Summary
Bu yazı, embriyonik sıçan sempatik nöronların superior servikal gangliyondan izole ve kültürlenmesini açıklamaktadır. Ayrıca immünositokimyasal boyama ve kütle spektrometrik analizi için nöronal özler hazırlamak için ayrıntılı protokoller sağlar.
Abstract
Embriyonik sıçan üstün servikal gangliyonunsempatik nöronlar (SCG) aksonal büyüme, aksonal kaçakçılık, sinaptogenez, dendritik büyüme, dendritik plastitik plastisite ve eş-kültür sistemlerinde sinir hedef etkileşimleri incelemek için periferik nöronlar için bir in vitro model sistemi olarak kullanılmıştır. Bu protokol, E21 sıçan embriyolarının üstün servikal ganglinden nöronların izolasyonunu ve ayrıştırMalarını, ardından serumsuz ortamda saf nöronal kültürlerin hazırlanması nı ve bakımını açıklar. Nöronlar kaplamasız plastik yapışmaz olduğundan, nöronlar ya 12 mm cam kapakları veya poli-D-lizin ile kaplı 6-iyi plakalar kültürlü olacaktır. Bir antimitotik ajan (Ara-C, sitozin β-D-arabinofuranoside) ile yapılan tedavinin ardından, bu protokol% 5'ten az nöronal olmayan hücrelerile sağlıklı nöronal kültürler oluşturur, hangi in vitro bir ay boyunca muhafaza edilebilir. Embriyonik sıçan SCG nöronlar in vivo 5-8 dendritler ile multipolar olmasına rağmen; serumsuz koşullar altında, bu nöronlar kültürde sadece tek bir akson genişletmek ve kültür süresince tek kutuplu olmaya devam. Ancak, bu nöronlar bazal membran ekstresi varlığında dendritler uzatmak için indüklenebilir, kemik morfogenetik proteinler (BP), veya 10% fetal buzağı serum. Bu homojen nöronal kültürler immünositokimyasal boyama ve biyokimyasal çalışmalar için kullanılabilir. Bu yazıda ayrıca bu nöronlarda mikrotübül ilişkili protein-2 (MAP-2) için immünositokimyasal boyama ve kütle spektrometresi için nöronal ekstrelerin hazırlanması için optimize edilmiş protokol açıklanmaktadır.
Introduction
Embriyonik superior servikal gangliyondan (SCG) elde edilen sempatik nöronlar, büyüme faktörü bağımlılığı da dahil olmak üzere nöronal gelişimin birçok yönünü incelemek için yaygın olarak birincil nöronal kültür sistemi olarak kullanılmaktadır. nöron hedef etkileşimleri, nörotransmitter sinyalizasyon, aksonal büyüme, dendrite gelişimi ve plastisite, sinaptogenez ve sinir-hedef /nöron-glia etkileşimleri altında yatan sinyal mekanizmaları1,2,3,4,5,6,7,8,9. Onların küçük boyutuna rağmen (yaklaşık 10000 nöronlar / ganglia), gelişimi ve bu kültür sisteminin yaygın kullanımı için üç ana nedeni vardır i) sempatik zincirinde ilk ganglia olmak, onlar daha büyük, ve bu nedenle izole etmek daha kolay, sempatik ganglia geri kalanından daha10; ii) merkezi nöronlar aksine, SCG nöronlar oldukça nöral ibik türetilen tüm nöronlar ile homojen, benzer bir boyuta sahip, sinir büyüme faktörü bağımlılığı ve ne adrenerjik olmak. Bu onları morfolojik ve genomik çalışmalar için değerli bir model yapar10,11 ve iii) Bu nöronlar bir ay boyunca sinir büyüme faktörü içeren tanımlanmış bir serum içermeyen ortamda muhafaza edilebilir10,12. Perinatal SCG nöronlar yoğun olarak dendritlerin başlatılması ve bakımı altında yatan mekanizmaları incelemek için kullanılmıştır2. Bunun başlıca nedeni, SCG nöronlar in vivo geniş bir dendritik arbor olmasına rağmen, onlar serum yokluğunda in vitro dendritler uzatmak yok ama kemik morfogenetik proteinler 2 gibi bazı büyüme faktörlerinin varlığında dendritler büyümeye indüklenebilir2,12,13.
Bu yazıda embriyonik sıçan SCG nöronların izole ve culturing için protokol açıklanmaktadır. Son 50 yıl içinde, SCG birincil nöronal kültürler ağırlıklı olarak büyük ölçekli genomik veya proteomik değişiklikleri inceleyen çalışmalar sınırlı sayıda morfolojik çalışmalar için kullanılmıştır. Bunun başlıca nedeni düşük miktarda DNA veya proteinin izole edilmesiyle sonuçlanan küçük doku boyutudur, bu da bu nöronlar üzerinde genomik ve proteomik analizlerin gerçekleştirilmesini zorlaştırır. Ancak, son yıllarda, artan algılama duyarlılığı dendritik büyüme gelişimi sırasında SCG nöronlarda genom, miRNom ve proteom incelemek için yöntemlerin geliştirilmesini sağlamıştır14,15,16,17. Bu yazı da immünositokimya ve kütle spektrometrik analizi için nöronal protein özleri elde etmek için bir protokol kullanarak bu nöronların morfolojik analizi için yöntem açıklayacağız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvanlarla ilgili çalışmalarda yapılan tüm prosedürler, Saint Mary's College of California'daki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Saint Mary's College'daki hayvan bakımı ve kullanım kılavuzları, Ulusal Sağlık Enstitüsü'ndeki (https://olaw.nih.gov/sites/default/files/PHSPolicyLabAnimals.pdf ve https://olaw.nih.gov/sites/default/files/Guide-for-the-Care-and-Use-of-Laboratory-Animals.pdf) Laboratuvar Hayvan Refahı Ofisi tarafından sağlanan yönergelere göre geliştirilmiştir.
1. Kültür medyasının hazırlanması (kontrol aracı olarak da adlandırılır)
- Aşağıdaki maddeleri, aşağıda listelenen sırayla, steril 500 mL şişeye ekleyin: 190 mL 1x düşük glikozlu DMEM, 10 mL 20 mg/mL yağ asidi serbest büyükbaş serum albumini (FAF-BSA) DMEM'de, 2.8 mL 200 mM L-glutamin, 4 mL 100x insülin-selenyum-transferrin karışımı, 0.4 mL 125 μg/mL sinir büyüme faktörü (DMEM'de %0.2 inert protein stabilizatörü) ve 200 mL Ham F-12 ortamı.
- Pipetin pipete yapışmasını önlemek için insülin-selenyum transferrin ve NGF gibi protein içeren çözeltilerin eklenmesinden önce pipeti FAF-BSA içeren ortamla kapladığından emin olun.
- Her eklemeden sonra malzemeyi karıştırmak için şişe girdap. F-12 ilave edildikten sonra 25 mL'lik pipetle iyice karıştırın.
- Aliquot kültür medya 10 mL aliquots ve saklamak -80 °C. Aliquots faaliyet kaybı olmadan altı ay saklanabilir.
2. Kültür nöronları için plakahazırlanması
- 1 mg/mL poli-D-lizin stoğunu (0,5 M Tris tampon, pH 8'de yapılan) 100 μg/mL'ye kadar steril distile su ile seyreltin.
- Proteomik veya genomik analiz için, diseksiyondan bir ila iki gün önce, yaklaşık 2 mL steril 100 g/mL poli-D-lizin (PDL) içeren 6 kuyulu plakalar kaplanır. Bu kuyuya hücre yapışmasını sağlamak için gereklidir. Plakaları yapışkan filmle sarın ve plakaları gece boyunca 4 °C'de saklayın.
- Morfolojik analiz ve mikroskopi için, 12 mm2 önceden işlenmiş Alman cam kapakları (daha önce18 veya satın alınan nitrik asit tedavisi ile temizlenebilir) 24 kuyuluk bir tabak kuyularının her birine yerleştirin.
- 0,3 mL steril 100 g/mL poli-D-lizin (PDL) ile kaplama kapakları. Plakaları gece boyunca 4 °C'de saklayın.
- Diseksiyon günü, diseksiyon başlamadan önce, kuyulardan poli-D-lizin çözeltisini çıkarın ve kuyuları steril distile suyla beş kez durulayın ve ardından düşük glikozlu DMEM ile bir kez durulayın.
- Gangliyonun enzimatik sindirimi sırasında (hücreleri kaplamadan yaklaşık bir saat önce), DMEM'i plakalardan aspire edin ve 0,3 mL kontrol ortamı ile değiştirin. Plakaları 35,5 °C'de %5 CO2 altında nemli bir odada saklayın.
3. Diseksiyon kurulumu
- Diseksiyon için 200 mL'lik ortam hazırlanması (Diseksiyon media olarak adlandırılır)
- Düşük glukozLu DMEM'de (1 mg/mL glukozlu) 20 mg/mL yağ asidi içermeyen büyükbaş serum albumini (FAF-BSA) ve 193 mL steril Leibovitz'in L-15 orta (veya herhangi bir hava tamponlu orta) 100x penisilin-streptomisin 2 mL ekleyin
- Kaputta, diseksiyon için aşağıdaki öğeleri ayarlayın: her tüpte yaklaşık 20 mL diseksiyon media ile dört adet 50 mL steril konik tüp, 1,5 mL diseksiyon media ile dört steril 35 mm çanak, santrifüj için 20 mL diseksiyon media ile bir steril 50 mL konik tüp, santrifüj için bir steril 15 mL konik tüp , ve ayrıştırılmış hücreleri toplamak için bir steril 10 mL tüp.
- En az bir dakika boyunca ince forseps (no.4 veya no. 5 forseps) sterilize etmek için kuru boncuk sterilizatör kullanın.
4. Embriyonik sıçan yavrularından superior servikal gangliyonun izolasyonu
- Hamile sıçandan E21 embriyolarının çıkarılması
NOT: Çevredeki alan iyice sterilize edilirse rahim boynuzunun çıkarılması kaputun dışına yapılabilir.- CO2 inhalasyon kullanarak hamile sıçan ötenazi. Karın bölgesinden kürk yamak ve sterilize etmek için% 70 alkol ile bölgede cilt silin.
- Steril makas ve forceps taze bir set kullanarak, deri ve daha sonra embriyoiçeren rahim boynuzları ortaya çıkarmak için kas tabakası ile kesti. Bu süreçte bağırsaklara zarar vermemeye özen tayarak yeni bir makas ve çalgılar seti kullanarak embriyolarla rahim boynuzlarını çıkarın.
- Embriyolarla birlikte rahim boynuzlarını 150 mm2 steril Petri kabına aktarın ve kaputa aktarın.
- Forceps ve makas yeni bir dizi kullanarak, rahim boynuzu gelen embriyolar kaldırmak ve amniyotik membranlar ve plasenta embriyoları ayırın.
- Embriyoları ötenazi yapmak için, sağ kol altında orta çizgi boyunca embriyoların omurilik kesti. Bu da SCG çıkarılması sırasında karotis arter kanaması azaltacaktır.
- Bu embriyoları diseksiyon ortamı içeren hazırlanmış 50 mL konik tüplere aktarın. Embriyoların medyaya gömüldüğünü emin ol. Her tüp 3 embriyo yada kadar tutabilir.
- Embriyodan superior servikal ganglion izolasyonu
- Diseksiyon medyasından bir yavruyu, substrat üzerindeki dorsal yüzeyi ile yarı katı substrat (parafin balmumu veya silikon polimer) ile dolu steril 150 mm2 Petri kabına aktarın. Üç steril 23 G iğne kullanarak, boynu dikkatlice genişletmek için yavruyu her bir kolun altından bir iğne ve ağızdan üçüncü bir iğne yle tabağa sabitleyin.
- Altında tükürük bezleri ortaya çıkarmak için steril ince çalgılar (no. 4 veya no. 5 forceps) kullanarak boyun bölgesinde deri ile kesin. İnce forceps kullanarak bu bezleri çıkarın.
- Sırasıyla köprücük kemiği ve trakea yakınında sternokleidomastoid ve omohyoid kasları bulun. Önce enine sternokleidomastoid kasları kesip sonra ince forceps kullanarak ince omohyoid kas dikkatle kesti. Bu kaslar çıkarıldıktan sonra, ön uçta karotis arter bifurkasyon trakea nın her iki tarafında görünür olacak, SCG karotis arter bu çatal altında bulunan.
- Kapalı forseps kullanarak, scg görselleştirmek için yavaşça karotis arter kaldırın. SCG'nin her iki tarafında bir tane forceps kullanarak karotisi çıkarın ve hazırlanan steril 35 mm2 tabaklara aktarın. Bu doku büyük olasılıkla karotis arter ile SCG içerecektir, nodose gangliyonu ile vagus siniryanı sıra bölgede kas veya yağ diğer segmentleri.
- Diğer taraftaki diseksiyon işlemini tekrarlayın. Aşağıda belirtilen kalan diseksiyon adımlarına devam etmeden önce tüm embriyolardan SG'leri çıkarın. Doku örneklerinin işlenmesini kolaylaştırmak için izole edilmiş dokuları 35 mm2 tabaktan ikisi arasında dağıtın.
- SCG'nin işlenmesi nin post-i işleme
- SCG'yi parçalanmış dokudan ayırmak için, önce yağ veya kas gibi herhangi bir yabancı dokuyu çıkarmak için ince kesetler kullanın, karotis bifurkasyona yakın bölgeden uzak durmaya özen.
- Bu dokular çıkarıldıktan sonra, iki gangliyon görünür. Nodose ganglion daha küçük ve dairesel, SCG ise badem şeklindedir. Vagus sinirini ve nodose gangliyonu karotisten ayırmak için vagus sinirini yavaşça çekin ve scg'yi karotis arterden ayırın.
- SCG çevreleyen kapsül kaldırmak için ince forceps kullanın. SCG'yi 35 mm'lik yeni bir kültür yemeğine aktarın. Tüm diseksiyon doku örnekleri ile işlemi tekrarlayın.
- Dokunun pipet duvarlarına yapışmasını önlemek için sterilize edilmiş, pamuklu cam pipeti diseksiyonu ile kaplayın. Diseksiyon mediasını, dokuların parçalanmasına yardımcı olmak için kalsiyum ve magnezyumsuz HBSS'de kollajenaz tip II (1 mg/mL)/dispase tip II (5 mg/mL) ile değiştirmek için pipeti kullanın.
NOT: Kuluçka süresinin farklı kollajenaz/Dispase gruplarla optimize edilmesi gerekebilir ve genellikle 40 dakika ile bir saat arasında değişmektedir. - Kuluçka sırasında DMEM'i plakalardan aspire edin ve 0,3 mL kontrol ortamı ile değiştirin. Plakaları 35,5 °C'de %5 CO2 altında nemli bir odada saklayın.
- Kuluçkadan sonra, kollajenaz/dispase'deki SG'leri steril 15 mL konik tüpe aktarın. Plakaları durulamak ve çözeltiyi tüpe aktarmak için diseksiyon ortamını kullanın. Ses düzeyini yaklaşık 10 mL'ye çıkaracak kadar diseksiyon ortamı ekleyin.
- 200 x g (1000 - 1200 rpm) oda sıcaklığında 5 dakika boyunca numuneyi peletlemek için santrifüj. Supernatant aspire, pelet yerinden değil dikkat. 10 mL diseksiyon media ile peleti yeniden askıya alın. Santrifüjtekrar layın ve supernatant atın.
- 1 - 2 mL kültür ortamı ile değiştirin. Dar delikli, bükülmüş uçlu steril pastör pipet (kültür ortamı ile önceden kaplanmış) kullanarak, 5-6 kez hafifçe triturating tarafından mekanik kümeleri ayrıştırın. Büyük kümeler yaklaşık bir dakika razı olsun. Süpernatant hücre süspansiyonuna yeni bir 10 mL tüp aktarın.
- Bu işlemi 3 kez daha tekrarlayın, her seferinde artan üçleme kuvveti ile SCG'lerin neredeyse tamamen ayrışmasını sağlayın.
- Sesi 8 -10 mL'ye çıkarmak için yeterli kültür ortamı ekleyin. Hücre süspansiyonuna yavaşça karıştırın ve hücre yoğunluğunu hemositometre ile ölçün.
- Deneyler için uygun hücre yoğunluğunda hücre süspansiyonu kuyulara dağıtın. Hücrelerin kuyulara eşit şekilde dağıtılmasını sağlamak için kaplama işlemi sırasında hücre süspansiyonuna sürekli olarak karıştırın.
NOT: Morfolojik analiz için, hücreleri 24 kuyu plakasında 8.000 hücre/kuyu etrafında ve genomik ve proteomik protokoller için, hücreleri 30.000 hücre/kuyuya kadar plakalayın. - Bir nemli oda oluşturmak için alt steril su ile bir cam kurutucu plakaları aktarın. Sızdırmazlıktan önce kurutucuda %5 CO2 ortamı elde etmek için yeterli CO2 (yaklaşık 120 mL) enjekte edin. Plakaları 35,5 °C'de saklayabilirsiniz. Bu, protokolde Gün 0 olarak adlandırılır.
NOT: Bu plakalar düzenli olarak %5 CO2 inkübatörde de muhafaza edilebilir. Yukarıda açıklanan yöntem sıcaklık ve pH değişikliklerini en aza indirir ve çapraz kontaminasyonu önlemeye yardımcı olur.
5. Kültürdeki SCG nöronların bakımı ve tedavileri
- 1. Günde (kaplamadan 24 saat sonra), kültür ortamının yarısını dikkatlice çıkarın ve 2 μM Ara-C (sitozin β-D-arabinofuranoside, anti-mitotik ajan) ile değiştirin. Tedaviyi 48 saat boyunca hücrelerde bırakın. Genellikle, tedavi bu uzunluğu kültürde olmayan nöronal hücreleri ortadan kaldırmak için yeterlidir.
- 3. Günde, orta ortamın yarısını hafifçe aspire edin ve kontrol ortamıyla değiştirin.
- 4. günde hücreler deneysel tedaviler ehazırdır. Her gün kültürleri uygun ortamla besleyin, kuyudaki ortamın yarısını taze ortamla nazikçe değiştirin.
- Serumsuz ortamda kültürlü SCG nöronlar sadece aksonları genişletir. Deneyler dendritlerin varlığını gerektiriyorsa, hücreleri %10 fetal baldır serumu, 75-100 μg/mL bazal membran matris ekstresi veya 50 ng/mL kemik morfogenetik protein-7 ile tedavi edin. Dendritik büyüme tedaviden sonraki bir hafta içinde ayrıntılı dendritik arbor ile tedaviden sonraki 48 saat içinde gözlenir.
6. Immunostaining kültürlü SCG nöronlar
- Yavaş yavaş 0,1 M fosfat tampon% 4 paraformaldehit ile kuyuda hücre kültürü ortamı yerine, bir duman kaputunda pH 7.2.
- Kuyudaki kültür ortamının yarısını çıkarın ve %4 paraformaldehit le nazikçe değiştirin. Daha sonra işlemi en az iki kez daha tekrarlayın, her seferinde kuyudaki medyanın üçte ikisini kaldırın ve %4 paraformaldehit yerine. Bu işlemin sonunda, kuyudaki ortamın rengi pembeden renksize doğru değişmeliydi.
- Tüm ortam %4 paraformaldehit ile değiştirildikten sonra, kuyuları oda sıcaklığında 15-20 dakika kuluçkaya yatırın.
- Yukarıda açıklandığı gibi benzer bir işlemle, %4'lük paraformaldehit çözeltisini yavaş yavaş fosfat tamponlu salin (PBS), pH 7.2 ile değiştirin. 5 dakika bekletin. PBS ile 5 dakika her biri için iki kez daha kuyuları durulayın.
- %4 paraformaldehit çıkarıldıktan sonra, daha fazla işlem için plakaları tezgahın tepesine taşıyın. Bu adım, plakaların bir gecede 4 °C'de saklanabileceği iyi bir durma noktasıdır.
- Tüm PBS kaldırın. Hücreleri kapsayacak şekilde PBS%0.1 Triton X-100 hacmi ni ekleyin. Nöronları permeabilize etmek için 5 dakika kültürlerüzerinde bırakın. Bu adımın zamanlaması hücrelerin bütünlüğünü korurken iyi boyama sağlamak için önemlidir.
- Triton X-100 çözeltisini dikkatlice çıkarın ve PBS ile her seferinde 5 dakika boyunca kuyuları üç kez durulayın. PBS çözümlerini çıkarın.
- PBS'de hücreleri kapsayacak kadar %5 BSA ekleyin ve spesifik olmayan antikor bağlanmasını azaltmak için oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatırın.
- Engelleme çözeltisini çıkarın ve PBS'de %5 BSA'da seyreltilmiş MAP-2 proteinine karşı fare monoklonal antikor ile değiştirin. Birincil antikorları bir gecede 4 °C'de hücrelere bırakın.
- Birincil antikor'u yeniden kullanmak için çıkarın ve kaydedin. Primer antikor algılama yoğunluğu kaybı olmadan en az iki kez yeniden kullanılabilir.
- Hücreleri kapsayacak kadar PBS ile üç kez durulayın. PBS'yi durulama başına 10 dakika boyunca hücrelerde bırakın.
- PBS çözeltisini çıkarın ve PBS'de %5 BSA'da 1:1000 seyreltmede floresan etiket konjuge Keçi anti-Mouse IgG ikincil antikor ile değiştirin. Oda sıcaklığında karanlıkta 2 saat kuluçka.
- İkincil antikor çıkarın ve PBS ile değiştirin. Kuyuları PBS ile üç kez durulayın ve 10 dakika yıkın. Herhangi bir tuzları kaldırmak için su ile bir kez kuyuları durulayın.
- Kapakları, floresan olarak etiketlenmiş numuneler için uygun olan bir damla sulu montaj antanını içeren cam kaydıraklara monte edin. Slaytları görüntülemeye hazır olana kadar slayt klasöründe 4 °C'de saklayın.
7. Kütle spektrometresi ile birleşen sıvı kromatografi silikatografi kullanılarak proteom analizi için numune hazırlama
- Kültürlü nöronların lysis
- Kuyudaki tüm kültür ortamını nazikçe kaldırın. Soğuk, steril kalsiyum ve magnezyum içermeyen fosfat tamponlu salin (PBS), pH 7.4 ile değiştirin. Hızlı bir şekilde çıkarın ve PBS ile değiştirin ve 5 dakika boyunca oturup sağlar. Bu adım kültür medyasında bulunan proteinleri uzaklaştırmak için yapılır.
- Dikkatle belirli bir tedavi için tüm kuyulardan tüm PBS kaldırın. İşlemi bir kez daha tekrarlayın. Nöronal hasarı ve proteozisi en aza indirmek için hücreleri lysing yaparken buz üzerinde plakaları koruyun.
- Kuyulardan birine 50 mM amonyum bikarbonat, pH 7,5 (NH4HCO3)100 - 150 μL ekleyin ve steril bir hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri kazıyın. Bir mikropipet kullanarak, sıvı transferi ve belirli bir tedavi için tüm kuyular ile kazıma işlemi tekrarlayın. Hücrelerin çoğunun çıkarıldığından emin olmak için kazıma sonra mikroskop altında kuyuları inceleyin.
- Nöron sayısının düşük olmasıyla, proteomik analiz için yeterli konsantrasyonu sağlamak için hücreleri lyse sınırlı bir hacim kullanın.
- Hücre lisi ile yardımcı olmak için çözeltiyi bir gecede -80 °C'de dondurun. Lysates daha fazla işleme hazır olana kadar bu aşamada saklanabilir.
- Çözüldükten sonra, hücreleri mekanik olarak eritmek için numuneleri 26 G veya 28 G iğnesi ile bir şırınga dan fışkırtın.
- 10 dakika boyunca iki kez sonicating su banyosuörnekleri sonicate. Proteinlerin aşırı ısınmasını ve denatürasyonunu önlemek için su banyosuna buz ekleyin. 12.000 x g4 °C'de 5 dakika santrifüj .
- Protein konsantrasyonu ölçün. Tipik protein konsantrasyonları 0,4 - 1 μg/μL arasında değişmektedir
- Proteom analizi için numune hazırlama ve tripsin sindirimi
- En fazla 60 μL lysate veya 50 μg proteini DNase-, RNase ve proteease-free-free 1.5 mL tüpe aktarın. Lysat'ın hacmi 60 μL'den azsa, hacmi oluşturacak kadar 50 mM amonyum bikarbonat ekleyin.
- % 0.2 asit labile yüzey aktif madde ve girdap 25 μL ekleyin. Tüpü 80 °C'de bir blok ısıtıcıda 15 dakika kuluçkaya yatırın. Tüpü 12.000 x g'de 30 s için santrifüj edin.
- 100 mM dithiothreitol ve girdap 2.5 μL ekleyin. Bu protein daha alkilyasyon ve sindirim için erişilebilir hale getirir. Tüpü 60 °C'de bir blok ısıtıcıda 30 dakika kuluçkaya yatırın. Oda sıcaklığına ve santrifüje kadar serin.
- Numune ve girdaba 2,5 μL 300 mM iodoacetamide ekleyin. Bu adım sisteinallate yardımcı olur ve disülfit bağları reform onları engeller. Tüpleri 30 dakika boyunca karanlıkta oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın.
- Bir tripsinde tüpe kütle spektrometresi dereceli tripsin (0.5 g/μL) ekleyin: protein oranı 1:10. Numuneleri bir gecede 37 °C'de sindirin.
- % 5 trifloroasetik asit (TFA) ve girdap 10 μL ekleyin. Örnekleri 37 °C'de 90 dakika kuluçkaya yatırın. Bu adım, kütle spektrometresi sırasında paraziti önlemek için asit labile yüzey aktif hidrolize etmek için gereklidir.
- Numuneleri 4 °C'de 12.000 x g'da 30 dakika santrifüj edin ve ön yarık Teflon/Silikon septum kapaklı kromatografi sertifikalı berrak cam şişeye aktarın. Numuneler kütle spektrometresi analizi öncesinde -20 °C'de saklanabilir.
- Örnek şişeleri yüksek tanımlı kütle spektrometresi ile birleştiğinde sıvı kromatografiye tabi talın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Embriyonik SCG nöronların nöronal kültürleri izole etmek ve sürdürmek
Sıçan embriyonik SCG'sinden ayrıştırılan hücreler poli-D-lizin kaplı plaka veya coverslip ile kaplandı ve b-sinir büyüme faktörü içeren serumsuz kültür ortamlarında muhafaza edildi. Nöronlar ve glial hücrelerin karışımını içeren ayrışmış hücreler kaplama üzerine dairesel görünürler (Şekil 1A). Kaplamadan sonraki 24 saat içinde nöronlar glial hücrelerin düzeşme ve faz kontrastlı mikroskopi altında faz-koyu görünmesi ile küçük aksonal süreçleri genişletirler (Şekil 1B). Ara-C ile yapılan tedaviden sonra glial hücrelerin %99'u ortadan kaldırılır ve kültürlerde oval hücre gövdesi, geniş aksonal büyüme ve dendrit içermeyen ağırlıklı nöronal hücreler bulunur(Şekil 1C).
Kültürlü embriyonik sıçan üstün servikal gangliyon nöronlarının immünositokimyasal boyanması
Önceki çalışmalar, serumsuz ortamda yetiştirilen kültürlü sempatik nöronların sadece aksonları uzattığını ve sadece temel membran ekstresi, %10 serum veya 50 ng/mL kemik morfogenetik protein-7 (BMP-7)2,12varlığında ayrıntılı bir dendritik arbor uzadığını göstermiştir. Bu gözlemlerle uyum içinde faz kontrast mikroskobu, 5 gün boyunca BMP-7 (50 ng/mL) varlığında yetişen nöronların serumsuz kontrol ortamlarında yetişen nöronlarla karşılaştırıldığında birden fazla kalın konik prosese sahip düzleştirilmiş bir hücre gövdesine sahip olduğunu göstermektedir (Şekil 2). Dendritler olarak bu süreçlerin kimliği MAP-2 varlığı ile doğrulanır, ağırlıklı olarak hücre vücudunda bulunan bir sitoskeletal protein ve dendritler19,20. Kontrol koşulları altında, MAP-2 için floresan boyama sitoplazma ve proksimal aksonlarla gözlenir ve çekirdekten çıkarılır (çekirdeği görselleştirmek için nükleer bir leke ile birlikte etiketlenerek kanıtlanır(Şekil 3A-3D). 5 gün boyunca 50 ng/mL'de BMP-7 ile tedavi den sonra MAP-2 için immünoreaktivite sadece sitoplazmada değil, dendritlerde de gözlenmektedir(Şekil 3E-3H).
Kontrol medyasında yetişen kültürlü SCG nöronların örnek proteomik analizi
E21 sıçan sempatik nöronlar kontrol medyasında 6 gün boyunca in vitro, lysed ve LC-MS analizine tabi kültürlendi. Örnek kütle spektrometresi üzerinde üç kopya halinde çalıştırıldı ve proteinler her örnek için gözlenen parçalanmış peptid sayısına göre tanımlandı. Proteinlerin bolluğu (0 ile 300.000 arasında değişen keyfi birimler) ve her protein için gözlenen parçalanmış peptid sayısına göre protein kimliği için güven puanı (5 - 500 arasında) hesaplandı. Serumsuz kontrol ortamlarında kültüre salınan SCG nöronlarından 30 μg proteinproteomunun kütle spektrometrik analizinden elde edilen örnek veri seti Şekil 4'tegösterilmiştir.
Örnekte 1287 proteine karşılık gelen 13,134 peptid saptamıştır. Bunlardan 1100'ü, 500'den büyük normalleştirilmiş bolluk değerleriyle üç teknik çoğaltmada da mevcuttu. Bu 1100 proteinden 90'ı tek bir peptit çarpması sonucu tanımlanmıştır ve bu proteinler proteinin sadece küçük bir kısmını kaplar. Bu nedenle, tanımlamanın doğru olup olmadığını belirlemek zordu ve bu proteinlerin protein güven puanı düşüktü (skor <10). Bu proteinler analizden çıkarıldı ve kalan 1010 protein, protokolün farklı lokalizasyon ve fonksiyona sahip proteinlerin saptanmasında başarılı olup olmadığını belirlemek için Gene ontolojisi kullanılarak daha da analiz edildi.
Bu veri kümesinin gen ontoloji siması analizi, bu veri setinin farklı hücresel lokalizasyona veya moleküler ve biyolojik fonksiyonlara sahip proteinleri dahil edip etmediğini belirlemek ve tanımlanan proteinler ile bilinen yollar21arasındaki bağlantıların olup olmadığını incelemek için Panther sınıflandırma veritabanı (http://www.pantherdb.org/) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Analiz, proteinlerin 700'den fazlasının sitoplazmik olmasına rağmen, bu veri setinin çekirdek, membran, çeşitli hücresel organeller ve hücre bağlantıları da dahil olmak üzere hücrenin diğer bölgelerine lokalize proteinler içerdiğini göstermiştir(Şekil 4A). Analiz ayrıca 400'den fazla proteinin katalitik aktiviteye sahip olduğunu ve sinyal yollarında yaklaşık 300 proteinin yer aldığını ortaya koymuştur(Şekil 4B ve Şekil 4C). Buna ek olarak, veri seti çeşitli sinyal yolları dahil proteinler içeriyordu. Tablo 1, g-protein sinyalizasyonu, hücre adezyonu, büyüme faktörü sinyal yolu ve sinaptik vezikül ticareti yollarında sırasıyla veri setinde tanımlanan proteinlerin beşini göstermektedir.
Şekil 1: Kültürlü E21 sıçan embriyonik SCG nöronların morfolojisindeki değişiklikler zaman içinde. E21 sıçan SCG 20 dk kaplama dan sonra ayrışmış hücrelerin 10x büyütme temsil faz kontrast mikroskopisi görüntüleri (A), kaplama sonra bir gün (B) ve Ara-C tedavisinden sonra 48 saat sonra (5 gün kaplama sonra) (C). Glial hücrelerin (oklar) ve aksonal uzantısı (ok başları) içinde(B)varlığı na dikkat edin ve glial hücrelerin ve nöronların yokluğunda geniş aksonal büyüme gösteren(C). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: BMP-7 ile tedavi sonrası E21 sıçan SCG nöronlarının nöronal morfolojisindeki değişiklikler. Nöronal olmayan hücrelerin ortadan kaldırılmasının ardından kültürlü SCG nöronları 5 gün boyunca 50 ng/mL (B) ile kontrol media (A) veya BMP-7 ile tedavi edildi. Temsili faz kontrast mikrograflar (10x büyütme) kontrol nöronlarında akson ile dairesel nöronal hücre gövdesi göstermek (A) ve BMP-7 ile tedavi edildiğinde birden fazla kısa dendrite benzeri süreçleri ile nöronlar (oklar, B). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Kültürlü embriyonik sıçan sempatik nöronlarda MAP-2 proteini için immünboyama. Nöronal olmayan hücrelerin ortadan kaldırılmasının ardından kültürlü SCG nöronları 5 gün boyunca 50 ng/mL(E-H)kontrol ortamı(A-D)veya BMP-7 ile tedavi edildi ve MAP-2'ye karşı fare monoklonal antikor kullanılarak immünojenelendi ve nükleer marker ile birlikte etiketlendi. Nöronların mikrotübüle ilişkili protein-2 (MAP-2)(C,G),faz kontrastmikrografları(B,F)ile bir nükleer leke(D,H)ve üç kanalın birleştirilmesi(A,E)ile immünositokimyasal boyamasını gösteren temsili mikrograflar . Mikrotübül ilişkili protein-2 için immünositokimyasal boyama hücre gövdesi ve kontrol nöronların proksimal aksonları mevcuttur(C) ve hücre vücudunda MAP-2 protein ve BMP-7 tedavi nöronlarda dendritler için boyama(G). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Kültürlü E21 sıçan SCG nöronlarının proteom analizinde tanımlanan proteinlerin sınıflandırılması ve dağılımı. 1100 proteinin protein iþleri, protein yapisýna (C) dayalý hücresel lokalizasyon(A),hücresel fonksiyon ve biyolojik proseslere iliþkin veri kümesindeki proteinlerin daýmýþlarýný incelemek için Panter sınıflandırma sisteminde gen ontoloji analizine tabi tutuldular (B) ve protein yapýsýna(C)göre moleküler fonksiyon sýnýnýn. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| A) Biyolojik yapışmaile ilgili proteinler | ||
| UniProt Katılım Kimliği | Gen adı | Gen sembolü |
| Q9Z1Y3 | Kadherin-2 | Cdh2 |
| O35112 | CD166 antijeni | Alcam |
| P49134 | İntegrin beta-1 | Itgb1 |
| D3ZES7 | Plexin A4 | Plxna4 |
| F1LP44 | Integrin alt birimi alfa L | Itgal |
| B) Büyüme faktörü sinyalizasyonunda rol oynayan proteinler | ||
| P35213 | 14-3-3 protein beta/alfa | Ywhab |
| Q5BJ92 | Serine/Treonin-protein fosfataz 4 katalitik alt birim | Ppp4c |
| P47196 | Rac – alfa serine/treonin protein kiaz | Akt1 |
| P62994 | Büyüme faktörü reseptör bağlı protein 2 | Grb2 |
| P21708 | Mitojen aktive protein kigaz 3 | Mapk3 |
| C) G-protein birleşen sinyal yolu ile uğraşan proteinler | ||
| P08753 | Guanin nükleotit bağlayıcı protein G(k) alt birimi alfa | Gnai3 |
| D4ABV5 | Kalmodülen-2 | Sakin2 |
| P18266 | Glikojen synthase kigaz-3 beta | Gsk3b |
| P09456 | cAMP bağımlı protein kiaz türü I-alfa düzenleyici alt birim | Prkar1a |
| P53534 | Glikojen fosforilaz | Pygb (beyin formu) |
| D) Sinaptik vezikül ticaretinde rol oynayan proteinler | ||
| P47861 | Sinaptotagmin-5 | Syt5 |
| P63045 | Vezikül ilişkili membran proteini 2 | Vamp2 |
| P61265 | Sözdizimi-1B | Stx1b |
| Q63537 | Sinapsin-2 | Syn2 |
| P60881 | Sinaptozomal ilişkili protein 25 | Snap25 |
Tablo 1: Kültürlü sıçan embriyonik SCG nöronlarından proteom verilerinde tanımlanan ve biyolojik fonksiyonlarına göre sınıflandırılan temsili proteinler. 1100 proteinli proteom verileri Panter sınıflandırma sistemi kullanılarak gen ontolojisi analizine tabi tutuldu. Aşağıda dört biyolojik yol için tanımlanan ilk beş protein listelenmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yazı, embriyonik sıçan yavrularının üstün servikal gangliyonundan sempatik nöronların kültürlendirilmesi için protokolleri açıklamaktadır. Bu model sistemi kullanmanın avantajları, büyüme faktörlerine benzer bir yanıt veren nöronların homojen bir popülasyon elde etmek mümkün olmasıdır, ve bu nöronlar için büyüme faktörü gereksinimleri iyi karakterize olduğundan, serumsuz koşullar altında, tanımlanmış ortamda vitro bu nöronlar büyümek mümkündür10. Protokol E21 sıçan yavrularından SCG izole süreci açıklasa da, bu protokol E17'den E21'e kadar sıçan yavrularından SCG diseksiyonu ve embriyonik fare SCG10,,22,23diseksiyon için kullanılabilir. Bu diseksiyon protokolü, ilk adımlarda küçük değişiklikler yapılan doğum sonrası sıçanlardan SCG izole etmek için de kullanılabilir. Bu değişiklikler arasında sezaryen ihtiyacının ortadan kaldırılması, karbondioksit kullanan postnatal hayvanların ötanazisi ve ötanazi sonrası doğum sonrası yavruların kısırlaştırılması% 70 alkol pups daldırma tarafından, önce diseksiyon media10onları transfer. Bu nöronal kültür protokolü de aksonal rehberlik, aksonal taşıma ve campenot odaları ve mikroakışkan odaları24,25kullanarak sinaps oluşumu nu incelemek için adapte edilebilir. Bu nöronlar da co-dorsal kök ganglia veya spinal motor nöronlar veya kardiyomiyositler ile nöronal etkileşimleri ve nöron çalışma nöron lar ile kültürlü olabilir – periferik sinir sisteminde hedef etkileşimleri26,27,28,29.
Immünositokimyasal çalışmalar için kültürlü SCG nöronların kullanımı iyi belgelenmiştir. Kağıt açıklanan protokol çoğu antikor ile çalışmak için iyi bir başlangıç noktası sağlar. Ancak, fiksasyon protokolü ve permeabilizasyon protokolünde değişiklik gerektirebilecek nükleer proteinleri tespit edenler gibi antikorlar vardır. Fosfo-SMAD antikordurumunda -20 °C'de %100 metanol ile tedavi,30,31nöronların sabitlenmesi ve permeabilizasyonu için kullanılmıştır.
Bu model sisteminde çalışma ana sınırlamalar embriyonik sıçan yavrularında SCGs küçük boyutu ndan kaynaklanıyor, hangi nöronların az sayıda sonuçlanır. Bu yavrubir çöp diseksiyon elde edilebilir nükleik asitler veya protein sınırlı miktarda sonuçlanır. Bu genomik ve proteomik analiz için sorunlu olabilir, özellikle bir diseksiyon birden fazla tedavi arasında karşılaştırırken. Ayrıca tek bir embriyodan SCG nöronal kültürler elde etmek mümkün değildir. Bu nedenle tüm deneyler, bir çöpteki tüm sıçan embriyolarının SCG'sinden elde edilen havuzlu numuneler üzerinde gerçekleştirilir. Sistemin bir diğer sınırlamasi scg nöronlar düşük DNA transfeksiyon verimliliği (10 - 20%, yayınlanmamış gözlemler) ve merkezi nöronlar ile karşılaştırıldığında transfeksiyon sonrası yüksek toksisite olmasıdır32. Bu transfeksiyon verimliliği münferit nöronlar ile morfolojik çalışmalar için iyi olmasına rağmen, gen ekspresyonu değişiklikleri tespit / onaylamak için moleküler veya biyokimyasal çalışmalar yapmak zordur.
Ancak, son yıllarda, kültürlü SCG nöronlar dendritik büyüme altında yatan mekanizmaları inceleyen çalışmalar ve transkripsiyon ve miRNom analizleri için kullanılmıştır14,15,33. Daha önce de belirtildiği gibi, düşük protein miktarları nedeniyle, embriyonik SCG kültürlü nöronlar daha önce proteomik analiz için kullanılmamıştır. Bu protokol ve temsili sonuçlar, düşük numune konsantrasyonu yla bile, mevcut yüksek tanımlı kütle spektrometresi aletlerinin bu nöronlar üzerinde proteomik çalışmalarda kullanılabileceğini kanıtlamaktadır. Burada açıklanan numune hazırlama protokolü SCG nöronlar için olmasına rağmen, bu protokol LC-MS analizi için düşük protein konsantrasyonu olan herhangi bir numunenin hazırlanması için kullanılabilir. Sınırlamalardan biri, protein konsantrasyonu veya tripsin sindirim in verimliliği küçük farklılıklar eksik parçalanma ve LC-MS tarafından tespit protein sayısında dramatik bir azalmaya neden olabilir. Bu nedenle, başlangıç protein konsantrasyonlarının 10:1 protein oranı ile 50 μg'a yakın olduğundan emin olmak önemlidir: tripsin. Ayrıca, birden fazla donma-çözülme döngüleri önlemek için kütle spektrometresi dereceli tripsin aliquot iyi bir uygulamadır.
Protokolün bir diğer sınırlaması da proteomda sadece sınırlı sayıda transmembran proteini tespit edildiğidir. Asit labile sürfaktan kütle spektrometresi için etkili bir yüzey aktif olduğu gösterilmiştir iken, kültürlü hücreler üzerinde bir önceki çalışmada bu yüzey aktif ediciler biraz sitoplazmik protein sayısını artırmak ve proteomik profil membran proteinleri azaltabilir bulundu34. Ayrıca, bu lys-C gibi bakteriyel bir endopeptidaz kullanarak ön sindirim, tripsin sindirim önce membran bağlı proteinlerin tripsin sindirim verimliliğini artırabilir ve LC sütunlarda muhafaza membran protein parçaları önlemek önerilmiştir35.
Özetle, bu yazı kültürlü sıçan embriyonik sempatik nöronlar büyüyen ve bu nöronlar üzerinde morfolojik ve proteomik çalışmalar yapmak için ayrıntılı protokoller sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, Saint Mary's College of California'daki Fakülte Geliştirme Fonu ve Yaz Araştırma Programı hibesi tarafından desteklenmiştir. Yazarlar ayrıca Davis California Üniversitesi'nden Dr. Pamela Lein'e ve UC Berkeley Kütle spektrometresi tesisinden Dr. Anthony Iavarone'ye bu protokollerin geliştirilmesi sırasında ki tavsiyeleri için teşekkür etmek isterler. Yazarlar ayrıca Video prodüksiyonu ve kurgusu ndaki yardımları için Saint Mary's College of California'daki College Communications OfisindeHaley Nelson'a teşekkür etmek istiyor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2D nanoACQUITY | Waters Corporation | ||
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| BMP-7 | R&D Systems | 354-BP | |
| Bovine Serum Alumin | Sigma-Aldrich | 5470 | |
| Cell scraper | Corning | CLS-3010 | |
| Collagenase | Worthington Biochemical | 4176 | |
| Corning Costar or Nunc Flat bottomed Cell culture plates | Fisher Scientific | 07-200, 140675, 142475 | |
| Cytosine- β- D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich | C1768 | |
| D-phosphate buffered saline (Calcium and magnesium free) | ATCC | 30-2200 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 15230 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| DMEM - Low glucose + Glutamine, + sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11885 | |
| Fatty Acid Free BSA | Calbiochem | 126609 | 20 mg/mL stock in low glucose DMEM |
| Fine forceps Dumont no.4 and no.5 | Ted Pella Inc | 5621, 5622 | |
| Forceps and Scissors for Dissection | Ted Pella Inc | 1328, 1329, 5002 | |
| Glass coverlips - 12mm | Neuvitro Corporation | GG-12 | |
| Goat-Anti Mouse IgG Alexa 488 conjugated | Thermo Fisher Scientific | A32723 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 11765 | |
| Hank's balanced salt soltion (Calcium and Magnesium free) | Thermo Fisher Scientific | 14185 | |
| Insulin-Selenium-Transferrin (100X) | Thermo Fisher Scientific | 41400-045 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | A3221 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030 | |
| Leibovitz L-15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
| Mounting media for glass coverslips | Thermo Fisher Scientific | P36931, P36934 | |
| Mouse-anti- MAP2 antibody (SMI-52) | BioLegend | SMI 52 | |
| Nerve growth factor | Envigo Bioproducts (formerly Harlan Bioproducts) | BT5017 | Stock 125 μg/mL in 0.2% Prionex in DMEM |
| Paraformaldehye | Spectrum Chemicals | P1010 | |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15140 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| Prionex | Millipore | 529600 | 10% solution, 100 mL |
| RapiGest SF | Waters Corporation | 186001861 | 5 X 1 mg |
| Synapt G2 High Definition Mass Spectrometry | Waters Corporation | ||
| Trifluoro acetic acid - Sequencing grade | Thermo Fisher Scientific | 28904 | 10 X 1 mL |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trypsin | Promega or NEB | V511A, P8101S | 100 μg or 5 X 20 mg |
| Waters Total recovery vials | Waters Corporation | 186000385c |
References
- Rees, R. P., Bunge, M. B., Bunge, R. P. Morphological Changes in the neuritic growth cone and target neuron during synaptic junction development in culture. Journal of Cell Biology. 9, (1976).
- Chandrasekaran, V., Lein, P. J. Regulation of Dendritogenesis in Sympathetic Neurons. Autonomic Nervous System. , (2018).
- Higgins, D., Burack, M., Lein, P., Banker, G. Mechanisms of neuronal polarity. Current Opinion in Neurobiology. 7 (5), 599-604 (1997).
- Lein, P., Guo, X., Hedges, A. M., Rueger, D., Johnson, M., Higgins, D. The effects of Extracellular Matrix And Osteogenic Protein-1 on the morphological differentiation of rat sympathetic neurons. International Journal of Developmental Neuroscience. 14 (3), 203-215 (1996).
- Kobayashi, M., Fujii, M., Kurihara, K., Matsuoka, I. Bone morphogenetic protein-2 and retinoic acid induce neurotrophin-3 responsiveness in developing rat sympathetic neurons. Molecular Brain Research. 53 (1-2), 206-217 (1998).
- Burnham, P., Louis, J. C., Magal, E., Varon, S. Effects of ciliary neurotrophic factor on the survival and response to nerve growth factor of cultured rat sympathetic neurons. Developmental Biology. 161 (1), 96-106 (1994).
- Hou, X. E., Li, J. Y., Dahlström, A. Clathrin light chain and synaptotagmin I in rat sympathetic neurons. Journal of the Autonomic Nervous System. 62 (1-2), 13-26 (1997).
- Harris, G. M., et al. Nerve Guidance by a Decellularized Fibroblast Extracellular Matrix. Matrix Biology. , 176-189 (2017).
- Wingerd, K. L., et al. α4 integrins and vascular cell adhesion molecule-1 play a role in sympathetic innervation of the heart. Journal of Neuroscience. 22 (24), 10772-10780 (2002).
- Higgins, D., Lein, P., Osterhout, D. J., Johnson, M. Tissue culture of autonomic neurons. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge, MA. 177-205 (1991).
- Lein, P., Johnson, M., Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 induces dendritic growth in rat sympathetic neurons. Neuron. 15 (3), 597-605 (1995).
- Bruckenstein, D. A., Higgins, D. Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. Developmental Biology. 128 (2), 337-348 (1988).
- Voyvodic, J. T. Development and regulation of dendrites in the rat superior cervical ganglion. The Journal of Neuroscience. 7 (3), 904-912 (1987).
- Garred, M. M., Wang, M. M., Guo, X., Harrington, C. A., Lein, P. J. Transcriptional Responses of Cultured Rat Sympathetic Neurons during BMP-7-Induced Dendritic Growth. PLoS ONE. 6 (7), 21754 (2011).
- Pravoverov, K., et al. MicroRNAs are Necessary for BMP-7-induced Dendritic Growth in Cultured Rat Sympathetic Neurons. Cellular and Molecular Neurobiology. 39 (7), 917-934 (2019).
- Natera-Naranjo, O., Aschrafi, A., Gioio, A. E., Kaplan, B. B. Identification and quantitative analyses of microRNAs located in the distal axons of sympathetic neurons. RNA (New York, N.Y.). 16 (8), 1516-1529 (2010).
- Aschrafi, A., et al. Angiotensin II mediates the axonal trafficking of tyrosine hydroxylase and dopamine β-hydroxylase mRNAs and enhances norepinephrine synthesis in primary sympathetic neurons. Journal of Neurochemistry. 150 (6), 666-677 (2019).
- Ghogha, A., Bruun, D. a, Lein, P. J. Inducing dendritic growth in cultured sympathetic neurons. Journal of Visualized Experiments. (61), 4-8 (2012).
- Caceres, A., Banker, G., Steward, O., Binder, L., Payne, M. MAP2 is localized to the dendrites of hippocampal neurons which develop in culture. Brain Research. 315 (2), 314-318 (1984).
- Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 and related bone morphogenetic proteins regulate dendritic growth and the expression of microtubule-associated protein-2 in rat sympathetic neurons. Neuroscience Letters. 245 (3), 131-134 (1998).
- Mi, H., et al. PANTHER version 11: Expanded annotation data from Gene Ontology and Reactome pathways, and data analysis tool enhancements. Nucleic Acids Research. 45, 183-189 (2017).
- Chandrasekaran, V., et al. Retinoic acid regulates the morphological development of sympathetic neurons. Journal of Neurobiology. 42 (4), (2000).
- Courter, L. A., et al. BMP7-induced dendritic growth in sympathetic neurons requires p75 NTR signaling. Developmental Neurobiology. 76 (9), 1003-1013 (2016).
- Lein, P. J., Fryer, A. D., Higgins, D. Cell Culture: Autonomic and Enteric Neurons. Encyclopedia of Neuroscience. , 625-632 (2009).
- Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In vitro Tools for Neurobiological Research. Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
- Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9 (1), 82 (2016).
- Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. Lectin-based isolation and culture of mouse embryonic motoneurons. Journal of Visualized Experiments. (55), e3200 (2011).
- Takeuchi, A., et al. Microfabricated device for co-culture of sympathetic neuron and iPS-derived cardiomyocytes. Proceedings of the Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, EMBS. 2013, 3817-3820 (2013).
- Takeuchi, A., et al. Development of semi-separated co-culture system of sympathetic neuron and cardiomyocyte. Proceedings of the 31st Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society: Engineering the Future of Biomedicine, EMBC 2009. , 1832-1835 (2009).
- Chandrasekaran, V., Lea, C., Sosa, J. C., Higgins, D., Lein, P. J. Reactive oxygen species are involved in BMP-induced dendritic growth in cultured rat sympathetic neurons. Molecular and Cellular Neuroscience. 67, (2015).
- Kim, W. Y., et al. Statins decrease dendritic arborization in rat sympathetic neurons by blocking RhoA activation. Journal of Neurochemistry. 108 (4), 1057-1071 (2009).
- Dalby, B., et al. Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: Primary neurons, siRNA, and high-throughput applications. Methods. 33 (2), 95-103 (2004).
- Szpara, M. L., et al. Analysis of gene expression during neurite outgrowth and regeneration. BMC Neuroscience. 8 (1), 100 (2007).
- Pop, C., Mogosan, C., Loghin, F. Evaluation of rapigest efficacy for the digestion of proteins from cell cultures and heart tissue. Clujul Medical. 87 (4), 5 (2014).
- Vit, O., Petrak, J. Integral membrane proteins in proteomics. How to break open the black box. Journal of Proteomics. 153, 8-20 (2017).
