Een driedimensionaal uniaxiale mechanische stimulatie bioreactorsysteem is een ideale bioreactor voor tenogeen-specifieke differentiatie van pees-afgeleide stamcellen en neo-peesvorming.
Tendinopathie is een veel voorkomende chronische peesziekte met betrekking tot ontsteking en degeneratie in een orthopedisch gebied. Met een hoge morbiditeit, beperkte zelfherstellende capaciteit en, belangrijker nog, geen definitieve behandelingen, tendinopathie nog steeds van invloed op de kwaliteit van het leven van patiënten negatief. Pees-afgeleide stamcellen (TDC’s), als primaire voorloper cellen van peescellen, spelen een essentiële rol in zowel de ontwikkeling van tendinopathie, en functionele en structurele restauratie na tendinopathie. Zo zou een methode die in vitro de in vivo differentiatie van TSCs in peescellen kan nabootsen nuttig zijn. Hier beschrijft het huidige protocol een methode op basis van een driedimensionaal (3D) uniaxial stretchingsysteem om de TSCs te stimuleren om zich te onderscheiden in peesachtige weefsels. Er zijn zeven stadia van het huidige protocol: isolatie van muizen-TSCs, cultuur en uitbreiding van muizen-TSCs, voorbereiding van stimulatiecultuurmedium voor celbladvorming, celbladvorming door culturing in stimulatiemedium, voorbereiding van 3D-peesstamcelconstructie, assemblage van het uniaxiale mechanische stimulatiecomplex en evaluatie van het mechanische gestimuleerde in vitropepeweefsel. De effectiviteit werd aangetoond door histologie. De hele procedure duurt minder dan 3 weken. Om extracellulaire matrixdepositie te bevorderen, werd 4,4 mg/mL ascorbinezuur gebruikt in het stimulatiecultuurmedium. Een gescheiden kamer met een lineaire motor zorgt voor nauwkeurige mechanische belasting en is draagbaar en gemakkelijk af te stellen, die wordt toegepast voor de bioreactor. Het laadregime in het huidige protocol was 6% spanning, 0,25 Hz, 8 uur, gevolgd door 16 uur rust gedurende 6 dagen. Dit protocol kan celdifferentiatie in de pees nabootsen, wat nuttig is voor het onderzoek van het pathologische proces van tendinopathie. Bovendien wordt het peesachtige weefsel mogelijk gebruikt om de genezing van pees bij peesletsel als een gemanipuleerde autologe graft te bevorderen. Kortom, het huidige protocol is eenvoudig, economisch, reproduceerbaar en geldig.
Tendinopathie is een van de gemeenschappelijke sportblessures. Het manifesteert zich voornamelijk door pijn, lokale zwelling, verminderde spierspanning in het getroffen gebied, en disfunctie. De incidentie van tendinopathie is hoog. De aanwezigheid van achilles tendinopathie komt het meest voor bij midden- en langeafstandslopers (tot 29%), terwijl de aanwezigheid van patellar tendinopathie ook hoog is bij volleyballers (45%), basketbal (32%), atletiek (23%), handbal (15%), en voetbal (13%)1,2,3,4,5. Echter, als gevolg van de beperkte zelfhelende vermogen van de pees, en het gebrek aan effectieve behandelingen, tendinopathie nog steeds van invloed op het leven van patiënten negatief6,7. Bovendien blijft de pathogenese van tendinopathie onduidelijk. Er zijn veel onderzoeken geweest naar de pathogenese, voornamelijk met inbegrip van “ontstekingstheorie”, “degeneratietheorie”, “overmatig gebruikstheorie”, enzovoort8. Op dit moment, veel onderzoekers geloofden dat tendinopathie was te wijten aan de mislukte zelf-reparatie aan de micro-verwondingen veroorzaakt door overmatige mechanische belasting van de pees ervaringen9,10.
Tendon-afgeleide stamcellen (TSCs), als primaire voorloper cellen van peescellen, spelen een essentiële rol in zowel de ontwikkeling van tendinopathie en functionele en structurele restauratie na tendinopathie11,12,13. Er werd gemeld dat mechanische stressstimulatie de proliferatie en differentiatie van osteocyten, osteoblasten, gladde spiercellen, fibroblasten, mesenchymale stamcellen en andere krachtgevoelige cellen14,15,16,17,18kan veroorzaken . Daarom kunnen TSC’s, als een van de mechanosensitive en multipotent cellen , eveneens worden gestimuleerd om te differentiëren door mechanische belasting19,20.
Verschillende mechanische belastingparameters (laadsterkte, laadfrequentie, laadtype en laadperiode) kunnen tdsc’s er echter toe aanzetten zich te onderscheiden in verschillende cellen21. Een effectief en geldig mechanisch belastingregime is dus zeer belangrijk voor tenogenese. Bovendien zijn er verschillende soorten bioreactoren als stimulatiesystemen die momenteel worden gebruikt voor het leveren van mechanische belasting aan TSC’s. De principes van elk soort bioreactor zijn verschillend, zodat zijn de mechanische ladingsparameters die aan verschillende bioreactoren overeenkomen ook verschillend. Daarom is er een eenvoudig, economisch en reproduceerbaar stimulatieprotocol in trek, inclusief het type bioreactor, het bijbehorende stimulatiemedium en het mechanische belastingregime.
Het onderhavige artikel beschrijft een methode op basis van een driedimensionaal (3D) uniaxial stretching systeem om de TSCs te stimuleren om zich te onderscheiden in peesachtig weefsel. Er zijn zeven stadia van het protocol: isolatie van muizen-TSCs, cultuur en uitbreiding van muizen-TSCs, voorbereiding van stimulatiecultuurmedium voor celbladvorming, celbladvorming door te kweken in stimulatiemedium, voorbereiding van 3D-peesstamcelconstructie, assemblage van het uniaxiale mechanische stimulatiecomplex en evaluatie van het mechanische gestimuleerde in vitrodonpees-achtige weefsel. De hele procedure duurt minder dan 3 weken om de 3D-celconstructie te verkrijgen, wat veel minder is dan sommige bestaande methoden22,23. Het huidige protocol is bewezen te kunnen tdc’s te onderscheiden in peesweefsel, en het is betrouwbaarder dan de huidige veelgebruikte tweedimensionale (2D) stretching systeem21. De effectiviteit werd aangetoond door histologie. Kortom, het huidige protocol is eenvoudig, economisch, reproduceerbaar en geldig.
De pees is een mechanosensitive vezelig bindweefsel. Volgens eerder onderzoek kan overtollige mechanische belasting leiden tot osteogene differentiatie van peesstamcellen, terwijl onvoldoende belasting zou leiden tot een verstoorde collageenvezelstructuur tijdens peesdifferentiatie21.
Een gemeenschappelijke mening is dat de sleutel tot een ideale bioreactor de capaciteit is om de in vitro cellulaire micro-omgeving te simuleren die de cellen in vivo ondergaan. Daarom is …
The authors have nothing to disclose.
Het onderzoek werd uitgevoerd terwijl de auteur in ontvangst van “een Universiteit van West-Australië International Fee Scholarship en een University Postgraduate Award aan de Universiteit van West-Australië”. Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (81802214).
Ascorbic acid | Sigma-aldrich | PHR1008-2G | |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibcoä by Life Technologies | 1908361 | |
Histology processor | Leica | TP 1020 | |
Minimal Essential Medium (Alpha-MEM) | Gibcoä by Life Technologies | 2003802 | |
Mouse Tendon Derived Stem Cell | Isolated from Achilles tendons of 6- to 8-wk-old C57BL/6 mice. Then digested with type I collagenase (3 mg/ml; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) for 3 h and passed through a 70 mmcell strainer to yield single-cell suspensions. | ||
Paraformaldehyde | Sigma-aldrich | 441244 | |
Streptomycin and penicillin mixture | Gibcoä by Life Technologies | 15140122 | |
Three-dimensional Uniaxial Mechanical Stimulation Bioreactor System | Centre of Orthopaedic Translational Research, Medical School, University of Western Australia | Available from the corresponding author upon request. Or make it according to our design* *Wang T, Lin Z, Day RE, et al. Programmable mechanical stimulation influences tendon homeostasis in a bioreactor system. Biotechnol Bioeng. 2013;110(5):1495–1507. doi:10.1002/bit.24809 | |
Trypsin | Gibcoä by Life Technologies | 1858331 |