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Neuroscience

कृंतक में रक्त-मस्तिष्क बाधा खोलने के लिए एक उच्च-थ्रूपुट इमेज-गाइडेड स्टीरियोअैक्टिक न्यूरोनैविगेशन और केंद्रित अल्ट्रासाउंड सिस्टम

Published: July 16, 2020 doi: 10.3791/61269
Automatic Translation
*1,2, *2, 2, 3, 1,2, 2, 1,2, 1,2, 3
1Amsterdam UMC, Vrije Universiteit Amsterdam, Pediatric Oncology, Cancer Center Amsterdam, 2Princess Máxima Center for Pediatric Oncology, 3Imaging Division, Utrecht University
* These authors contributed equally

Summary

रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) को अस्थायी रूप से माइक्रोबबल-मध्यस्थता केंद्रित अल्ट्रासाउंड (FUS) के साथ बाधित किया जा सकता है। यहां, हम गैर-अल्ट्रासाउंड विशेषज्ञों के लिए सुलभ मॉड्यूलर FUS सिस्टम का उपयोग करके वीवो में उच्च-थ्रूपुट बीबीबी खोलने के लिए एक कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।

Abstract

मस्तिष्क की विभिन्न बीमारियों के इलाज में ब्लड-ब्रेन बैरियर (बीबीबी) एक बड़ी बाधा रही है। तंग जंक्शनों से जुड़े एंडोथेलियल कोशिकाएं, बड़े अणुओं (>500 डीए) को मस्तिष्क के ऊतकों में प्रवेश करने से रोकने के लिए एक शारीरिक बाधा बनाती हैं। माइक्रोबबल-मध्यस्थता केंद्रित अल्ट्रासाउंड (FUS) का उपयोग क्षणिक स्थानीय बीबीबी खोलने को प्रेरित करने के लिए किया जा सकता है, जिससे बड़ी दवाओं को मस्तिष्क परेन्चिमा में प्रवेश करने की अनुमति मिल सकती है।

नैदानिक अनुवाद के लिए बड़े पैमाने पर नैदानिक उपकरणों के अलावा, दवा उम्मीदवारों के चिकित्सा प्रतिक्रिया मूल्यांकन के लिए प्रीक्लिनिकल अनुसंधान लक्षित बीबीबी खोलने के लिए समर्पित छोटे पशु अल्ट्रासाउंड सेटअप की आवश्यकता होती है। अधिमानतः, ये प्रणालियां उच्च-स्थानिक परिशुद्धता के साथ-साथ एकीकृत कैविटेशन मॉनिटरिंग दोनों के साथ उच्च-थ्रूपुट वर्कफ्लो की अनुमति देती हैं, जबकि अभी भी प्रारंभिक निवेश और रनिंग लागत दोनों में लागत प्रभावी है।

यहां, हम एक बायोल्यूमिनेसेंस और एक्स-रे निर्देशित स्टीरियोटाैक्टिक छोटे पशु FUS प्रणाली प्रस्तुत करते हैं जो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध घटकों पर आधारित है और उपरोक्त आवश्यकताओं को पूरा करता है। उच्च मात्रा वाले प्रीक्लिनिकल दवा मूल्यांकन अध्ययनों में आम तौर पर सामने आने वाली चुनौतियों को सुविधाजनक बनाने वाले स्वचालन के उच्च स्तर पर एक विशेष जोर दिया गया है। इन चुनौतियों के उदाहरण डेटा प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करने, अंतर-समूह परिवर्तनशीलता को कम करने, नमूना आकार को कम करने और इस प्रकार नैतिक आवश्यकताओं का अनुपालन करने और अनावश्यक कार्यभार को कम करने के लिए मानकीकरण की आवश्यकता है । प्रस्तावित बीबीबी प्रणाली को बीबीबी खोलने के दायरे में मान्य किया गया है, जो ग्लियोब्लास्टोमा मल्टीफोर्म और डिफ्यूज मिडलाइन ग्लियोमा के रोगी-व्युत्पन्न ज़ेनोबेड़ा मॉडल पर दवा वितरण परीक्षणों की सुविधा प्रदान करता है।

Introduction

ब्लड-ब्रेन बैरियर (बीबीबी) ब्रेन पैरेन्चिमा में दवा वितरण के लिए एक बड़ी बाधा है। अधिकांश चिकित्सीय दवाएं जो विकसित की गई हैं, वे अपने भौतिक रसायन मापदंडों (जैसे, लिपोफिलिटी, आणविक वजन, हाइड्रोजन बॉन्ड स्वीकारकर्ताओं और दानदाताओं) के कारण बीबीबी को पार नहीं करती हैं या मस्तिष्क1,2में एफ्लक्स ट्रांसपोर्टरों के लिए उनकी आत्मीयता के कारण नहीं रखी जाती हैं। दवाओं का छोटा समूह जो बीबीबी को पार कर सकता है, आम तौर पर छोटे लिपोफिलिक अणु होते हैं, जो केवल सीमित संख्या में मस्तिष्क रोगों में प्रभावी होते हैं1,2। नतीजतन, मस्तिष्क रोगों के बहुमत के लिए, औषधीय उपचार विकल्प सीमित हैं और नई दवा वितरण रणनीतियों की आवश्यकता है3,4।

चिकित्सीय अल्ट्रासाउंड एक उभरती हुई तकनीक है जिसका उपयोग बीबीबी व्यवधान (बीबीबीडी), न्यूरोमोडुलेशन और एब्लेशन4,5,6,7जैसे विभिन्न न्यूरोलॉजिकल अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है। आदेश में कपाल के माध्यम से एक असाधारण अल्ट्रासाउंड उत्सर्जक के साथ एक BBB खोलने को प्राप्त करने के लिए, केंद्रित अल्ट्रासाउंड (FUS) माइक्रोबबल के साथ संयुक्त है । माइक्रोबबल-मध्यस्थता वाले फ्यूस के परिणामस्वरूप मस्तिष्कपरेन्चिमा5,8,9में दवाओं की जैव उपलब्धता में वृद्धि होती है। ध्वनि तरंगों की उपस्थिति में, माइक्रोबबल्स ट्रांससाइटोसिस शुरू करने और बीबीबी की एंडोथेलियल कोशिकाओं के बीच तंग जंक्शनों के व्यवधान को दोलन करना शुरू कर देते हैं, जिससे बड़े अणुओं के पैरासेलुलर परिवहन को सक्षम किया जाता है10। पिछले अध्ययनों में ध्वनिक उत्सर्जन की तीव्रता और बीबीबी खोलने11 , 12, 13,14पर जैविक प्रभावकेबीच संबंध की पुष्टि हुई . माइक्रोबबल्स के संयोजन में फ्यूज का उपयोग पहले से ही कीमोजोलोमाइड या लिपोसोमल डॉक्सोरुबिसिन का उपयोग करके कीमोजोज़लैस्टिक एजेंट के रूप में, या अल्जाइमर रोग और एमियोट्रोफिक पार्श्व स्क्लेरोसिस5,9,15,16की चिकित्सा के लिए नैदानिक परीक्षणों में किया जा चुका है।

चूंकि अल्ट्रासाउंड मध्यस्थता BBB फार्माकोथेरेपी के लिए पूरी तरह से नई संभावनाओं में खोलने के परिणाम, नैदानिक अनुवाद के लिए पूर्व नैदानिक अनुसंधान चयनित दवा उंमीदवारों की चिकित्सा प्रतिक्रिया का आकलन करने की जरूरत है । इसके लिए आमतौर पर उच्च-स्थानिक परिशुद्धता के साथ एक उच्च-थ्रूपुट वर्कफ्लो की आवश्यकता होती है और अधिमानतः उच्च प्रजनन क्षमता के साथ लक्षित बीबीबी खोलने की निगरानी के लिए एक एकीकृत कैविटेशन डिटेक्शन की आवश्यकता होती है। यदि संभव हो तो, इन प्रणालियों के लिए दोनों प्रारंभिक निवेश और चल लागत में लागत प्रभावी होने की जरूरत है ताकि अध्ययन के आकार के अनुसार स्केलेबल हो । अधिकांश प्रीक्लिनिकल फ्यूस सिस्टम को एमआरआई के साथ छवि-मार्गदर्शन और उपचार योजना15, 17,18, 19केलिए जोड़ाजाताहै। हालांकि एमआरआई ट्यूमर शरीर रचना विज्ञान और मात्रा के बारे में विस्तृत जानकारी देता है, यह एक महंगी तकनीक है, जो आम तौर पर प्रशिक्षित/कुशल ऑपरेटरों द्वारा किया जाता है । इसके अलावा, उच्च संकल्प एमआरआई हमेशा पूर्व नैदानिक सुविधाओं में शोधकर्ताओं के लिए उपलब्ध नहीं हो सकता है और पशु प्रति लंबी स्कैनिंग समय की आवश्यकता है, यह कम उच्च थ्रूपुट औषधीय अध्ययन के लिए उपयुक्त बना रही है । उल्लेखनीय है कि, न्यूरो-ऑन्कोलॉजी के क्षेत्र में प्रीक्लिनिकल शोध के लिए, विशेष रूप से घुसपैठ ट्यूमर मॉडल में, ट्यूमर की कल्पना और लक्ष्य करने की संभावना उपचार सफलता20के लिए आवश्यक है। वर्तमान में, यह आवश्यकता केवल एमआरआई द्वारा या फोटोप्रोटीन के साथ ट्रांसड्यूस किए गए ट्यूमर द्वारा पूरी की जाती है, जो फोटोप्रोटीन सब्सट्रेट के प्रशासन के संयोजन में बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग (ब्ली) के साथ दृश्य को सक्षम करती है।

एमआरआई निर्देशित FUS सिस्टम अक्सर ट्रांसक्रैनियल अनुप्रयोगों के लिए अल्ट्रासाउंड तरंग प्रचार सुनिश्चित करने के लिए पानी के स्नान का उपयोग करते हैं, जिससे जानवर का सिर आंशिक रूप से पानी में डूबा हुआ है, तथाकथित 'बॉटम-अप' सिस्टम15,17,18। जबकि ये डिजाइन आम तौर पर छोटे पशु अध्ययनों में अच्छी तरह से काम करते हैं, वे उपयोग के दौरान पशु तैयारी के समय, पोर्टेबिलिटी और वास्तविक रखरखाव योग्य स्वच्छ मानकों के बीच समझौता करते हैं। एमआरआई के विकल्प के रूप में, स्टीरियोटैक्टिक नेविगेशन के लिए अन्य मार्गदर्शन विधियों में कृंतक शारीरिक एटलस21,22,23,लेजर पॉइंटर असिस्टेड विजुअल साइटिंग24,पिनहोल-असिस्टेड मैकेनिकल स्कैनिंग डिवाइस25,या ब्ली26का उपयोग शामिल है। इनमें से अधिकांश डिजाइन "टॉप-डाउन" सिस्टम हैं जिसमें ट्रांसड्यूसर को जानवर के सिर के शीर्ष पर रखा जाता है, जिसमें जानवर प्राकृतिक स्थिति में होता है। 'ऊपर-नीचे' कार्यप्रवाह में या तो जल स्नान22, 25,26 या पानी से भरे शंकु21, 24होते हैं। एक बंद शंकु के अंदर एक ट्रांसड्यूसर का उपयोग करने का लाभ अधिक कॉम्पैक्ट पदचिह्न, छोटे सेटअप समय और सीधे-आगे विसंदूषण संभावनाएं पूरे कार्यप्रवाह को सरल बनाने के लिए है।

माइक्रोबबल्स के साथ ध्वनिक क्षेत्र की बातचीत दबाव निर्भर है और कम आयाम दोलनों (जिसे स्थिर कैविटेशन के रूप में संदर्भित) से क्षणिक बुलबुला पतन (जड़त्वीय कैविटेशन के रूप में संदर्भित)27, 28से होती है। एक स्थापित आम सहमति है कि अल्ट्रासाउंड-बीबीबीडी को सफल बीबीबीडी प्राप्त करने के लिए स्थिर कैविटेशन सीमा से ऊपर एक ध्वनिक दबाव की आवश्यकता होती है, लेकिन जड़त्वीय कैविटेशन दहलीज से नीचे, जो आम तौर पर संवहनी/न्यूरोनल क्षति29से जुड़ा होता है । निगरानी और नियंत्रण का सबसे आम रूप निष्क्रिय कैविटेशन डिटेक्शन (पीसीडी) का उपयोग करके (बैक-) बिखरे हुए ध्वनिक संकेत का विश्लेषण है, जैसा कि मैकडानल्ड एट अल12द्वारा सुझाया गया है। पीसीडी माइक्रोबबल उत्सर्जन संकेतों के फोरियर स्पेक्ट्रा के विश्लेषण पर निर्भर करता है, जिसमें स्थिर कैविटेशन हॉलमार्क (हार्मोनिक्स, सबहर्मोनिक्स, और अल्ट्राहारमोनिक्स) और जड़त्वीय कैविटेशन मार्कर (ब्रॉडबैंड प्रतिक्रिया) की ताकत और उपस्थिति को वास्तविक समय में मापा जा सकता है।

एक "एक आकार सभी फिट बैठता है" पीसीडी-सटीक दबाव नियंत्रण के लिए पीसीडी-विश्लेषण माइक्रोबबल फॉर्मूलेशन (दोलन आयाम बुलबुले व्यास पर दृढ़ता से निर्भर करता है), ब्रांडों के बीच बुलबुला खोल गुणों में अंतर, और ध्वनिक दोलन, जो आवृत्ति औरदबाव30, 31,32पर दृढ़ता से निर्भर करता हैकीबहुविषरी के कारण जटिल है। नतीजतन, कई अलग-अलग पीसीडी डिटेक्शन प्रोटोकॉल का सुझाव दिया गया है, जिन्हें इन सभी मापदंडों के विशेष संयोजनों के अनुकूल बनाया गया है और विभिन्न अनुप्रयोग परिदृश्यों (नैदानिक उपयोग के लिए छोटे पशु प्रोटोकॉल से लेकर पीसीडी तक) में उपयोग किया गया है) मजबूत कैविटेशन डिटेक्शन के लिए और यहां तककि दबाव11,14,30,31,32,33,34,3, 35 केपूर्वव्यापी प्रतिक्रिया नियंत्रण के लिए। इस अध्ययन के दायरे में नियोजित पीसीडी प्रोटोकॉल सीधे मैकडोनॉल्ड एट अल12 से लिया गया है और जड़त्वीय कैविटेशन डिटेक्शन के लिए स्थिर कैविटेशन और ब्रॉडबैंड शोर की उपस्थिति के लिए हार्मोनिक उत्सर्जन पर नजर रखता है।

हमने मस्तिष्क परेंचिमा में दवा वितरण बढ़ाने के लिए बीबीबी के क्षणिक उद्घाटन के लिए एक छवि-निर्देशित न्यूरोनैवेंशन फ्यूज सिस्टम विकसित किया है। यह प्रणाली वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध घटकों पर आधारित है और पशु सुविधा में उपलब्ध इमेजिंग तकनीकों के आधार पर कई अलग-अलग इमेजिंग तौर-तरीकों के लिए आसानी से अनुकूलित की जा सकती है। चूंकि हमें एक उच्च-थ्रूपुट वर्कफ्लो की आवश्यकता होती है, इसलिए हमने छवि-मार्गदर्शन और उपचार योजना के लिए एक्स-रे और ब्ली का उपयोग करने का विकल्प चुना है। एक फोटोप्रोटीन (जैसे, लूसिफ़ेरेस) के साथ स्थानांतरित ट्यूमर कोशिकाएं ब्ली इमेजिंग20के लिए उपयुक्त हैं। फोटोप्रोटीन सब्सट्रेट के प्रशासन के बाद, ट्यूमर कोशिकाओं को वीवो में निगरानी की जा सकती है और ट्यूमर विकास और स्थान20,36निर्धारित किया जा सकता है। BLI एक कम लागत इमेजिंग मोडलिटी है, यह समय के साथ ट्यूमर के विकास का पालन करने में सक्षम बनाता है, इसमें तेजी से स्कैनिंग समय होता है और यह एमआरआई36, 37के साथ मापा गया ट्यूमर विकास के साथ अच्छीतरहसे संबंधित है। हमने पानी के स्नान को ट्रांसड्यूसर से जुड़े पानी से भरे शंकु से बदलने का विकल्प चुना है ताकि लचीलापन उस मंच को स्वतंत्र रूप से स्थानांतरित कर सके जिस पर कृंतक8,24पर चढ़कर है। डिजाइन एक्स-रे और ऑप्टिकल-इमेज अनुकूलता (III) रैपिड-अलग संज्ञाहरण मुखौटा, और (IV) एकीकृत तापमान विनियमित पशु हीटिंग सिस्टम के साथ (I) छोटे-पशु स्टीरियोटैक्टिक प्लेटफॉर्म (II) प्रत्ययी मार्कर के एकीकरण से लैस एक अलग मंच पर आधारित है। संज्ञाहरण के प्रारंभिक प्रेरण के बाद, जानवर को मंच पर एक सटीक स्थिति में रखा जाता है जहां यह पूरी प्रक्रिया के दौरान रहता है। नतीजतन, एक सटीक और प्रजनन योग्य स्थिति और निरंतर संज्ञाहरण को बनाए रखते हुए, पूरे मंच पूरे हस्तक्षेप के कार्यप्रवाह के सभी स्टेशनों से गुजरता है। नियंत्रण सॉफ्टवेयर प्रत्ययी मार्कर का स्वचालित पता लगाने की अनुमति देता है और स्वचालित रूप से सभी प्रकार की छवियों और छवि के तौर-तरीकों (यानी, माइक्रो-सीटी, एक्स-रे, ब्ली और फ्लोरेसेंस इमेजिंग) को स्टीरियोटैक्टिक प्लेटफॉर्म के संदर्भ के फ्रेम में पंजीकृत करता है। एक स्वचालित अंशांकन प्रक्रिया की मदद से, अल्ट्रासाउंड ट्रांसड्यूसर की फोकल लंबाई ठीक भीतर जाना जाता है, जो इंटरवेंशनल प्लानिंग, ध्वनिक वितरण और अनुवर्ती इमेजिंग विश्लेषण के स्वचालित संलयन को सक्षम बनाता है। जैसा कि चित्रा 1 और चित्रा 2 में दिखाया गया है, यह सेटअप समर्पित प्रयोगात्मक कार्यप्रवाहों को डिजाइन करने के लिए उच्च स्तर का लचीलापन प्रदान करता है और विभिन्न स्टेशनों पर जानवर की इंटरलीव्ड हैंडलिंग की अनुमति देताहै, जो बदले में उच्च-थ्रूपुट प्रयोगों की सुविधा प्रदान करता है। हमने इस तकनीक का उपयोग उच्च ग्रेड ग्लियोमा जैसे डिफ्यूज मिडलाइन ग्लियोमा के माउस ज़ेनोग्रॉफ्ट्स में सफल दवा वितरण के लिए किया है।

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Protocol

वीवो प्रयोगों में सभी डच नैतिक समिति (लाइसेंस परमिट संख्या AVD114002017841) और नीदरलैंड के व्रिजे यूनीवर्सिट एम्स्टर्डम के पशु कल्याण निकाय द्वारा अनुमोदित किए गए थे। जांचकर्ताओं को जानवरों की परेशानी को कम करने के लिए FUS सिस्टम की मूल बातें में प्रशिक्षित किया गया था ।

1. फोकस्ड अल्ट्रासाउंड सिस्टम

नोट: वर्णित सेटअप वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध घटकों के आधार पर एक इनहाउस निर्मित बीबीबी व्यवधान प्रणाली है और इसमें 3डी-मुद्रित कस्टम-निर्मित शंकु और अलग करने योग्य स्टीरियोटैक्टिक प्लेटफॉर्म शामिल है। सिस्टम मॉड्यूलर बनाया गया है, जो उपलब्ध उपकरणों और विशिष्ट उपयोग के अनुसार संशोधनों की सुविधा प्रदान करता है। प्रोटोकॉल माउस मस्तिष्क के पोंटाइन क्षेत्र में एक बड़े क्षेत्र के सोनोपोरेशन के लिए प्रक्रिया का वर्णन करता है। लक्ष्य स्थान को समायोजित करके, मस्तिष्क के विभिन्न हिस्सों को लक्षित किया जा सकता है। इस अध्ययन में 75 मिमी की फोकल लंबाई के साथ 1 मेगाहर्ट्ज मोनो-एलिमेंट ट्रांसड्यूसर, 60 मिमी का अपर्चर और 1.5 x 1.5 x 5 मिमी (पीक प्रेशर का एफडब्ल्यूएचएम) का एक फोकल क्षेत्र का उपयोग किया गया था। ट्रांसड्यूसर का फोकल प्लेन कान की सलाखों के साथ एक दूसरे के साथ क्षैतिज विमान में जानवर के कपाल के माध्यम से तैनात है।

  1. कृंतक में बीबीबी खोलने के लिए एक उपयुक्त ट्रांसड्यूसर का चयन करें।
    नोट: माइक्रोबबल और नियोजित आवृत्ति के गुणों के आधार पर, ध्वनिक सेटिंग्स, विशेष रूप से यांत्रिक सूचकांक (एमआई)13, 38को बदलने के अधीन हैं।
  2. ट्रांसड्यूसर को 3डी प्रिंटेड कोन में रखें।
  3. बीम प्रचार पथ के ध्वनिक युग्मन को प्राप्त करने के लिए शंकु के नीचे-अंत में एक ध्वनिक रूप से पारदर्शी माइलर झिल्ली को नियोजित करें, और शंकु को डगैस किए गए पानी से भरें।
  4. एक मोटराइज्ड रैखिक चरण पर जानवर के ऊपर ट्रांसड्यूसर माउंट करें जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है जिससे ट्रांसड्यूसर की स्वचालित ऊर्ध्वाधर स्थिति की अनुमति दी जाती है।
  5. अध्ययन की आवश्यकताओं के आधार पर एक अलग करने योग्य स्टीरियोटैक्टिक प्लेटफॉर्म डिजाइन करें, जिसमें तापमान विनियमित हीटिंग, काटने और कान की सलाखों, संज्ञाहरण और बहु-मोडलिटी प्रत्यूषक मार्कर शामिल हैं, जैसा कि चित्र 1 और चित्रा 2में दिखाया गया है। स्टीरियोटैक्टिक प्लेटफॉर्म के बढ़ते में 2डी रैखिक स्टेज सिस्टम होता है, जो बीम के नीचे जानवर की सटीक स्वचालित स्थिति (< 0.1 मिमी) की अनुमति देता है।
  6. एक ट्रांसड्यूसर, एक फ़ंक्शन जनरेटर और एक पावर एम्पलीफायर से मिलकर चित्र 1 में दिखाए गए ध्वनिक उत्सर्जन श्रृंखला से ट्रांसड्यूसर को कनेक्ट करें।
  7. बहु-मोडलिटी प्रत्ययी मार्कर का पता लगाने के लिए एक छवि-प्रसंस्करण पाइपलाइन ईजाद करें जो सुई हाइड्रोफोन द्वारा पता लगाया गया कैविटेशन डेटा के ब्याज और संग्रह के मस्तिष्क क्षेत्र के सटीक सोनोपोरेशन को लक्षित करने की अनुमति देता है।
  8. सिस्टम को कैलिब्रेट करें और स्टीरियोटैक्टिक प्लेटफॉर्म पर जानवर की ऊर्ध्वाधर स्थिति के लिए पत्राचार में ट्रांसड्यूसर के फोकस बिंदु का निर्धारण करें।

2. पशु तैयारी

नोट: निम्नलिखित प्रोटोकॉल चूहों के लिए निर्दिष्ट है, लेकिन चूहों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इन प्रयोगों के लिए महिला एथिमिक न्यूड फॉक्सएन1-/-चूहों (6-8 सप्ताह पुराने) का उपयोग किया गया था।

  1. जानवर को पशु सुविधा में कम से कम एक सप्ताह के लिए अनुकूलित करने की अनुमति दें और जानवर को नियमित रूप से तौलें।
  2. एनाल्जेसिक उपचार शुरू करने के लिए FUS उपचार से 30 मिनट पहले चमड़े के नीचे (एस.c.) इंजेक्शन के माध्यम से buprenorphine (0.05 मिलीग्राम/किलो) प्रशासन।
  3. 3% आइसोफ्लुरेन, 2 एल/मिनओ 2 के साथ जानवर को एनेस्थेटाइज करें और सत्यापित करें कि जानवर गहराई से एनेस्थेटाइज्ड है। पूरी प्रक्रिया के दौरान जानवरों को एनेस्थेटाइज्ड रखें और आवश्यकतानुसार आइसोफ्लुएरन की एकाग्रता को समायोजित करने के लिए श्वास आवृत्ति और हृदय गति की निगरानी करें।
  4. सूखी आंखों को रोकने और संभावित चोट से बचने के लिए आंखों का मरहम लगाएं।
  5. सिर के शीर्ष पर बालों को रेजर और डिपिलेटरी क्रीम से हटाएं और त्वचा में जलन से बचने के लिए किसी भी अवशेष को हटाने के लिए पानी से बाद में धोएं।
  6. BLI ट्यूमर मॉडल के साथ प्रयोगों के लिए, BLI छवि-मार्गदर्शन के लिए एक 29 जी इंसुलिन सिरिंज के साथ डी-लूसिफ़ेरिन (30 मिलीग्राम/एमएल) इंट्रापेरिटोनियल (ऊबना) के १५० μL इंजेक्ट ।
  7. एक 26-30 जी पूंछ नस कैथेटर डालें और हेपरिन समाधान (5 UI/mL) की एक छोटी मात्रा के साथ कैथेटर और नस फ्लश । खून के थक्के से बचने के लिए कैथेटर को हेपरिन घोल से भरें।
    नोट: कैथेटर में रक्त का एक भाटा होने पर अच्छा कैथेटरीकरण देखा जाता है। एम्बोली को रोकने के लिए कैथेटर में हवा के बुलबुले से बचें। अत्यधिक इंजेक्शन दबाव से बचने के लिए, सुनिश्चित करें कि कैथेटर की लंबाई जितना संभव हो उतना कम है।
  8. हाइपोथर्मिया से बचने के लिए जानवर को तापमान विनियमित स्टीरियोटाैक्टिक प्लेटफॉर्म पर रखें।
    नोट: हाइपोथर्मिया रक्त परिसंचरण को कम करता है, जो माइक्रोबबल्स के इंजेक्शन/परिसंचरण और दवाओं के फार्माकोकिनेटिक्स को प्रभावित कर सकता है३९।
  9. कान की सलाखों और काटने की पट्टी का उपयोग करके स्टीरियोटिक प्लेटफॉर्म पर जानवर के सिर को स्थिर और ठीक करें। शरीर को एक पट्टा के साथ उतारें और जानवर की पूंछ को मंच पर टेप करें।

3. वीवो छवि निर्देशित केंद्रित अल्ट्रासाउंड में

नोट: इस प्रोटोकॉल के लिए 1 मेगाहर्ट्ज मोनो-एलिमेंट ट्रांसड्यूसर जिसमें 10 एमएस अवधि, 0.4 की एमआई और 1.6 हर्ट्ज की पल्स रिपीटेशन फ्रीक्वेंसी के साथ 240 एस के लिए 40 चक्रों के साथ टोन-बर्स्ट पल्स का इस्तेमाल किया गया था। प्रोटोकॉल को एक अहानिकर गैस के रूप में सल्फर हेक्साफ्लोराइड (एस एफ6)युक्त फॉस्फोलिपिड्स द्वारा स्थिर माइक्रोबबल्स के लिए अनुकूलित किया गया है, जिससे मतलब बुलबुला व्यास 2.5 माइक्रोन है और 90% से अधिक बुलबुले 8 माइक्रोन से छोटे हैं।

  1. इमेजिंग मोडलिट्यूल(जैसे, ब्ली या एक्स-रे) में घुड़सवार जानवर के साथ स्टीरियोटायिक प्लेटफॉर्म रखें और जानवर की इमेज (एस) लें।
  2. ट्रांसड्यूसर के फोकस पॉइंट के अनुसार जानवर की स्थिति को चिह्नित करने के लिए छवि-प्रसंस्करण पाइपलाइन के साथ संयोजन में बहु-मोडलिटी प्रत्यूषक मार्कर का उपयोग करें।
  3. अधिग्रहीत एक्स-रे छवि पर एक मस्तिष्क रूपरेखा रखकर या ट्यूमर के केंद्र(चित्रा 2)का निर्धारण करने के लिए BLI छवियों का उपयोग करके लक्ष्य क्षेत्र का निर्धारण करें। मस्तिष्क के विशिष्ट भागों की स्थिति पैक्सिनोस ब्रेन एटलस40 में खोपड़ी के निशान ब्रेग्मा और लैम्ब्डा का उपयोग करते हुए संदर्भ बिंदुओं के रूप में निर्दिष्ट की गई है। उदाहरण के लिए पोन लैम्ब्डा से एक्स =-1.0, वाई =-0.8 और z=-4.5 स्थित है।
  4. अल्ट्रासाउंड जेल को सांस लेने में हस्तक्षेप करने से रोकने के लिए चिपकने वाले टेप के साथ जानवर के नथुने और मुंह को ढाल दें।
  5. जानवर के सिर के ऊपर अल्ट्रासाउंड जेल लगाएं।
  6. जानवरों की गर्दन की त्वचा को वापस लें, अल्ट्रासाउंड जेल के साथ सुई हाइड्रोफोन को चिकनाई करें और सुई हाइड्रोफोन को ऑक्सीपिटल हड्डी के सीधे आसपास रखें।
  7. इमेज-प्रोसेसिंग पाइपलाइन और फोकस पॉइंट का उपयोग करके ट्रांसड्यूसर को सही स्थिति में गाइड करें।
  8. सभी संलग्न उपकरणों के लिए पूर्वअं्फिगर सेटिंग्स लागू करें और ब्याज के मस्तिष्क क्षेत्र को लक्षित करें।
    नोट: अनुसंधान प्रश्न के आधार पर, ट्यूमर या मस्तिष्क क्षेत्रों को एक ही केंद्र बिंदु के रूप में या वॉल्यूमेट्रिक आकार के रूप में सोनोपोरेटेड किया जा सकता है,जैसा कि चित्र 2 में दिखाया गया है।
  9. निर्माता द्वारा वर्णित माइक्रोबबल्स को सक्रिय करें। माइक्रोबबल्स के 120 माइक्रोन (5.4 माइक्रोग्राम) के एक बोलस इंजेक्ट करें।
  10. कैथेटर के उद्घाटन की जांच करने के लिए खारा के साथ पूंछ नस कैथेटर फ्लश।
  11. माइक्रोबबल्स इंजेक्ट करें और इनसोनेशन शुरू करें।
  12. सुई हाइड्रोफोन के साथ रिकॉर्ड माइक्रोबबल कैविटेशन।
  13. सोनोपोरेशन के बाद एक इंट्रावैस्कुलर कंट्रास्ट एजेंट या दवा का प्रशासन करें। खुराक, समय और योजना अध्ययन और दवा के उद्देश्य पर निर्भर हैं।
    नोट: इवांस ब्लू BBB खोलने४१का आकलन करने के लिए एक आम रंग एजेंट है ।
  14. पूर्व निर्धारित समय बिंदु तक या मानवीय अंत बिंदु से पहले जानवर की निगरानी करें।

4. माइक्रोबबल कैविटेशन का विश्लेषण

नोट: यहां लागू प्रक्रिया का वर्णन किया गया है, जो एस एफ6के लिए वीवो प्रयोग में उपयुक्त है -फॉस्फोलिपिड माइक्रोबबल्स के औसत व्यास के साथ 2.5 माइक्रोन (8 माइक्रोन से नीचे के बुलबुले का 80%) 1 मेगाहर्ट्ज की आवृत्ति पर 10 एमएस अवधि के फट-टोन पल्स के साथ उत्साहित है, जैसा कि मूल रूप से मैकएनओल्ड एट अल122द्वारा सुझाया गया है।

  1. फोरियर- रिकॉर्ड किए गए पीसीडी सिग्नल को टाइम-डोमेन से फ्रीक्वेंसी डोमेन में बदलें।
  2. 2 और3 हार्मोनिक (± 50 किलोहर्ट्ज) के आसपास स्थिर कैविटेशन डिटेक्शन के लिए परिणामी स्पेक्ट्रल पावर को एकीकृत करें, जैसा कि चित्र 3 (2 और 3 मेगाहर्ट्ज में ग्रीन बॉक्स) में दिखाया गया है।
  3. जड़त्वीय कैविटेशन डिटेक्शन के लिए स्पेक्ट्रल पावर को एकीकृत करें, प्रिंसिपल फ्रीक्वेंसी के बीच,2,3हार्मोनिक, 1और 2 अल्ट्राहारमोनिक और पहला उप-हार्मोनिक (± 150 किलोहर्ट्ज), जैसा कि चित्र 3 (लाल बक्से) में दिखाया गया है।
  4. पहले प्राप्त पीसीडी संकेतों के सामान्यीकरण के लिए सिद्धांत आवृत्ति (1 मेगाहर्ट्ज ± 50 किलोहर्ट्ज) के आसपास स्पेक्ट्रल पावर को एकीकृत करें।
    नोट: 1 मेगाहर्ट्जमें वीवो प्रयोगों में एस एफ 6-फॉस्फोलिपिड माइक्रोबबल्स के लिए पीसीडी सिग्नल, जड़ता कैविटेशन सेट से पहले अल्ट्राहारमोनिक्स या सबहर्मोनिक्स प्रदर्शित नहीं करता है, जैसा कि चित्र 3में दिखाया गया है ।

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Representative Results

वर्णित FUS प्रणाली(चित्रा 1 और चित्रा 2)और संबंधित कार्यप्रवाह एक १०० से अधिक जानवरों में इस्तेमाल किया गया है और दोनों स्वस्थ और ट्यूमर असर चूहों पर प्रजनन डेटा का उत्पादन किया । माइक्रोबबल बोलस इंजेक्शन के चरम क्षण में हार्मोनिक्स में रिकॉर्ड किए गए कैविटेशन और स्पेक्ट्रल घनत्व के आधार पर, प्रत्येक आवृत्ति की स्पेक्ट्रल पावर की गणना फोरियर विश्लेषण का उपयोग करके की जा सकती है जैसा कि प्रोटोकॉल के चरण 4 में समझाया गया है। माइक्रोबबल्स के संयोजन में 0.4 के एमआई के साथ ध्वनिक प्रोटोकॉल (1 मेगाहर्ट्ज, 10 एमएस पल्स अवधि) के आधार पर, 2और 3 वें हार्मोनिक्स पर सामान्यीकृत एकीकृत एकीकृत शक्ति स्पेक्ट्रम ने चित्र 3 में देखी गई एक्सटिटेशन फ्रीक्वेंसी के एकीकृत शक्ति स्पेक्ट्रम को सामान्य बनाया। इसने स्थिर कैविटेशन डिटेक्शन का एक बहुत ही संवेदनशील और विश्वसनीय साधन प्रदान किया, जब कोई माइक्रोबबल इंजेक्शन नहीं दिया गया था या 0.6 के एमआई को लागू किए जाने पर जड़त्वीय कैविटेशन का अवलोकन नहीं किया गया था। जड़ता कैविटेशन के मामले में, 25 डीबी तक के एक बढ़े हुए ब्रॉड-बैंड शोर फ्लोर के साथ-साथ अल्ट्रा-हार्मोनिक्स और सबहर्मोनिक्स की उपस्थिति का पता चला। यद्यपि 0.4 और 0.6 के एमआई के ध्वनिक दबाव के परिणामस्वरूप कोई स्थूल क्षति नहीं हुई, सूक्ष्म क्षति को 0.6 के एमआई में हिस्टोलॉजिकल रूप से प्रमाणित किया गया था, जैसा कि चित्र 4में दिखाया गया है। 0.8 के एमआई तक दबाव आयाम की एक और वृद्धि के परिणामस्वरूप बड़े जहाजों का स्थूल मस्तिष्क नकसीर और एरिथ्रोसाइट्स के अपव्यय के साथ व्यापक-प्रसार ऊतक लाइसिस हुआ। हिस्टोलॉजिकल निष्कर्ष निष्क्रिय कैविटेशन सेंसर से ध्वनिक डेटा से मेल खाते हैं, जैसा कि चित्र 3में दिखाया गया है, जो मस्तिष्क के ऊतकों के जड़त्वीय गुहा के हानिकारक गुणों की पुष्टि करता है। नतीजतन, 0.4 के एमआई को सुरक्षित दबाव आयाम के रूप में चुना गया था जो बहुत ही प्रजनन योग्य बीबीबी-उद्घाटन प्रदान करता था, जबकि जड़त्वीय कैविटेशन शासन को एक सुरक्षित मार्जिन प्रदान करता था, जैसा कि11से पहले मनाया गया था।

नसों में इवांस ब्लू को पोंटिन क्षेत्र में बीबीबी के उद्घाटन को मान्य करने के लिए इंजेक्ट किया गया था । इवांस ब्लू के मजबूत एल्बुमिन-बाइंडिंग से ६६ केडीए४२से अधिक का एक बड़ा अणु होता है । पोन और आंशिक रूप से सेरिबैलम के स्तर पर, इवांस ब्लू-संयुग्मित एल्बेमिन का अतिवरण माउस में देखा गया था जो माइक्रोबबल(चित्रा 5)के बिना माउस के विपरीत FUS और माइक्रोबबल के साथ इलाज किया गया था। यह इन-हाउस बिल्ड फ्यूज सिस्टम और वर्णित प्रोटोकॉल के साथ छवि-निर्देशित स्टीरियोटायिक नेविगेशन के आधार पर ब्याज के क्षेत्र के सटीक लक्ष्यीकरण पर जोर देता है।

Figure 1
चित्रा 1: फोकस्ड अल्ट्रासाउंड सेटअप।
(क)केंद्रित अल्ट्रासाउंड की स्थापना का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (ख)केंद्रित अल्ट्रासाउंड सेटअप की तस्वीर । सिस्टम में स्वचालित 3डी पोजिशनिंग के लिए दूसरे 2D चरण पर 1D रैखिक चरण पर एक टॉप-डाउन माउंटेड ट्रांसड्यूसर होता है। ट्रांसड्यूसर पानी से भरे बीम-कोन में बनाया गया है, जो एक ध्वनिक पारदर्शी मायलर झिल्ली के साथ नीचे बंद हो जाता है, जो जानवर के कपाल के लिए ध्वनि का संचालन करता है। ट्रांसड्यूसर एक पावर एम्पलीफायर से जुड़ा हुआ है, जो सिग्नल उत्पादन के लिए मनमाने ढंग से तरंग जनरेटर (एडब्ल्यूजी) से जुड़ा हुआ है। कैविटेशन डिटेक्शन के लिए कम शोर वाले वोल्टेज एम्पलीफायर के साथ कॉम्बिनेशन में अलग करने वाला हाइड्रोफोन का इस्तेमाल किया जाता है । हाइड्रोफोन को ऑक्सीपिटल बोन के सीधे आसपास के क्षेत्र में रखा गया है। बाहरी हाइड्रोफोन में 2 मिमी सक्रिय सतह है और अल्ट्रासाउंड जेल के साथ ध्वनिक रूप से युग्मित है। उत्तेजना नाड़ी के उच्च वोल्टेज संकेत के साथ-साथ रिकॉर्ड किए गए कैविटेशन सिग्नल दोनों को मानक 200 मेगाहर्ट्ज ऑसिलोस्कोप द्वारा डिजिटल किया जाता है और ऑन-द-फ्लाई प्रसंस्करण और वास्तविक समय नियंत्रण के लिए एक नियंत्रण कंप्यूटर (नहीं दिखाया गया) से रिले किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: फोकस्ड अल्ट्रासाउंड वर्कफ्लो।
केंद्रित अल्ट्रासाउंड प्रणाली का प्रस्तावित कार्यप्रवाह(ए)एक अलग करने योग्य स्टीरियोटैक्टिक प्लेटफॉर्म पर जानवर की प्रारंभिक स्थिति के साथ शुरू होता है, ध्वनिक युग्मन जेल (लागू पोस्ट BLI/एक्स-रे) के आवेदन पर ध्यान दें। इसके साथ ही मल्टीमॉडल इमेजिंग को टारगेट करने के लिए आयोजित किया जा सकता है। (ख)पहले एक्स-रे इमेजिंग एक संभावना है, जबकि ब्याज के एक क्षेत्र मस्तिष्क की एक रूपरेखा की मदद से लक्षित किया जा सकता है (जो बदले में माउस मस्तिष्क एटलस४०के लिए संदर्भित है, आकार और खोपड़ी की मुद्रा के लिए अनुकूलित) । (ग)वैकल्पिक रूप से, एक्स-रे अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण पर मढ़ा एक लूसिफ़ेरेस ट्रांसफेड डिफ्यूज मिडलाइन ग्लियोमा ट्यूमर की एक BLI छवि को लक्षित करने के लिए लागू किया जा सकता है । (घ)इसके बाद, स्टीरियोटैक्टिक प्लेटफॉर्म को हाइड्रोफोन और ट्रांसड्यूसर दोनों के साथ चिकित्सा की स्थिति में जानवर के साथ रखा जाता है। ट्रांसड्यूसर स्वचालित रूप से चिकित्सा की स्थिति में ड्राइव करता है और चुने हुए प्रक्षेपवक्र पोस्ट बोलस इंजेक्शन को सोनिकेट करता है। सिस्टम को उच्च-थ्रूपुट प्रयोगों के लिए अनुकूलित किया गया है, जिससे कई प्लेटफ़ॉर्म शीर्ष पर दिखाए गए इंटरलीव्ड काम की अनुमति देते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: कैविटेशन मॉनिटरिंग।
(A)माइक्रोबबल्स के इंजेक्शन के बाद 04 के एमआई में माइक्रोबबल प्रशासन के अभाव में एक वीवो प्रयोग का आवृत्ति स्पेक्ट्रम0.4 के एमआई पर दिखाया गया है । उच्च हार्मोनिक्स की वृद्धि पर ध्यान दें, जो माइक्रोबबल्स के स्थिर कैविटेशन के लिए संकेत है। (ग)माइक्रोबबल इंजेक्शन के संयोजन में 0.6 के उच्च एमआई पर इसी स्पेक्ट्रम को देखा गया, संक्रमण बैंड के भीतर जड़त्वीय कैविटेशन की शुरुआत के लिए, जिससे 25 डीबी तक शोर मंजिल में वृद्धि हुई और अल्ट्राहारमोनिक्स और सुहारमोनिक्स की उपस्थिति हुई। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: BBB खोलने और संबद्ध हिटोलॉजी ।
(A)०.४ के एमआई का उपयोग कर स्थिर कैविटेशन सफेद प्रकाश स्थूल और वह दाग माइक्रोस्कोपी दोनों में एक अक्षुण्ण मस्तिष्क परन्चिमा का सबूत है । (ख)मस्तिष्क परेन्चिमा के स्थानीय अपरिवर्तनीय ऊतक क्षति के ०.६ पहले संकेतों के एक एमआई के बाद वह हिस्टोलॉजिकल डेटा दाग में स्पष्ट होता जा रहा है । (ग)एमआई 0.8 के उच्च यांत्रिक दबाव के लिए, स्थूल रक्तस्राव स्पष्ट है और साथ ही मस्तिष्क परिन्चिमा के व्यापक प्रसार वाले ऊतक लाइसिस और माइक्रो-हेमरेजिंग के कारण एरिथ्रोसाइट्स का स्व्यवस्था है। सफेद प्रकाश मैक्रोस्कोपी में नीली छटा सह-इंजेक्शन इंट्रा-वैस्कुलर कंट्रास्ट एजेंट इवांस ब्लू के स्व्यवस्था के लिए संकेत है जो बीबीबी खोलने का संकेत देता है (एक धनु दृश्य के लिए चित्रा 5 देखें)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: BBB खोलने का सत्यापन ।
नियंत्रण(ए)की तुलना में स्थिर कैविटेशन व्यवस्था(बी)में सफल बीबीबी खोलने का प्रदर्शन, कोई माइक्रोबबल इंजेक्शन नहीं। इस मामले में इवांस ब्लू को इंट्रावैस्कुलर कंट्रास्ट एजेंट के रूप में इस्तेमाल किया गया है। इवांस ब्लू के मजबूत एल्बुमिन-बाइंडिंग से 66 केडीए से अधिक का एक बड़ा अणु होता है। नतीजतन, इवांस ब्लू एक्सट्रावेशन के सबूत तंग जंक्शनों के (आंशिक) खोलने के कारण बीबीबी में पैरासेलुलर परिवहन के लिए संकेत है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

इस अध्ययन में, हमने मस्तिष्क परेन्चिमा में दवा वितरण में वृद्धि के लिए क्षणिक बीबीबी व्यवधान के लिए एक लागत प्रभावी छवि निर्देशित फ़्यूस सिस्टम विकसित किया। प्रणाली काफी हद तक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध घटकों के साथ और एक्स-रे और BLI के साथ संयोजन के रूप में बनाया गया था । प्रस्तावित डिजाइन की मॉड्यूलरिटी उच्च थ्रूपुट वर्कफ्लो में योजना और मूल्यांकन के लिए कई इमेजिंग तौर-तरीकों के उपयोग की अनुमति देती है। इस प्रणाली को अधिक व्यापक उच्च-रिज़ॉल्यूशन 3डी इमेजिंग तौर-तरीकों के साथ जोड़ा जा सकता है, उदाहरण के लिए उच्च-रिज़ॉल्यूशन एमआरआई या माइक्रो-सीटी, जबकि अध्ययन के थोक के लिए 2डी एक्स-रे और/या BLI जैसे 2D इमेजिंग तौर-तरीकों का उपयोग किया जाता है । 2डी एक्स-रे और/या BLI दोनों काफी अधिक लागत प्रभावी होने के साथ-साथ अपने संबंधित छोटे अधिग्रहण समय के कारण उच्च मात्रा वाले अध्ययनों के लिए आदर्श हैं । यहां वर्णित ट्रांसड्यूसर मस्तिष्क के गहरे हिस्सों (1.25 की एफ संख्या) में बड़े क्षेत्रों (माउस मस्तिष्क के पैमाने पर) में बीबीबीडी का उत्पादन करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है। हमने इस प्रणाली का उपयोग पोंटिन क्षेत्र43,44में ट्यूमर को फैलाने के लिए किया है . इन क्षेत्रों के लिए एक बड़ी मात्रा में सोनोपोरेटेड होने की आवश्यकता होती है जिसमें पोन में पूरे ट्यूमर क्षेत्र शामिल होते हैं। मॉड्यूलर प्रणाली को मस्तिष्क के अधिक सुप्रेनिटोरियल हिस्सों में अन्य प्रकार के ब्रेन ट्यूमर के लिए आसानी से समायोजित किया जा सकता है। ट्रांसड्यूसर टाइप एक पर निर्णय लेने के लिए एफ-नंबर, फोकल लंबाई और आवृत्ति को ध्यान में रखना चाहिए।

समग्र डिजाइन में पहले सुझाए गए डिजाइनों की तुलना में दो शोधन का प्रस्ताव है। (I) अक्सर एक पानी स्नान चिकित्सकीय प्रणालियों के अल्ट्रासाउंड तरंग संचरण के लिए प्रयोग किया जाता है । छोटे जानवरों में ट्रांसक्रैनियल अनुप्रयोगों के लिए इस प्रकार के डिजाइन के परिणामस्वरूप बड़े और उल्टे सेटअप होते हैं, जिससे जानवर आंशिक रूप से11,22,25डूब जाता है। हालांकि ये डिजाइन आम तौर पर छोटे पशु अध्ययन के दायरे में बहुत अच्छी तरह से काम करते हैं, वे उपयोग के दौरान सेटअप समय, पोर्टेबिलिटी और वास्तविक रखरखाव योग्य स्वच्छ मानकों के संबंध में समझौता करते हैं। विशेष रूप से बाद में प्रतिरक्षा वादा किया जानवरों और इस तरह सख्त स्वच्छ मानकों को शामिल गुंजाइश अध्ययन में काफी महत्व का है । नतीजतन, अधिक कॉम्पैक्ट पदचिह्न, छोटे सेटअप समय, आसान विसंदूषण संभावनाओं और पूरे कार्यप्रवाह के दौरान जानवर की एक प्राकृतिक स्थिति के साथ एक प्रणाली डिजाइन करने के लिए, एक "टॉप-डाउन" डिजाइन चुना गया था। (II) पहले वर्णित कई डिजाइनों से भिन्न दूसरा डिजाइन विकल्प ध्वनिक वितरण प्रणाली के प्रत्यक्ष एकीकरण को एमआरआई या माइक्रो-सीटी15, 17, 18,19,45जैसे चिकित्सा इमेजिंग प्रणाली में छोड़ना था। जबकि पूरी तरह से एकीकृत प्रणालियां सीमित संख्या में जानवरों पर देशांतर फार्माकोकाइनेटिक अध्ययन या अन्वेषणात्मक अनुसंधान के लिए आदर्श हैं, ऐसे सेटअप आम तौर पर काफी बढ़ी हुई जटिलता, उच्च रनिंग-लागत और प्रशिक्षित/कुशल ऑपरेटरों की आवश्यकता के कारण उच्च मात्रा वाले औषधीय अध्ययनों के लिए कम उपयुक्त होते हैं । इसके अलावा, इस तरह के सिस्टम आम तौर पर केवल एक इमेजिंग मोडलि मोडलि बनने तक सीमित होते हैं। नतीजतन, यहां प्रस्तावित डिजाइन एक मॉड्यूलर अलग करने योग्य स्टीरियोटैक्टिक प्लेटफॉर्म पर निर्भर करता है, जो कई इमेजिंग तौर-तरीकों (माइक्रो-सीटी, छोटे पशु एमआरआई, ब्ली/फ्लोरेसेंस कैमरों की एक किस्म, इन के साथ या बिना एकीकृत एक्स-रे इमेजिंग) के साथ संगत है और हस्तक्षेप योजना और अनुवर्ती पोस्ट खोलने के लिए संदर्भ के एक आम फ्रेम में सभी छवि डेटा के स्वचालित संलयन के लिए भी बहु-रूपल फिड्यूशियल मार्कर प्रदान करता है ।

व्यावहारिक विचारों के संबंध में, प्रक्रिया में विफलता का सबसे महत्वपूर्ण बिंदु उनके सीमित जीवनकाल और उनके नाजुक स्वभाव के कारण माइक्रोबबल्स की स्थिरता है। हम इस बात पर जोर देना चाहेंगे कि निम्नलिखित चर्चा फॉस्फोलिपिड्स द्वारा स्थिर माइक्रोबबल्स से संबंधित है और सल्फर हेक्साफ्लोराइड(एसएफ 6)को अहानिकर गैस46, 47के रूप में शामिल करती है, जबकि अन्य माइक्रोबबल फॉर्मूलेशन आम तौर पर विभिन्न गुणों को प्रदर्शित करेंगे।

माइक्रोबबल इंजेक्शन से पहले समय: पुनः जलयोजन के बाद व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माइक्रोबबल्स की विज्ञापित उम्र 3 और 4 घंटे के बीच है। हालांकि यह नैदानिक अल्ट्रासाउंड अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त है, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इस पूरी अवधि के दौरान माइक्रोबबल लगातार गैस खो देते हैं और नतीजतन मतलब बुलबुला व्यास 2.5 माइक्रोन के प्रारंभिक औसत आकार से निरंतर नीचे-बहाव के अधीन होता है। अल्ट्रासाउंड-मध्यस्थता बीबीबीडी जैसे चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए इसका तात्पर्य बहुत सख्त समय-अनिवार्यता है, क्योंकि स्थिर गुहा (दिए गए आवृत्ति और दबाव पर) का दोलन आयाम और जड़त्वीय कैविटेशन की शुरुआत-दहलीज एक प्रत्यक्ष परिणाम के रूप में भी एक निरंतर बहाव के अधीन हैं। हमारे अनुभव में, हमने देखा है कि पिछले रिपोर्टिंग48के समान, प्रजनन योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए रिहाइड्रेशन के बाद 30 मिनट के भीतर माइक्रोबबल का सबसे अच्छा उपयोग किया जाता है।

माइक्रोबबल इंजेक्शन के बाद समय: बड़े वानरों में, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एस एफ6-फॉस्फोलिपिड माइक्रोबबल्स रक्त-प्लाज्मा उन्मूलन आधा जीवन लगभग 6 मिनट का प्रदर्शित करते हैं और प्रशासित गैस का 80% से अधिक केवल 11 मिनट48के बाद फेफड़ों के माध्यम से बाहर निकाला जाता है। चूहों और चूहों जैसे छोटे स्तनधारियों में वीवो में इस प्रकार के माइक्रोबबल्स का रक्त-प्लाज्मा उन्मूलन आधा जीवन 90-120 सेकंड के साथ है जो उच्च हृदय गति20के कारण काफी कम है। नतीजतन, बोलस इंजेक्शन के बाद सीधे माइक्रोबबल एकाग्रता का तेजी से गतिशील और बुलबुले की निरंतर गैस मात्रा हानि के साथ संयुक्त तेजी से बाद में प्लाज्मा उन्मूलन 3-4 मिनट के बाद इंजेक्शन की छोटी अवधि के भीतर प्रजनन योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए सोनीशन/इंजेक्शन प्रोटोकॉल पर सख्त समय आवश्यकताओं को लगाता है। बीबीबीडी की लंबी प्रक्रियाओं या अधिक व्यापक मात्रा में अधिमानतः माइक्रोबबल्स के निरंतर प्रशासन की आवश्यकता होती है। हालांकि, इस तरह के एक दृष्टिकोण दोनों सिरिंज और खिला प्रणाली में बुलबुले की उछाल से जटिल है और यह भी आवश्यक जलसेक टयूबिंग द्वारा एक काफी वृद्धि की मृत मात्रा का परिचय । हमारे अनुभव में कुल इंजेक्शन की मात्रा को 2 से 3 छोटे उप-खुराक में विभाजित करने के सरल समाधान ने एक मजबूत और प्रजनन योग्य परिणाम प्रदान किए।

इसके अलावा, माइक्रोबबल बहुत दबाव संवेदनशील होते हैं और इंजेक्शन के दौरान उच्च हाइड्रोस्टैटिक दबाव की सिफारिश नहीं की जाती है। माइक्रोबबल्स को प्लास्टिक ट्यूब में स्थानांतरित करने या सिरिंज49के साथ माइक्रोबबल्स को आकर्षित करने के लिए बड़ी सुइयों (>19 जी) की सिफारिश की जाती है। चूहों में 26-30 जी सुइयों में 26-30 जी इंजेक्शन की सिफारिश की जाती है; चूंकि बड़ी सुइयों को पूंछ नस में डालने के लिए अधिक कठिन होते हैं। इस सुई के साथ हाइड्रोस्टैटिक दबाव कम होने के बाद से 26 जी सुई की सिफारिश की जाती है। हालांकि, मुश्किल शिरा का उपयोग के मामले में 30 जी सुई की सिफारिश की जाती है।

माउस का कपाल दबाव आयाम का एक महत्वपूर्ण क्षीणता है जो ध्यान में दबाव आयाम को काफी कम करता है। क्षीणन ट्रांसड्यूसर की आवृत्ति और अल्ट्रासाउंड तरंग के माध्यम के घनत्व से निर्धारित होता है। उच्च अल्ट्रासाउंड आवृत्तियों और उच्च ऊतक घनत्व, हड्डी की तरह उच्च क्षीणन में परिणाम। दबाव आयाम आंशिक रूप से हड्डी द्वारा अवशोषित हो जाता है और कुछ दबाव आयाम प्रतिबिंब और50बिखरने से खो जाता है। हमारे प्रयोगों में हमने माउस शवों में यह निर्धारित किया है कि 1 मेगाहर्ट्ज में क्षीणता 14.5 ± 1.3 डीबी/सेमी है, जिसकी औसत खोपड़ी मोटाई 0.9 मिमी है जैसा कि21,50से पहले दिखाया गया है। कैविटेशन मॉनिटरिंग की अत्यधिक सिफारिश की जाती है क्योंकि माइक्रोबबल स्थिर कैविटेशन और जड़ता कैविटेशन के दौरान अलग ध्वनिक उत्सर्जन को दर्शाते हैं। वाइडबैंड उत्सर्जन12जड़त्वीय कैविटेशन के लिए एक अलग ध्वनिक उत्सर्जन है । वास्तविक समय की निगरानी से जड़त्वीय कैविटेशन का पता लगाना संभव हो जाता है और ऊतक क्षति से बचने के लिए तदनुसार दबाव आयाम को कम करता है।

पिछली रिपोर्टों में प्राप्त बीबीबी पारमीबिलिटी11,31पर संज्ञाहरण के प्रकार के प्रभाव का वर्णन किया गया था । आइसोफ्लुनाणे आधारित संज्ञाहरण के लिए, एनेस्थीसिया दीक्षा के तुरंत बाद एक वासोडिलेशन होता है, जो मस्तिष्क रक्त प्रवाह की थोड़ी कमी से जुड़ा होता है। इसके अलावा, विस्तारित अवधि पर संज्ञाहरण, विशेष रूप से तापमान स्थिरीकरण के अभाव में, हृदय गति में कमी आती है। चूंकि दोनों कारक संभावित रूप से माइक्रोबबल या सह-प्रशासित दवाओं दोनों की मस्तिष्क एकाग्रता का एक बड़ा विचरण कर सकते हैं, इसलिए प्रजनन योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए एक सख्त संज्ञाहरण प्रोटोकॉल की सलाह दी जाती है51। ३५ से ४५ मिनट के लिए 2 एल/मिन ऑक्सीजन में १.५% v/v आइसोफ्लारेन के साथ संज्ञाहरण समस्याग्रस्त नहीं था, जैसा कि कॉन्स्टेंटिनाइड्स एट अल५१द्वारा सलाह दी गई थी । मैकडानल्ड एट अल के विपरीत, जिन्होंने दिखाया कि उनके माइक्रोबबल्स के विशिष्ट प्रकार के साथ संयोजन में यह गैस मिश्रण समस्याग्रस्त52था, हमने इस प्रकार के माइक्रोबबल्स के साथ उल्लेखनीय समस्याओं को नहीं देखा है। वैकल्पिक रूप से, जानवरों को केटामाइन/जाइलाज़ीन के मिश्रण के साथ एनेस्थेटाइज्ड किया जा सकता है, जिसका कोई ज्ञात वासोएक्टिव प्रभाव53नहीं है।

संक्षेप में, इमेजिंग निर्देशित BBB-खोलने तकनीक यहां वर्णित उच्च मात्रा पूर्व नैदानिक दवा मूल्यांकन अध्ययन है कि सुझाव कार्यप्रवाह की दक्षता का प्रदर्शन के लिए इस्तेमाल किया गया है । इस प्रणाली को स्वचालन की उच्च डिग्री के कारण एक छोटे से प्रशिक्षण के बाद गैर तकनीकी कर्मियों द्वारा संचालित किया जा सकता है । सेटअप की सादगी के संयोजन में इसके परिणामस्वरूप उच्च स्तर का मानकीकरण हुआ, जो बदले में प्रयोगात्मक प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करता है, अंतर-समूह परिवर्तनशीलता को कम करता है और इस प्रकार आवश्यक नमूना आकार को कम करने की अनुमति देता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस परियोजना को केडब्ल्यूएफ-एसटीडब्ल्यू (बचपन डिफ्यूज आंतरिक पोंटिन ग्लियोमा और हाई-ग्रेड ग्लियोमा में सोनोपोरेशन द्वारा दवा वितरण) द्वारा वित्त पोषित किया गया था। हम प्रणाली के विकास में उनके इनपुट के लिए इलिया स्काचकोव और चार्ल्स मोगेनोट को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL luer-lock syringe Becton Dickinson 309628 Plastipak
19 G needle Terumo Agani 8AN1938R1
23 G needle Terumo Agani 8AN2316R1
3M Transpore surgical tape Science applied to life 7000032707 or similar
Arbitrary waveform generator Siglent n.a. SDG1025, 25 MHz, 125 Msa/s
Automated stereotact in-house built n.a. Stereotact with all elements were in-house built
Bruker In-Vivo Xtreme Bruker n.a. Includes software
Buffered NaCl solution B. Braun Melsungen AG 220/12257974/110
Buprenorfine hydrochloride Indivior UK limitd n.a. 0.324 mg
Cage enrichment: paper-pulp smart home Bio services n.a.
Carbon filter Bickford NC0111395 Omnicon f/air
Ceramic spoon n.a n.a.
Cotton swabs n.a. n.a.
D-luciferin, potassium salt Gold Biotechnology LUCK-1
Ethanol VUmc pharmacy n.a. 70%
Evans Blue Sigma Aldrich E2129
Fresenius NaCl 0.9% Fresenius Kabi n.a. NaCl 0.9 %, 1000 mL
Histoacryl Braun Surgical n.a. Histoacryl 0.5 mL
Hydrophone Precision Acoustics n.a.
Insulin syringe Becton Dickinson 324825/324826 0.5 mL and 0.3 mL
Isoflurane TEVA Pharmachemie BV 8711218013196 250 mL
Ketamine Alfasan n.a. 10 %, 10 mL
Mouse food: Teklad global 18% protein rodent diet Envigo 2918-11416M
Neoflon catheter Becton Dickinson 391349 26 GA 0.6 x 19 mm
Oscilloscope Keysight technologies n.a. InfiniiVision DSOX024A
Plastic tubes Greiner bio-one 210261 50 mL
Power amplifier Electronics & Innovation Ltd 210L Model 210L
Preamplifier DC Coupler Precision Acoustics n.. Serial number: DCPS94
Scissors Sigma Aldrich S3146-1EA or similar
Sedazine AST Farma n.a. 2%
SonoVue microbubbles Bracco n.a. 8 µl/ml
Sterile water Fresenius Kabi n.a. 1000 mL
Syringe n.a. n.a. various syringes can be used
Temgesic Indivior UK limitd n.a. 0.3 mg/ml
Transducer Precision Acoustics n.a. 1 MHz
Tweezers Sigma Aldrich F4142-1EA or similar
Ultrasound gel Parker Laboratories Inc. 01-02 Aquasonic 100
Vidisic gel Bausch + Lomb n.a. 10 g

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References

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