Summary
Questo articolo descrive l'isolamento e la tatura dei neuroni simpatici del ratto embrionale dai gangli cervicali superiori. Fornisce anche protocolli dettagliati per la colorazione immunocitomica e per la preparazione di estratti neuronali per l'analisi spettrometrica di massa.
Abstract
I neuroni simpatici dei gangli cervicali superiori del ratto embrionale (SCG) sono stati utilizzati come sistema modello in vitro per i neuroni periferici per studiare la crescita assonale, il traffico assonale, la sinaptogenesi, la crescita dendritica, la plasticità dendritica e le interazioni nervo-bersaglio nei sistemi di co-coltura. Questo protocollo descrive l'isolamento e la dissociazione dei neuroni dai gangli cervicali superiori degli embrioni di ratto E21, seguiti dalla preparazione e dal mantenimento di colture neuronali pure in mezzo senza siero. Poiché i neuroni non aderiscono alla plastica non rivestita, i neuroni saranno colturati su coperture di vetro da 12 mm o su piastre da 6 po 'rivestite con poli-D-lisina. Dopo il trattamento con un agente antimitotico (Ara-C, citosina β-D-arabinofuranoside), questo protocollo genera colture neuronali sane con meno del 5% di cellule non neuronali, che possono essere mantenute per oltre un mese in vitro. Anche se i neuroni SCG ratto embrionale sono multipolari con 5-8 dendriti in vivo; in condizioni di non siero, questi neuroni estendono solo un singolo assone in coltura e continuano ad essere unipolari per tutta la durata della coltura. Tuttavia, questi neuroni possono essere indotti ad estendere i dendriti in presenza di estratto di membrana seminterrato, proteine morfogenetiche ossee (BMPs), o 10% siero di vitello fetale. Queste colture neuronali omogenee possono essere utilizzate per la colorazione immunocitomica e per studi biochimici. Questo documento descrive anche il protocollo ottimizzato per la colorazione immunocitomica per la proteina-2 associata al microtubulo (MAP-2) in questi neuroni e per la preparazione di estratti neuronali per la spettrometria di massa.
Introduction
I neuroni simpatici derivati da gangli cervicali superiori embrionali (SCG) sono stati ampiamente utilizzati come sistema di coltura neuronale primario per studiare molti aspetti dello sviluppo neuronale, tra cui la dipendenza dal fattore di crescita, interazioni neurone-bersaglio, segnalazione neurotrasmettitore, crescita assonale, sviluppo dendrite e plasticità, sinaptogenesi e meccanismi di segnalazione alla base delle interazioni nervo-bersaglio/neurone-glia1,2,3,4,5,6,7,8,9. Nonostante le loro piccole dimensioni (circa 10000 neuroni/ganglia), ci sono tre ragioni principali per lo sviluppo e l'ampio uso di questo sistema culturale sono i) essendo i primi gangli nella catena simpatica, sono più grandi, e quindi più facili da isolare, rispetto al resto dei ganglisimpatici 10; ii) a differenza dei neuroni centrali, i neuroni nella SCG sono abbastanza omogenei con tutti i neuroni derivati dalla cresta neurale, avendo una dimensione simile, dipendenza dal fattore di crescita del nervo e l'essere né-adrenergico. Questo li rende un modello prezioso per gli studi morfologici egenomici 10,11 e iii) questi neuroni possono essere mantenuti in un mezzo definito privo di siero contenente il fattore di crescita del nervo per oltreun mese 10,12. I neuroni SCG perinatale sono stati ampiamente utilizzati per studiare i meccanismi alla base dell'iniziazione e del mantenimento dei dendriti2. Questo è principalmente perché, anche se i neuroni SCG hanno un ampio pergolato dendritico in vivo, non estendono i dendriti in vitro in assenza di siero, ma possono essere indotti a crescere dendriti in presenza di alcuni fattori di crescita come le proteine morfogeneticheossee 2,12,13.
Questo documento descrive il protocollo per isolare e cultare i neuroni SCG del ratto embrionale. Negli ultimi 50 anni, le colture neuronali primarie del SCG sono state utilizzate principalmente per studi morfologici con un numero limitato di studi che esaminano i cambiamenti genomici o proteomici su larga scala. Ciò è dovuto principalmente alle piccole dimensioni dei tessuti che hanno portato all'isolamento di basse quantità di DNA o proteine, il che rende difficile eseguire analisi genomiche e proteomiche su questi neuroni. Tuttavia, negli ultimi anni, una maggiore sensibilità al rilevamento ha permesso lo sviluppo di metodi per esaminare il genoma, miRNome e proteoma nei neuroni SCG durante lo sviluppo della crescita dendritica14,15,16,17. Questo articolo descriverà anche il metodo per l'analisi morfologica di questi neuroni utilizzando l'immunocitochimica e un protocollo per ottenere estratti di proteine neuronali per l'analisi spettrometrica di massa.
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Protocol
Tutte le procedure eseguite in studi che coinvolgono animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) del Saint Mary's College of California. Le linee guida per la cura e l'uso degli animali presso il Saint Mary's College sono state sviluppate sulla base delle linee guida fornite dall'Office of Laboratory Animal Welfare presso l'Istituto Nazionale per la Salute (https://olaw.nih.gov/sites/default/files/PHSPolicyLabAnimals.pdf e https://olaw.nih.gov/sites/default/files/Guide-for-the-Care-and-Use-of-Laboratory-Animals.pdf).
1. Preparazione dei supporti di coltura (noto anche come mezzo di controllo)
- Aggiungere i seguenti ingredienti, nell'ordine indicato di seguito, ad un flacone sterile da 500 mL: 190 mL di 1x DMEM a basso glucosio, 10 mL di 20 mg/mL di siero bovino libero da acido grasso (FAF-BSA) in DMEM, 2,8 mL di 200 mM L-glutamina, 4 mL di 100x miscela insulino-selenio-transferrina, 0,4 mL di 125 g/mL fattore di crescita del nervo (in 0,2% stabilizzatore proteico inerte in DMEM) e 200 mL del mezzo F-12 di Ham.
- Assicurarsi di rivestire la pipetta con il mezzo contenente FAF-BSA prima dell'aggiunta di soluzioni contenenti proteine come insulin-selenio-transferrin e NGF per evitare l'attaccamento di proteine alla pipetta.
- Swirl il flacone per mescolare gli ingredienti dopo ogni aggiunta. Mescolare accuratamente con una pipetta da 25 mL dopo l'aggiunta di F-12.
- Aliquot i mezzi di coltura in 10 mL aliquots e memorizzare a -80 gradi centigradi. Gli aliquot possono essere conservati per sei mesi senza perdita di attività.
2. Preparazione delle piastre per la tatura dei neuroni
- Diluire uno stock di 1 mg/mL di poli-d-lysina (fatto in tampone Tris 0,5 M, pH 8) a 100 g/mL con acqua distillata sterile.
- Per l'analisi proteomica o genomica, uno o due giorni prima della dissezione, rivestire piastre da 6 pozzetti con circa 2 mL di sterili 100 g/mL di poli-D-lysina (PDL). Questo è necessario per garantire l'adesione cellulare al pozzo. Avvolgere i piatti con pellicola trasparente e conservare i piatti durante la notte a 4 gradi centigradi.
- Per l'analisi morfologica e la microscopia, inserire 12 mm2 coperture di vetro tedesco pre-trattate (che possono essere pulite utilizzando il trattamento con acido nitrico descrittoin precedenza 18 o acquistato) in ciascuno dei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti.
- Rivestire le coperture con 0,3 mL di sterile 100 g/mL di poli-D-lsensilina (PDL). Conservare i piatti durante la notte a 4 gradi centigradi.
- Il giorno della dissezione, prima dell'inizio della dissezione, rimuovere la soluzione poli-D-lisina dai pozzetti e risciacquare i pozzi cinque volte con acqua distillata sterile, seguita da una volta con DMEM a basso glucosio.
- Durante la digestione ezimatica dei gangli (circa un'ora prima di placcare le cellule), aspirare il DMEM dalle piastre e sostituirlo con 0,3 mL di supporti di controllo. Conservare le piastre a 35,5 gradi centigradi sotto il 5% di CO2 in una camera umidificata.
3. Impostazione della dissezione
- Preparazione di 200 mL di supporti per la dissezione (denominati mezzi di dissezione)
- Aggiungere 8 mL di 20 mg/mL di albumina di siero bovino senza acidi grassi (FAF-BSA) in DMEM a basso glucosio (con glucosio 1 mg/mL) e 2 mL di 100x penicillina-streptomicina a 193 mL di sterile leibovitz's L-15 medium (o qualsiasi mezzo tamponato d'aria)
- Nel cofano, impostare i seguenti elementi per la dissezione: quattro tubi conici sterili da 50 mL con circa 20 mL di mezzi di dissezione in ogni tubo, quattro piatti sterili da 35 mm con 1,5 mL di supporti di dissezione, un tubo conico sterile da 50 mL con 20 mL di mezzi di dissezione per la centrifugazione, uno sterile tubo conico da 15 mL per la centrifugazione e un tubo sterile da 10 mL per la raccolta delle cellule dissociate.
- Utilizzare uno sterilizzatore di perline secche per sterilizzare un paio di forze sottili (n. 4 o n. 5, per almeno un minuto.
4. Isolamento dei gangli cervicali superiori dai cuccioli di ratto embrionale
- Rimozione degli embrioni E21 dal ratto in gravidanza
NOTA: La rimozione del corno uterino può essere eseguita al di fuori del cofano se l'area circostante è completamente sterilizzata.- Eutanasia del ratto incinta coninalazione di CO 2. Cesoiare la pelliccia dalla regione addominale e pulire la pelle nella zona con 70% di alcol per sterilizzarla.
- Utilizzando una nuova serie di forbici sterili e forbici, tagliare attraverso la pelle e poi lo strato muscolare per esporre le corna uterino contenenti gli embrioni. Rimuovere le corna uterino con gli embrioni utilizzando una nuova serie di forbici e forbici, facendo attenzione a non danneggiare l'intestino nel processo.
- Trasferire le corna uterino con gli embrioni in un piatto Petri sterile da 150 mm2 e trasferirle nel cappuccio.
- Utilizzando una nuova serie di forbici e forbici, rimuovere gli embrioni dal corno uterino e separare gli embrioni dalle membrane amniotiche e dalla placenta.
- Per eutanasia gli embrioni, tagliare il midollo spinale degli embrioni lungo la linea mediana sotto il braccio destro. Questo ridurrà anche l'emorragia dall'arteria carotide durante la rimozione del SCG.
- Trasferire questi embrioni nei tubi conici preparati da 50 mL contenenti supporti di dissezione. Assicurarsi che gli embrioni siano sommersi dai media. Ogni tubo può contenere fino a 3 embrioni.
- Isolamento del ganglio cervicale superiore dall'embrione
- Trasferire un cucciolo dal supporto di dissezione su un piatto sterile di 150 mm2 Petri mezzo riempito con substrato solido (cera di paraffina o polimero di silicone), con la sua superficie dorsale sul substrato. Utilizzando tre aghi sterili da 23 G, fissare il cucciolo al piatto con un ago sotto ogni braccio e un terzo ago attraverso la bocca per iperestersire con attenzione il collo.
- Tagliare la pelle nella regione del collo utilizzando taglie sottili sterili (n. 4 o n. 5 taglie) per esporre le ghiandole salivari sotto. Rimuovere queste ghiandole con le force misure fini.
- Individuare i muscoli sternocleidomastoid e omohyoid vicino alla clavicola e alla trachea, rispettivamente. Tagliare prima i muscoli sternocleidostoidi trasversale e quindi tagliare con cura il muscolo omoidoide sottile utilizzando forti. Una volta rimossi questi muscoli, la biforcazione nell'arteria carotide all'estremità anteriore sarà visibile su entrambi i lati della trachea, con il SCG situato sotto questa forchetta nell'arteria carotidea.
- Utilizzando le forcelle chiuse, sollevare delicatamente l'arteria carotide per visualizzare il SCG. Utilizzando una forza su entrambi i lati del SCG, estrarre la carotide e trasferirla nei piatti sterili preparati da 35 mm2. Questo tessuto conterrà molto probabilmente il SCG con l'arteria carotide, il nervo vago con i gangli nodosi e altri segmenti di muscolo o grasso nella zona.
- Ripetere il processo di dissezione sull'altro lato. Rimuovere gli SCG da tutti gli embrioni prima di continuare con le fasi di dissezione rimanenti descritte di seguito. Distribuire i tessuti isolati tra due dei piatti da 35 mm2 per facilitare l'elaborazione dei campioni di tessuto.
- Post-elaborazione di SCG
- Per separare il SCG dal tessuto sezionato, utilizzare prima le forcelle fini per rimuovere qualsiasi tessuto estraneo, come grasso o muscolo, facendo attenzione a evitare l'area vicino alla biforcazione carotide.
- Una volta che questi tessuti sono stati rimossi, due gangli sono visibili. Il ganglio nodoso è più piccolo e circolare, mentre il SCG è a forma di mandorla. Tirare delicatamente il nervo vago per separare il nervo vago e nodosare gangli dalla carotide e quindi separare il SCG dall'arteria carotide.
- Utilizzare le forcepi fini per rimuovere la capsula che circonda il SCG. Trasferire l'SCG in un nuovo piatto di coltura da 35 mm. Ripetere il processo con tutti i campioni di tessuto sezionati.
- Rivestire una pipetta di vetro sterilizzata in cotone con supporti di dissezione per evitare che il tessuto adasi alle pareti delle pipette. Utilizzare la pipetta per sostituire il supporto di dissezione con sterili 2 mL di Collagenase di tipo II (1 mg/mL)/dispase di tipo II (5 mg/mL) in HBSS senza calcio e magnesio, e incubare per 50 min a 37 gradi centigradi per aiutare a scomporsi i tessuti.
NOTA: Il tempo di incubazione potrebbe essere necessario ottimizzare con diversi lotti di Collagenase/Dispase e di solito varia da 40 min a un'ora. - Durante l'incubazione, aspirare il DMEM dalle piastre e sostituirlo con 0,3 mL di supporti di controllo. Conservare le piastre a 35,5 gradi centigradi sotto il 5% di CO2 in una camera umidificata.
- Dopo l'incubazione, trasferire gli SCG in collagenase/dispase in un tubo conico sterile da 15 mL. Utilizzare il supporto di dissezione per risciacquare le piastre e trasferire la soluzione al tubo. Aggiungere un supporto di dissezione sufficiente per portare il volume a circa 10 mL.
- Centrifuga a 200 x g (1000 - 1200 giri/min) per 5 minuti a temperatura ambiente per pellet il campione. Aspirare il supernatant, facendo attenzione a non spostare il pellet. Rispendere il pellet con 10 mL di supporti di dissezione. Ripetere la centrifugazione e scartare il supernatant.
- Sostituire con 1 - 2 mL di media coltura. Utilizzando una pipetta di pasteur sterile a foro stretto e piegato (pre-rivestita con mezzo di coltura), dissocia meccanicamente i grumi triturando delicatamente 5-6 volte. Lasciate che i grumi più grandi si stabiliscano per circa un minuto. Trasferire la sospensione della cella supernatant in un nuovo tubo da 10 mL.
- Ripetere questo processo altre 3 volte, con una forza di triturazione crescente ogni volta per garantire la dissociazione quasi completa degli SCG. Trasferire il supernante dopo ogni giro di triturazione in un tubo da 10 mL con il supernatante dalla prima triturazione.
- Aggiungere un supporto di coltura sufficiente per portare il volume a 8 - 10 mL. Mescolare delicatamente le sospensioni cellulari e quantificare la densità cellulare con un emocitometro.
- Distribuire la sospensione cellulare nei pozzetti alla densità cellulare appropriata per gli esperimenti. Mescolare continuamente la sospensione cellulare durante il processo di placcatura per garantire anche la distribuzione delle cellule nei pozzetti.
NOTA: Per l'analisi morfologica, placcare le cellule intorno a 8.000 cellule/pozzo in un pozzo di 24 pozzetti e per protocolli genomici e proteomici, placcare le cellule fino a 30.000 cellule/bene. - Trasferire le piastre in un desiccatore di vetro con acqua sterile sul fondo per creare una camera umidificata. Iniettare abbastanza CO2 (circa 120 mL) per ottenere un ambiente 5% CO2 nel desiccatore, prima della sigillatura. Mantenere le piastre a 35,5 gradi centigradi. Questo è indicato come Giorno 0 nel protocollo.
NOTA: Queste piastre possono essere mantenute anche in un normale incubatore di CO2 del 5%. Il metodo descritto in precedenza riduce al minimo i cambiamenti di temperatura e pH e aiuta anche a prevenire la contaminazione incrociata.
5. Manutenzione dei neuroni e dei trattamenti SCG colturati
- Il primo giorno (24 ore dopo la placcatura), rimuovere con attenzione metà dei mezzi di coltura, e sostituirlo con 2 Ara-C (citosina β-D-arabinofuranoside, un agente anti-mitotico). Lasciare il trattamento sulle cellule per 48 h. Di solito, questa lunghezza del trattamento è sufficiente per eliminare le cellule non neuronali nella coltura.
- Il giorno 3, aspirare delicatamente metà del mezzo e sostituire con mezzo di controllo.
- Il giorno 4, le cellule sono pronte per trattamenti sperimentali. Nutrire le colture ogni due giorni con il mezzo appropriato, sostituendo delicatamente metà del mezzo nel pozzo con mezzo fresco.
- I neuroni SCG colturati in mezzo senza siero estendono solo gli assoni. Se gli esperimenti richiedono la presenza di dendriti, trattare le cellule con siero del vitello fetale al 10%, 75-100 g/mL di estratto di matrice di membrana seminterrato o 50 ng/mL di proteina morfogenetica ossea-7. La crescita dendritica si osserva entro 48 ore dal trattamento con un pergolato dendritico elaborato osservato entro una settimana dal trattamento.
6. Immunostaining neuroni SCG colturati
- Sostituire gradualmente il mezzo di coltura cellulare nel pozzo con 4% di paraformaldeide in tampone di fosfato di 0,1 M, pH 7.2 in una cappa di fumi.
- Rimuovere metà dei mezzi di coltura nel pozzo e sostituirlo delicatamente con 4% di paraformaldeide. Quindi, ripetere il processo almeno altre due volte, rimuovendo ogni volta due terzi dei supporti nel pozzo e sostituendolo con il 4% di paraformaldeide. Alla fine di questo processo, il colore dei media nel pozzo avrebbe dovuto cambiare da rosa a incolore.
- Una volta che tutto il mezzo è stato sostituito da 4% paraformaldeide, incubare i pozzi per 15 - 20 minuti a temperatura ambiente.
- Con un processo simile a quello descritto in precedenza, sostituire gradualmente la soluzione di paraformaldeide del 4% con salina tamponata di fosfato (PBS), pH 7.2. Lasciare partire per 5 minuti. Sciacquare i pozzetti altre due volte per 5 minuti ciascuno con PBS.
- Una volta rimossa la paraformaldeide del 4%, spostare le piastre sul piano di panca per un'ulteriore lavorazione. Questo passaggio è un buon punto di sosta in cui le piastre possono essere conservate a 4 gradi centigradi durante la notte.
- Rimuovere tutto il PBS. Aggiungere un volume sufficiente di 0,1% Triton X-100 in PBS per coprire le cellule. Lasciare sulle colture per 5 minuti per permeare i neuroni. La tempistica di questo passaggio è fondamentale per garantire una buona colorazione pur mantenendo l'integrità delle cellule.
- Rimuovere con cura la soluzione Triton X-100 e sciacquare i pozzetti tre volte per 5 minuti ogni volta con PBS. Rimuovere la soluzione PBS.
- Aggiungere abbastanza 5% BSA in PBS per coprire le cellule e incubare a temperatura ambiente per 20 minuti per ridurre il legame anticorpo non specifico.
- Rimuovere la soluzione di blocco e sostituirla con un anticorpo monoclonale del topo contro la proteina MAP-2 diluita in 5% BSA in PBS. Lasciare l'anticorpo primario sulle cellule durante la notte a 4 gradi centigradi.
- Rimuovere e salvare l'anticorpo primario per il riutilizzo. L'anticorpo primario può essere riutilizzato almeno due volte senza perdita di intensità di rilevamento.
- Risciacquare tre volte con abbastanza PBS per coprire le cellule. Lasciare PBS sulle cellule per 10 minuti per risciacquo.
- Rimuovere la soluzione PBS e sostituirla con un anticorpo secondario anti-mouse IgG capra fluorescente con tag a 1:1000 in BSA del 5% in PBS. Incubare per 2 ore al buio a temperatura ambiente.
- Rimuovere l'anticorpo secondario e sostituirlo con PBS. Sciacquare i pozzetti tre volte con PBS per 10 minuti per risciacquo. Sciacquare i pozzetti una volta con acqua per rimuovere eventuali sali.
- Montare le coperture su vetrini contenenti una goccia di montante aques appropriata per i campioni etichettati in modo fluorescente. Conservare le diapositive a 4 gradi centigradi, in una cartella di diapositive fino a quando non sono pronte per l'imaging.
7. Preparazione del campione per l'analisi del proteoma utilizzando la cromatografia liquida accoppiata con spettrometria di massa
- Lisi dei neuroni colturati
- Rimuovere delicatamente tutti i mezzi di coltura nei pozzi. Sostituirlo con calcio freddo e sterile e salina tamponata al fosfato senza magnesio (PBS), pH 7.4. Rimuovere rapidamente e sostituire con PBS e lasciarlo riposare per 5 min. Questo passaggio viene fatto per rimuovere tutte le proteine presenti nei media di coltura.
- Rimuovere con attenzione tutti i PBS da tutti i pozzetti per un particolare trattamento. Ripetere il processo ancora una volta. Mantenere le piastre sul ghiaccio durante la lalisa delle cellule per ridurre al minimo i danni neuronali e la proteolysi.
- Aggiungere 100 - 150 l di bicarbonato di ammonio da 50 mM, pH 7,5 (NH4HCO3) a uno dei pozzi e raschiare le cellule utilizzando un raschietto sterile. Utilizzando una micropipetta, trasferire il liquido e ripetere il processo di raschiare con tutti i pozzetti per un particolare trattamento. Esaminare i pozzi al microscopio dopo la raschitura per assicurarsi che la maggior parte delle cellule siano state rimosse.
- Con il basso numero di neuroni, utilizzare un volume limitato per lyse le cellule per garantire una concentrazione abbastanza elevata per l'analisi proteomica.
- Congelare la soluzione a -80 gradi centigradi durante la notte per aiutare con la lisi cellulare. I lysates possono essere conservati in questa fase fino a quando non sono pronti per un'ulteriore elaborazione.
- Una volta scongelati, spruzzare i campioni attraverso una siringa con un ago da 26 G o 28 G per sliviare meccanicamente le cellule.
- Srotolariare i campioni in un bagno d'acqua sonicante due volte per 10 minuti. Aggiungere ghiaccio al bagno d'acqua per evitare il surriscaldamento e la denaturazione delle proteine. Centrifuga per 5 minuti a 4 gradi centigradi a 12.000 x g.
- Misurare la concentrazione di proteine. Le concentrazioni proteiche tipiche variano da 0,4 a 1 g/L
- Preparazione del campione e digestione della trypsina per l'analisi del proteoma
- Trasferire un massimo di 60 L del liato o 50 g di proteina in un tubo DNase-, RNase- e protease-free da 1,5 mL. Se il volume del llito è inferiore a 60 L, aggiungere abbastanza bicarbonato di ammonio da 50 mM per molare il volume.
- Aggiungere 25 L dello 0,2% di labile surfactant acido e vortice. Incubare il tubo in un riscaldatore a blocchi a 80 gradi centigradi per 15 minuti. Centrifugare il tubo a 12.000 x g per 30 s.
- Aggiungere 2,5 L di 100 mM dithiothreitol e vortice. Questo rende la proteina più accessibile per l'alchilazione e la digestione. Incubare il tubo a 60 gradi centigradi in un riscaldatore a blocchi per 30 minuti. Raffreddare a temperatura ambiente e centrifuga.
- Aggiungere 2,5 L di 300 mM iodoacetamide al campione e al vortice. Questo passo aiuta ad alchilare i cisteine e impedisce loro di riformare i legami disulfide. Incubare i tubi a temperatura ambiente al buio per 30 minuti.
- Aggiungere la metapsina di grado di spettrometria di massa (0,5 g/L) al tubo in una prova: rapporto proteico di 1:10. Digerire i campioni a 37 gradi centigradi durante la notte.
- Aggiungere 10 L di acido trifluoroacetico (TFA) e vortice. Incubare i campioni a 37 gradi centigradi per 90 minuti. Questo passaggio è necessario per idrolizzare il surfactant labile acido per prevenire interferenze durante la spettrometria di massa.
- Centrifugare i campioni a 12.000 x g a 4 gradi centigradi per 30 minuti e trasferire il supernatant in una fiala di vetro trasparente certificata cromatografica con tappi di setto Teflon/Silicone pre fessura. I campioni possono essere conservati a -20 gradi centigradi prima dell'analisi della spettrometria di massa.
- Sottoponete le fiale del campione alla cromatografia liquida abbinata alla spettrometria di massa ad alta definizione.
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Representative Results
Isolare e mantenere colture neuronali di neuroni SCG embrionali
Le cellule dissociate dal RATto embrionale SCG sono state placcate in una piastra rivestita in poli-D-lisina o coverslip e mantenute in supporti di coltura libera dal siero contenenti fattore di crescita b-nerve. Le cellule dissociate contenenti una miscela di neuroni e cellule gliali sembrano circolari sulla placcatura (Figura 1A). Entro 24 ore dalla placcatura, i neuroni estendono piccoli processi asoriali con cellule gliali che appiattiscono e appaiono graduale-scuro sotto microscopia a contrasto di fase (Figura 1B). Dopo il trattamento con Ara-C, il 99% delle cellule gliali viene eliminato e le colture contengono prevalentemente cellule neuronali con un corpo cellulare ovale, un'ampia crescita assonale e nessun dendrite(Figura 1C).
Colorazione immunocitomica dei neuroni dei gangli cervicali superiori al ratto embrionale
Studi precedenti hanno dimostrato che i neuroni simpatici coltivati in mezzo senza siero estendono solo gli assoni e estendono solo un elaborato pergolato dendritico in presenza di estratto di membrana seminterrato, 10% siero o 50 ng/mL proteina morfogenetica ossea-7 (BMP-7)2,12. In accordo con queste osservazioni, la microscopia a contrasto di fase mostra che i neuroni cresciuti in presenza di BMP-7 (50 ng/mL) per 5 giorni hanno un corpo cellulare appiattito con più processi di spessore rastremo rispetto ai neuroni cresciuti in supporti di controllo senza siero(Figura 2). L'identità di questi processi come dendriti è confermata dalla presenza di MAP-2, una proteina citoscheletale prevalentemente presente nel corpo cellulare e dendriti19,20. In condizioni di controllo, la colorazione fluorescente per MAP-2 è osservata all'interno del citoplasma e degli assoni prossimali ed esclusa dal nucleo (come evidenziato dalla co-etichettatura con una macchia nucleare per visualizzare il nucleo (Figura 3A-3D). Dopo il trattamento con BMP-7 a 50 ng/mL per 5 giorni, l'immunoreattività per MAP-2 si osserva non solo nel citoplasma, ma anche nei dendriti(Figura 3E-3H).
Esempio di analisi proteomica dei neuroni SCG coltivati in supporti di controllo
I neuroni simpatici del ratto E21 sono stati colturati in supporti di controllo per 6 giorni in vitro, lussati e sottoposti ad analisi LC-MS. Il campione è stato eseguito in tre repliche sullo spettrometro di massa e le proteine sono state identificate in base al numero di peptidi frammentati osservati per ogni campione. È stata calcolata l'abbondanza delle proteine (da 0 a oltre 300000 unità arbitrarie) e il punteggio di confidenza per l'ID proteina in base al numero di peptidi frammentati osservati per ogni proteina (che vanno da 5 a 500). Nella Figura 4 è illustrato un set di dati di esempio dell'analisi spettrometrica di massa del proteoma di 30 g di proteina scG colturata nei supporti di controllo senza siero.
Nel campione sono stati rilevati 13.134 peptidi che corrispondevano a 1287 proteine. Di questi, 1100 dei quali erano presenti in tutte e tre le repliche tecniche con valori di abbondanza normalizzati superiori a 500. Di queste 1100 proteine, 90 proteine sono state identificate dalla presenza di un singolo peptide colpito, che copriva solo una piccola parte della proteina. Pertanto, era difficile determinare se l'identificazione fosse corretta e se queste proteine avessero un basso punteggio di confidenza proteica (punteggio <10). Queste proteine sono state eliminate dall'analisi e le restanti 1010 proteine sono state ulteriormente analizzate utilizzando l'ontologia genica per determinare se il protocollo è riuscito a rilevare proteine con diversa localizzazione e funzione.
L'analisi dell'ontologia genica di questo set di dati è stata eseguita utilizzando il database di classificazione Panther (http://www.pantherdb.org/) per determinare se questo set di dati includeva proteine con diverse localizzazioni cellulari o funzioni molecolari e biologiche e per esaminare se esistevano le connessioni tra le proteine identificate e le vienote 21. L'analisi ha mostrato che sebbene oltre 700 delle proteine fossero citoplasmiche, tale set di dati conteneva proteine localizzate in altre regioni della cellula, tra cui il nucleo, la membrana, diversi organelli cellulari e giunzioni cellulari(Figura 4A). L'analisi ha inoltre rivelato che oltre 400 proteine avevano attività catalitica e circa 300 proteine erano coinvolte in vie di segnalazione(Figura 4B e Figura 4C). Inoltre, il set di dati conteneva proteine coinvolte in vari percorsi di segnalazione. La tabella 1 mostra cinque delle proteine nella segnalazione delle proteine G, l'adesione cellulare, il percorso di segnalazione del fattore di crescita e le vie di traffico di vescicole sinaptiche, rispettivamente, che sono state identificate nel set di dati.
Figura 1: Cambiamenti nella morfologia dei neuroni SCG embrionali del ratto E21 nel tempo. Immagini di microscopia a contrasto di fase rappresentativa a 10 volte l'ingrandimento delle cellule dissociate dal ratto E21 SCG 20 min dopo la placcatura (A), un giorno dopo la placcatura (B) e dopo 48 ore di trattamento Ara-C (5 giorni dopo la placcatura) (C). Si noti la presenza di cellule gliali (frecce) e di estensione assonale (teste difreccia)in ( B ) e l'assenza di cellule gliali e neuroni che mostrano una crescita assonale estesa in (C). Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Cambiamenti nella morfologia neuronale dei neuroni SCG del ratto E21 dopo il trattamento con BMP-7. Dopo l'eliminazione delle cellule non neuronali, i neuroni SCG colturati sono stati trattati con supporti di controllo (A) o BMP-7 a 50 ng/mL (B) per 5 giorni. Micrografi di contrasto di fase rappresentativa (ingrandimento 10x) mostrano il corpo circolare delle cellule neuronali con assoni nei neuroni di controllo (A) e neuroni con più processi corti simili a dendriti quando trattati con BMP-7 (frecce, B). Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Immunostaining per la proteina MAP-2 nei neuroni simpatici del ratto embrionale colturati. In seguito all'eliminazione di cellule non neuronali, i neuroni SCG colturati sono stati trattati con supporti di controllo (A-D) o BMP-7 a 50 ng/mL (E-H) per 5 giorni e immunostati utilizzando un anticorpo monoclonale del topo contro MAP-2 e co-etichettati con un marcatore nucleare. Micrografi rappresentativi che mostrano la colorazione immunocitomica dei neuroni con proteina microtubula associata a microtubuli -2 (MAP-2) (C,G), una macchia nucleare (D,H) con micrografie a contrasto di fase (B,F) e una fusione dei tre canali (A,E). La colorazione immunocitochimica per la proteina associata ai microtubuli-2 è presente nel corpo cellulare e negli assoni prossimali dei neuronidi controllo( C ) e colorazione per la proteina MAP-2 nel corpo cellulare e i dendriti nei neuroni trattati BMP-7 (G). Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Classificazione e distribuzione delle proteine identificate nell'analisi proteoma dei neuroni SCG del ratto E21. Gli ID proteici per le 1100 proteine sono stati sottoposti ad analisi di ontologia genica sul sistema di classificazione Panther per esaminare la distribuzione delle proteine nel set di dati rispetto alla localizzazione cellulare (A), alla funzione cellulare e ai processi biologici in cui sono stati coinvolti (B) e alla classe di funzione molecolare basata sulla struttura proteica (C). Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| A) Proteine coinvolte nell'adesione biologica | ||
| ID di accesso UniProt | Nome gene | Simbolo genetico |
| Q9-1Y3 | Cadherin-2 | Cdh2 |
| Errore O35112 | Antigene CD166 | Alcam |
| P49134 | Integrin beta-1 | Itgb1 |
| D3ES7 | Plexin A4 | Plxna4 |
| F1LP44 | Sottounità integrina alfa L | Itgal |
| B) Proteine coinvolte nella segnalazione dei fattori di crescita | ||
| P35213 | 14-3-3 proteine beta/alfa | Ywhab |
| Q5BJ92 | Fosforasi catalitica 4 sottounità catalitica | Ppp4c |
| P47196 | Rac – chinasi proteica alfa serina/treonina | Akt1 |
| P62994 | Proteina legata al recettore del fattore di crescita 2 | Grb2 |
| P21708 | Chinasi proteica attivata dal mitogeno 3 | Mapk3 |
| C) Proteine coinvolte nel percorso di segnalazione accoppiato con proteine G | ||
| P08753 | Proteina legante nucleotide di guanina G(k) sottounità alfa | Gnai3 |
| D4ABV5 | Calmodulin-2 | Calma2 |
| P18266 | Sintetizzazione glicogeno chinasi-3 beta | Gsk3b |
| Valore P09456 | sottounità regolamenta I-alfa dipendente da cAMP | Prkar1a |
| P53534 | Fosforilsi glicogeno | Pygb (forma cerebrale) |
| D) Proteine coinvolte nel traffico di vescicole sinaptiche | ||
| P47861 | Synaptotagmin-5 | Syt5 |
| P63045 | Proteina della membrana associata alla Vescicolo 2 | Vamp2 |
| P61265 | Sintassiin-1B | Stx1b |
| Q63537 | Synapsin-2 | Syn2 |
| P60881 | Proteina associata al sinotosomico 25 | Snap25 |
Tabella 1: Proteine rappresentative identificate nei dati del proteoma provenienti da neuroni SCG embrionali di ratto sereco, classificati in base alle loro funzioni biologiche. I dati sul proteoma con le 1100 proteine sono stati sottoposti ad analisi di ontologia genica utilizzando il sistema di classificazione Panther. Di seguito sono elencate le prime cinque proteine identificate per quattro vie biologiche.
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Discussion
Questo documento descrive i protocolli per la tatura di neuroni simpatici da gangli cervicali superiori di cuccioli di ratto embrionale. I vantaggi dell'utilizzo di questo sistema di modelli sono che è possibile ottenere una popolazione omogenea di neuroni che forniscono una risposta simile ai fattori di crescita, e dal momento che il fabbisogno di fattore di crescita per questi neuroni è stato ben caratterizzato, è possibile far crescere questi neuroni in vitro in supporti definiti, in condizioni di siero-libero10. Anche se il protocollo descrive il processo per isolare SCG da cuccioli di ratto E21, questo protocollo può essere utilizzato per la dissezione di SCG da cuccioli di ratto da E17 a E21 e per la dissezione del topo embrionale SCG10,22,23. Questo protocollo di dissezione può essere utilizzato anche per isolare SCG dai ratti postnatali con piccole modifiche ai passaggi iniziali. Queste modifiche includono l'eliminazione della necessità di sezione C, l'eutanasia degli animali postnatali che utilizzano l'anidride carbonica e la sterilizzazione dei cuccioli postnatali a seguito di eutanasia per immersione dei cuccioli nel 70% di alcol, prima di trasferirli ai mezzi di dissezione10. Questo protocollo di tastruttura neuronale può anche essere adattato per lo studio della guida assonale, del trasporto assonale e della formazione delle sinapsi utilizzando camere Campenot e camere microfluidiche24,25. Questi neuroni possono anche essere co-colturati con neuroni dai gangli radice dorsale o dai motoneuroni spinali o con cardiomiociti per studiare le interazioni neuronali e neurone – interazioni bersaglio nel sistema nervoso periferico26,27,28,29.
L'uso di neuroni SCG colturati per studi immunocitochimici è ben documentato. Il protocollo descritto nel documento fornisce un buon punto di partenza per lavorare con la maggior parte degli anticorpi. Tuttavia, ci sono anticorpi, come quelli che rilevano le proteine nucleari che possono richiedere una modifica al protocollo di fissazione e al protocollo di permeabilizzazione. Nel caso dell'anticorpo fosfo-SMAD, il trattamento con metanolo al 100% a -20 gradi centigradi è stato utilizzato per fissare e permeare i neuroni30,31.
I principali limiti di lavoro in questo sistema modello derivano dalle piccole dimensioni degli SCG nei cuccioli di ratto embrionale, che si traduce in un piccolo numero di neuroni. Ciò si traduce in una quantità limitata di acidi nucleici o proteine che possono essere ottenuti dalla dissezione di una cucciolata di cuccioli. Questo può essere problematico per l'analisi genomica e proteomica, soprattutto quando si confrontano tra più trattamenti in una dissezione. Inoltre, non è possibile ottenere colture neuronali SCG da un singolo embrione. Tutti gli esperimenti vengono quindi eseguiti su campioni in pool che vengono ottenuti da SCG di tutti gli embrioni di ratto in una lettiera. Un'altra limitazione del sistema è che i neuroni SCG hanno una minore efficienza di trasfezione del DNA (10 - 20%, osservazioni inedite) e maggiore tossicità dopo la trasfezione rispetto ai neuroni centrali32. Anche se questa efficienza della trasfezione va bene per gli studi morfologici con singoli neuroni, è difficile eseguire studi molecolari o biochimici per rilevare/confermare i cambiamenti di espressione genica.
Tuttavia, negli ultimi anni, i neuroni SCG colturati sono stati utilizzati per studi che esaminano i meccanismi alla base della crescita dendritica e per le analisi trascrittomama e miRNome14,15,33. Come indicato in precedenza, a causa di basse quantità proteiche, i neuroni colturati da SCG embrionale non sono stati utilizzati in precedenza per l'analisi proteomica. Questo protocollo e i risultati rappresentativi forniscono la prova che anche con bassa concentrazione di campioni, gli attuali strumenti di spettrometria di massa ad alta definizione potrebbero essere utilizzati per studi proteomici su questi neuroni. Anche se il protocollo di preparazione del campione qui descritto è per i neuroni SCG, questo protocollo può essere utilizzato per la preparazione di qualsiasi campione con bassa concentrazione di proteine per l'analisi LC-MS. Una delle limitazioni è che piccole variazioni nella concentrazione di proteine o nell'efficienza della digestione della trypsina possono provocare una frammentazione incompleta e una drastica diminuzione del numero di proteine rilevate dalla LC-MS. Pertanto, è fondamentale garantire che le concentrazioni proteiche di partenza siano vicine a 50 g con un rapporto di 10:1 di proteina: la trypsina. Inoltre, è buona pratica per aliquot la prova di spectrometria di massa-grado per evitare più cicli di congelamento-disgelo.
Un'altra limitazione del protocollo è che c'era solo un numero limitato di proteine transmembrane rilevate nel proteoma. Mentre l'acido labile surfactant ha dimostrato di essere un efficace surfactant per la spettrometria di massa, uno studio precedente sulle cellule culture ha scoperto che questi surfactants possono aumentare leggermente il numero di proteine citoplasmiche e diminuire le proteine della membrana nel profilo proteomico34. Inoltre, è stato suggerito che la pre-digestione utilizzando un endopeptidasi batterico come Lys-C, prima della digestione della trypsina può migliorare l'efficienza della digestione della trypsina delle proteine legate alla membrana e impedire che i frammenti di proteina della membrana vengano mantenuti sulle colonne LC35.
In sintesi, questo articolo fornisce protocolli dettagliati per la crescita dei neuroni simpatici embrionali di ratto coltivati e per l'esecuzione di studi morfologici e proteomici su questi neuroni.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal Faculty Development Fund e dalla borsa di studio Summer Research Program presso il Saint Mary's College of California. Gli autori vorrebbero anche ringraziare la Dott.ssa Pamela Lein dell'Università della California a Davis e il Dr. Anthony Iavarone presso la struttura di spettrometria di massa uc Berkeley per i loro consigli durante lo sviluppo di questi protocolli. Gli autori ringraziano anche Haley Nelson dell'Office of College Communications del Saint Mary's College of California per il suo aiuto nella produzione e nell'editing video.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2D nanoACQUITY | Waters Corporation | ||
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| BMP-7 | R&D Systems | 354-BP | |
| Bovine Serum Alumin | Sigma-Aldrich | 5470 | |
| Cell scraper | Corning | CLS-3010 | |
| Collagenase | Worthington Biochemical | 4176 | |
| Corning Costar or Nunc Flat bottomed Cell culture plates | Fisher Scientific | 07-200, 140675, 142475 | |
| Cytosine- β- D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich | C1768 | |
| D-phosphate buffered saline (Calcium and magnesium free) | ATCC | 30-2200 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 15230 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| DMEM - Low glucose + Glutamine, + sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11885 | |
| Fatty Acid Free BSA | Calbiochem | 126609 | 20 mg/mL stock in low glucose DMEM |
| Fine forceps Dumont no.4 and no.5 | Ted Pella Inc | 5621, 5622 | |
| Forceps and Scissors for Dissection | Ted Pella Inc | 1328, 1329, 5002 | |
| Glass coverlips - 12mm | Neuvitro Corporation | GG-12 | |
| Goat-Anti Mouse IgG Alexa 488 conjugated | Thermo Fisher Scientific | A32723 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 11765 | |
| Hank's balanced salt soltion (Calcium and Magnesium free) | Thermo Fisher Scientific | 14185 | |
| Insulin-Selenium-Transferrin (100X) | Thermo Fisher Scientific | 41400-045 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | A3221 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030 | |
| Leibovitz L-15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
| Mounting media for glass coverslips | Thermo Fisher Scientific | P36931, P36934 | |
| Mouse-anti- MAP2 antibody (SMI-52) | BioLegend | SMI 52 | |
| Nerve growth factor | Envigo Bioproducts (formerly Harlan Bioproducts) | BT5017 | Stock 125 μg/mL in 0.2% Prionex in DMEM |
| Paraformaldehye | Spectrum Chemicals | P1010 | |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15140 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| Prionex | Millipore | 529600 | 10% solution, 100 mL |
| RapiGest SF | Waters Corporation | 186001861 | 5 X 1 mg |
| Synapt G2 High Definition Mass Spectrometry | Waters Corporation | ||
| Trifluoro acetic acid - Sequencing grade | Thermo Fisher Scientific | 28904 | 10 X 1 mL |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trypsin | Promega or NEB | V511A, P8101S | 100 μg or 5 X 20 mg |
| Waters Total recovery vials | Waters Corporation | 186000385c |
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