Summary
我们描述了荧光活化方法，用于分析来自转基因小鼠的周围神经单髓轴的轴感传输，这些轴感来自转基因小鼠，这些轴线来自表达可光激活神经丝蛋白的外周神经。
Abstract
神经丝蛋白聚合物以±0.35-3.5 mm/天的平均速度沿轴线传输的慢速成分的轴子移动。直到最近，这种原位运动的研究只能通过放射性同位素脉冲标记，它允许分析整个神经的电学传输与时间分辨率为天和毫米的空间分辨率。为了研究具有更高时空分辨率的神经丝体原位传输，我们开发了一种hThy1-paGFP-NFM转基因小鼠，它表示神经元中用光激活的GFP标记的神经丝质蛋白M。在这里，我们描述荧光活化脉冲逃逸和脉冲传播方法，以分析神经丝传输在单骨髓轴的三角神经从这些小鼠 前活体。通过用含氧盐水灌注和旋转圆盘共和荧光显微镜在显微镜阶段保持分离的神经段。紫光用于在短的斧头窗口中激活荧光。随着时间的推移，对激活区域和侧翼区域的荧光进行分析，从而分别研究神经丝传输与时间空间分辨率的分分钟和微米顺序。数学建模可用于从生成的数据中提取神经丝传输的动力学参数，包括速度、方向偏置和暂停行为。脉冲逃逸和脉冲传播方法也可以适应以可视化其他神经的神经丝传输。随着其他转基因小鼠的发展，这些方法还可用于成像和分析轴管和囊肿蛋白在轴子中的轴骼传输。
Introduction
神经丝的电弓传输在20世纪70年代首次通过放射性同位素脉冲标记1进行证明。这种方法已经产生了大量有关神经丝在体内传输 的信息，但它具有相对较低的空间和时间分辨率，通常以毫米和天的顺序，充其量2。此外，放射性同位素脉冲标记是一种间接方法，需要注射和牺牲多个动物来生成一个时间过程。随着荧光蛋白的发现和荧光显微镜在20世纪90年代的进步，它随后成为可能在培养神经元中直接成像神经丝传输的时间尺度为秒或分钟，并具有亚微米的空间分辨率，提供了对运动3机制的更深入的了解。这些研究表明，轴子中的神经细合聚合物在微管运动蛋白的推动下，在反风和逆行方向上快速、间歇性地移动。然而，神经丝是衍射受限的结构，直径只有10纳米，通常与邻居相距只有几十纳米;因此，聚合物只能在含有稀疏分布神经丝的培养神经元中进行跟踪，以便移动的聚合物可以从其邻居4中解析。因此，目前无法跟踪轴子中含有大量神经丝聚合物的单一神经丝，如骨髓轴。
为了利用荧光显微镜分析神经细细轴的轴向，我们采用荧光活化脉冲-逃逸法，研究培养神经细胞4、5,中神经丝的长期暂停行为。标有光激活荧光神经丝融合蛋白的神经丝在轴孔的一小段中激活，然后通过测量荧光衰变来量化这些丝从激活区域的离开速度。这种方法的优点是，它是神经丝传输的人口级分析，可以在几分钟或数小时的时间尺度上应用，而无需跟踪单个神经丝聚合物的运动。例如，我们用这种方法来分析骨髓培养物6中神经丝体传输的动力学。
最近，我们描述了一个hThy1-paGFP-NFM转基因小鼠的发展，它表示在人类神经元特异性Thy1启动子7的控制的神经元中，paGFP标记神经丝蛋白M（paGFP-NFM）的低水平。此小鼠允许使用荧光显微镜分析神经丝在原位传输。在这篇文章中，我们描述了用两种方法分析这些小鼠骨髓神经轴子神经纤维素的神经丝传输的实验方法。其中第一种方法是上述脉冲转义方法。此方法可以生成有关神经丝的暂停行为的信息，但对细丝离开激活区域的方向视而不见，因此不允许测量净方向性和传输速度8。第二种方法是一种新的脉冲传播方法，我们不仅分析来自激活区域的荧光损失，而且分析两个侧翼窗口中荧光的瞬态增加，荧光丝在离开激活区域时在逆行和逆行方向上移动。在这两种方法中，通过数学分析和测量窗口荧光变化的建模，可以获得神经丝传输参数，如平均速度、净方向性和暂停行为。 图 3说明了这两种方法。
该协议演示了神经的解剖和准备，paGFP荧光的激活和成像，以及使用 ImageJ9的FIFI分布包从获得的图像中对神经丝传输的定量。我们使用三元神经，因为它是长（几厘米），不分支;然而，原则上，任何神经表达paGFP-NFM是适合与这种技术，如果它可以解剖和脱套而不损害轴子。
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Protocol
此处描述的所有方法都已获得俄亥俄州立大学机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准。
1. 神经盐水溶液的准备
- 使100 mL的布劳尔的盐水10：98mM NaCl，1 mM KCl，2 mM KH2PO4，1mM MgSO 4，1.5 mM CaCl2，5.6%的D-葡萄糖，23.8 mM NaHCO3在双蒸馏水中。4
- 使用前至少30分钟通过盐水溶液泡95%氧气/5%二氧化碳（碳原）。剩余的盐水可以在一周内重复使用;但是，在每次使用之前必须重新氧化。
- 将含氧盐水倒入 60 mL 注射器中，并确保注射器中剩余的空气最少。
2. 神经灌注室的初始组装
- 如图所示，将注射器和管子 连接，将流出管放入废瓶中。
- 将外垫片放入灌注室壳体中，确保进气口和出口柱与垫片中的孔对齐。
- 将内垫片（硅胶，100 μm 厚）放在 #1.5 圆形盖玻片（直径 40 mm）上，小心地平滑垫片中的任何皱纹，以确保密封紧密。为了便于以后组装，请将盖玻片和垫片放在纸巾上，或将垫片朝上擦拭任务。
3. 小鼠三维神经的解剖和准备
- 通过吸入二氧化碳或其他机构认可的方法牺牲动物。当动物停止运动/呼吸时启动计时器，因为实验只能在牺牲的3小时内进行。
- 用70%乙醇喷洒毛皮，并尽可能多地从动物的腿上和背部使用电动剃须刀。
- 使用一双大型解剖剪刀，在靠近脊柱中间的皮肤上做一个背部切口，并继续在动物的腹边周围切割。从这个切口开始，慢慢地反射皮肤从腿轻轻地把它从肌肉和切割筋膜。
- 将动物放在解剖托盘上的超活位置，并固定所有四只爪子。可选固定尾部以进一步减少运动。
- 使用微切除剪刀，在大腿肌肉的尾巴和膝盖之间做一个切口，以暴露坐骨神经。确保通过肌肉可见的神经不会被切割。
- 将切口的骨和通风延长，以去除肌肉。同样，去除小腿的肌肉，保持切口浅和短，以避免损害神经。
- 去除肌肉，直到双骨神经完全暴露在从坐骨神经（膝盖）分支到脚跟的点（图2A）。
注意：在所有步骤中，包括和以下解剖的三口神经，避免不必要的暴露在环境光，以尽量减少可能附带激活paGFP在神经。 - 用一对钳子抓住脊柱近端的三头神经，用一把微切除剪刀切割神经。注意不要把紧张放在神经上，把它从肌肉上抬起来，切掉任何附件。
- 切开脊柱-端的三头神经，并转移到一个小的培养皿室温氧盐。从这一点在程序中，始终要保持神经的近端和远端的跟踪。
注：这样做的一个方法就是用倾斜的切口标记神经的端端，使锥度可见。 - 从神经的近端开始，轻轻抓住暴露的轴孔末端，用一对非常细尖的钳子。
- 用第二对钳子，抓住神经护套，慢慢拉向神经的端端。神经护套会以最小的阻力沿着轴角滑动。确保在这个过程中不会对神经施加过度的紧张。
4. 最终神经灌注室组件
- 抓住神经的近端，将其从盐水中去除，然后慢慢放下内垫片矩形开口内灌注室的盖玻片，在放下神经时保持柔和的张力，使神经直躺。
- 将微槽滑过神经，凹槽侧朝向神经，且流向与神经平行。翻转盖玻片和微灌管组件，并将其放在灌注室外壳中，将微灌管滑轨与外垫片上安装。神经和周围的内垫片现在将夹在盖玻片和微桥滑之间，由垫片隔开，盖玻片朝上（图1B）。
- 将灌注室放在金属壳体中并旋转锁环，从而固定灌注室。确保塑料外壳完全位于所有金属夹下，并拧紧，以防止盐水泄漏。过紧可能会破裂微槽滑轨或盖玻片。翻转室，使盖玻片朝下。
- 缓慢按下盐水注射器柱塞以填充灌注室。在设置和成像过程中，请随时将进气管、出口瓶和注射器放在腔室上方。这样可以避免虹吸，因为室内有负压，可能会引入气泡或导致焦点不稳定。
- 将灌注组件转移到倒置显微镜阶段，将盐水注射器安装到注射器泵中。以适当的速度启动电机，流量为 0.25 mL/min。然后连接并打开设置为 37°C 的在线解决方案加热器。
- 连接目标加热器并设置为 37°C，将机油涂抹到目标上，并将灌注室插入舞台安装。
- 将机油涂抹到腔室加热器垫上，并连接到灌注室。连接并打开腔室加热器;设置为 37 °C。
注：温度变化可能导致灌注室中由于溶液的脱气而形成气泡。如果气泡形成，将溶液流速短暂地提高 5-10 倍，直到气泡清除腔室。 - 将灌注室锁定到舞台适配器中，并将目标机油与腔室底面的盖玻片接触。
注：此处使用的带 ASI 级适配器的 Bioptech 室专为倒置显微镜配置而设计。
5. 荧光激活和图像采集
- 使用亮场照明，聚焦在最接近盖玻片表面的神经底部表面的轴子层（图 2B）。骨髓轴（在成年小鼠中直径为1-6μm）可以通过骨髓护套的存在来识别，在明亮的场透光照明下，这种护套是可见的，没有对比度增强。施密特-兰特曼的裂痕和兰维尔的节点也很容易明显。未髓轴孔更细长（通常为 <1 μm 直径），通常以捆绑方式存在（Remak 捆绑包），通常它们过于紧密，无法相互解析。
- 如果在显微镜上可用，请激活自动对焦系统，在延时成像过程中保持对焦。
- 获取亮场参考图像。记录神经（脊柱近端和端端）与图像的方向。
- 使用 488 nm 激光和适用于 paGFP（例如 525/50 nm）的发射滤波器获取共和图像，以记录漂白前自动荧光。保持激光功率低，以尽量减少光漂白，并相应地调整曝光时间以检测微弱信号。例如，以 5% 的激光功率和 4 s 的曝光获得代表性数据。记录采集设置，供将来所有实验使用。
注：光激活后，理想的成像设置将产生信号噪声比> 8，在 20 张图像中光漂白小于原始信号的 25%。轴子也可以像我们最初7时那样用宽场荧光显微镜成像，但是由于缺乏共和性，图像质量会低劣。 - 将激光功率设置为大约 5 倍的正常成像功率，并获取曝光时间为 3-4 分钟的图像。虽然不重要，但建议此步骤漂白自荧光和其他不需要的荧光源，以减少背景信号，从而最大限度地提高光激活荧光的信号对噪声。
- 使用步骤 5.4 中使用的设置获取图像，以记录此漂白步骤后激活前自动荧光。
- 在亮场图像上，绘制一条与轴子平行的线，其长度等于所需的激活窗口大小。此窗口的长度将因实验目标和参数而异，但脉冲转义范式的典型长度为 5 μm，脉冲传播范式为 40 μm。
- 使用此线作为参考，在垂直于轴的视场上绘制一个矩形感兴趣区域 （ROI）。该区域必须包含要照片激活的所有轴。
- 确定使用 405 nm 照明进行照片激活的最佳设置。
注意：仅在首次实验激活之前执行此步骤和子步骤。在实验过程中，必须使用相同的照片激活设置。- 使用 405 nm 激光线、低激光功率（例如 5%）和像素停留时间（例如 40 μs）和一个脉冲反复激活感兴趣的区域，在每次激活后获取激活的 GFP 荧光图像。重复，直到荧光不再增加，然后量化每个图像感兴趣的区域中的荧光。
- 绘制平均荧光强度与脉冲数。选择荧光不再增加的脉冲数，作为用于激活的最佳脉冲数。
- 通过 405 nm 光的图案激发，激活步骤 5.8 中绘制的 paGFP 荧光区域。确保在激活之前和激活后获取映像。
注：理想的 paGFP 激活将产生一个明确定义的荧光区域，其中包含 ROI 中的清晰边界。 - 激活完成后启动 1 分钟计时器。在 1 分钟结束时，开始获取延时系列。
注：1分钟的延迟是必要的，以允许荧光的增加后观察到的paGFP11光激活。对于脉冲传播方法，5-10 分钟的采集周期（30 秒延时间隔）足以测量中央和侧翼窗口中的初始坡度，以测量速度和方向性。对于脉冲转义方法，采集周期为 30-150 分钟，延时间隔为 5 或 10 分钟，可以分析细丝的长期暂停行为 - 保存获得的所有图像，以及用于荧光激活的 ROI。
- 移动到神经的新区域，并重复步骤 5.1-5.11。如果新区域沿同轴孔，它必须至少从先前激活的区域 500 μm，以避免检测到移出其他激活区域的荧光神经丝。最终延时的获取必须在 3 小时窗口结束之前完成。
注：准备可能可行超过3小时，但我们尚未确认。通过熟练的解剖和准备，在这 3 小时的窗口中可以获取 5 到 8 个 10 分钟的延时图像集。 - 获得最终延时图像系列后，停止盐水的流动，断开溶液和腔室加热器，将灌注装置从显微镜阶段取出。
6. 平地和暗场图像采集
- 在0.5 mL的双蒸馏水中加入250毫克氟素粉，使荧光素溶液得到溶液。混合，直到没有可见的颗粒，并在桌面离心机中旋转溶液30秒，沉淀任何未溶解的材料。如果防止光线照射，此解决方案可以在 4 °C 下储存数月。
- 在幻灯片中加入 8 μL 荧光素溶液，然后应用#1.5 盖玻片。多余液体，用指甲油密封，并允许干燥。
注：在这个高浓度下，荧光素染料的强烈吸收会熄灭溶液中的发光束，在盖玻片表面产生一个细薄的荧光平面，由于快速扩散交换12，这种荧光剂既均匀又耐光漂白。 - 将荧光素滑动盖玻片侧向下放在倒置显微镜阶段，并调整对罩滑动表面荧光薄平面的焦点。在幻灯片周围移动，查找不包含气泡（黑点）或大荧光素颗粒（亮点）的视场。
- 以 0.2 μm 间隔获取跨越 6 μm 的 z 堆栈，使中间图像成为原始对焦平面。使用较短的曝光时间（例如 40 ms），因为荧光会非常明亮。这种 z 堆栈采集对于捕获整个视野的最大荧光是必要的，因为盖玻片很少是完全水平的，荧光的平面非常窄。对总共 25 个视场重复此步骤，在字段之间的任何方向上移动舞台至少 20 μm。
- 关闭所有光路快门（包括相机快门），并设置激光功率和曝光时间为零。使用这些设置获取 100 个图像的堆栈。这些图像将平均生成暗场图像，该图像将用于校正暗电流和相机芯片上的偏置偏移。
注意：流式处理采集是捕获这些图像的理想方式。
7. 成像糖基抑制神经漂白剂校正
- 制作和氧氧盐水溶液，如步骤1;然而，用2-脱氧-D-葡萄糖代替D-葡萄糖，加入0.5 mM碘多乙酸钠抑制糖解13。我们称之为"抑制盐水"。
- 使用抑制性盐水重复步骤 2-5，步骤 5.11 中设置了 10-30 分钟的延时图像。在成像前，在应用抑制性盐水后40-50分钟，以确保完全抑制神经纤维运输。
注：糖解抑制最终会杀死轴子，所以有一个狭窄的时间窗口后，抑制，其中获取数据，通常约30分钟。代谢抑制水平的指标是极线粒体的火焰自荧光，由于我们用长时间曝光来成像paGFP荧光14，可以在延时序列中检测到这种荧光。通常，线粒体自荧光在治疗期间会增加，使用抑制性盐水。如果线粒体开始四舍五入或碎片，则停止成像。
8. 使用 ImageJ 进行图像处理和分析
- 平场和暗场校正
- 打开暗场图像堆栈，通过单击"图像"来平均 图像 |堆栈 |Z 项目和 下 拉菜单 中选择"平均强度"以生成 暗场 图像。
- 打开荧光平地图像堆栈，通过单击"图像"创建每个（共 25 个）的最大强度投影 |堆栈 |Z 项目和 在 下拉菜单 中选择最大强度。
- 单击"图像" 将结果的 25 个最大投影图像合并到一个 堆栈中 |堆栈 |要堆叠的图像。单击"图像"创建此堆栈的平均强度 投影 |堆栈 |Z 项目和 从 下拉菜单 中选择平均强度以生成 平地图像。
- 单击"过程" 从平地图像中减去暗场 图像 |图像计算器，选择 "减 法"作为操作。确保选中 32 位（浮动） 结果选项。结果是校正的 平地图像。
- 通过首先单击"分析 |" 来测量校正平地图像 的平均像素强度设置" 测量"并 选中"均值 灰色"框，然后按"m"键。
- 通过单击"过程"将校正的平地图像除以其 平均强度 |数学 |分割 并输入步骤 7.1.5 中获得的平均灰色值。这将生成 反向增益 图像。
- 打开激活前和激活后映像以及延时图像堆栈。单击"图像"将图像合并到单个堆栈 中 |堆栈 |工具 |串联 ，然后按时间顺序从下拉菜单中选择图像。确保未选择 "打开为 4D 图像 "选项。生成的堆栈是 完整的图像集。
- 在完整图像集上重复步骤 8.1.4， 然后通过单击"处理" 将 结果除 以反向 增益图像 |图像计算器 并选择 "分割 "作为操作。这将生成 校正的完整图像集，其中每个图像都已校正为照明领域和探测器上的不均匀性。
- 图像堆栈对齐
- 要更正由于阶段或样本漂移而导致的延时系列中图像平面的不对齐，请 通过单击插件 安装固定区域插件 （补充文件 1） 对齐 |安装插件，导航到包含插件文件的文件夹，并选择插件。安装插件后重新启动 ImageJ。
注：此插件根据"最少平方凝结"原则15对齐图像。 - 在校正的完整 图像集上绘制 ROI，该图像集跨越多个轴子，不会超出每个轴子内激活荧光的近距和距离边界。区域的几何体并不重要，但排除结构更改形状或大小的区域将改善对齐方式。
- 通过单击插件运行 对齐插件 |按固定区域对齐。该插件对帧之间的位移设置默认的 2 像素最大值，但如果样本有显著漂移，则可能在初始弹出窗口中调整。根据图像堆栈的大小，对齐可能需要几分钟时间。
- 目视检查对齐的堆栈，以评估对齐质量。然后，某些帧可能需要手动对齐，因为自动对齐对于帧之间的荧光动可能不起作用。这可以通过单击"图像" | 查看必须移动的 帧来完成。变换 |翻译。单击 下面的 弹出窗口"否"，询问是否应转换整个堆栈。在转换中仅使用整数像素值，并确保下拉插值菜单设置为 "无"，因为小数像素移位或插值将因像素强度的重新采样而更改数据。
- 将其保存为对齐的完整图像集。
- 要更正由于阶段或样本漂移而导致的延时系列中图像平面的不对齐，请 通过单击插件 安装固定区域插件 （补充文件 1） 对齐 |安装插件，导航到包含插件文件的文件夹，并选择插件。安装插件后重新启动 ImageJ。
- 荧光强度的测量
- 使用对齐完整图像集的第一帧上的"角度 "工具 绘制 ROI，第一个臂沿激活区域的一条边缘垂直于轴，第二臂垂直。按"m"键测量角度，该角度描述视场中轴角的方向。
- 设置图像比例，以便通过单击"分析 | " 以微米为单位测量尺寸设置"缩放"并输入相应的值。
- 单击"分析 " 打开 ROI 管理器 |工具 |投资回报率管理器。对于脉冲转义范式，请跳到步骤 8.3.7。对于脉冲传播，继续执行步骤 8.3.4。
- 绘制任何维度的方形 ROI，然后单击"编辑| "选择 |指定。确保选中"缩放单位"选项，然后将 ROI 设置为 15μm 的宽度和等于或大于图像高度的高度。
- 单击"编辑 | "按步骤 8.3.1 中测量的角度旋转 ROI选择 |旋转 使其垂直于轴角，并沿激活区域的近边将 ROI 与一侧放置。通过按"t"键将此 ROI 添加到经理，我们将将其称为近位指南 ROI。
- 拖动 ROI 以与激活区域的致名边缘对齐，然后按"t"键再次添加到 ROI 管理器中。我们将将其称为"希望收益"指导投资回报率。稍后将使用近位和近距离参考线 PI 绘制齿面测量 PI。
- 使用上面步骤 5.11 中获取的延时图像序列选择轴子进行量化。此图像序列有助于此目的，因为它捕获轴子的弱自荧光，揭示其在激活区域外的形态。
注：不符合以下条件的轴孔将从分析中排除：- 轴孔必须沿所有测量窗口的整个长度进行聚焦。
- 轴孔必须位于垂直于激活区域近端和端端的 5° 范围内。
- 轴孔必须在激活区域的近端和近端 5μm 内没有内华。
- 排除在成像过程中形状明显变化的轴子。
- 排除在激活后图像中不存在离散激活区域（图2C，底部）中看起来不健康的轴子，因为这表明激活荧光的扩散分散，当轴孔死亡时，就会发生这种散射。
- 观察步骤 5.5 中的长曝光漂白图像，以观察轴子内的自发光结构。这种荧光是由于线粒体16中的飞光。如果这些线粒体呈圆形或碎片化（图2D，底部），而不是扩展的线性结构（图2D，顶部），则从分析中排除轴子，因为这是代谢下降的迹象。
- 使用上面创建的近角和距离指南 ROIS，绘制三个测量 ROIS 每个轴被分析：一个中央窗口，包括 40 μm 激活区域内的轴孔，和两个宽度受侧翼窗口 15 μm ROIS 约束的侧翼窗口和高度受激活区域边界处轴孔直径约束的高度。将所有三个区域添加到 ROI 管理器。对于糖基抑制轴子，在激活区域中间绘制一个不超过 5 μm 宽且不延伸到轴孔外的单个区域。对于脉冲转义范式，激活区域只有 5 μm 宽，因此必须使用整个窗口。
- 对于符合步骤 8.3.7 和 8.3.8 标准的所有轴子重复步骤 8.3.9。
- 单击"分析" 将活动测量设置为平均 像素强度 |设置"测量 "并选择 "均值灰色值" 选项。确保未检查其他测量选项。
- 通过选择窗口并按"Ctrl"="a"，选择 ROI 管理器窗口中的所有 ROI。在 ROI 管理器窗口中，单击" 更多" |测量 荧光强度的多度量。将数据从结果窗口复制到电子表格中，以进行进一步分析。
- 单击"分析 |" 将活动测量设置为 区域 |设置"测量 "并选择 "区域" 选项。确保未检查其他测量选项。
- 重复步骤 8.3.12。只需复制区域的一行结果，因为区域不会随时间而变化。
9. 光漂白校正
- 在糖分抑制轴子的数据电子表格中，从给定 ROI 帧 3（第一个延时帧）开始的每个帧的均荧光中减去帧 1（预激活帧）的均荧光。结果是背景 减法的用法。
- 将数据绘制为散点图，帧编号为 absissa。使用 Ae-bx 形式的方程，将指数趋势线与每个 ROI 中的数据（大多数电子表格程序都有 此函数）拟合一个指数趋势线。此方程等效于光漂白函数 Ft = F0 * e-tɣ 其中 F0 是延时第一帧的荧光，ɣ 是指数漂白速率，t 是时间，e 是自然对数基。
- 对于糖酸抑制神经的所有轴子的所有 ROS 重复步骤 9.1.1-9.1.2。要最准确地估计光漂白速率，请从至少 5 个独立神经中总共使用至少 15 个轴子。使用所有抑制轴的指数漂白率（ɣ）的平均值来校正光漂白的实验数据。必须对每个实验或研究进行新的漂白校准，因为光漂白取决于图像采集设置和激光功率，这些功率可能会随着时间而变化。
- 对于用普通盐水成像的所有轴子区域重复步骤 9.1.1（即非糖基抑制）。
- 将每个数据点除以tɣ-tɣ，使用 t 的时间和步骤 9.1.3 中ɣ的平均数据点。这些是光漂白校正的指点。
- 将每个数据点乘以该感兴趣区域的区域 ，以查找 该区域每次的总荧光。
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Representative Results
图3显示了脉冲逃逸和脉冲传播实验中的代表性图像。我们发表了几项研究，描述使用脉冲转义法获得的数据，以及分析这些数据的方法,5、6、7、8、17。6,7,8,17下面，我们将展示脉冲传播数据如何产生神经丝传输的方向性和速度信息，而我们以前没有报告过这些信息。
轴孔中的神经丝传输是间歇性和双向的。这种传输可以通过在逆行和逆行方向的任何给定时间移动的细丝的分数，以及它们在逆向和逆行方向中的速度（由 和 
表示 
）。如果我们以轴的单位长度的神经丝聚合物总量为 
，则通过给定区域的逆向和逆行方向中的通量由
和
,
分别由 
,
凡 
有单位+m-1， 
有单位和 
有单位 
。由于轴沿给定位置的通量是神经丝聚合物的数量，在时间单位中移过该位置，因此它与通过 的平均 
速度有关 
。因此，我们可以写
.
在脉冲传播实验中，可根据荧光神经丝从激活区域的离开速率确定通量，我们称之为中心窗口。荧光神经丝聚合物从这个中心窗口每秒钟的总损失是荧光神经丝聚合物在逆向和逆行方向留下的损失的总和 
， 即.
与中央窗口中荧光神经丝聚合物的初始含量规范化，即 
，中心窗口的长度在哪里，则此损耗率变为
其中是中心窗口中荧光减少的斜率，该斜率最初为 8 给出的 
时间段的线性。对于 40 μm 的中央窗口，这相当于几十秒。但是，对于如此大的窗口，向指数衰减相的过渡是渐进的，斜率实际上是线性的几分钟或更多的8。
在早期，侧翼窗口捕获从中央窗口退出的所有神经丝，因为这些灯丝没有足够的时间通过侧翼窗口，并在另一侧退出它们。在这种情况下，荧光神经丝聚合物的数量，离开中央窗口逆行和逆行秒，即通量和 ，是由神经丝的含量增加 
和侧翼窗口。与中央窗口中荧光神经丝聚合物的初始含量正常化，侧翼窗口的增压率变为
其中 
和 分别是近侧窗和近侧翼窗口荧光增加的斜率。
因此，我们可以用侧翼窗口的斜面来表示平均速度，即
（1.
以及逆向和逆行运动神经丝的数量与这些斜坡的比例的比率，即
（2. 2）
其中 
和表示神经丝从逆向向逆行移动的速率，反之亦然8。和 
的值 
可以通过测量培养神经元中单个神经丝的运动来确定，如前面17号报告。重要的是，Eq.1 中速度的表达式仅在激活后短时间适用，在此期间荧光神经丝进入侧翼窗口，但不允许离开。这个短时间窗口的持续时间将取决于侧翼窗口的长度和神经丝动的动力学。侧翼窗口越长，原则上时间窗口越长。从理论上讲，可以通过确认符合这一标准来检验这一标准。
（Eq. 3）
与 Eq.1 中速度的表达式（由侧翼窗口中的斜率表示）不同，Eq.2 中方向性表达式与齿面窗口大小相比是健壮的，因为它是由侧翼窗口中的斜率给出的。
图3 显示了从我们一只8周大雄性小鼠在C57Bl/6J背景线上的8周雄性小鼠的骨髓神经中，脉冲逃逸和脉冲传播实验的代表性结果，分别使用5和40μm的窗口尺寸。至少2周年龄的小鼠，包括男性和女性，已被用于这些实验范式。适当的年龄和性别应该由研究人员根据研究中测试的。随着时间的推移，可以看到，由于逆向和逆行方向的神经丝离开，激活区域的边缘模糊，导致从中央窗口失去荧光。
对于脉冲逃逸方法（图3A、C、E），激活区域的荧光衰减动力学可以产生关于长期和短期暂停行为8，18,的信息。对于这些实验，激活区域可能很短（我们通常使用 5 μm;参见图3A 中的黄色框）。对于脉冲传播方法（图3B、D、F），我们使用更长的激活区域（此处为 40 μm;参见图3B 中的黄色框），以便提供更大的荧光神经丝池。这延长了侧翼区域荧光增加保持线性的时间（见上文）。侧翼窗口中荧光增加的线性域也可以通过增加这些窗口的长度来增加，但是这受到视场大小的限制。对于图 3D 中显示的数据，我们使用 15 μm 侧翼窗口（以红色和绿色显示）。
图 3E，3F分别显示了图3 C、3D所示测量窗口的总荧光强度（即像素强度之和）的定量。对于脉冲逃逸方法，衰变是双相的，初始指数衰减表示轨道神经丝的偏离。这大约在10-20分钟过渡到第二缓慢的指数衰减，代表运和离开的偏离轨道灯丝8。为了与脉冲传播方法进行比较，我们在图3E中只显示12分钟的时间过程，但分析的时间过程通常需要更长（通常为30-120分钟），才能捕获长期暂停动力学5、6、18。,6,18对于脉冲扩散策略，运动的速度和方向的计算仅取决于侧翼窗口中的坡度。对于此处使用的窗口长度，线性相位将延长约 5 分钟。此线性时间窗口的持续时间应通过逐步缩短用于测量斜率的时间并确定坡度不再增加的点来评估。如果摄像机视场允许，可以通过增加窗口长度来增加此持续时间，尽管给定实验中所有轴的窗口长度应保持不变。例如，我们使用前 5 分钟的数据来测量图3F中脉冲传播数据的斜率。这将导致斜坡 72 A.U./min，-594 A.U./min 和 111 A.U./min 的近位窗口，中央和近元窗口（A.U. = 任意单位）。为了使这些值正常化，它们除以中央窗口的初始荧光，导致速率为 0.108 %F0/min、-0.962 %F0/min 和 0.173 %F0/min。由于 EMCCD 摄像机的视野（82 μm x 82 μm），因此存在技术限制。具有 sCMOS 芯片的摄像机可以具有更大的视野，可以允许使用更大的侧翼窗口尺寸。然而，我们不能排除中心斜坡和侧翼斜坡之间的这种差异可能也是由于低估了光漂白的程度（见讨论），这将产生低估侧翼窗口的正斜率和高估中央窗口负斜率的效果。
从侧翼窗口 （%F0/min） 和 Eq.2 以上的速率，并使用 
和 17的值，我们计算比率 
= 2.12。这表明68%的灯丝在逆行，32%的逆行。使用上述相同速率和 Eq.1，我们计算平均净人口速度 
= 40*（0.00173-0.00108） = 0.026 μm/min，或 0.037 mm/天。对年龄相近小鼠的放射性同位素脉冲标记研究报告说，在坐骨神经最近的部分，神经丝体种群速度约为0.6毫米/天，在2厘米19、20的距离内减缓至0.12毫米19/天。我们的脉搏传播数据是在气管神经中收集的，大约是与这些措施的另外2-3厘米。出于上述原因，我们认为，0.037 mm/天的估计低估了真实速度。然而，将放射性同位素脉冲标记观察到的空间减速推断到三叶神经中，这个估计并非不合理，尤其是当我们认为它是在非常不同的空间和时间尺度上使用非常不同的方法确定的。
为了证明脉冲传播方法检测种群之间显著差异的能力，我们比较了从充满正常和抑制剂盐系的神经中测量的近向和远侧翼窗斜率。抑制糖解阻断神经丝的运动,，正如我们之前报告5，6，7。5,67稍后我们将讨论实验样本大小的选择，但在这里，我们使用了一个神经在正常盐水和两个在抑制盐水，由于限制期间每个神经一个采集场的限制。图 4A显示了来自糖基抑制神经的延时示例，表明从激活区域传输的传输明显减少。事实上，我们发现在用抑制盐水治疗的神经中，与使用普通盐水治疗的神经中，图基在抗性盐水治疗的对比中明显降低（图4B，p= 0.0000639和0.0121，Tukey在抗星法后进行对比）。我们还发现这两个条件之间的总体速度显著下降（图4C，p= 0.0232，t-测试具有不相等的方差，F 测试后，与 p = 0.0190 相等方差）。
图1：灌注室。（A） 显示灌注室外壳和外垫片的组装图，油管连接到盐水注射器和废瓶。（B） 显示腔室本身的装配图。内垫片平放在#1.5 盖玻片的顶部。神经被放置在内垫片矩形开口创建的井的盖玻片上。微电槽滑梯放在神经上，将神经夹在#1.5盖玻片和微电槽滑梯之间。最后，在安装在 （A） 所示的组件外垫片顶部之前，三明治会翻转，然后用锁定环固定（未显示）。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：气管准备。（A） 显示小鼠腿部的胸神经位置的图像，其中谷胱甘肽表面肌、二头肌、半丁肌、罂粟、头骨和屈肌肌肉已被切除。骨神经可以被看做是膝盖上产生坐骨神经的三大分支之一。（B） 装配室横截面神经的示意图，显示盖玻片下方的油浸目标。通过激活和成像与盖玻片表面接触的轴子层，获得最佳光学质量;由于光线散射，图像质量会更深入于神经。（C） 激活后立即显示健康轴孔（顶部）和不健康的轴孔（底部）的示例。虚线黄线标记激活区域。激活荧光在健康的轴孔中具有尖锐的边界，而在不健康的轴孔中，激活的荧光迅速从激活区域扩散出来，在几秒钟内填充轴孔。比例线 = 10 μm。（D） 健康轴突（上）和不健康轴突（底部）中线粒体外观的例子。线粒体是可见的，由于火焰自荧光16。它们在健康的轴孔中显示为线性（实心箭头）。在不健康的轴子中，线粒体首先变得具有双面体（打开箭头），然后随着时间的推移而变淡，从而提供轴孔健康状况的指标。健康轴突中虚线打开箭头指向线粒体从线性到双子体的过渡。比例线 = 10 μm。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：脉冲逃逸和脉冲传播实验。在脉冲逃逸实验和（B）脉冲传播实验中，8周大小鼠的三角神经中骨髓轴的激活前、激活后和延时图像示例A。激活前图像是顶部面板，下图是激活后图像。 时间戳显示激活后经过的时间。黄色框表示激活区域。这些激活使用 5 次扫描执行，像素停留时间和 5% 的激光功率。比例线 = 10 μm。（C） 脉冲逃逸实验中三个轴子的测量ROIS（黄色）。（D） 脉冲传播实验中三个轴子的近位（红色）、中心（黄色）和近角（绿色）测量ROIS。每个轴的测量 PI 以实心红色（近边）、纯黄色（中央窗口）和纯绿色（近边窗口）显示。（E） 平均荧光与时间之间的图，C. Dashed线中 3 个轴子的平均值是适合数据的指数函数，如前面所述的Ft =Ae-μt。F） 中心、近方和近近路 PI 中荧光的图与时间，平均 14 个轴子，包括 D 中的三个轴子。坡度根据趋势线拟合到数据前 5 分钟计算。请单击此处查看此图的较大版本。
图4：代谢抑制剂对神经丝体传输的影响。（A） 神经的延时图像示例，用 5.6% （w/v） 2-脱氧葡萄糖和 0.5 mM 碘乙酸钠进行预处理，以抑制糖解并消耗细胞 ATP。请注意，激活区域的致特边界和近边界仍然尖锐，表明抑制神经丝力传输。比例线 = 10 μm。 （B） 远端 （D） 和近端 （P） 侧翼窗口（分别逆行和逆行）中的斜率的定量，表示为中央窗口 （%F0/min） 中初始荧光的百分比，从一个神经（14 轴子）使用标准盐水和两个神经（8 轴子）预处理含有甘油抑制剂的盐水。（C） 从侧翼窗的斜坡计算的神经丝量密度，显示抑制剂治疗后速度显著下降。- p < 0.005;** - p < 0.01;* - p < 0.05。数据显示，在抑制剂存在的情况下，神经丝传输存在显著损伤。 请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
在分析脉冲逃逸和脉冲传播实验时必须小心，因为在后处理过程中，主要是在平场校正、图像对齐和漂白校正期间，存在引入误差的巨大潜力。平场校正对于校正照明中的不均匀性是必要的，这会导致从中心到外围的视野强度下降。非均匀性的程度取决于波长，因此，应始终以用于获取实验数据的波长执行。必须确保平场图像中的不均匀性真正代表要校正的图像中的不均匀性。脉冲传播实验特别容易受到不当平场校正造成的误差，因为测量 ROIS 延伸到强度下降最大的图像的外围。
最佳 paGFP 激活设置将因激活方法和激光参数而异，并且必须在第一次成像会话之前以经验方式确定。激活过小会导致激活荧光的信号噪声比低，而激活荧光的漂白率过低，因为非激活和激活的 paGFP 都可以被紫光点燃。为了有选择地照亮图像中感兴趣的区域，我们使用安多FRAPPA激光高光扫描仪，该扫描仪可生成具有尖锐边界的清晰定义的荧光区域，如"代表结果"所示。我们还成功地使用安多马赛克数字隔膜，这是一个数字微镜设备，与汞弧灯作为照明源7。其他选项也可用于商业。使用 paGFP 时面临的一个挑战是荧光强度的延迟增加，该延迟增加发生在照片激活步骤后 1 分钟内。这种增加是因为紫光的照明导致一定比例的激活paGFP分子进入"黑暗状态"，从中它们可以放松回到几十秒11的时间过程。根据我们的经验，宽场激发的增加率通常小于5%，但激光激发时增加率通常超过20%，这可能导致对激活荧光的显著低估。我们通过获取 paGFP 荧光的第二个"激活后"图像（照片激活 1 分钟后，然后使用此图像作为后续延时参考点）来对此进行说明。然而，重要的是要认识到，这确实引入了另一个潜在的错误来源，在确定初始荧光和衰减动力学在早期的时间。
必须特别注意图像堆栈的对齐。错位的主要来源是延时图像采集过程中试样漂移或其他运动。通过使用适当厚度的内部垫片并允许在成像前"沉淀"，可以最大限度地减少这种情况。但是，任何此类延迟都会减少可用于图像采集的时间，因为准备工作的生存能力窗口有限。避免扭曲图像或引入子像素移位的对齐算法也很重要，因为这些过程将重新采样图像中的像素强度。脉冲传播实验特别容易受到因校准不当而引起的错误的影响，因为激活荧光区域的边界相对尖锐，而且该区域荧光明显高于侧翼未激活区域。即使堆栈中图像平面稍有不对齐，也可能导致致义和近距离测量窗口中荧光值的跳跃。因此，在继续分析之前，必须正确对齐和仔细检查图像集。
光漂白的校正是必要的，以确保荧光强度随时间的变化准确地反映荧光蛋白量的变化。在估计中央和侧翼窗口的绝对荧光强度时，这种修正可能是一个重要的误差来源。由于光漂白动力学取决于照明强度和荧光团的环境，因此实际光漂白速率可能因会话而异，从轴孔到轴孔之间。因此，有必要测量多轴和平均结果数据，这本身就引入了一些误差。上述方法是用糖解抑制剂治疗神经，然后在感兴趣的区域激活荧光，并跟踪荧光强度的一段时间损失。糖解抑制剂耗尽ATP，从而抑制神经丝传输，因此荧光的丧失完全是由于光漂白，而不是神经丝运动出激活区域。然后用这种方式确定的平均漂白动力学用于校正实验数据。由于在每个成像会话中执行单独的漂白校准不实用，因此必须对分布在数周的多个会话应用单个校准。这种方法的一个缺点是，它不包括激光功率/照明强度的变化，因此，应监测。另一种方法，我们称之为"内在漂白校正"，是通过量化用于传输测量的相同延时电影中激活区域中心的荧光来估计光漂白。如果此测量区域位于中心位置，并且比激活区域的长度短得多，则在短时间内，任何移出测量区域的荧光神经丝将被移入测量区域的荧光神经丝所取代。然而，随着时间的推移，非荧光神经丝从轴的侧翼进入测量区域的概率增加，导致高估由于漂白而失去荧光。这种方法的一个优点是，它纠正了同一字段中的漂白特性，但缺点是，时间窗口的持续时间必须以经验方式确定，并且取决于传输速率以及激活区域的长度。话虽如此，应该指出，使用我们的方法对神经丝传输的方向性的估计是可靠的漂白误差（因为它是侧翼窗口大小），因为它是由侧翼窗口的斜率给出的，任何漂白校正都是应用于该计算中的分子和分母的乘数。
由于荧光系统固有的噪声，以及上述图像后处理步骤中可能添加的额外错误，因此使用大样本量以产生足够的统计能力非常重要。虽然在实验前无法准确确定总体值、偏差和效果大小，但我们建议使用 Cohen 方法21 假设中等效果大小和 alpha 为 0.05。这就产生一个Cohen 的d，即均值除以两个组的池标准差0.5，这意味着每组至少获取105个样本。一旦达到这一阈值，可以进行临时权力分析，根据实际人口量量来重新评估统计能力。在最佳实验条件下，每次激活时应有可能从 1-7 个可分析轴子（共 9-20 个轴子中）获得，如果每次激活获得 10 分钟的延时，每个神经可获得 5-8 个活化。
表达针对线粒体或囊泡的荧光融合蛋白的转基因小鼠也被用来研究周围神经外体22、23、24、25,23,的小鼠的雄ex vivo体24器官的子体运输。此外，Schiavo实验室已经开发出一种方法，利用荧光标记的破伤风毒素片段，在体内的轴向移动的子宫内器官的轴向 in vivo传输图像，这些片段可以注射到肌肉中，并由运动神经终端26被利用。然而，由于膜状细胞器可以通过荧光显微镜在这些轴子中解析，因此可以使用延时或基谱分析直接分析其运动的速度和频率。此处描述的脉冲逃逸和脉冲传播方法的制定目标是分析这些轴子中神经丝传输的动力学，其中单个神经丝无法解析。这需要在几分钟或几十分钟内进行总体级分析。我们使用转基因小鼠用于此目的，但也应该可以使用病毒转导或子宫电穿孔等方法表达光活性蛋白。虽然焦点一直是神经丝传输，但脉冲逃逸和脉冲传播方法也可以被调整为研究其他细胞骨骼和细胞细胞细胞细胞细胞细胞细胞细胞细胞细胞细胞蛋白的运动，这些蛋白质在轴骼传输的缓慢成分中沿着轴线分量传输。我们将其分析局限于骨髓轴孔，因为它们的大小和骨髓护套使我们能够从邻居那里解决它们。未解髓轴子无法解析，因为其口径小，且倾向于在 Remak 捆绑包中聚类。我们描述了使用三维神经外体，但方法也应该适用于其他外围神经足够长（>5毫米）和未支管。原则上，还应能够调整这些方法，使之在体内成像神经丝结构传输（例如，通过手术将神经暴露在静静小鼠体内，然后将鼠标置于显微镜阶段）。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者要感谢保拉·蒙斯玛在共声显微镜和三口神经解剖方面的指导和协助，感谢Atsuko Uchida博士、Chloe Duger和Sana Chahande博士对小鼠饲养的帮助。这项工作得到了国家科学基金会合作资助IOS1656784至B.B. IOS1656765 向 P.J. 和国家卫生研究院提供 R01 NS038526、P30 NS104177 和 S10 OD010383 到 A.B. N.P.B. 的奖学金得到了俄亥俄州立大学校长博士后学者计划的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 x 22 Rectangle Gasket 0.1mm | Bioptechs | 1907-1422-100 | inner gasket |
| 2-deoxy-D-glucose | Sigma | D6134 | |
| 30mm Round Gasket w/ Holes | Bioptechs | 1907-08-750 | outer gasket |
| 35 x 10mm dish | Thermo Fisher | 153066 | dissection dishes |
| 40mm round coverslips | Bioptechs | 40-1313-0319 | |
| 60mL syringe - Luer-lock tip | BD | 309653 | |
| Andor Revolution WD spinning-disk confocal system | Andor | outfitted with Perfect Focus and FRAPPA systems | |
| Calcium chloride | Fisher | C79 | |
| Coverslips | Fisher | 12-541-B | for fluorescein slide |
| D-(+)-glucose solution | Sigma | G8769 | |
| Dissecting pins | Fine Science Tools | 26001-70 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | fine tipped forceps |
| Dissection microscope | Zeiss | 47 50 03 | |
| Dissection pan with wax | Ginsberg Scientific | 568859 | |
| Dissection scissors | Fine Science Tools | 14061-09 | initial dissection scissors |
| FCS2 perfusion chamber | Bioptechs | 060319-2-03 | |
| Fluorescein sodium | Fluka | 46960 | |
| Inline solution heater | Warner Instruments | SH27-B | |
| Laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | initial dissection forceps |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Microaqueduct slide | Bioptechs | 130119-5 | |
| Microscope slides | Fisher | 12-544-3 | for fluorescein slide |
| Microscope stage insert | Applied Scientific Instrumentation | I-3017 | |
| Objective heater system | Okolab | Oko Touch with objective collar | |
| Objective oil - type A | Nikon | discontinued | |
| Plan Apo VC 100x 1.40 NA objective | Nikon | MRD01901 | |
| Potassium chloride | Fisher | P217 | |
| Potassium phosphate | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium iodoacetate | Sigma-Aldrich | I2512 | |
| Syringe pump | Sage Instruments | Model 355 | |
| Tubing adapter - female | Small Parts Inc. | 1005109 | |
| Tubing adapter - male | Small Parts Inc. | 1005012 | |
| Tygon tubing | Bioptechs | 1/16" ID, 1/32" wall thickness | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | fine scissors |
References
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