Summary
Dieses Papier beschreibt die Isolierung und Kultivierung von embryonalen Ratten sympathischen Neuronen aus den überlegenen zervikalen Ganglien. Es bietet auch detaillierte Protokolle für immunzytochemische Färbung und für die Vorbereitung neuronaler Extrakte für die Massenspektrometrie-Analyse.
Abstract
Sympathische Neuronen aus der embryonalen Ratte überlegene Zervixganglien (SCG) wurden als In-vitro-Modellsystem für periphere Neuronen verwendet, um axonales Wachstum, Axonalhandel, Synaptogenese, dendritisches Wachstum, dendritische Plastizität und Nerven-Ziel-Wechselwirkungen in Co-Kultur-Systemen zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung und Dissoziation von Neuronen von den überlegenen zervikalen Ganglien von E21-Rattenembryonen, gefolgt von der Herstellung und Aufrechterhaltung reiner neuronaler Kulturen im serumfreien Medium. Da Neuronen nicht an unbeschichtetem Kunststoff haften, werden Neuronen entweder auf 12 mm Glasabdeckungen oder 6-Well-Platten mit Poly-D-Lysin beschichtet kultiviert. Nach der Behandlung mit einem antimitatischen Mittel (Ara-C, Cytosin-D-Arabinofuranosid) erzeugt dieses Protokoll gesunde neuronale Kulturen mit weniger als 5% nicht-neuronalen Zellen, die über einen Monat in vitro aufrechterhalten werden können. Obwohl embryonale Ratten-SCG-Neuronen multipolar mit 5-8 Dendriten in vivo sind; unter serumfreien Bedingungen dehnen sich diese Neuronen nur ein einziges Axon in der Kultur aus und sind für die Dauer der Kultur weiterhin unipolar. Jedoch, Diese Neuronen können induziert werden, um Dendriten in Gegenwart von Kellermembran-Extrakt, Knochen morphogenetische Proteine (BMPs) oder 10% fetales Kalbsserum zu erweitern. Diese homogenen neuronalen Kulturen können für immunzytochemische Färbung und für biochemische Studien verwendet werden. In diesem Beitrag wird auch das optimierte Protokoll für die immunzytochemische Färbung für Mikrotubuli-assoziiertes Protein-2 (MAP-2) in diesen Neuronen und für die Herstellung neuronaler Extrakte für die Massenspektrometrie beschrieben.
Introduction
Sympathische Neuronen, die aus embryonalen überlegenen Halsbandlien (SCG) abgeleitet wurden, wurden weithin als primäres neuronales Kultursystem für die Untersuchung vieler Aspekte der neuronalen Entwicklung verwendet, einschließlich Wachstumsfaktorabhängigkeit, Neuron-Ziel-Interaktionen, Neurotransmitter-Signalisierung, Axonalwachstum, Dendritenentwicklung und Plastizität, Synaptogenese und Signalmechanismen, die Nervenziel-/Neuron-Glia-Wechselwirkungen zugrunde liegen1,2,3,4,5,,,6 ,7,9,9 ,. Trotz ihrer geringen Größe (ca. 10000 Neuronen/Ganglien) gibt es drei Hauptgründe für die Entwicklung und den umfassenden Einsatz dieses Kultursystems sind i) die ersten Ganglien in der sympathischen Kette, sie sind größer und daher leichter zu isolieren, als der Rest der sympathischen Ganglien10; ii) Im Gegensatz zu zentralen Neuronen sind die Neuronen im SCG ziemlich homogen, wobei alle Neuronen aus dem neuralen Kamm abgeleitet sind, eine ähnliche Größe haben, vom Nervenwachstumsfaktor abhängig sind und nor-adrenergen sind. Dies macht sie zu einem wertvollen Modell für morphologische und genomische Studien10,11 und iii) diese Neuronen können in einem definierten serumfreien Medium gehalten werden, das Nervenwachstumsfaktor für mehr als einen Monat10,12enthält. Perinatale SCG-Neuronen wurden ausgiebig für die Untersuchung der Mechanismen verwendet, die der Initiierung und Wartung von Dendriten zugrunde liegen2. Dies liegt vor allem daran, dass SCG-Neuronen zwar eine ausgedehnte dendritische Laube in vivo haben, aber sie nicht in vitro in Abwesenheit von Serum ausdehnen, sondern in Gegenwart bestimmter Wachstumsfaktoren wie Knochenmorphogenetische Proteine2,12,13zum Anbau von Dendriten induziert werden können.
Dieses Papier beschreibt das Protokoll zur Isolierung und Kultivierung embryonaler Ratten-SCG-Neuronen. In den letzten 50 Jahren wurden primäre neuronale Kulturen aus dem SCG hauptsächlich für morphologische Studien verwendet, wobei eine begrenzte Anzahl von Studien die groß angelegten genomischen oder proteomischen Veränderungen untersuchten. Dies ist hauptsächlich auf die geringe Gewebegröße zurückzuführen, die zur Isolierung geringer Mengen an DNA oder Protein führt, was es schwierig macht, genomische und proteomische Analysen an diesen Neuronen durchzuführen. Jedoch, in den letzten Jahren, erhöhte Nachweisempfindlichkeit hat die Entwicklung von Methoden zur Untersuchung des Genoms, miRNome und Proteom in den SCG-Neuronen während der dendritischen Wachstumsentwicklung14,15,16,17ermöglicht. In diesem Beitrag wird auch die Methode zur morphologischen Analyse dieser Neuronen mit Hilfe der Immunzytochemie und eines Protokolls zur Gewinnung neuronaler Proteinextrakte für die Massenspektrometrieanalyse beschrieben.
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Protocol
Alle Verfahren, die in Studien mit Tieren durchgeführt wurden, wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) am Saint Mary es College of California genehmigt. Die Richtlinien für die Tierpflege und -nutzung am St. Mary es College wurden auf der Grundlage der Richtlinien des Office of Laboratory Animal Welfare am National Institute for Health (https://olaw.nih.gov/sites/default/files/PHSPolicyLabAnimals.pdf und https://olaw.nih.gov/sites/default/files/Guide-for-the-Care-and-Use-of-Laboratory-Animals.pdf) entwickelt.
1. Vorbereitung von Kulturmedien (auch als Kontrollmedium bezeichnet)
- Fügen Sie die folgenden Zutaten in der unten aufgeführten Reihenfolge zu einem sterilen 500 ml Kolben hinzu: 190 ml 1x Glukose-Low-Glucose DMEM, 10 ml mit 20 mg/ml fettsäurefreiem Rinderserumalbumin(FAF-BSA) in DMEM, 2,8 ml 200 ml L-Glutamin, 4 ml 100x Insulin-Selen-Transferrin-Mischung, 0,4 ml mit 125 g/ml Nervenwachstumsfaktor (bei 0,2% inertes Proteinstabilisator in DMEM) und 200 ml des Schinken-Mediums F-12.
- Achten Sie darauf, die Pipette mit dem Medium zu beschichten, das FAF-BSA enthält, bevor Sie proteinhaltige Lösungen wie Insulin-Selen-Transferrin und NGF hinzufügen, um das Kleben von Proteinen an der Pipette zu verhindern.
- Wirbeln Sie den Kolben, um die Zutaten nach jeder Zugabe zu mischen. Mischen Sie gründlich mit einer 25 ml Pipette nach Zugabe von F-12.
- Aliquot die Kulturmedien in 10 ml aliquots und lagern bei -80 °C. Die Aliquots können sechs Monate lang ohne Aktivitätsverlust gelagert werden.
2. Vorbereitung von Platten zur Kultivierung von Neuronen
- Verdünnen Sie einen 1 mg/ml-Bestand an Poly-D-Lysin (hergestellt in 0,5 M Tris-Puffer, pH 8) auf 100 g/ml mit sterilem destilliertem Wasser.
- Für die proteomische oder genomische Analyse, ein bis zwei Tage vor der Zerlegung, beschichten 6-Well-Platten mit etwa 2 ml sterilen 100 g/ml Poly-D-Lysin (PDL). Dies ist notwendig, um die Zellhaftung am Brunnen zu gewährleisten. Die Platten mit Klebefolie umwickeln und die Platten über Nacht bei 4 °C lagern.
- Für die morphologische Analyse und Mikroskopie 12 mm2 vorbehandelte deutsche Glasabdeckungen (die mit Salpetersäurebehandlung wie zuvorbeschrieben 18 oder gekauft gereinigt werden können) in jeden brunnen einer 24-Well-Platte geben.
- Beschichten Sie die Abdeckungen mit 0,3 ml sterilem 100 g/ml Poly-D-Lysin (PDL). Lagern Sie die Platten über Nacht bei 4 °C.
- Am Tag der Zerlegung, vor Beginn der Zerlegung, entfernen Sie die Poly-D-Lysin-Lösung aus den Brunnen und spülen Sie die Brunnen fünfmal mit steril emstilliertem Wasser, gefolgt von einmal mit niedrigem Glukose-DMEM.
- Während der enzymatischen Verdauung der Ganglien (ca. eine Stunde vor dem Beschichten der Zellen) das DMEM von den Platten absaugen und durch 0,3 ml Steuermedien ersetzen. Lagern Sie die Platten bei 35,5 °C unter 5%CO2 in einer befeuchteten Kammer.
3. Dissektions-Setup
- Vorbereitung von 200 ml Medien zur Zerlegung (sogenannte Dissektionsmedien)
- 8 ml mit 20 mg/ml fettsäurefreiem Rinderserumalbumin (FAF-BSA) in glukosearmem DMEM (mit 1 mg/ml Glukose) und 2 ml 100x Penicillin-Streptomycin zu 193 ml sterilem Leibovitz-Medium L-15 (oder einem luftgepufferten Medium) hinzufügen.
- In der Haube die folgenden Teile für die Zerlegung aufstellen: vier 50 ml sterile konische Rohre mit ca. 20 ml Dissektionsmedien in jedem Rohr, vier sterile 35-mm-Schalen mit 1,5 ml Dissektionsmedien, ein steriles 50 ml konisches Rohr mit 20 ml Dissektionsmedium für die Zentrifugation, ein steriles 15 ml-Konikonrohr zur Zentrifugation der Ganglia und ein steriles 10 ml-Rohr zum Sammeln der dissoziierten Zellen.
- Verwenden Sie einen trockenen Perlensterilisator, um ein Paar feine Zangen (Nr. 4 oder Nr. 5 Zangen) für mindestens eine Minute zu sterilisieren.
4. Isolierung der überlegenen Zervixganglien von embryonalen Rattenwelpen
- Entfernung von E21-Embryonen von der trächtigen Ratte
HINWEIS: Die Entfernung des Gebärmutterhorns kann außerhalb der Haube durchgeführt werden, wenn die Umgebung gründlich sterilisiert ist.- Euthanisieren Sie die2 schwangere Ratte mit CO2-Inhalation. Das Fell aus dem Bauchbereich scheren und die Haut in der Gegend mit 70% Alkohol abwischen, um es zu sterilisieren.
- Mit einem frischen Satz von sterilen Scheren und Zangen, durch die Haut und dann die Muskelschicht schneiden, um die Gebärmutterhörner mit den Embryonen zu belichten. Entfernen Sie die Uterushörner mit den Embryonen mit einer neuen Reihe von Scheren und Zangen, wobei darauf geachtet wird, den Darm dabei nicht zu beschädigen.
- Die Uterushörner mit den Embryonen in eine 150 mm2 sterile Petrischale geben und in die Haube geben.
- Mit einem neuen Satz von Zangen und Scheren, entfernen Sie die Embryonen aus dem Gebärmutterhorn und trennen Sie die Embryonen von den Fruchtwassermembranen und der Plazenta.
- Um die Embryonen einzuschläfern, schneiden Sie das Rückenmark der Embryonen entlang der Mittellinie unter dem rechten Arm. Dies wird auch die Blutung aus der Halsschlagader während der Entfernung des SCG reduzieren.
- Übertragen Sie diese Embryonen in die präparierten 50 ml konischen Röhren, die Dissektionsmedien enthalten. Stellen Sie sicher, dass die Embryonen in den Medien untergetaucht sind. Jede Röhre kann bis zu 3 Embryonen aufnehmen.
- Isolierung des überlegenen Halsbandlions vom Embryo
- Einen Welpen aus dem Seziermedium auf eine sterile 150 mm2 Petrischale halbgefüllt mit festem Substrat (entweder Paraffinwachs oder Silikonpolymer) mit seiner dorsalen Oberfläche auf dem Substrat übertragen. Mit drei sterilen 23 G Nadeln, pin den Welpen auf die Schale mit einer Nadel unter jedem Arm und eine dritte Nadel durch den Mund, um vorsichtig hyperextend den Hals.
- Schneiden Sie die Haut im Nackenbereich mit sterilen feinen Zangen (Nr. 4 oder Nr. 5 Zangen) durch, um die Speicheldrüsen darunter freizulegen. Entfernen Sie diese Drüsen mit feinen Zangen.
- Suchen Sie die sternocleidomastoiden und omohyiden Muskeln in der Nähe des Schlüsselbeins bzw. der Luftröhre. Schneiden Sie zuerst die transversalen sternocleidomastoiden Muskeln und dann vorsichtig schneiden Sie den dünnen omohyoiden Muskel mit feinen Zangen. Sobald diese Muskeln entfernt sind, wird die Bifurkation in der Halsschlagader am vorderen Ende auf beiden Seiten der Luftröhre sichtbar sein, wobei sich das SCG unter dieser Gabel in der Halsschlagader befindet.
- Heben Sie die Halsschlagader mit geschlossenen Zangen vorsichtig an, um das SCG zu visualisieren. Mit einer Zange auf beiden Seiten des SCG, ziehen Sie die Carotis und übertragen Sie es auf die vorbereiteten sterilen 35 mm2 Gerichte. Dieses Gewebe wird höchstwahrscheinlich das SCG mit der Halsschlagader, den Vagusnerv mit den Nodose-Ganglien sowie andere Segmente von Muskel oder Fett in der Gegend enthalten.
- Wiederholen Sie den Seziervorgang auf der anderen Seite. Entfernen Sie SCGs von allen Embryonen, bevor Sie mit den unten beschriebenen verbleibenden Sezierschritten fortfahren. Verteilen Sie die isolierten Gewebe zwischen zwei der 35 mm2 Schalen, um die Verarbeitung der Gewebeproben zu erleichtern.
- Nachbearbeitung von SCG
- Um das SCG vom sezierten Gewebe zu trennen, verwenden Sie zuerst feine Zangen, um fremdartiges Gewebe, wie Fett oder Muskel, zu entfernen, wobei Darauf zu achten ist, den Bereich in der Nähe der Karotisbifurkation zu vermeiden.
- Sobald diese Gewebe entfernt wurden, sind zwei Ganglien sichtbar. Das Nodose Ganglion ist kleiner und kreisförmiger, während das SCG mandelförmig ist. Ziehen Sie vorsichtig auf den Vagusnerv, um den Vagusnerv und die Nodose-Ganglien vom Karotis zu trennen und trennen Sie dann das SCG von der Halsschlagader.
- Verwenden Sie feine Zangen, um die Kapsel zu entfernen, die das SCG umgibt. Übertragen Sie den SCG auf eine neue 35 mm Kulturschale. Wiederholen Sie den Vorgang mit allen sezierten Gewebeproben.
- Beschichten Sie eine sterilisierte, mit Baumwolle gesteckte Glaspipette mit Seziermedien, um zu verhindern, dass das Gewebe an den Pipettenwänden haften bleibt. Verwenden Sie die Pipette, um die Dissektionsmedien durch sterile 2 ml Kollagenase Typ II (1 mg/ml)/Dispase Typ II (5 mg/ml) in calcium- und magnesiumfreiem HBSS zu ersetzen, und brüten Sie für 50 min bei 37 °C, um das Gewebe aufzubrechen.
HINWEIS: Die Inkubationszeit muss möglicherweise mit verschiedenen Chargen von Collagenase/Dispase optimiert werden und reicht in der Regel von 40 min bis zu einer Stunde. - Während der Inkubation das DMEM von den Platten absaugen und durch 0,3 ml Steuermedien ersetzen. Lagern Sie die Platten bei 35,5 °C unter 5%CO2 in einer befeuchteten Kammer.
- Nach der Inkubation die SCGs in Kollagennase/Dispase in ein steriles 15 ml konisches Rohr übertragen. Verwenden Sie das Seziermedium, um die Platten zu spülen und die Lösung auf das Rohr zu übertragen. Fügen Sie genügend Seziermedien hinzu, um das Volumen auf ca. 10 ml zu erhöhen.
- Zentrifuge bei 200 x g (1000 - 1200 U/min) für 5 Minuten bei Raumtemperatur, um die Probe zu pellet. Aspirieren Sie den Überstand, achten Sie darauf, das Pellet nicht zu vertreiben. Das Pellet mit 10 ml Seziermedien aussetzen. Wiederholen Sie die Zentrifugation und entsorgen Sie den Überstand.
- Ersetzen Sie dies durch 1 - 2 ml Kulturmedium. Mit einer schmalbohrungen, gebogenen sterilen Pasteurpipetten (vorbeschichtet mit Kulturmedium) dissoziieren Sie die Klumpen mechanisch, indem sie 5-6-mal sanft trituieren. Lassen Sie die größeren Klumpen für etwa eine Minute begleichen. Übertragen Sie die überstande Zellsuspension in ein neues 10 ml Rohr.
- Wiederholen Sie diesen Vorgang 3 weitere Male, mit zunehmender Triturationskraft jedes Mal, um eine nahezu vollständige Dissoziation der SCGs zu gewährleisten. Übertragen Sie den Überstand nach jeder Trituration auf ein 10 ml Rohr mit dem Überstand aus der ersten Trituration.
- Fügen Sie genügend Kulturmedien hinzu, um das Volumen auf 8 - 10 ml zu erhöhen. Mischen Sie die Zellsuspension vorsichtig und quantifizieren Sie die Zelldichte mit einem Hämozytometer.
- Verteilen Sie die Zellsuspension in die Brunnen mit der entsprechenden Zelldichte für die Experimente. Mischen Sie die Zellsuspension während des Beschichtungsprozesses kontinuierlich, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen in die Brunnen zu gewährleisten.
HINWEIS: Für die morphologische Analyse, Platte die Zellen um 8.000 Zellen / gut in einem 24 Brunnen Platten und für genomische und proteomische Protokolle, Plattdie nieren die Zellen so hoch wie 30.000 Zellen / Well. - Übertragen Sie die Platten auf einen Glasaustrocknungsor mit sterilem Wasser am Boden, um eine befeuchtete Kammer zu schaffen. Injizieren Sie genügendCO2 (ca. 120 ml), um vor der Versiegelung eine 5%CO2-Umgebung im Trockenende zu erhalten. Bewahren Sie die Platten bei 35,5 °C auf. Dies wird im Protokoll als Tag 0 bezeichnet.
HINWEIS: Diese Platten können auch in einem regelmäßigen 5% CO2-Inkubator aufbewahrt werden. Das oben beschriebene Verfahren minimiert Temperatur- und pH-Änderungen und hilft auch, Kreuzkontaminationen zu verhindern.
5. Pflege der kultivierten SCG-Neuronen und -Behandlungen
- Entfernen Sie an Tag 1 (24 Stunden nach der Beschichtung) sorgfältig die Hälfte der Kulturmedien und ersetzen Sie sie durch 2 M Ara-C (Cytosin-D-Arabinofuranosid, ein Anti-Mitotik-Mittel). Lassen Sie die Behandlung auf den Zellen für 48 h. In der Regel ist diese Behandlungsdauer ausreichend, um nicht-neuronale Zellen in der Kultur zu beseitigen.
- An Tag 3, vorsichtig die Hälfte des Mediums aspirieren und durch Steuermedium ersetzen.
- Am 4. Tag sind die Zellen bereit für experimentelle Behandlungen. Füttern Sie Kulturen jeden zweiten Tag mit dem entsprechenden Medium, sanft ersetzen die Hälfte des Mediums im Brunnen mit frischem Medium.
- Kultivierte SCG-Neuronen in serumfreiem Medium verlängern nur Axone. Wenn Experimente das Vorhandensein von Dendriten erfordern, behandeln Sie Zellen mit entweder 10% fetalem Kalbsserum, 75-100 g/ml Kellermembranmatrixextrakt oder 50 ng/ml Knochenmorphogenetisches Protein-7. Das dendritische Wachstum wird innerhalb von 48 Stunden nach der Behandlung mit aufwendigen dendritischen Lauben beobachtet, die innerhalb einer Woche nach der Behandlung beobachtet werden.
6. Immunostaining kultivierte SCG-Neuronen
- Nach und nach das Zellkulturmedium im Brunnen durch 4% Paraformaldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,2 in einer Dunstabzugshaube ersetzen.
- Entfernen Sie die Hälfte der Kulturmedien im Brunnen und ersetzen Sie sie sanft durch 4% Paraformaldehyd. Wiederholen Sie dann den Vorgang mindestens zwei weitere Male, entfernen Sie jedes Mal zwei Drittel der Medien im Brunnen und ersetzen Sie 4% Paraformaldehyd. Am Ende dieses Prozesses sollte sich die Farbe der Medien im Brunnen von rosa zu farblos geändert haben.
- Sobald das gesamte Medium durch 4% Paraformaldehyd ersetzt wurde, bebrüten die Brunnen für 15 - 20 Minuten bei Raumtemperatur.
- Bei einem ähnlichen Verfahren wie oben beschrieben, ersetzen Sie schrittweise die 4%ige Paraformaldehydlösung durch phosphatgepufferte Saline (PBS), pH 7.2. Lassen Sie für 5 Minuten. Spülen Sie die Brunnen zwei weitere Male für jeweils 5 Minuten mit PBS.
- Sobald das 4% Paraformaldehyd entfernt ist, bewegen Sie die Platten zur Weiterverarbeitung auf die Tischplatte. Dieser Schritt ist ein guter Haltepunkt, an dem Platten über Nacht bei 4 °C gelagert werden können.
- Entfernen Sie alle PBS. Fügen Sie genügend Volumen von 0,1% Triton X-100 in PBS hinzu, um die Zellen abzudecken. Lassen Sie es auf den Kulturen für 5 Minuten, um die Neuronen zu permeabilisieren. Der Zeitpunkt dieses Schritts ist entscheidend, um eine gute Färbung unter Beibehaltung der Integrität der Zellen zu gewährleisten.
- Entfernen Sie vorsichtig die Triton X-100 Lösung und spülen Sie die Brunnen dreimal für 5 Minuten jedes Mal mit PBS. Entfernen Sie die PBS-Lösung.
- Fügen Sie genügend 5% BSA in PBS hinzu, um die Zellen abzudecken und bei Raumtemperatur für 20 Minuten zu brüten, um die unspezifische Antikörperbindung zu reduzieren.
- Entfernen Sie die Blockierlösung und ersetzen Sie sie durch einen monoklonalen Mausantikörper gegen MAP-2-Protein, das in 5% BSA in PBS verdünnt ist. Lassen Sie den primären Antikörper über Nacht bei 4 °C auf den Zellen.
- Entfernen und speichern Sie den primären Antikörper zur Wiederverwendung. Der primäre Antikörper kann mindestens zweimal ohne Verlust der Erkennungsintensität wiederverwendet werden.
- Spülen Sie dreimal mit genügend PBS, um die Zellen zu bedecken. Lassen Sie PBS auf den Zellen für 10 Minuten pro Spüle.
- Entfernen Sie die PBS-Lösung und ersetzen Sie sie durch fluoreszierende Tag-konjugierte Goat Anti-Maus IgG Sekundärantikörper bei 1:1000 Verdünnung in 5% BSA in PBS. 2 Stunden im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubieren.
- Entfernen Sie den sekundären Antikörper und ersetzen Sie ihn durch PBS. Spülen Sie die Brunnen dreimal mit PBS für 10 Minuten pro Spüle. Spülen Sie die Brunnen einmal mit Wasser, um alle Salze zu entfernen.
- Montieren Sie die Abdeckungen auf Glasschlitten, die einen Tropfen wässriger Halterung enthalten, der für fluoreszierend beschriftete Proben geeignet ist. Bewahren Sie die Dias bei 4 °C in einem Folienordner auf, bis sie für die Bildgebung bereit sind.
7. Probenvorbereitung zur Analyse des Proteoms mittels Flüssigchromatographie gekoppelt mit Massenspektrometrie
- Lyse kultivierter Neuronen
- Entfernen Sie vorsichtig alle Kulturmedien in den Brunnen. Ersetzen Sie es durch kaltes, steriles Kalzium und Magnesium-freies Phosphat-gepufferte Saline (PBS), pH 7.4. Schnell entfernen und durch PBS ersetzen und 5 min sitzen lassen. Dieser Schritt wird getan, um alle Proteine zu entfernen, die in den Kulturmedien vorhanden sind.
- Entfernen Sie vorsichtig alle PBS aus allen Brunnen für eine bestimmte Behandlung. Wiederholen Sie den Vorgang noch einmal. Halten Sie Platten über Eis, wenn Sie die Zellen lysieren, um neuronale Schäden und Proteolyse zu minimieren.
- Fügen Sie 100 - 150 l 50 mM Ammoniumbicarbonat, pH 7,5 (NH4HCO3) mit einem sterilen Zellschaber zu einer der Brunnen und Schaberzellen hinzu. Übertragen Sie die Flüssigkeit mit einer Mikropipette und wiederholen Sie den Abkratzvorgang mit allen Brunnen für eine bestimmte Behandlung. Untersuchen Sie die Brunnen unter dem Mikroskop nach dem Abkratzen, um sicherzustellen, dass die meisten Zellen entfernt wurden.
- Mit der geringen Anzahl von Neuronen, verwenden Sie ein begrenztes Volumen, um die Zellen zu lysieren, um eine hohe Konzentration für die proteomische Analyse zu gewährleisten.
- Einfrieren Sie die Lösung über Nacht bei -80 °C, um bei der Zelllyse zu helfen. Die Lysate können in diesem Stadium bis zur Weiterverarbeitung gelagert werden.
- Nach dem Auftauen die Proben durch eine Spritze mit einer 26 G oder 28 G Nadel spritzen, um die Zellen mechanisch zu lysieren.
- Beschallen Sie die Proben in einem beschallenden Wasserbad zwei Mal für 10 Minuten. Fügen Sie dem Wasserbad Eis hinzu, um eine Überhitzung und Denaturierung von Proteinen zu verhindern. Zentrifuge für 5 Minuten bei 4 °C bei 12.000 x g.
- Messen Sie die Proteinkonzentration. Typische Proteinkonzentrationen reichen von 0,4 - 1 g/l
- Probenvorbereitung und Trypsinverdauung zur Proteomanalyse
- Übertragen Sie maximal 60 l des Lysats oder 50 g Protein in ein DNase-, RNase- und proteasefreies 1,5 ml-Rohr. Wenn das Volumen des Lysats weniger als 60 l beträgt, fügen Sie genügend 50 mM Ammoniumbicarbonat hinzu, um das Volumen zu bilden.
- Fügen Sie 25 l 0,2% säurelabilen Tensid und Wirbel hinzu. Inkubieren Sie das Rohr in einem Blockheizer bei 80 °C für 15 Minuten. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 12.000 x g für 30 s.
- Fügen Sie 2,5 l von 100 mM Dithiothreitol und Wirbel hinzu. Dies macht das Protein zugänglicher für Alkylierung und Verdauung. Inkubieren Sie das Rohr bei 60 °C in einer Blockheizung für 30 Minuten. Auf Raumtemperatur und Zentrifuge abkühlen.
- Fügen Sie der Probe und dem Wirbel 2,5 l 300 mM Iodoacetamid hinzu. Dieser Schritt hilft, die Cysteins zu alkyliern und verhindert, dass sie die Disulfidbindungen reformieren. Inkubieren Sie die Rohre bei Raumtemperatur im Dunkeln für 30 Minuten.
- Fügen Sie der Tube bei einem Trypsin eine Massespektrometrie-Grade-Trypsin (0,5 g/l) hinzu: Proteinverhältnis von 1:10. Verdauen Sie die Proben bei 37 °C über Nacht.
- Fügen Sie 10 l von 5% Trifluoressigsäure (TFA) und Wirbel hinzu. Inkubieren Sie die Proben bei 37 °C für 90 Minuten. Dieser Schritt ist notwendig, um das säurelabile Tensid zu hydrolysieren, um Interferenzen während der Massenspektrometrie zu verhindern.
- Zentrifugieren Sie die Proben bei 12.000 x g bei 4 °C für 30 Minuten und übertragen Sie den Überstand auf eine chromatographisch zertifizierte Klarglasdurchstechflasche mit vorgeschlitzten Teflon/Silikonseptumkappen. Proben können vor der Massenspektrometrieanalyse bei -20 °C gelagert werden.
- Unterziehen Sie die Probenfläschchen einer Flüssigchromatographie in Verbindung mit einer hochauflösenden Massenspektrometrie.
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Representative Results
Isolierung und Aufrechterhaltung neuronaler Kulturen embryonaler SCG-Neuronen
Dissoziierte Zellen aus dem embryonalen SCG der Ratte wurden in einer poly-D-Lysin-beschichteten Platte oder einem Coverslip plattiert und in serumfreien Kulturmedien mit B-Nerve-Wachstumsfaktor gehalten. Die dissoziierten Zellen, die eine Mischung aus Neuronen und Gliazellen enthalten, sehen bei der Beschichtung kreisförmig aus (Abbildung 1A). Innerhalb von 24 Stunden nach der Beschichtung erweitern die Neuronen kleine axonale Prozesse mit Glialzellen, die abflachen und phasendunkel unter Phasenkontrastmikroskopie erscheinen (Abbildung 1B). Nach der Behandlung mit Ara-C werden 99% der Gliazellen eliminiert und die Kulturen enthalten überwiegend neuronale Zellen mit einem ovalen Zellkörper, einem ausgedehnten axonalen Wachstum und ohne Dendriten (Abbildung 1C).
Immunzytochemische Färbung von kultivierten embryonalen Ratte überlegene zervikale Ganglien Neuronen
Frühere Studien haben gezeigt, dass kultivierte sympathische Neuronen, die in serumfreiem Medium angebaut werden, nur Axone ausdehnen und nur eine aufwendige dendritische Laube in Gegenwart von Kellermembranextrakt, 10% Serum oder 50 ng/mL Knochenmorphogenetisches Protein-7 (BMP-7)2,12. In Übereinstimmung mit diesen Beobachtungen zeigt die Phasenkontrastmikroskopie, dass Neuronen, die in Gegenwart von BMP-7 (50 ng/mL) für 5 Tage angebaut werden, einen abgeflachten Zellkörper mit mehreren dicken verjüngten Prozessen haben, verglichen mit Neuronen, die in serumfreien Kontrollmedien angebaut werden (Abbildung 2). Die Identität dieser Prozesse als Dendriten wird durch das Vorhandensein von MAP-2 bestätigt, einem Zytoskelettprotein, das überwiegend im Zellkörper und dendriten19,20gefunden wird. Unter Kontrollbedingungen wird eine fluoreszierende Färbung für MAP-2 innerhalb des Zytoplasmas und der proximalen Axone beobachtet und vom Kern ausgeschlossen (wie durch Co-Etikettierung mit einem nuklearen Fleck zur Visualisierung des Kerns belegt (Abbildung 3A-3D). Nach der Behandlung mit BMP-7 bei 50 ng/ml für 5 Tage wird die Immunreaktivität für MAP-2 nicht nur im Zytoplasma, sondern auch in Dendriten beobachtet (Abbildung 3E-3H).
Beispiel proteomische Analyse kultivierter SCG-Neuronen, die in Kontrollmedien angebaut werden
E21 Ratten-sympathische Neuronen wurden in Kontrollmedien für 6 Tage in vitro kultiviert, lysiert und LC-MS-Analysen unterzogen. Die Probe wurde in drei Wiederholungen auf dem Massenspektrometer ausgeführt und die Proteine wurden anhand der Anzahl der für jede Probe beobachteten fragmentierten Peptide identifiziert. Die Häufigkeit der Proteine (von 0 bis über 300000 beliebige Einheiten) und die Konfidenzpunktzahl für die Protein-ID basierend auf der Anzahl der für jedes Protein beobachteten fragmentierten Peptide (von 5 bis 500) wurde berechnet. Abbildung 4zeigt einen Stichprobendatensatz aus der massenspektrometrischen Analyse des Proteoms von 30 g Protein aus SCG-Neuronen, die in serumfreien Kontrollmedien kultiviert werden.
In der Probe wurden 13, 134 Peptide nachgewiesen, die 1287 Proteinen entsprachen. Davon waren 1100 in allen drei technischen Repliken mit normalisierten Überflusswerten größer als 500 vorhanden. Von diesen 1100 Proteinen wurden 90 Proteine durch das Vorhandensein eines einzigen Peptidtreffers identifiziert, der nur einen kleinen Teil des Proteins bedeckte. Daher war es schwierig festzustellen, ob die Identifizierung korrekt war und diese Proteine einen niedrigen Protein-Konfidenz-Score hatten (Score <10). Diese Proteine wurden aus der Analyse eliminiert und die restlichen 1010 Proteine wurden mithilfe der Genontologie weiter analysiert, um festzustellen, ob das Protokoll erfolgreich Proteine mit unterschiedlicher Lokalisierung und Funktion aufspüren konnte.
Die Genontologieanalyse dieses Datensatzes wurde mit Hilfe der Panther-Klassifikationsdatenbank (http://www.pantherdb.org/) durchgeführt, um festzustellen, ob dieser Datensatz Proteine mit unterschiedlicher zellulärer Lokalisierung oder molekularen und biologischen Funktionen enthielt und ob es Verbindungen zwischen den identifizierten Proteinen und bekannten Signalen gab21. Die Analyse zeigte, dass, obwohl über 700 der Proteine zytoplasmisch waren, dieser Datensatz Proteine enthielt, die in andere Regionen der Zelle lokalisiert wurden, einschließlich des Zellkerns, der Membran, mehrerer Zellorganellen und Zellknoten (Abbildung 4A). Die Analyse ergab auch, dass über 400 Proteine eine katalytische Aktivität hatten und etwa 300 Proteine an Signalwegen beteiligt waren (Abbildung 4B und Abbildung 4C). Darüber hinaus enthielt der Datensatz Proteine, die an verschiedenen Signalwegen beteiligt waren. Tabelle 1 zeigt fünf der Proteine in der G-Protein-Signalisierung, Zelladhäsion, Wachstumsfaktor-Signalweg und synaptischen Vesikelhandelspfaden, die im Datensatz identifiziert wurden.
Abbildung 1: Veränderungen in der Morphologie kultivierter e21-ratter embryonaler SCG-Neuronen im Laufe der Zeit. Repräsentative Phasenkontrastmikroskopiebilder bei 10-facher Vergrößerung der dissoziierten Zellen von E21 Ratte SCG 20 min nach der Beschichtung (A), einen Tag nach der Beschichtung (B) und nach 48 Stunden Ara-C-Behandlung (5 Tage nach der Beschichtung) (C). Beachten Sie das Vorhandensein von Gliazellen (Pfeile) und axonale Ausdehnung (Pfeilspitzen) in (B), und das Fehlen von Gliazellen und Neuronen, die ein ausgedehntes axonales Wachstum in (C )zeigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Veränderungen in der neuronalen Morphologie von E21-Ratten-SCG-Neuronen nach der Behandlung mit BMP-7. Nach der Eliminierung nicht-neuronaler Zellen wurden kultivierte SCG-Neuronen 5 Tage lang mit Kontrollmedien (A) oder BMP-7 bei 50 ng/mL (B) behandelt. Repräsentative Phasenkontrast-Mikrographen (10x Vergrößerung) zeigen den kreisförmigen neuronalen Zellkörper mit Axonen in Kontrollneuronen (A) und Neuronen mit mehreren kurzen Dendrit-ähnlichen Prozessen, wenn sie mit BMP-7 (Pfeile, B)behandelt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Immunostainierung für MAP-2-Protein ein kultivierten embryonalen Ratten-sympathischen Neuronen. Nach der Eliminierung nicht-neuronaler Zellen wurden kultivierte SCG-Neuronen 5 Tage lang mit Kontrollmedien (A-D) oder BMP-7 bei 50 ng/ml (E-H) behandelt und mit einem monoklonalen Antikörper der Maus gegen MAP-2 immunisiert und mit einem Kernmarker ko-gekennzeichnet. Repräsentative Mikrographien zeigen immunzytochemische Färbung der Neuronen mit Mikrotubuli-assoziiertem Protein-2 (MAP-2) (C,G), einem nuklearen Fleck (D,H) mit Phasenkontrast-Mikrographen (B,F) und einer Verschmelzung der drei Kanäle (A,E). Immunzytochemische Färbung für Mikrotubuli assoziiertes Protein-2 ist im Zellkörper und proximale Axone der Kontrollneuronen (C) und Färbung für MAP-2 Protein im Zellkörper und Dendriten in BMP-7 behandeltneuronen (G). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Klassifikation und Verteilung von Proteinen, die in der Proteomanalyse kultivierter E21-Ratten-SCG-Neuronen identifiziert wurden. Protein-IDs für die 1100 Proteine wurden einer Genontologie-Analyse auf dem Panther-Klassifikationssystem unterzogen, um die Verteilung von Proteinen im Datensatz in Bezug auf die zelluläre Lokalisation (A), die zelluläre Funktion und biologische Prozesse zu untersuchen, an denen sie beteiligt waren (B) und die molekulare Funktionsklasse basierend auf der Proteinstruktur (C). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| A) Proteine, die an biologischer Adhäsion beteiligt sind | ||
| UniProt-Beitritts-ID | Genname | Gensymbol |
| Q9Z1Y3 | Cadherin-2 | Cdh2 |
| O35112 | CD166 Antigen | Alcam |
| P49134 | Integrin beta-1 | Itgb1 |
| D3ZES7 | Plexin A4 | Plxna4 |
| F1LP44 | Integrin Untereinheit alpha L | Itgal |
| B) Proteine, die an der Wachstumsfaktor-Signalisierung beteiligt sind | ||
| P35213 | 14-3-3 Protein beta/alpha | Ywhab |
| Q5BJ92 | Serin/Threonin-Proteinphosphatase 4 katalytische Untereinheit | Ppp4c |
| P47196 | Rac – Alpha-Serin/Threonin-Proteinkinase | Akt1 |
| P62994 | Wachstumsfaktor-Rezeptor gebundenes Protein 2 | Grb2 |
| P21708 | Mitogen-aktivierte Proteinkinase 3 | Mapk3 |
| C) Proteine, die an G-Protein-gekoppeltem Signalweg beteiligt sind | ||
| P08753 | Guanin-Nukleotid-bindendes Protein G(k) Untereinheit alpha | Gnai3 |
| D4ABV5 | Calmodulin-2 | Calm2 |
| P18266 | Glykogen-Synthase-Kinase-3 beta | Gsk3b |
| P09456 | cAMP-abhängige Proteinkinase Typ I-alpha regulatorische Untereinheit | Prkar1a |
| P53534 | Glykogenphosphorylase | Pygb (Gehirnform) |
| D) Proteine, die am synaptischen Vesikelhandel beteiligt sind | ||
| P47861 | Synaptotagmin-5 | Syt5 |
| P63045 | Vesikelassoziiertes Membranprotein 2 | Vamp2 |
| P61265 | Syntaxin-1B | Stx1b |
| Q63537 | Synapsin-2 | Syn2 |
| P60881 | Synaptosomal-assoziiertes Protein 25 | Snap25 |
Tabelle 1: Repräsentative Proteine, die in den Proteomdaten kultivierter embryonaler SCG-Neuronen identifiziert wurden, die nach ihren biologischen Funktionen klassifiziert sind. Die Proteomdaten mit den 1100 Proteinen wurden einer Genontologieanalyse mit dem Panther-Klassifikationssystem unterzogen. Im Folgenden sind die fünf wichtigsten Proteine aufgeführt, die für vier biologische Pfade identifiziert wurden.
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Discussion
Dieses Papier beschreibt die Protokolle für die Kultivierung sympathischer Neuronen aus überlegenen zervikalen Ganglien embryonaler Rattenwelpen. Die Vorteile dieses Modellsystems sind, dass es möglich ist, eine homogene Population von Neuronen zu erhalten, die eine ähnliche Reaktion auf Wachstumsfaktoren bietet, und da die Wachstumsfaktoranforderungen für diese Neuronen gut charakterisiert sind, ist es möglich, diese Neuronen in vitro in definierten Medien unter serumfreien Bedingungen zu züchten10. Obwohl das Protokoll den Prozess zur Isolierung von SCG von E21 Rattenwelpen beschreibt, kann dieses Protokoll zur Sektierung von SCG von Rattenwelpen von E17 bis E21 und zur Zerlegung der embryonalen Maus SCG10,22,23verwendet werden. Dieses Sezierprotokoll kann auch zur Isolierung von SCG von postnatalen Ratten mit geringfügiger Modifikation der Anfangsschritte verwendet werden. Diese Modifikationen umfassen die Beseitigung des Bedarfs an C-Sektion, Euthanasie der postnatalen Tiere mit Kohlendioxid, und Sterilisation der postnatalen Welpen nach Derinthanasie durch Eintauchen der Welpen in 70% Alkohol, bevor sie auf Dissektion Medienübertragen 10. Dieses neuronale Kultivierungsprotokoll kann auch für die Untersuchung der axonalen Führung, des axonalen Transports und der Synapsenbildung mit Campenot-Kammern und mikrofluidischen Kammern24,25angepasst werden. Diese Neuronen können auch mit Neuronen aus den dorsalen Wurzelganglien oder Spinalmotorneuronen oder mit Kardiomyozyten ko-kultiviert werden, um die neuronalen Wechselwirkungen und Neuronen zu studieren – Zielinteraktionen im peripheren Nervensystem26,27,28,29.
Die Verwendung von kultivierten SCG-Neuronen für immunzytochemische Studien ist gut dokumentiert. Das in dem Papier beschriebene Protokoll bietet einen guten Ausgangspunkt für die Arbeit mit den meisten Antikörpern. Es gibt jedoch Antikörper, wie solche, die Kernproteine aufspüren, die eine Änderung des Fixierungsprotokolls und des Permeabilisierungsprotokolls erfordern können. Bei Phospho-SMAD-Antikörpern wurde zur Fixierung und Permeabilisierung der Neuronen30,31eine Behandlung mit 100% Methanol bei -20 °C verwendet.
Die Haupteinschränkungen der Arbeit in diesem Modellsystem ergeben sich aus der geringen Größe von SCGs in embryonalen Rattenwelpen, was zu einer geringen Anzahl von Neuronen führt. Dies führt zu einer begrenzten Menge an Nukleinsäuren oder Protein, die aus der Zerlegung eines Wurfs von Welpen gewonnen werden kann. Dies kann für die genomische und proteomische Analyse problematisch sein, insbesondere beim Vergleich zwischen mehreren Behandlungen in einer Zerlegung. Außerdem ist es nicht möglich, SCG-Neuronalkulturen aus einem einzigen Embryo zu erhalten. Alle Experimente werden daher an gepoolten Proben durchgeführt, die aus SCG aller Rattenembryonen in einem Wurf gewonnen werden. Eine weitere Einschränkung des Systems ist, dass SCG-Neuronen eine geringere DNA-Transfektionseffizienz (10 - 20%, unveröffentlichte Beobachtungen) und eine höhere Toxizität nach Transfektion im Vergleich zu zentralen Neuronen32haben. Obwohl diese Transfektionseffizienz für morphologische Studien mit einzelnen Neuronen in Ordnung ist, ist es schwierig, molekulare oder biochemische Studien durchzuführen, um Veränderungen der Genexpression zu erkennen/bestätigen.
Jedoch, in den letzten Jahren, kultivierte SCG-Neuronen wurden für Studien zur Untersuchung der Mechanismen zugrunde dendritischen Wachstums und für Transkriptome und miRNome Analysen14,15,33. Wie bereits erwähnt, wurden kultivierte Neuronen aus embryonalem SCG aufgrund geringer Proteinmengen bisher nicht für die proteomische Analyse verwendet. Dieses Protokoll und repräsentative Ergebnisse liefern Beweise dafür, dass selbst bei geringer Konzentration von Proben aktuelle Hochauflösende Massenspektrometrieinstrumente für proteomische Studien an diesen Neuronen eingesetzt werden könnten. Obwohl das hier beschriebene Probenvorbereitungsprotokoll für SCG-Neuronen gilt, kann dieses Protokoll zur Herstellung jeder Probe mit geringer Proteinkonzentration für die LC-MS-Analyse verwendet werden. Eine der Einschränkungen ist, dass kleine Schwankungen der Proteinkonzentration oder Effizienz der Trypsinverdauung zu einer unvollständigen Fragmentierung und einer dramatischen Abnahme der Anzahl der von LC-MS nachgewiesenen Proteine führen können. Daher ist es wichtig, sicherzustellen, dass die Beginnende Proteinkonzentrationen bei einem Proteinverhältnis von 10:1 bis zu 50 g bei einem Proteinverhältnis von 10:1 liegen: Trypsin. Außerdem ist es eine gute Praxis, die Massenspektrometrie-Grade-Trypsin zu aliquotieren, um mehrere Freeze-Tau-Zyklen zu verhindern.
Eine weitere Einschränkung des Protokolls ist, dass im Proteom nur eine begrenzte Anzahl von Transmembranproteinen nachgewiesen wurde. Während sich gezeigt hat, dass das säurelabile Tensid ein wirksames Tensid für die Massenspektrometrie ist, hat eine frühere Studie über kultivierte Zellen herausgefunden, dass diese Tenside die Anzahl der zytoplasmatischen Proteine leicht erhöhen und die Membranproteine im proteomischen Profil verringern können34. Es wurde auch vorgeschlagen, dass die Vorverdauung mit einer bakteriellen Endopeptidase wie Lys-C, vor der Trypsin-Verdauung die Effizienz der Trypsin-Verdauung von membrangebundenen Proteinen verbessern kann und verhindern kann, dass die Membranproteinfragmente auf den LC-Säulen35zurückgehalten werden.
Zusammenfassend enthält dieses Papier detaillierte Protokolle für wachsende kultivierte tonende embryonale sympathische Neuronen und für die Durchführung morphologischer und proteomischer Studien an diesen Neuronen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch den Faculty Development Fund und das Summer Research Program Stipendium am Saint Mary es College of California unterstützt. Die Autoren möchten auch Dr. Pamela Lein von der University of California at Davis und Dr. Anthony Iavarone an der UC Berkeley Mass Spectrometry Anlage für ihre Beratung bei der Entwicklung dieser Protokolle danken. Die Autoren möchten auch Haley Nelson im Office of College Communications am Saint Mary es College of California für ihre Hilfe bei der Videoproduktion und -bearbeitung danken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2D nanoACQUITY | Waters Corporation | ||
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| BMP-7 | R&D Systems | 354-BP | |
| Bovine Serum Alumin | Sigma-Aldrich | 5470 | |
| Cell scraper | Corning | CLS-3010 | |
| Collagenase | Worthington Biochemical | 4176 | |
| Corning Costar or Nunc Flat bottomed Cell culture plates | Fisher Scientific | 07-200, 140675, 142475 | |
| Cytosine- β- D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich | C1768 | |
| D-phosphate buffered saline (Calcium and magnesium free) | ATCC | 30-2200 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 15230 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| DMEM - Low glucose + Glutamine, + sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11885 | |
| Fatty Acid Free BSA | Calbiochem | 126609 | 20 mg/mL stock in low glucose DMEM |
| Fine forceps Dumont no.4 and no.5 | Ted Pella Inc | 5621, 5622 | |
| Forceps and Scissors for Dissection | Ted Pella Inc | 1328, 1329, 5002 | |
| Glass coverlips - 12mm | Neuvitro Corporation | GG-12 | |
| Goat-Anti Mouse IgG Alexa 488 conjugated | Thermo Fisher Scientific | A32723 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 11765 | |
| Hank's balanced salt soltion (Calcium and Magnesium free) | Thermo Fisher Scientific | 14185 | |
| Insulin-Selenium-Transferrin (100X) | Thermo Fisher Scientific | 41400-045 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | A3221 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030 | |
| Leibovitz L-15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
| Mounting media for glass coverslips | Thermo Fisher Scientific | P36931, P36934 | |
| Mouse-anti- MAP2 antibody (SMI-52) | BioLegend | SMI 52 | |
| Nerve growth factor | Envigo Bioproducts (formerly Harlan Bioproducts) | BT5017 | Stock 125 μg/mL in 0.2% Prionex in DMEM |
| Paraformaldehye | Spectrum Chemicals | P1010 | |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15140 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| Prionex | Millipore | 529600 | 10% solution, 100 mL |
| RapiGest SF | Waters Corporation | 186001861 | 5 X 1 mg |
| Synapt G2 High Definition Mass Spectrometry | Waters Corporation | ||
| Trifluoro acetic acid - Sequencing grade | Thermo Fisher Scientific | 28904 | 10 X 1 mL |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trypsin | Promega or NEB | V511A, P8101S | 100 μg or 5 X 20 mg |
| Waters Total recovery vials | Waters Corporation | 186000385c |
References
- Rees, R. P., Bunge, M. B., Bunge, R. P. Morphological Changes in the neuritic growth cone and target neuron during synaptic junction development in culture. Journal of Cell Biology. 9, (1976).
- Chandrasekaran, V., Lein, P. J.
- Higgins, D., Burack, M., Lein, P., Banker, G.
- Lein, P., Guo, X., Hedges, A. M., Rueger, D., Johnson, M., Higgins, D. The effects of Extracellular Matrix And Osteogenic Protein-1 on the morphological differentiation of rat sympathetic neurons. International Journal of Developmental Neuroscience. 14 (3), 203-215 (1996).
- Kobayashi, M., Fujii, M., Kurihara, K., Matsuoka, I. Bone morphogenetic protein-2 and retinoic acid induce neurotrophin-3 responsiveness in developing rat sympathetic neurons. Molecular Brain Research. 53 (1-2), 206-217 (1998).
- Burnham, P., Louis, J. C., Magal, E., Varon, S. Effects of ciliary neurotrophic factor on the survival and response to nerve growth factor of cultured rat sympathetic neurons. Developmental Biology. 161 (1), 96-106 (1994).
- Hou, X. E., Li, J. Y., Dahlström, A. Clathrin light chain and synaptotagmin I in rat sympathetic neurons. Journal of the Autonomic Nervous System. 62 (1-2), 13-26 (1997).
- Harris, G. M., et al. Nerve Guidance by a Decellularized Fibroblast Extracellular Matrix. Matrix Biology. , 176-189 (2017).
- Wingerd, K. L., et al. α4 integrins and vascular cell adhesion molecule-1 play a role in sympathetic innervation of the heart. Journal of Neuroscience. 22 (24), 10772-10780 (2002).
- Higgins, D., Lein, P., Osterhout, D. J., Johnson, M. Tissue culture of autonomic neurons. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge, MA. 177-205 (1991).
- Lein, P., Johnson, M., Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 induces dendritic growth in rat sympathetic neurons. Neuron. 15 (3), 597-605 (1995).
- Bruckenstein, D. A., Higgins, D. Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. Developmental Biology. 128 (2), 337-348 (1988).
- Voyvodic, J. T. Development and regulation of dendrites in the rat superior cervical ganglion. The Journal of Neuroscience. 7 (3), 904-912 (1987).
- Garred, M. M., Wang, M. M., Guo, X., Harrington, C. A., Lein, P. J. Transcriptional Responses of Cultured Rat Sympathetic Neurons during BMP-7-Induced Dendritic Growth. PLoS ONE. 6 (7), 21754 (2011).
- Pravoverov, K., et al. MicroRNAs are Necessary for BMP-7-induced Dendritic Growth in Cultured Rat Sympathetic Neurons. Cellular and Molecular Neurobiology. 39 (7), 917-934 (2019).
- Natera-Naranjo, O., Aschrafi, A., Gioio, A. E., Kaplan, B. B. Identification and quantitative analyses of microRNAs located in the distal axons of sympathetic neurons. RNA (New York, N.Y.). 16 (8), 1516-1529 (2010).
- Aschrafi, A., et al. Angiotensin II mediates the axonal trafficking of tyrosine hydroxylase and dopamine β-hydroxylase mRNAs and enhances norepinephrine synthesis in primary sympathetic neurons. Journal of Neurochemistry. 150 (6), 666-677 (2019).
- Ghogha, A., Bruun, D. a, Lein, P. J. Inducing dendritic growth in cultured sympathetic neurons. Journal of Visualized Experiments. (61), 4-8 (2012).
- Caceres, A., Banker, G., Steward, O., Binder, L., Payne, M. MAP2 is localized to the dendrites of hippocampal neurons which develop in culture. Brain Research. 315 (2), 314-318 (1984).
- Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 and related bone morphogenetic proteins regulate dendritic growth and the expression of microtubule-associated protein-2 in rat sympathetic neurons. Neuroscience Letters. 245 (3), 131-134 (1998).
- Mi, H., et al. PANTHER version 11: Expanded annotation data from Gene Ontology and Reactome pathways, and data analysis tool enhancements. Nucleic Acids Research. 45, 183-189 (2017).
- Chandrasekaran, V., et al. Retinoic acid regulates the morphological development of sympathetic neurons. Journal of Neurobiology. 42 (4), (2000).
- Courter, L. A., et al. BMP7-induced dendritic growth in sympathetic neurons requires p75 NTR signaling. Developmental Neurobiology. 76 (9), 1003-1013 (2016).
- Lein, P. J., Fryer, A. D., Higgins, D. Cell Culture: Autonomic and Enteric Neurons. Encyclopedia of Neuroscience. , 625-632 (2009).
- Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In vitro Tools for Neurobiological Research. Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
- Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9 (1), 82 (2016).
- Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. Lectin-based isolation and culture of mouse embryonic motoneurons. Journal of Visualized Experiments. (55), e3200 (2011).
- Takeuchi, A., et al. Microfabricated device for co-culture of sympathetic neuron and iPS-derived cardiomyocytes. Proceedings of the Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, EMBS. 2013, 3817-3820 (2013).
- Takeuchi, A., et al. Development of semi-separated co-culture system of sympathetic neuron and cardiomyocyte. Proceedings of the 31st Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society: Engineering the Future of Biomedicine, EMBC 2009. , 1832-1835 (2009).
- Chandrasekaran, V., Lea, C., Sosa, J. C., Higgins, D., Lein, P. J. Reactive oxygen species are involved in BMP-induced dendritic growth in cultured rat sympathetic neurons. Molecular and Cellular Neuroscience. 67, (2015).
- Kim, W. Y., et al. Statins decrease dendritic arborization in rat sympathetic neurons by blocking RhoA activation. Journal of Neurochemistry. 108 (4), 1057-1071 (2009).
- Dalby, B., et al. Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: Primary neurons, siRNA, and high-throughput applications. Methods. 33 (2), 95-103 (2004).
- Szpara, M. L., et al. Analysis of gene expression during neurite outgrowth and regeneration. BMC Neuroscience. 8 (1), 100 (2007).
- Pop, C., Mogosan, C., Loghin, F. Evaluation of rapigest efficacy for the digestion of proteins from cell cultures and heart tissue. Clujul Medical. 87 (4), 5 (2014).
- Vit, O., Petrak, J. Integral membrane proteins in proteomics. How to break open the black box. Journal of Proteomics. 153, 8-20 (2017).
