל עיכוב כזה יקטין את הזמן הזמין לרכישת תמונה מאחר שלהכנה יש חלון מוגבל של קיימות. חשוב גם להימנע מאלגוריתמי יישור המעוותים את התמונה או מציגים משמרות תת-פיקסלים, מכיוון שהליכים אלה יתאמנו מחדש את עוצמת הפיקסל בתמונה. ניסויי התפשטות הדופק פגיעים במיוחד לשגיאות הנובעות מיישור לא תקין מכיוון שגבולות האזור של פלואורסציה מופעלת חדים יחסית, והפלואורסציה באזור זה גבוהה משמעותית מאזורי האיגף שאינם מופעלים. אפילו אי-יישור קל של מישורים התמונה בערימה יכול לגרום קפיצות גדולות בערכי הפלואורסצנטיות בחלונות המדידה הדיסטליים והקודמליים. לפיכך, חשוב שקבוצות התמונה יישרו קו כראוי וייבדקו בקפידה לפני שימשיך בניתוח.
תיקון עבור פוטו-בליחות הכרחי כדי להבטיח ששינויים בעוצמת הפלואורסצנטיות לאורך זמן ישקפו במדויק שינויים בכמות חלבון הפלורסנט. תיקונים כאלה יכולים להיות מקור משמעותי לטעויות בהערכת עוצמת הפלואורסציה המוחלטת בחלונות המרכזיים והמאגפים. כמו קינטיקה פוטו-בליכה תלויה בעוצמת התאורה והסביבה של פלואורופור, שיעורי פוטו-בליחות בפועל יכולים להשתנות בין הפעלות ומאקסון לאקסון. לכן, יש צורך למדוד אקסונים מרובים בממוצע את הנתונים המתווברים, אשר עצמו מציג שגיאה כלשהי. הגישה המתוארת לעיל היא לטפל בעצב עם מעכבי גליקוליטיק ולאחר מכן להפעיל את הפלואורסץ באזור של עניין ולעקוב אחר אובדן עוצמת פלואורסץ לאורך זמן. מעכבי גליקוליטיק לרוקן ATP ובכך לעכב את התחבורה neurofilament כך אובדן של פלואורסצנטי הוא בשל לחלוטין photobleaching ולא תנועה של neurofilaments מתוך האזור הפעיל. הקינטיקה הלבנה הממוצעת שנקבעה בדרך זו משמשת לאחר מכן לתיקון הנתונים הניסיוניים. מאז זה לא מעשי לבצע כיול הלבנת נפרד בכל מפגש הדמיה, כיול יחיד חייב להיות מוחל על הפעלות מרובות להפיץ על פני שבועות רבים. חיסרון של גישה זו הוא כי זה לא חשבון וריאציות בעוצמת כוח לייזר / תאורה מיום ליום, אשר לכן צריך להיות במעקב. גישה חלופית, שאנו מכנים "תיקון הלבנה פנימי", היא להעריך את ההתלוננת על ידי כימות הפלואורסצנטיות במרכז האזור הפעיל באותם סרטים המשמשים למדידות התחבורה. אם אזור מדידה זה נמצא במיקום מרכזי וקצר בהרבה מאורך האזור הפעיל, ולאחר מכן בזמנים קצרים כל נוירופילמנטים פלורסנטים שזוזו מאזור המדידה יוחלפו על ידי נוירופילמנטים פלורסנטים שנכנסים לתוכו. עם זאת, עם הזמן ההסתברות של נוירופילטורים שאינם פלורסנט נע לאזור המדידה מאיגוף אזורים שאינם פלורסנט של האקסון גדל, המוביל להערך יתר של אובדן פלואורסצנטי עקב הלבנה. יתרון של גישה זו הוא שהיא מתקנת את מאפייני ההלבנה באותו שדה, אך חיסרון הוא שיש לקבוע את משך חלון הזמן באופן אמפירי ויהיה תלוי בקצב התעבורה, כמו גם באורך האזור הפעיל. כל זאת לאחר נאמר, יש לציין כי ההערכה של הכיווניות של תחבורה neurofilament באמצעות השיטה שלנו היא חזקה שגיאות הלבנה (כפי שהוא עבור איגוף גודל החלון) כי זה ניתן על ידי היחס של המדרונות בחלונות האגף וכל תיקון הלבנת הוא מכפיל מוחל על שני מספרי ומכיוון בחישוב זה.
בשל הרעש הטבוע במערכת פלורסנט והפוטנציאל לשגיאה נוספת שנוספו במהלך השלבים שלאחר עיבוד התמונה המתוארים לעיל, חשוב להשתמש בגדלים מדגם גדול עבור עוצמה סטטיסטית מספקת. אמנם לא ניתן לקבוע במדויק את אמצעי האוכלוסייה, סטיות וגדלי אפקטים לפני הניסויים, אך מומלץ להשתמש בשיטת כהן21 בהנחה שגודל אפקט בינוני ואלפא של 0.05. התוצאה היא של כהן- שזה ההבדל בין האמצעים המחולקים על ידי סטיית התקן של שתי האוכלוסיות, של 0.5, מה שמצביע על רכישת לפחות 105 דגימות לקבוצה. לאחר שהסף הזה הושג, אפשר לבצע ניתוח צריכת חשמל לאחר הוק כדי להעריך מחדש את הכוח הסטטיסטי לאור מדדי האוכלוסייה בפועל. בתנאים ניסיוניים אופטימליים, זה צריך להיות אפשרי להשיג מ 1-7 אקסונים ניתנים לניתוח (מתוך 9-20 אקסונים בסך הכל) לכל הפעלה, ו 5-8 הפעלות לכל עצב בהנחה הרכישה של 10 דקות timelapse לכל הפעלה.
עכברים טרנסגניים המביעים חלבוני היתוך פלורסנט המיועדים למיטוכונדריה או של שלוק שימשו גם לחקר תובלה אקסונאלית של אורגנלים קרום בעצבים היקפיים ex vivo22,23,24,25. בנוסף, מעבדת Schiavo פיתחה גישות כדי למצוא את ההובלה האקסונלית של אורגנלים ממברנות נע ים לאחור באקסונים vivo באמצעות שברי רעלן טטנוס מתויגים פלורסנט, אשר ניתן להזריק לתוך השריר נלקחים על ידי מסופיעצב מנוע 26. עם זאת, מאז organelles ממברנות ניתן לפתור באקסונים אלה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצינטי, ניתן לנתח את המהירות והתדירות של התנועה שלהם ישירות באמצעות timelapse או ניתוח kymograph. שיטות הבריחה והדופק המתוארות כאן פותחו במטרה ספציפית לנתח את הקינטיקה של תעבורת נוירופילמנטים באקסונים אלה, שבהם לא ניתן לפתור תסתי עצב בודדים. זה דורש ניתוח ברמת האוכלוסייה על פני תקופה של דקות או עשרות דקות. אנו משתמשים בעכבר טרנסגני למטרה זו, אבל זה צריך להיות גם אפשרי לבטא את החלבון פוטוactivatable באמצעות שיטות כגון מתמר ויראלי או באלקטרואידציה הרחם. בעוד המוקד היה תחבורה neurofilament, שיטות הבריחה הדופק והתפשטות הדופק עשוי להיות מותאם גם כדי ללמוד את התנועה של חלבונים ציטוסקלקטיים אחרים וציטוסוליים שמועברים לאורך אקסונים ברכיבים איטיים של תחבורה אקסונלית. אנחנו מגבילים את הניתוחים שלנו לאקסונים מינויים כי גודלם ונדן המילין שלהם מאפשרים לנו לפתור אותם משכניהם. לא ניתן לפתור אקסונים לא מומינליים בשל הקליבר הקטן שלהם והנטייה להתקבץ בחבילות Remak. אנו מתארים את השימוש של עצבי טיביים ex vivo אבל השיטות צריך להיות ישים גם על עצבים היקפיים אחרים כי הם מספיק ארוך (>5 מ"מ) וbranched. באופן עקרוני, זה צריך להיות גם אפשרי להתאים שיטות אלה כדי להעביר neurofilament תמונה vivo (למשל, על ידי חשיפת עצב בניתוח בעכבר מרותם ולאחר מכן הנחת העכבר על שלב מיקרוסקופ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לסופרים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
המחברים רוצים להודות פאולה מונסמה על הדרכה וסיוע עם מיקרוסקופית confocal וניתוק עצב ים ד"ר Atsuko Uchida, קלואי דגר וסאנה Chahande לסיוע עם גידוך העכבר. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי קרן המדע הלאומית השיתופית Grants IOS1656784 ל-A.B. ו- IOS1656765 ל-P.J., והכונים הלאומיים של מענקי בריאות R01 NS038526, P30 NS104177 ו- S10 OD010383 ל-A.B. N.P.B. נתמכו על ידי מלגה מהתוכנית לחקר פוסט-טוטוריאלי של נשיא אוניברסיטת אוהיו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 x 22 Rectangle Gasket 0.1mm | Bioptechs | 1907-1422-100 | inner gasket |
| 2-deoxy-D-glucose | Sigma | D6134 | |
| 30mm Round Gasket w/ Holes | Bioptechs | 1907-08-750 | outer gasket |
| 35 x 10mm dish | Thermo Fisher | 153066 | dissection dishes |
| 40mm round coverslips | Bioptechs | 40-1313-0319 | |
| 60mL syringe - Luer-lock tip | BD | 309653 | |
| Andor Revolution WD spinning-disk confocal system | Andor | outfitted with Perfect Focus and FRAPPA systems | |
| Calcium chloride | Fisher | C79 | |
| Coverslips | Fisher | 12-541-B | for fluorescein slide |
| D-(+)-glucose solution | Sigma | G8769 | |
| Dissecting pins | Fine Science Tools | 26001-70 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | fine tipped forceps |
| Dissection microscope | Zeiss | 47 50 03 | |
| Dissection pan with wax | Ginsberg Scientific | 568859 | |
| Dissection scissors | Fine Science Tools | 14061-09 | initial dissection scissors |
| FCS2 perfusion chamber | Bioptechs | 060319-2-03 | |
| Fluorescein sodium | Fluka | 46960 | |
| Inline solution heater | Warner Instruments | SH27-B | |
| Laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | initial dissection forceps |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Microaqueduct slide | Bioptechs | 130119-5 | |
| Microscope slides | Fisher | 12-544-3 | for fluorescein slide |
| Microscope stage insert | Applied Scientific Instrumentation | I-3017 | |
| Objective heater system | Okolab | Oko Touch with objective collar | |
| Objective oil - type A | Nikon | discontinued | |
| Plan Apo VC 100x 1.40 NA objective | Nikon | MRD01901 | |
| Potassium chloride | Fisher | P217 | |
| Potassium phosphate | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium iodoacetate | Sigma-Aldrich | I2512 | |
| Syringe pump | Sage Instruments | Model 355 | |
| Tubing adapter - female | Small Parts Inc. | 1005109 | |
| Tubing adapter - male | Small Parts Inc. | 1005012 | |
| Tygon tubing | Bioptechs | 1/16" ID, 1/32" wall thickness | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | fine scissors |
References
- Hoffman, P. N., Lasek, R. J. The slow component of axonal transport. Identification of major structural polypeptides of the axon and their generality among mammalian neurons. Journal of Cell Biology. 66 (2), 351-366 (1975).
- Brown, A. Slow Axonal Transport. Reference Module in Biomedical Sciences. , (2014).
- Wang, L., Ho, C. -L., Sun, D., Liem, R. K. H., Brown, A. Rapid movement of axonal neurofilaments interrupted by prolonged pauses. Nature Cell Biology. 2 (3), 137-141 (2000).
- Uchida, A., Monsma, P. C., Fenn, J. D., Brown, A. Live-cell imaging of neurofilament transport in cultured neurons. Methods in Cell Biology. 131, 21-90 (2016).
- Trivedi, N., Jung, P., Brown, A. Neurofilaments switch between distinct mobile and stationary states during their transport along axons. Journal of Neuroscience. 27 (3), 507-516 (2007).
- Monsma, P. C., Li, Y., Fenn, J. D., Jung, P., Brown, A. Local regulation of neurofilament transport by myelinating cells. Journal of Neuroscience. 34 (8), 2979-2988 (2014).
- Walker, C. L., et al. Local Acceleration of Neurofilament Transport at Nodes of Ranvier. Journal of Neuroscience. 39 (4), 663-677 (2019).
- Li, Y., Brown, A., Jung, P. Deciphering the axonal transport kinetics of neurofilaments using the fluorescence photoactivation pulse-escape method. Physical Biology. 11 (2), 026001 (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Breuer, A. C., et al. Fast axonal transport in amyotrophic lateral sclerosis: an intra-axonal organelle traffic analysis. Neurology. 37 (5), 738-748 (1987).
- Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, photoactivation, photoconversion, and FLIP. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (12), (2010).
- Model, M. Intensity calibration and flat-field correction for fluorescence microscopes. Current Protocols in Cytometry. 68, (2014).
- Schmidt, M. M., Dringen, R. Differential effects of iodoacetamide and iodoacetate on glycolysis and glutathione metabolism of cultured astrocytes. Frontiers in Neuroenergetics. 1, 1-10 (2009).
- Surre, J., et al. Strong increase in the autofluorescence of cells signals struggle for survival. Scientific Reports. 8 (1), 12088 (2018).
- Cox, M., Lucey, S., Sridharan, S., Cohn, J. Least Squares Congealing for Unsupervised Alignment of Images. Proceedings of the IEEE Computer Society Conference on Computer Vision and Pattern Recognition. , (2008).
- Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. Two-photon fluorescence spectroscopy and microscopy of NAD(P)H and flavoprotein. Biophysical Journal. 82 (5), 2811-2825 (2002).
- Fenn, J. D., Johnson, C. M., Peng, J., Jung, P., Brown, A. Kymograph analysis with high temporal resolution reveals new features of neurofilament transport kinetics. Cytoskeleton. 75 (1), 22-41 (2018).
- Alami, N. H., Jung, P., Brown, A. Myosin Va increases the efficiency of neurofilament transport by decreasing the duration of long-term pauses. Journal of Neuroscience. 29 (20), 6625-6634 (2009).
- Xu, Z., Tung, V. W. Temporal and Spatial Variations in Slow Axonal Transport Velocity Along Peripheral Motoneuron Axons. Neuroscience. 102 (1), 193-200 (2001).
- Jung, P., Brown, A. Modeling the Slowing of Neurofilament Transport Along the Mouse Sciatic Nerve. Physical Biology. 6 (4), 046002 (2009).
- Cohen, J. The effect size index: d. Statistical Power Analysis for the Behavioral Sciences 2nd ed. , Lawrence Erlbaum Associates. 20-26 (1988).
- Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. Imaging axonal transport of mitochondria in vivo. Nature Methods. 4 (7), 559-561 (2007).
- Gilley, J., et al. Age-dependent axonal transport and locomotor changes and tau hypophosphorylation in a "P301L" tau knockin mouse. Neurobiology of Aging. 33 (3), 1-15 (2012).
- Marinkovic, P., et al. Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 109 (11), 4296-4301 (2012).
- Milde, S., Adalbert, R., Elaman, M. H., Coleman, M. P. Axonal transport declines with age in two distinct phases separated by a period of relative stability. Neurobiology of Aging. 36 (2), 971-981 (2015).
- Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons. Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).
