Summary
De bloed-hersenbarrière (BBB) kan tijdelijk worden verstoord met microbubble-gemedieerde gerichte echografie (FUS). Hier beschrijven we een stapsgewijs protocol voor BBB-opening met hoge doorvoer in vivo met behulp van een modulair FUS-systeem dat toegankelijk is voor niet-echografie-experts.
Abstract
De bloed-hersenbarrière (BBB) is een belangrijke hindernis geweest voor de behandeling van verschillende hersenziekten. Endotheelcellen, verbonden door nauwe verbindingen, vormen een fysiologische barrière die voorkomt dat grote moleculen (>500 Da) het hersenweefsel binnendringen. Microbubble-gemedieerde gerichte echografie (FUS) kan worden gebruikt om een voorbijgaande lokale BBB-opening te induceren, waardoor grotere geneesmiddelen het parenchym van de hersenen kunnen binnendringen.
Naast grootschalige klinische apparaten voor klinische vertaling, vereist preklinisch onderzoek voor therapieresponsbeoordeling van geneesmiddelkandidaten speciale echografie-opstellingen voor kleine dieren voor gerichte BBB-opening. Bij voorkeur maken deze systemen workflows met hoge doorvoer mogelijk met zowel hoge ruimtelijke precisie als geïntegreerde cavitatiebewaking, terwijl ze nog steeds kosteneffectief zijn in zowel initiële investeringen als bedrijfskosten.
Hier presenteren we een bioluminescentie- en röntgengeleid stereotactisch FUS-systeem voor kleine dieren dat is gebaseerd op in de handel verkrijgbaar componenten en voldoet aan de bovengenoemde vereisten. Bijzondere nadruk is gelegd op een hoge mate van automatisering die de uitdagingen vergemakkelijkt die doorgaans worden ondervonden in preklinische geneesmiddelenevaluatiestudies met een hoog volume. Voorbeelden van deze uitdagingen zijn de noodzaak van standaardisatie om de reproduceerbaarheid van gegevens te waarborgen, de variabiliteit binnen de groep te verminderen, de steekproefgrootte te verminderen en zo te voldoen aan ethische vereisten en onnodige werklast te verminderen. Het voorgestelde BBB-systeem is gevalideerd in het kader van BBB-opening gefaciliteerde geneesmiddelenleveringsproeven op patiënt-afgeleide xenograftmodellen van glioblastoom multiforme en diffuse midline glioma.
Introduction
De bloed-hersenbarrière (BBB) is een groot obstakel voor de levering van geneesmiddelen in het parenchym van de hersenen. De meeste therapeutische geneesmiddelen die zijn ontwikkeld, kruisen de BBB niet vanwege hun fysisch-chemische parameters (bijv. lipofielheid, moleculair gewicht, waterstofbindingsacceptoren en donoren) of worden niet behouden vanwege hun affiniteit voor effluxtransporters in de hersenen1,2. De kleine groep geneesmiddelen die de BBB kunnen kruisen, zijn meestal kleine lipofiele moleculen, die slechts effectief zijn bij een beperkt aantal hersenziekten1,2. Als gevolg hiervan zijn voor de meeste hersenziekten de farmacologische behandelingsopties beperkt en zijn nieuwe strategieën voor de toediening van geneesmiddelen nodig3,4.
Therapeutische echografie is een opkomende techniek die kan worden gebruikt voor verschillende neurologische toepassingen zoals BBB-verstoring (BBBD), neuromodulatie en ablatie4,5,6,7. Om een BBB-opening te bereiken met een extracorporale echografie-emitter door de schedel, wordt gerichte echografie (FUS) gecombineerd met microbubbels. Microbubble-gemedieerde FUS resulteert in een verhoogde biologische beschikbaarheid van geneesmiddelen in het hersenparenchym5,8,9. In aanwezigheid van geluidsgolven beginnen microbubbels te oscilleren bij het initiëren van transcytose en verstoring van de nauwe verbindingen tussen de endotheelcellen van de BBB, waardoor paracellulair transport van grotere moleculen mogelijk wordt10. Eerdere studies bevestigden de correlatie tussen de intensiteit van de akoestische emissie en de biologische impact op de BBB-opening11,12,13,14. FUS in combinatie met microbubbels is al gebruikt in klinische studies voor de behandeling van glioblastoom met temozolomide of liposomale doxorubicine als chemotherapeutisch middel, of voor de behandeling van de ziekte van Alzheimer en amyotrofische laterale sclerose5,9,15,16.
Aangezien echografie gemedieerde BBB-opening resulteert in geheel nieuwe mogelijkheden voor farmacotherapie, is preklinisch onderzoek voor klinische vertaling nodig om de therapierespons van geselecteerde geneesmiddelkandidaten te beoordelen. Dit vereist meestal een workflow met hoge doorvoer met zowel hoge ruimtelijke precisie als bij voorkeur een geïntegreerde cavitatiedetectie voor het bewaken van gerichte BBB-opening met een hoge reproduceerbaarheid. Indien mogelijk moeten deze systemen kosteneffectief zijn in zowel initiële investeringen als bedrijfskosten om schaalbaar te zijn op basis van de studiegrootte. De meeste preklinische FUS-systemen worden gecombineerd met MRI voor beeldbegeleiding en behandelingsplanning15,17,18,19. Hoewel MRI gedetailleerde informatie geeft over de anatomie en het volume van de tumor, is het een dure techniek, die over het algemeen wordt uitgevoerd door getrainde / bekwame operators. Bovendien is MRI met hoge resolutie mogelijk niet altijd beschikbaar voor onderzoekers in preklinische faciliteiten en vereist het lange scantijden per dier, waardoor het minder geschikt is voor farmacologische studies met hoge doorvoer. Opmerkelijk is dat voor preklinisch onderzoek op het gebied van neuro-oncologie, in het bijzonder infiltratieve tumormodellen, de mogelijkheid om de tumor te visualiseren en te targeten essentieel is voor het succes van de behandeling20. Momenteel wordt aan deze eis alleen voldaan door MRI of door tumoren die worden getransduceerd met een fotoproteïne, waardoor visualisatie met bioluminescentiebeeldvorming (BLI) in combinatie met toediening van het fotoproteïnesubstraat mogelijk is.
MRI-geleide FUS-systemen gebruiken vaak een waterbad om ultrasone golfvoortplanting te garanderen voor transcraniële toepassingen, waarbij het hoofd van het dier gedeeltelijk in het water wordt ondergedompeld, de zogenaamde ''bottom-up'' systemen15,17,18. Hoewel deze ontwerpen over het algemeen goed werken in kleinere dierstudies, zijn ze een compromis tussen de bereidingstijden van dieren, draagbaarheid en realistisch handhaafbare hygiënische normen tijdens het gebruik. Als alternatief voor MRI omvatten andere geleidingsmethoden voor stereotactische navigatie het gebruik van een anatomische atlas voor knaagdieren21,22,23, laserpointer assisted visual sighting24, pinhole-assisted mechanical scanning device25, of BLI26. De meeste van deze ontwerpen zijn "top-down" systemen waarbij de transducer bovenop het hoofd van het dier wordt geplaatst, met het dier in een natuurlijke positie. De ''top-down'' workflow bestaat uit een waterbad22,25,26 of een met water gevulde kegel21,24. Het voordeel van het gebruik van een transducer in een gesloten kegel is de compactere voetafdruk, kortere insteltijd en eenvoudige ontsmettingsmogelijkheden die de hele workflow vereenvoudigen.
De interactie van het akoestische veld met de microbubbels is drukafhankelijk en varieert van oscillaties met lage amplitude (stabiele cavitatie genoemd) tot voorbijgaande instorting van de bellen (inertial cavitatie genoemd)27,28. Er is een vaste consensus dat ultrasound-BBBD een akoestische druk vereist die ver boven de stabiele cavitatiedrempel ligt om succesvolle BBBD te bereiken, maar onder de traagheids cavitatiedrempel, die over het algemeen geassocieerd wordt met vasculaire/neuronale schade29. De meest voorkomende vorm van monitoring en controle is de analyse van het (back-)scattered akoestische signaal met behulp van passieve cavitatiedetectie (PCD), zoals voorgesteld door McDannold et al.12. PCD baseert zich op de analyse van de Fourier spectra van microbubble emissiesignalen, waarbij de sterkte en het uiterlijk van stabiele cavitatie-kenmerken (harmonischen, subharmonica en ultraharmonica) en traagheids cavitatiemarkers (breedbandrespons) in realtime kunnen worden gemeten.
Een "one size fits all" PCD-analyse voor nauwkeurige drukregeling is gecompliceerd vanwege de polydispersiteit van de microbubbelformulering (de oscillatieamplitude hangt sterk af van de bubbeldiameter), de verschillen in bubble shell-eigenschappen tussen merken en de akoestische oscillatie, die sterk afhankelijk is van frequentie en druk30,31,32. Als gevolg hiervan zijn veel verschillende PCD-detectieprotocollen voorgesteld, die zijn aangepast aan specifieke combinaties van al deze parameters en zijn gebruikt in verschillende toepassingsscenario's (variërend van in vitro experimenten over protocollen voor kleine dieren tot PCD voor klinisch gebruik) voor robuuste cavitatiedetectie en zelfs voor retroactieve feedbackcontrole van de druk11,14,30,31,32,33,34,35. Het PCD-protocol dat in het kader van deze studie wordt gebruikt, is rechtstreeks afgeleid van McDannold et al.12 en bewaakt de harmonische emissie voor de aanwezigheid van stabiele cavitatie en breedbandgeluid voor traagheids cavitatiedetectie.
We hebben een beeldgestuurd neuronavigatie FUS-systeem ontwikkeld voor het transiënt openen van de BBB om de afgifte van geneesmiddelen in het parenchym van de hersenen te verhogen. Het systeem is gebaseerd op in de handel verkrijgbaar componenten en kan eenvoudig worden aangepast aan verschillende beeldvormingsmodaliteiten, afhankelijk van de beschikbare beeldvormingstechnieken in de dierenfaciliteit. Omdat we een workflow met hoge doorvoer nodig hebben, hebben we ervoor gekozen om röntgenfoto's en BLI te gebruiken voor beeldbegeleiding en behandelingsplanning. Tumorcellen getransduceerd met een fotoproteïne (bijv. luciferase) zijn geschikt voor BLI imaging20. Na toediening van het fotoproteïnesubstraat kunnen tumorcellen in vivo worden gecontroleerd en kunnen tumorgroei en locatie worden bepaald20,36. BLI is een goedkope beeldvormingsmodaliteit, het maakt het mogelijk om de tumorgroei in de loop van de tijd te volgen, het heeft snelle scantijden en het correleert goed met tumorgroei gemeten met MRI36,37. We hebben ervoor gekozen om het waterbad te vervangen door een met water gevulde kegel die aan de transducer is bevestigd om flexibiliteit mogelijk te maken om het platform waarop het knaagdier is gemonteerd vrij te verplaatsen8,24. Het ontwerp is gebaseerd op een afneembaar platform dat is uitgerust met integratie van (I) stereotactisch platform voor kleine dieren (II) fiducial markers met zowel röntgen- als optische beeldcompatibiliteit (III) snel-afneembare anesthesiemasker en (IV) geïntegreerd temperatuurgeregeld dierverwarmingssysteem. Na de eerste inductie van anesthesie wordt het dier in een precieze positie op het platform gemonteerd waar het tijdens de hele procedure blijft. Bijgevolg passeert het hele platform alle stations van de workflow van de hele interventie, met behoud van een nauwkeurige en reproduceerbare positionering en aanhoudende anesthesie. De besturingssoftware maakt de automatische detectie van de fiducial markers mogelijk en registreert automatisch alle soorten beelden en beeldmodaliteiten (d.w.z. micro-CT, röntgen, BLI en fluorescentiebeeldvorming) in het referentiekader van het stereotactische platform. Met behulp van een automatische kalibratieprocedure is de brandpuntsafstand van de ultrasone transducer precies bekend binnenin, wat de automatische fusie van interventionele planning, akoestische levering en follow-up beeldvormingsanalyse mogelijk maakt. Zoals weergegeven in figuur 1 en figuur 2,biedt deze opstelling een hoge mate van flexibiliteit om specifieke experimentele workflows te ontwerpen en maakt het mogelijk om het dier op verschillende stations met elkaar te behandelen, wat op zijn beurt experimenten met hoge doorvoer vergemakkelijkt. We hebben deze techniek gebruikt voor succesvolle medicijnafgifte bij muis xenografts van hoogwaardig glioom zoals diffuus midline glioom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle in vivo experimenten zijn goedgekeurd door de Nederlandse ethische commissie (vergunningsnummer AVD114002017841) en het Dierenwelzijnsorgaan van de Vrije Universiteit Amsterdam. De onderzoekers werden getraind in de basis van het FUS-systeem om het ongemak van de dieren te minimaliseren.
1. Gericht echografiesysteem
OPMERKING: De beschreven opstelling is een in eigen huis gebouwd BBB-storingssysteem op basis van in de handel verkrijgbare componenten en bevat een 3D-geprinte op maat gemaakte kegel en een afneembaar stereotactisch platform. Het systeem is modulair ontworpen, wat aanpassingen mogelijk maakt op basis van beschikbare apparatuur en specifiek gebruik. Het protocol beschrijft de procedure voor de sonoporatie van een groter gebied in het pontinegebied van de muizenhersenen. Door de doellocatie aan te passen, kunnen verschillende delen van de hersenen worden getarget. In deze studie werd een 1 MHz mono-element transducer met een brandpuntsafstand van 75 mm, een diafragma van 60 mm en een brandpunt van 1,5 x 1,5 x 5 mm (FWHM piekdruk) gebruikt. Het brandpuntsvlak van de transducer bevindt zich door de schedel van het dier in het horizontale vlak dat de oorstaven kruist.
- Selecteer een geschikte transducer voor BBB-opening bij knaagdieren.
OPMERKING: Op basis van de eigenschappen van de microbubbels en de gebruikte frequentie zijn de akoestische instellingen, met name de mechanische index (MI), onderhevig aan wijziging13,38. - Plaats de transducer in de 3D-geprinte kegel.
- Gebruik een akoestisch transparant mylarmembraan aan de onderkant van de kegel om een akoestische koppeling van het straalvoortplantingspad te bereiken en vul de kegel met ontgast water.
- Monteer de transducer boven het dier op een gemotoriseerd lineair stadium zoals weergegeven in figuur 1, zodat de transducer automatisch verticaal kan worden geplaatst.
- Ontwerp een afneembaar stereotactisch platform op basis van de vereisten van het onderzoek, dat temperatuurgereguleerde verwarming, beet- en oorstaven, anesthesie en multimodale fiduciale markers omvat, zoals weergegeven in figuur 1 en figuur 2. De montage van het stereotactische platform bestaat uit een 2D lineair podiumsysteem, dat nauwkeurige automatische positionering (< 0,1 mm) van het dier onder de balk mogelijk maakt.
- Sluit de transducer aan op de akoestische emissieketen in figuur 1, bestaande uit een transducer, een functiegenerator en een eindversterker.
- Bedenk een beeldverwerkingspijplijn om de multimodale fiduciale markers te detecteren die nauwkeurige sonoporatietargeting van het hersengebied van belang en verzameling van de cavitatiegegevens die door de naaldhydrofoon worden gedetecteerd, mogelijk maakt.
- Kalibreer het systeem en bepaal het scherpstelpunt van de transducer in overeenstemming met de verticale positionering van het dier op het stereotactische platform.
2. Voorbereiding van dieren
OPMERKING: Het volgende protocol is gespecificeerd voor muizen, maar kan worden aangepast voor ratten. Voor deze experimenten werden vrouwelijke athymische naakte Foxn1-/- muizen (6-8 weken oud) gebruikt.
- Laat het dier minstens een week acclimatiseren in de dierenvoorziening en weeg het dier regelmatig.
- Toedienen van buprenorfine (0,05 mg/kg) via subcutane (s.c.) injectie 30 min voorafgaand aan fus behandeling om te beginnen met de pijnstillende behandeling.
- Verdoof het dier met 3% isofluraan, 2 L/min O2 en controleer of het dier diep verdoofd is. Houd de dieren tijdens de hele procedure verdoofd en controleer de ademhalingsfrequentie en hartslag om de concentratie isofluraan naar behoefte aan te passen.
- Breng oogzalf aan om droge ogen te voorkomen en mogelijk letsel te voorkomen.
- Verwijder het haar op de bovenkant van het hoofd met een scheermes en ontharingscrème en was daarna met water om eventuele resten te verwijderen om irritatie van de huid te voorkomen.
- Injecteer voor experimenten met BLI-tumormodellen 150 μL D-luciferine (30 mg/ml) intraperitoneaal (i.p.) met een 29 G insulinespuit voor BLI-beeldgeleiding.
- Plaats een 26-30 G staartaderkatheter en spoel de katheter en ader door met een klein volume heparineoplossing (5 UI/ml). Vul de katheter met heparineoplossing om bloedstolling te voorkomen.
OPMERKING: Een goede katheterisatie wordt waargenomen wanneer er een reflux van bloed in de katheter is. Vermijd luchtbellen in de katheter om emboli te voorkomen. Om overmatige injectiedruk te voorkomen, moet u ervoor zorgen dat de lengte van de katheter zo kort mogelijk is. - Plaats het dier op het temperatuurgeregelde stereotactische platform om onderkoeling te voorkomen.
OPMERKING: Onderkoeling vermindert de bloedcirculatie, wat de injectie/circulatie van microbubbels en de farmacokinetiek van de geneesmiddelen kan beïnvloeden39. - Immobiliseer en bevestig het hoofd van het dier op het stereotactische platform met behulp van oorstangen en een bijtbeugel. Fixeer het lichaam met een riem en plak de staart van het dier vast aan het platform.
3. In vivo beeldgeleide gerichte echografie
OPMERKING: Voor dit protocol werd een 1 MHz mono-element transducer met een toon-burst puls met een duur van 10 ms, een MI van 0,4 en een pulsherhalingsfrequentie van 1,6 Hz met 40 cycli gedurende 240 s gebruikt. Het protocol is geoptimaliseerd voor microbubbels gestabiliseerd door fosfolipiden die zwavelhexafluoride (SF6) bevatten als onschadelijk gas, waarbij de gemiddelde bubbeldiameter 2,5 μm is en meer dan 90% van de bellen kleiner is dan 8 μm.
- Plaats het stereotactische platform met het gemonteerde dier in de beeldvormingsmodaliteit (bijv. BLI of röntgenfoto's) en maak foto('s) van het dier.
- Gebruik de multimodale fiducial markers in combinatie met de beeldverwerkingspijplijn om de positie van het dier te markeren op basis van het scherpstelpunt van de transducer.
- Bepaal het doelgebied door een hersencontour over het verkregen röntgenbeeld te plaatsen of BLI-afbeeldingen te gebruiken om het centrum van de tumor te bepalen (figuur 2). De positie van specifieke delen van de hersenen wordt gespecificeerd in de Paxinos Brain Atlas40 met behulp van de schedelmarkeringen bregma en lambda als referentiepunten. De pons bevindt zich bijvoorbeeld x=-1.0, y=-0.8 en z=-4.5 van lambda.
- Bescherm de neusgaten en mond van het dier met plakband om te voorkomen dat ultrasone gel de ademhaling verstoort.
- Breng ultrasone gel aan op het hoofd van het dier.
- Trek de huid van de nek van de dieren in, smeer de naaldhydrofoon met ultrasone gel en plaats de naaldhydrofoon in de directe omgeving van het achterhoofdsbeen.
- Leid de transducer naar de juiste positie met behulp van de beeldverwerkingspijplijn en het scherpstelpunt.
- Pas de vooraf geconfigureerde instellingen toe op alle aangesloten apparaten en richt u op het hersengebied van belang.
OPMERKING: Afhankelijk van de onderzoeksvraag kunnen tumor- of hersengebieden worden gesnoopoeerd als één brandpunt of als volumetrische vorm, zoals weergegeven in figuur 2. - Activeer microbubbels zoals beschreven door de fabrikant. Injecteer één bolus van 120 μL (5,4 μg) microbubbels.
- Spoel de staartaderkatheter met zoutoplossing om de opening van de katheter te controleren.
- Injecteer de microbubbels en start de insonatie.
- Neem microbubble cavitatie op met de naald hydrofoon.
- Dien een intravasculaire contrastmiddel of geneesmiddel toe na sonoporatie. De dosis, timing en planning zijn afhankelijk van het doel van het onderzoek en het medicijn.
OPMERKING: Evans blauw is een veel voorkomende kleurstof om BBB opening41te beoordelen . - Bewaak het dier tot het vooraf bepaalde tijdspunt of vóór het humane eindpunt.
4. Analyse van microbubble cavitatie
OPMERKING: Hier wordt de toegepaste procedure beschreven, die geschikt is voor in vivo experimenten voor SF6-fosfolipide microbubbels met een gemiddelde diameter van 2,5 μm (80% van de bellen onder 8 μm) opgewekt met een burst-tone puls van 10 ms duur bij een frequentie van 1 MHz, zoals oorspronkelijk gesuggereerd door McDannold et al.12.
- Fourier transformeert het opgenomen PCD-signaal van het tijddomein naar het frequentiedomein.
- Integreer het resulterende spectrale vermogen voor stabiele cavitatiedetectie rond de2e en3e harmonische (± 50 kHz), zoals weergegeven in figuur 3 (groene doos op 2 en 3 MHz).
- Integreer het spectrale vermogen voor traagheids cavitatiedetectie, tussen de hoofdfrequentie, de 2e,3e harmonische, de1e en2e ultraharmonische en de eerste subharmonische (± 150 kHz), zoals weergegeven in figuur 3 (rode vakken).
- Integreer het spectrale vermogen rond de principefrequentie (1 MHz ± 50 kHz) voor de normalisatie van beide eerder verkregen PCD-signalen.
OPMERKING: Het PCD-signaal, voor SF6-fosfolipide microbubbels in vivo experimenten op 1 MHz, geeft geen ultraharmonica of subharmonica weer voordat traagheidsholte ingaat, zoals weergegeven in figuur 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het beschrevenFUS-systeem ( figuur 1 en figuur 2) en de bijbehorende workflow zijn gebruikt bij meer dan 100 dieren en produceerden reproduceerbare gegevens over zowel gezonde als tumordragende muizen. Op basis van de geregistreerde cavitatie en de spectrale dichtheid bij de harmonischen op het piekmoment van de microbubble bolus injectie, kan het spectrale vermogen van elke frequentie worden berekend met behulp van de Fourier-analyse zoals uitgelegd in stap 4 van het protocol. Op basis van het akoestische protocol (1 MHz, 10 ms pulsduur) met een MI van 0,4 in combinatie met microbubbels normaliseerde het genormaliseerde geïntegreerde vermogensspectrum bij de 2e en 3rd harmonischen het geïntegreerde vermogensspectrum van de excitatiefrequentie waargenomen in figuur 3. Dit bood een zeer gevoelig en betrouwbaar middel voor stabiele cavitatiedetectie, in vergelijking met geen detectie van subharmonica wanneer er geen microbubbels werden geïnjecteerd of de observatie van traagheidsholte wanneer een MI van 0,6 werd toegepast. In het geval van traagheids cavitatie werd een verhoogde breedbandruisvloer van maximaal 25 dB gedetecteerd, evenals het verschijnen van ultraharmonica en subharmonica. Hoewel een akoestische druk van een MI van 0,4 en 0,6 resulteerde in geen macroscopische schade, werd microscopische schade histologisch aangetoond bij een MI van 0,6, zoals weergegeven in figuur 4. Een verdere toename van de drukamplitude tot een MI van 0,8 resulteerde in een macroscopische hersenbloeding van grotere vaten en wijdverspreide weefsellysis met de extravasatie van erytrocyten. De histologische bevindingen kwamen overeen met de akoestische gegevens van de passieve cavitatiesensor, zoals weergegeven in figuur 3, die de schadelijke eigenschappen van traagheidsholte van het hersenweefsel bevestigen. Als gevolg hiervan werd een MI van 0,4 gekozen als de veilige drukamplitude die een zeer reproduceerbare BBB-opening bood, terwijl een veilige marge werd geboden aan het traagheids cavitatieregime, zoals waargenomen vóór11.
Intraveneus Evans blauw werd geïnjecteerd om de opening van de BBB in het pontinegebied te valideren. De sterke albuminebinding van Evans blauw leidt tot een groot molecuul van meer dan 66 kDa42. Op het niveau van de pons en gedeeltelijk het cerebellum werd extravasatie van Evans blauwgevoegde albumine waargenomen bij de muis behandeld met FUS en microbubbels in tegenstelling tot de muis zonder microbubbels (Figuur 5). Dit benadrukt de precieze targeting van de regio van belang op basis van beeldgestuurde stereotactische navigatie met het in-house gebouwde FUS-systeem en het beschreven protocol.
Figuur 1: Gerichte echografie opstelling.
(A) Schematische weergave van de gerichte echografie opstelling. (B) Beeld van de geconcentreerde ultrasone klankopstelling. Het systeem bestaat uit een top-down gemonteerde transducer op een 1D lineaire fase over een tweede 2D-fase voor automatische 3D-positionering. De transducer is gebouwd in een met water gevulde beam-cone, aan de onderkant gesloten met een akoestisch transparant mylarmembraan, dat het geluid naar de schedel van het dier geleidt. De transducer is aangesloten op een eindversterker, die op zijn beurt is aangesloten op een willekeurige golfvormgenerator (AWG) voor signaalgeneratie. Voor cavitatiedetectie wordt een afneembare hydrofoon in combinatie met een geluidsarme spanningsversterker gebruikt. De hydrofoon wordt in de directe omgeving van het achterhoofdsbeen geplaatst. De externe hydrofoon heeft een 2 mm actief oppervlak en is akoestisch gekoppeld aan ultrasone gel. Zowel het hoogspanningssignaal van de excitatiepuls als het opgenomen cavitatiesignaal worden gedigitaliseerd door een standaard oscilloscoop van 200 MHz en doorgegeven aan een besturingscomputer (niet weergegeven) voor on-the-fly verwerking en real-time controle. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Gerichte echografie workflow.
De voorgestelde workflow van het gerichte echografiesysteem begint met (A) de initiële positionering van het dier op een afneembaar stereotactisch platform, let op de toepassing van de akoestische koppelingsgel (toegepast na BLI / röntgenfoto). Tegelijkertijd kan multimodale beeldvorming worden uitgevoerd voor targeting. (B) In eerste instantie is röntgenbeeldvorming een mogelijkheid, terwijl een interessegebied kan worden gericht met behulp van een omtrek van de hersenen (die op zijn beurt wordt verwezen naar de muishersenatlas40, aangepast aan de grootte en houding van de schedel). (C) Als alternatief kan een BLI-beeld van een luciferase transfected diffuse midline glioma tumor bedekt met een röntgenprojectie met maximale intensiteit worden toegepast voor targeting. (D) Vervolgens wordt het stereotactische platform gemonteerd met het dier in therapiepositie met zowel hydrofoon als transducer bevestigd. De transducer rijdt automatisch in therapiepositie en soniceert het gekozen traject na bolusinjectie. Het systeem is geoptimaliseerd voor experimenten met hoge doorvoer, waarbij meerdere platforms interleaved werk mogelijk maken, zoals hierboven wordt getoond. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Cavitatiebewaking.
(A) Frequentiespectrum van een in vivo experiment bij afwezigheid van microbubble administation bij een MI van 0,4 bij 1 MHz. (B) Getoond is het overeenkomstige spectrum bij piek-bolus na injectie van microbubbels. Let op de toename van de hogere harmonischen, wat indicatief is voor stabiele cavitatie van de microbubbels. (C) Overeenkomstig spectrum waargenomen bij een hogere MI van 0,6 in combinatie met microbubbelinjectie, binnen de overgangsband tot het begin van traagheids cavitatie, wat leidt tot een toename van de geluidsvloer tot 25 dB en het verschijnen van ultraharmonica en subharmonica. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: BBB opening en bijbehorende histologie.
(A) Stabiele cavitatie met behulp van een MI van 0,4 toonde een intact hersenparenchym aan in zowel witlichtmacroscopie als HE-bevlekte microscopie. (B) Na een MI van 0,6 worden de eerste tekenen van lokale onomkeerbare weefselschade van het hersenparenchym duidelijk in de he-bevlekte histologische gegevens. (C) Voor een nog hogere mechanische druk van MI 0,8 is macroscopische bloeding zichtbaar, evenals wijdverspreide weefsellysis van het hersenparenchym en de extravasatie van erytrocyten als gevolg van microbloeding. De blauwe tint in de witte lichtmacroscopie is indicatief voor de extravasatie van het gelijktijdig geïnjecteerde intra-vasculaire contrastmiddel Evans blue dat de BBB-opening aangeeft (zie figuur 5 voor een sagittale weergave). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: Validatie van BBB opening.
Demonstratie van succesvolle BBB-opening in het stabiele cavitatieregime (B) in vergelijking met de controle (A), geen microbubbels geïnjecteerd. In dit geval is Evans blauw gebruikt als een intravasculaire contrastmiddel. De sterke albuminebinding van Evans blauw leidt tot een groot molecuul van meer dan 66 kDa. Als gevolg hiervan is het bewijs van de Evans blauwe extravasatie indicatief voor paracellulair transport over de BBB als gevolg van een (gedeeltelijke) opening van de krappe kruisingen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze studie ontwikkelden we een kosteneffectief beeldgestuurd FUS-systeem voor voorbijgaande BBB-verstoring voor verhoogde medicijnafgifte in het hersenparenchym. Het systeem werd grotendeels gebouwd met in de handel verkrijge componenten en in combinatie met röntgen en BLI. De modulariteit van het voorgestelde ontwerp maakt het gebruik van verschillende beeldvormende modaliteiten mogelijk voor planning en beoordeling in workflows met hoge doorvoer. Het systeem kan worden gecombineerd met uitgebreidere 3D-beeldvormingsmodaliteiten met hoge resolutie, bijvoorbeeld MRI of micro-CT met hoge resolutie, terwijl voor het grootste deel van het onderzoek 2D-beeldvormingsmodaliteiten zoals 2D-röntgenfoto's en/of BLI worden gebruikt. 2D-röntgenfoto's en/of BLI zijn beide aanzienlijk kosteneffectiever en ideaal voor studies met een hoog volume vanwege hun respectieve korte acquisitietijden. De hier beschreven transducer is zeer geschikt om BBBD te produceren in grotere gebieden (op de schaal van een muisbrein) in diepere delen van de hersenen (f-getal van 1,25). We hebben het systeem gebruikt voor diffuus groeiende tumoren in het pontinegebied43,44. Voor deze regio's moet een groter volume worden gesnopoeerd dat het hele tumorgebied in de pons omvat. Het modulaire systeem kan eenvoudig worden aangepast voor andere soorten hersentumoren in meer supratentoriale delen van de hersenen. Om te beslissen over het transducertype moet men rekening houden met het f-getal, de brandpuntsafstand en de frequentie.
Het algemene ontwerp stelt daardoor twee verfijningen voor in vergelijking met eerder voorgestelde ontwerpen. (I) Vaak wordt een waterbad gebruikt voor ultrasone golfoverdracht van therapeutische systemen. Voor transcraniële toepassingen bij kleine dieren resulteert dit type ontwerp in grotere en omgekeerde opstellingen, waarbij het dier gedeeltelijk onder water staat11,22,25. Hoewel deze ontwerpen over het algemeen zeer goed werken in het kader van kleinere dierstudies, zijn ze een compromis met betrekking tot de insteltijden, draagbaarheid en realistisch onderhoudbare hygiënische normen tijdens het gebruik. Dit laatste is met name van groot belang voor de scopestudies die immunocompromitterende dieren omvatten en dus strenge hygiënische normen. Om een systeem te ontwerpen met een compactere voetafdruk, kortere insteltijd, eenvoudige ontsmettingsmogelijkheden en een natuurlijke positie van het dier tijdens de hele workflow, is daarom gekozen voor een "top-down" ontwerp. (II) De tweede ontwerpkeuze die verschilt van verschillende eerder beschreven ontwerpen was het weglaten van de directe integratie van het akoestische afgiftesysteem in een medisch beeldvormingssysteem zoals een MRI of een micro-CT15,17,18,19,45. Hoewel volledig geïntegreerde systemen ideaal zijn voor longitudinale farmacokinetische studies of verkennend onderzoek bij een beperkt aantal dieren, zijn dergelijke opstellingen over het algemeen minder geschikt voor farmacologische studies met een hoog volume vanwege aanzienlijk verhoogde complexiteit, hoge bedrijfskosten en behoefte aan opgeleide / bekwame operators. Bovendien zijn dergelijke systemen over het algemeen beperkt tot slechts één beeldvormingsmodaliteit. Als gevolg hiervan is het voorgestelde ontwerp hier gebaseerd op een modulair afneembaar stereotactisch platform, dat compatibel is met verschillende beeldmodaliteiten (micro-CT, MRI voor kleine dieren, een verscheidenheid aan BLI / fluorescentiecamera's, deze met of zonder geïntegreerde röntgenbeeldvorming) en biedt ook multimodale fiduciale markers voor automatische fusie van alle beeldgegevens in een gemeenschappelijk referentiekader voor zowel interventieplanning als de follow-up na BBB-opening.
Wat praktische overwegingen betreft, is het meest kritieke punt van falen in de procedure de stabiliteit van de microbubbels vanwege hun beperkte levensduur en hun fragiele aard. Wij willen benadrukken dat de volgende discussie betrekking heeft op microbubbels gestabiliseerd door fosfolipiden en die zwavelhexafluoride (SF6) bevatten als onschadelijk gas46,47, terwijl andere microbubbelformuleringen over het algemeen verschillende eigenschappen zullen vertonen.
Timing voor microbubble injectie: De geadverteerde levensduur van in de handel verkrijgde microbubbels na rehydratatie ligt tussen de 3 en 4 uur. Hoewel dit geschikt is voor diagnostische ultrasone toepassingen, moet worden opgemerkt dat gedurende deze hele periode de microbubbels continu gas verliezen en bijgevolg de gemiddelde bubbeldiameter onderhevig is aan een continue neerwaartse afwijking van de initiële gemiddelde grootte van 2,5 μm. Voor therapeutische toepassingen zoals echografie-gemedieerde BBBD impliceert dit veel strengere timing-imperatieven, aangezien de oscillatieamplitude van stabiele cavitatie (bij een bepaalde frequentie en druk) en de aanvangsdrempel van traagheidsholte ook als direct gevolg onderworpen zijn aan een continue drift. In onze ervaring hebben we waargenomen dat microbubbels het beste binnen 30 minuten na rehydratatie kunnen worden gebruikt om reproduceerbare resultaten te verkrijgen, vergelijkbaar met eerdere rapporten48.
Timing na microbubble injectie: Bij grotere primaten vertonen in de handel verkrijgbaarheid SF6-fosfolipide microbubbels een bloedplasma eliminatiehalfwaardetijd van ongeveer 6 minuten en meer dan 80% van het toegediende gas wordt uitgeademd via de longen na slechts 11 minuten48. Bij kleine zoogdieren zoals muizen en ratten is de bloed-plasma eliminatie halfwaardetijd van dit type microbubbels in vivo met 90-120 seconden aanzienlijk korter vanwege de hogere hartslag20. Als gevolg hiervan legt de snelle dynamiek van de microbubbelconcentratie direct na bolusinjectie en de snelle daaropvolgende plasmaverwijdering in combinatie met het continue gasvolumeverlies van de bellen strikte timingvereisten op aan het sonicatie-/injectieprotocol om reproduceerbare resultaten te verkrijgen binnen de korte duur van 3-4 minuten na injectie. Langere procedures of uitgebreidere hoeveelheden BBBD vereisen bij voorkeur een continue toediening van microbubbels. Een dergelijke aanpak wordt echter gecompliceerd door het drijfvermogen van de bubbels in zowel de spuit als het voedingssysteem en introduceert ook een aanzienlijk verhoogd dood volume door de vereiste infusieslangen. Onze ervaring is dat de eenvoudigere oplossing om het totale injectievolume op te splitsen in 2 tot 3 kleinere subdoses een robuust en reproduceerbaar resultaat opdeed.
Bovendien zijn microbubbels zeer drukgevoelig en wordt hoge hydrostatische druk tijdens injectie daarom niet aanbevolen. Grote naalden (>19 G) worden aanbevolen voor de overdracht van microbubbels in een plastic buis of om microbubbels op te stellen met een spuit49. Voor i.v. injectie bij muizen worden 26-30 G naalden aanbevolen; omdat grotere naalden moeilijker in de staartader kunnen worden ingebracht. De 26 G naald wordt aanbevolen omdat de hydrostatische druk met deze naald lager is. In geval van moeilijke veneuze toegang wordt de 30 G-naald echter aanbevolen.
De schedel van de muis is een belangrijke verzwakker van de drukamplitude die de drukamplitude bij de focus aanzienlijk verlaagt. Demping wordt bepaald door de frequentie van de transducer en de dichtheid van het medium dat de ultrasone golf zich voortplant. Hogere ultrasone frequenties en hoge weefseldichtheden, zoals bot, resulteren in een hoge demping. De drukamplitude wordt gedeeltelijk geabsorbeerd door bot en sommige drukamplitude gaat verloren door reflectie en verstrooiing50. In onze experimenten hebben we in muiskadavers vastgesteld dat de demping bij 1 MHz 14,5 ± 1,3 dB/cm is met een gemiddelde schedeldikte van 0,9 mm zoals getoond voor21,50. Cavitatiebewaking wordt ten zeerste aanbevolen omdat microbubbels verschillende akoestische emissies weerspiegelen tijdens stabiele cavitatie en traagheids cavitatie. Breedbandemissie is een uitgesproken akoestische emissie voor traagheids cavitatie12. Real-time monitoring maakt het mogelijk om traagheids cavitatie te detecteren en de drukamplitude dienovereenkomstig te verlagen om weefselschade te voorkomen.
Eerdere rapporten beschreven de invloed van het type anesthesie op de bereikte BBB-permeabiliteit11,31. Voor anesthesie op basis van isofluraan treedt kort na anesthesie-initiatie een vasodilatatie op, die gepaard gaat met een lichte vermindering van de cerebrale bloedstroom. Bovendien leidt anesthesie over langere duur, met name bij afwezigheid van een temperatuurstabilisatie, tot een verminderde hartslag. Aangezien beide factoren mogelijk kunnen leiden tot een grotere variantie van de cerebrale concentratie van zowel microbubbels als gelijktijdig toegediende geneesmiddelen, is een strikt anesthesieprotocol raadzaam om reproduceerbare resultaten te bereiken51. Anesthesie met 1,5% v/v isofluraan in 2 L/min zuurstof gedurende 35 tot 45 minuten was niet problematisch, zoals geadviseerd door Constantinides et al.51. In tegenstelling tot McDannold et al. die aantoonden dat dit gasmengsel in combinatie met het specifieke type van hun microbubbels problematisch was52, hebben we geen opmerkelijke problemen met dit type microbubbels waargenomen. Als alternatief kunnen de dieren worden verdoofd met een mix van ketamine/xylazine, die geen bekende vasoactieve effecten heeft53.
Samengevat is de hier beschreven beeldvormende BBB-openingstechniek gebruikt voor grootschalige preklinische geneesmiddelenevaluatiestudies die de efficiëntie van de voorgestelde workflow aantoonden. Het systeem kon daardoor na een korte opleiding door niet-technisch personeel worden bediend vanwege de hoge mate van automatisering. Dit in combinatie met de eenvoud van de opstelling resulteerde in een hoge mate van standaardisatie, wat op zijn beurt zorgt voor experimentele reproduceerbaarheid, verminderde variabiliteit binnen de groep en dus de vereiste monstergrootte kan verminderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Acknowledgments
Dit project werd gefinancierd door de KWF-STW (Drug Delivery by Sonoporation in Childhood Diffuse Intrinsic Pontine Glioma and High-grade Glioma). Wij danken Ilya Skachkov en Charles Mougenot voor hun inbreng in de ontwikkeling van het systeem.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL luer-lock syringe | Becton Dickinson | 309628 | Plastipak |
| 19 G needle | Terumo Agani | 8AN1938R1 | |
| 23 G needle | Terumo Agani | 8AN2316R1 | |
| 3M Transpore surgical tape | Science applied to life | 7000032707 | or similar |
| Arbitrary waveform generator | Siglent | n.a. | SDG1025, 25 MHz, 125 Msa/s |
| Automated stereotact | in-house built | n.a. | Stereotact with all elements were in-house built |
| Bruker In-Vivo Xtreme | Bruker | n.a. | Includes software |
| Buffered NaCl solution | B. Braun Melsungen AG | 220/12257974/110 | |
| Buprenorfine hydrochloride | Indivior UK limitd | n.a. | 0.324 mg |
| Cage enrichment: paper-pulp smart home | Bio services | n.a. | |
| Carbon filter | Bickford | NC0111395 | Omnicon f/air |
| Ceramic spoon | n.a | n.a. | |
| Cotton swabs | n.a. | n.a. | |
| D-luciferin, potassium salt | Gold Biotechnology | LUCK-1 | |
| Ethanol | VUmc pharmacy | n.a. | 70% |
| Evans Blue | Sigma Aldrich | E2129 | |
| Fresenius NaCl 0.9% | Fresenius Kabi | n.a. | NaCl 0.9 %, 1000 mL |
| Histoacryl | Braun Surgical | n.a. | Histoacryl 0.5 mL |
| Hydrophone | Precision Acoustics | n.a. | |
| Insulin syringe | Becton Dickinson | 324825/324826 | 0.5 mL and 0.3 mL |
| Isoflurane | TEVA Pharmachemie BV | 8711218013196 | 250 mL |
| Ketamine | Alfasan | n.a. | 10 %, 10 mL |
| Mouse food: Teklad global 18% protein rodent diet | Envigo | 2918-11416M | |
| Neoflon catheter | Becton Dickinson | 391349 | 26 GA 0.6 x 19 mm |
| Oscilloscope | Keysight technologies | n.a. | InfiniiVision DSOX024A |
| Plastic tubes | Greiner bio-one | 210261 | 50 mL |
| Power amplifier | Electronics & Innovation Ltd | 210L | Model 210L |
| Preamplifier DC Coupler | Precision Acoustics | n.. | Serial number: DCPS94 |
| Scissors | Sigma Aldrich | S3146-1EA | or similar |
| Sedazine | AST Farma | n.a. | 2% |
| SonoVue microbubbles | Bracco | n.a. | 8 µl/ml |
| Sterile water | Fresenius Kabi | n.a. | 1000 mL |
| Syringe | n.a. | n.a. | various syringes can be used |
| Temgesic | Indivior UK limitd | n.a. | 0.3 mg/ml |
| Transducer | Precision Acoustics | n.a. | 1 MHz |
| Tweezers | Sigma Aldrich | F4142-1EA | or similar |
| Ultrasound gel | Parker Laboratories Inc. | 01-02 | Aquasonic 100 |
| Vidisic gel | Bausch + Lomb | n.a. | 10 g |
References
- Lipinski, C. A. Lead- and drug-like compounds: the rule-of-five revolution. Drug Discovery Today: Technologies. 1 (4), 337-341 (2004).
- Pardridge, W. M. Blood-brain barrier delivery. Drug Discovery Today. 12 (1-2), 54-61 (2007).
- Alli, S., et al. Brainstem blood brain barrier disruption using focused ultrasound: A demonstration of feasibility and enhanced doxorubicin delivery. Journal of Controlled Release. 281, 29-41 (2018).
- Burgess, A., Hynynen, K. Noninvasive and targeted drug delivery to the brain using focused ultrasound. ACS Chemical Neuroscience. 4 (4), 519-526 (2013).
- Meng, Y., et al. Safety and efficacy of focused ultrasound induced blood-brain barrier opening, an integrative review of animal and human studies. Journal of Controlled Release. 309, 25-36 (2019).
- Darrow, D. P. Focused Ultrasound for Neuromodulation. Neurotherapeutics. 16 (1), 88-99 (2019).
- Zhou, Y. F. High intensity focused ultrasound in clinical tumor ablation. World Journal of Clinical Oncology. 2 (1), 8-27 (2011).
- O'Reilly, M. A., Hough, O., Hynynen, K. Blood-Brain Barrier Closure Time After Controlled Ultrasound-Induced Opening Is Independent of Opening Volume. Journal of Ultrasound in Medicine. 36 (3), 475-483 (2017).
- Mainprize, T., et al. Blood-Brain Barrier Opening in Primary Brain Tumors with Non-invasive MR-Guided Focused Ultrasound: A Clinical Safety and Feasibility Study. Scientific Reports. 9 (1), 321 (2019).
- Dasgupta, A., et al. Ultrasound-mediated drug delivery to the brain: principles, progress and prospects. Drug Discovery Today: Technologies. 20, 41-48 (2016).
- O'Reilly, M. A., Waspe, A. C., Chopra, R., Hynynen, K. MRI-guided disruption of the blood-brain barrier using transcranial focused ultrasound in a rat model. Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).
- McDannold, N., Vykhodtseva, N., Hynynen, K. Targeted disruption of the blood-brain barrier with focused ultrasound: association with cavitation activity. Physics in Medicine & Biology. 51 (4), 793 (2006).
- McDannold, N., Vykhodtseva, N., Hynynen, K. Blood-brain barrier disruption induced by focused ultrasound and circulating preformed microbubbles appears to be characterized by the mechanical index. Ultrasound in Medicine and Biology. 34 (5), 834-840 (2008).
- Sun, T., et al. Closed-loop control of targeted ultrasound drug delivery across the blood-brain/tumor barriers in a rat glioma model. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (48), 10281-10290 (2017).
- Lipsman, N., et al. Blood-brain barrier opening in Alzheimer's disease using MR-guided focused ultrasound. Nature Communications. 9 (1), 2336 (2018).
- Carpentier, A., et al. Clinical trial of blood-brain barrier disruption by pulsed ultrasound. Science Translational Medicine. 8 (343), 342 (2016).
- Chopra, R., Curiel, L., Staruch, R., Morrison, L., Hynynen, K. An MRI-compatible system for focused ultrasound experiments in small animal models. Medical Physics. 36 (5), 1867-1874 (2009).
- Kinoshita, M., McDannold, N., Jolesz, F. A., Hynynen, K. Targeted delivery of antibodies through the blood–brain barrier by MRI-guided focused ultrasound. Biochemical and Biophysical Research Communications. 340 (4), 1085-1090 (2006).
- Larrat, B., et al. MR-guided transcranial brain HIFU in small animal models. Physics in Medicine & Biology. 55 (2), 365 (2009).
- Contag, C. H., Jenkins, D., Contag, P. R., Negrin, R. S. Use of reporter genes for optical measurements of neoplastic disease in vivo. Neoplasia. 2 (1-2), New York, NY. 41 (2000).
- Choi, J. J., Pernot, M., Small, S. A., Konofagou, E. E. Noninvasive, transcranial and localized opening of the blood-brain barrier using focused ultrasound in mice. Ultrasound in Medicine & Biology. 33 (1), 95-104 (2007).
- Bing, C., et al. Trans-cranial opening of the blood-brain barrier in targeted regions using astereotaxic brain atlas and focused ultrasound energy. Journal of Therapeutic Ultrasound. 2 (1), 13 (2014).
- Marquet, F., et al. Real-time, transcranial monitoring of safe blood-brain barrier opening in non-human primates. PloS One. 9 (2), (2014).
- Anastasiadis, P., et al. characterization and evaluation of a laser-guided focused ultrasound system for preclinical investigations. Biomedical Engineering Online. 18 (1), 36 (2019).
- Liu, H. L., Pan, C. H., Ting, C. Y., Hsiao, M. J. Opening of the blood-brain barrier by low-frequency (28-kHz) ultrasound: a novel pinhole-assisted mechanical scanning device. Ultrasound in Medicine & Biology. 36 (2), 325-335 (2010).
- Zhu, L., et al. Focused ultrasound-enabled brain tumor liquid biopsy. Scientific Reports. 8 (1), 1-9 (2018).
- Bader, K. B., Holland, C. K. Gauging the likelihood of stable cavitation from ultrasound contrast agents. Physics in Medicine & Biology. 58 (1), 127 (2012).
- Neppiras, E. Acoustic cavitation series: part one: Acoustic cavitation: an introduction. Ultrasonics. 22 (1), 25-28 (1984).
- Aryal, M., Arvanitis, C. D., Alexander, P. M., McDannold, N. Ultrasound-mediated blood-brain barrier disruption for targeted drug delivery in the central nervous system. Advanced Drug Delivery Reviews. 72, 94-109 (2014).
- Tung, Y. S., Choi, J. J., Baseri, B., Konofagou, E. E. Identifying the inertial cavitation threshold and skull effects in a vessel phantom using focused ultrasound and microbubbles. Ultrasound in Medicine & Biology. 36 (5), 840-852 (2010).
- Arvanitis, C. D., Livingstone, M. S., Vykhodtseva, N., McDannold, N. Controlled ultrasound-induced blood-brain barrier disruption using passive acoustic emissions monitoring. PloS One. 7 (9), (2012).
- Tsai, C. H., Zhang, J. W., Liao, Y. Y., Liu, H. L. Real-time monitoring of focused ultrasound blood-brain barrier opening via subharmonic acoustic emission detection: implementation of confocal dual-frequency piezoelectric transducers. Physics in Medicine & Biology. 61 (7), 2926 (2016).
- Chen, W. S., Brayman, A. A., Matula, T. J., Crum, L. A. Inertial cavitation dose and hemolysis produced in vitro with or without Optison. Ultrasound in Medicine & Biology. 29 (5), 725-737 (2003).
- Qiu, Y., et al. The correlation between acoustic cavitation and sonoporation involved in ultrasound-mediated DNA transfection with polyethylenimine (PEI) in vitro. Journal of Controlled Release. 145 (1), 40-48 (2010).
- Sun, T., Jia, N., Zhang, D., Xu, D. Ambient pressure dependence of the ultra-harmonic response from contrast microbubbles. The Journal of the Acoustical Society of America. 131 (6), 4358-4364 (2012).
- Rehemtulla, A., et al. Rapid and quantitative assessment of cancer treatment response using in vivo bioluminescence imaging. Neoplasia. 2 (6), 491-495 (2000).
- Puaux, A. L., et al. A comparison of imaging techniques to monitor tumor growth and cancer progression in living animals. International Journal of Molecular Imaging. 2011, (2011).
- Wu, S. K., et al. Characterization of different microbubbles in assisting focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening. Scientific Reports. 7, 46689 (2017).
- van den Broek, M. P., Groenendaal, F., Egberts, A. C., Rademaker, C. M. Effects of hypothermia on pharmacokinetics and pharmacodynamics. Clinical Pharmacokinetics. 49 (5), 277-294 (2010).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. Paxinos and Franklin's the mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic press. (2019).
- Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Møllgård, K., Habgood, M. D. Markers for blood-brain barrier integrity: how appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives. Frontiers in Neuroscience. 385, 385 (2015).
- Yao, L., Xue, X., Yu, P., Ni, Y., Chen, F. Evans blue dye: a revisit of its applications in biomedicine. Contrast Media & Molecular Imaging. 2018, (2018).
- Caretti, V., et al. Monitoring of tumor growth and post-irradiation recurrence in a diffuse intrinsic pontine glioma mouse model. Brain Pathology. 21 (4), 441-451 (2011).
- Yoshimura, J., Onda, K., Tanaka, R., Takahashi, H. Clinicopathological study of diffuse type brainstem gliomas: analysis of 40 autopsy cases. Neurologia Medico-Chirurgica. 43 (8), 375-382 (2003).
- Yang, F. Y., et al. Micro-SPECT/CT-based pharmacokinetic analysis of 99mTc-diethylenetriaminepentaacetic acid in rats with blood-brain barrier disruption induced by focused ultrasound. Journal of Nuclear Medicine. 52 (3), 478-484 (2011).
- Sirsi, S., Borden, M. Microbubble compositions, properties and biomedical applications. Bubble Science, Engineering & Technology. 1 (1-2), 3-17 (2009).
- Greis, C. Technology overview: SonoVue. European Radiology. 14, Bracco, Milan. 11-15 (2004).
- Schneider, M. Characteristics of sonovue. Echocardiography. 16, 743-746 (1999).
- Talu, E., Powell, R. L., Longo, M. L., Dayton, P. A. Needle size and injection rate impact microbubble contrast agent population. Ultrasound in Medicine & Biology. 34 (7), 1182-1185 (2008).
- Pinton, G., et al. Attenuation, scattering, and absorption of ultrasound in the skull bone. Medical Physics. 39 (1), 299-307 (2012).
- Constantinides, C., Mean, R., Janssen, B. J. Effects of isoflurane anesthesia on the cardiovascular function of the C57BL/6 mouse. ILAR journal/National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 52, 21 (2011).
- McDannold, N., Zhang, Y., Vykhodtseva, N. The effects of oxygen on ultrasound-induced blood-brain barrier disruption in mice. Ultrasound in Medicine & Biology. 43 (2), 469-475 (2017).
- McDannold, N., Zhang, Y., Vykhodtseva, N. Blood-brain barrier disruption and vascular damage induced by ultrasound bursts combined with microbubbles can be influenced by choice of anesthesia protocol. Ultrasound in Medicine and Biology. 37 (8), 1259-1270 (2011).
