Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

חולדה Culturing נוירונים סימפטיים מגנגליה צוואר הרחם מעולה עוברית לניתוח מורפולוגי ופרוטונומי

Published: September 27, 2020 doi: 10.3791/61283

Summary

מאמר זה מתאר את הבידוד וההתלות של נוירונים אוהדים של חולדה עוברית מגנגליה צוואר הרחם מעולה. הוא גם מספק פרוטוקולים מפורטים עבור כתמים חיסוניים והכנת תמציות עצביות לניתוח ספקטרומטרי מסה.

Abstract

נוירונים סימפטיים מן החולדה העוברית מעולה ganglia צוואר הרחם (SCG) שימשו כמערכת מודל מבחנה עבור נוירונים היקפיים לחקור צמיחה סקסונית, סחר באקסונים, סינפטוגנזה, צמיחה דנדריטית, פלסטיות דנדריטית ואינטראקציות מטרה עצבית במערכות תרבות שותף. פרוטוקול זה מתאר את הבידוד והניתיקות של תאי העצב מהגרגליה צוואר הרחם מעולה של עוברי חולדה E21, ואחריו הכנה ותחזוקה של תרבויות עצביות טהורות במדיום ללא סרום. מאז נוירונים אינם לדבוק פלסטיק לא מצופה, נוירונים יהיה תרבותי על או 12 מ"מ כיסוי זכוכית או 6-well צלחות מצופה פולי-D-לינזין. לאחר טיפול עם סוכן אנטימיוטי (Ara-C, ציטוסין β-D-arabinofuranoside), פרוטוקול זה יוצר תרביות עצביות בריאות עם פחות מ 5% תאים שאינם נוירוניים, אשר ניתן לשמור במשך יותר מחודש במבחנה. למרות חולדה עוברית SCG נוירונים הם רב קוטבי עם 5-8 דנדריטים ב vivo; בתנאים ללא סרום, נוירונים אלה להרחיב רק axon אחד בתרבות ולהמשיך להיות חד קוטבי למשך כל התרבות. עם זאת, נוירונים אלה יכולים להיות מושרה להאריך דנדריטים בנוכחות תמצית קרום מרתף, חלבונים מורפוגנטיים עצם (BMPs), או 10% סרום עגל עוברי. תרבויות עצביות הומוגניות אלה יכולות לשמש להכתמה חיסונית ולחקרים ביוכימיים. מאמר זה מתאר גם פרוטוקול אופטימיזציה עבור כתמים חיסוניים עבור microtubule הקשורים חלבון-2 (MAP-2) בנוירונים אלה, להכנת תמציות עצביות לספקטרומטריה מסה.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

נוירונים סימפטיים נגזר גנגליה צוואר הרחם מעולה עוברי (SCG) שימשו באופן נרחב כמערכת תרבות עצבית ראשית לחקר היבטים רבים של התפתחות עצבית כולל תלות גורם גדילה, אינטראקציות נוירון-יעד, נוירוטרנסמיטר איתות, צמיחה סקסוני, פיתוח דנדריט ו פלסטיות, סינפטוגנזה ומנגנוני איתות הבסיסית עצב-יעד / נוירון-glia אינטראקציות1,,2,,3,,4,,5,,6,,7,,8,,9. למרות גודלם הקטן (כ-10000 נוירונים/גנגליה), ישנן שלוש סיבות עיקריות לפיתוח ולשימוש נרחב במערכת תרבות זו הם אני) להיות הגנגליה הראשונה בשרשרת הסימפטית, הם גדולים יותר, ולכן קל יותר לבודד, מאשר שאר הגנגליה הסימפטית10; ii) בניגוד לנוירונים המרכזיים, הנוירונים ב-SCG הם הומוגניים למדי עם כל הנוירונים הנגזרים מהציצה העצבית, בעל גודל דומה, תלות בגורם גדילה עצבי ולהיות נור-adrenergic. זה הופך אותם מודל יקר ערך עבור מחקרים מורפולוגיים וגנומיים10,11 ו- iii) נוירונים אלה יכולים להישמר במדיום מוגדר ללא סרום המכיל גורם גדילהעצבי במשך יותר מחודש 10,12. נוירונים SCG Perinatal שימשו בהרחבה לחקר המנגנונים הבסיסיים ייזום ותחזוקה של דנדריטים2. הסיבה לכך היא בעיקר, למרות נוירונים SCG יש arbor דנדריטי נרחב vivo, הם לא להרחיב דנדריטים במבחנה בהיעדר סרום, אבל יכול להיות מושרה לגדול דנדריטים בנוכחות גורמי גדילה מסוימים כגון חלבונים מורפוגנטעצם 2,,12,13.

מאמר זה מתאר את הפרוטוקול לבידוד ולקולות נוירונים SCG חולדה עוברית. במהלך 50 השנים האחרונות, תרבויות עצביות עיקריות של SCG שימשו בעיקר מחקרים מורפולוגיים עם מספר מוגבל של מחקרים הבוחנים את השינויים הגנומיים או פרוטאומיים בקנה מידה גדול. זה בעיקר בשל גודל רקמה קטנה וכתוצאה מכך בידוד של כמויות נמוכות של DNA או חלבון, מה שמקשה לבצע ניתוחים גנומיים ופרוטונומיים על נוירונים אלה. עם זאת, בשנים האחרונות, רגישות גילוי מוגברת אפשרה פיתוח של שיטות לבחון את הגנום, miRNome ופרוטומה בנוירונים SCG במהלך פיתוח צמיחהדנדריטית 14,15,16,17. מאמר זה יתאר גם את השיטה לניתוח מורפולוגי של נוירונים אלה באמצעות אימונוציטוכימיה ופרוטוקול כדי להשיג תמציות חלבון עצבי לניתוח ספקטרומטרי מסה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

כל ההליכים שבוצעו במחקרים הקשורים לבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) במכללת סנט מרי בקליפורניה. ההנחיות לטיפול בבעלי חיים ולשימוש במכללת סנט מרי פותחו בהתאם להנחיות שסיפק המשרד לרווחת בעלי חיים במעבדה במכון הלאומי לבריאות (https://olaw.nih.gov/sites/default/files/PHSPolicyLabAnimals.pdf https://olaw.nih.gov/sites/default/files/Guide-for-the-Care-and-Use-of-Laboratory-Animals.pdf).

1. הכנת מדיה תרבות (המכונה גם אמצעי בקרה)

  1. הוסף את המרכיבים הבאים, בסדר המפורט להלן, לבקבוקן סטרילי 500 מ"ל: 190 מ"ל של 1x DMEM דל גלוקוז, 10 מ"ל של 20 מ"ג / מ"ל חומצת שומן ללא חומצת שומן אלבומין סרום(FAF-BSA) ב DMEM, 2.8 מ"ל של 200 מ"ל ל-גלוטמין, 4 מ"ל של תערובת אינסולין-סלניום-transferrin 100x, 0.4 מ"ל של 125 μg/mL גורם גדילה עצבי (ב 0.2% מייצב חלבון אינרטי ב DMEM), ו 200 מ"ל של M-12 מדיום של האם.
  2. הקפד לכסות את הפיפטה עם המדיום המכיל FAF-BSA לפני תוספת של פתרונות המכילים חלבון כגון אינסולין-סלניום-transferrin ו NGF כדי למנוע דבק של חלבונים לפיפטה.
  3. מערבבים את הבקבוקון כדי לערבב את המרכיבים לאחר כל תוספת. מערבבים היטב עם פיפטה של 25 מ"ל לאחר תוספת של F-12.
  4. Aliquot התקשורת התרבות ב 10 mL aliquots ולאחסן ב -80 °C. ניתן לאחסן את האליקוטים במשך שישה חודשים ללא אובדן פעילות.

2. הכנת צלחות לתנוירונים

  1. לדלל 1 מ"ג / מ"ל מלאי של פולי-D-לינזין (עשוי 0.5 M Tris מאגר, pH 8) כדי 100 μg / מ"ל עם מים מזוקקים סטריליים.
  2. לניתוח פרוטאומי או גנומי, יום עד יומיים לפני הניתוח, מעיל 6-well צלחות עם כ 2 מ"ל של סטרילי 100 גרם/מ"ל של פולי-D-לינזין (PDL). זה הכרחי כדי להבטיח הדבקת תאים לבאר. עוטפים את הצלחות בניילון נצמד ומאחסנים את הצלחות למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.
  3. לניתוח מורפולוגי ומיקרוסקופיה, המקום 12 מ"מ2 כיסויי זכוכית גרמנית מטופלים מראש (אשר ניתן לנקות באמצעות טיפול חומצה חנקתית כפי שתוארבעבר 18 או נרכש) לתוך כל בארות של צלחת 24 באר.
    1. לכסות את כיסויי עם 0.3 מ"ל של סטרילי 100 גרם/מ"ל של פולי-D-לינזין (PDL). לאחסן את הצלחות למשך הלילה ב-4°C.
  4. ביום הקטע, לפני תחילת הקטע, להסיר את תמיסת poly-D-לינזין מהבארות ולשטוף את הבארים חמש פעמים עם מים מזוקקים סטריליים, ואחריו פעם אחת עם DMEM גלוקוז נמוך.
  5. במהלך העיכול האנזימטי של הגנגליה (כשעה לפני ציפוי התאים), לשאוף DMEM מן הצלחות ולהחליף אותו עם 0.3 מ"ל של מדיה שליטה. לאחסן את הצלחות ב 35.5 ° C תחת 5% CO2 בתא לח.

3. כיוונון פעולה

  1. הכנת 200 מ"ל של מדיה עבור פירוק (המכונה מדיה פירוק)
    1. הוסף 8 מ"ל של 20 מ"ג/מ"ל ללא חומצת שומן סרום אלומין (FAF-BSA) ב DMEM גלוקוז נמוך (עם 1 מ"ג / מ"ל גלוקוז ) ו-2 מ"ל של פניצילין-סטרפטומיצין פי 100 מ"ל עד 193 מ"ל של L-15 בינוני סטרילי (או כל מדיום עם אגירה אווירית)
  2. בשכונה, להגדיר את הפריטים הבאים עבור פירוק: ארבעה צינורות חסונים סטריליים 50 מ"ל עם כ 20 מ"ל של אמצעי פעולה פירוק בכל צינור, ארבע מנות סטריליות 35 מ"מ עם 1.5 מ"ל של תקשורת דיסטורית, שפופרת חרטית סטרילית אחת של 50 מ"ל עם 20 מ"ל של אמצעי פירוק צנטריפוגציה, צינור חנטרי אחד סטרילי של 15 מ"ל עבור צנטריפוגות הגנגליה וצינור סטרילי אחד של 10 מ"ל לאיסוף התאים התותקים.,
  3. השתמשו במחטא חרוז יבש כדי לחטא זוג מפסים עדינים (מס' 4 או לא 5 מפסים) למשך דקה אחת לפחות.

4. בידוד של גנגליה צוואר הרחם מעולה מגורי חולדות עובריות

  1. הסרת עוברי E21 מהעכברוש ההרה
    הערה: הסרת קרן הרחם יכולה להתבצע מחוץ למכסה המנוע אם האזור שמסביב הוא עיקור יסודי.
    1. המתת סד לעכברוש ההרה באמצעות שאיפת CO2. גזור את הפרווה מאזור הבטן ונגב את העור באזור עם 70% אלכוהול כדי לחטא אותו.
    2. באמצעות סט טרי של מספריים סטריליים ומקצות, לחתוך דרך העור ולאחר מכן את שכבת השריר כדי לחשוף את קרני הרחם המכילות את העוברים. הסר את קרני הרחם עם העוברים באמצעות סט חדש של מספריים ומלקחיים, תוך הקתה לא לפגוע במעיים בתהליך.
    3. מעבירים את קרני הרחם עם העוברים לצלחת פטרי סטריליתשל 150 מ"מ והעברתן למכסה המנוע.
    4. באמצעות סט חדש של מרטפים ומספריים, להוציא את העוברים מקרן הרחם ולהפריד את העוברים מן הממברנות מי המי שם ואת שליה.
    5. כדי להמתת סד העוברים, לחתוך את חוט השדרה של העוברים לאורך קו האמצע מתחת לזרוע ימין. זה גם יפחית את הדימום מהעורק הראשי במהלך הסרת SCG.
    6. להעביר עוברים אלה לתוך צינורות 50 mL קון מוכן המכיל מדיה פירוק. תוודא שהעוברים שקועים בתקשורת. כל צינור יכול להכיל עד 3 עוברים.
  2. בידוד של גנגליון צוואר הרחם מעולה מן העובר
    1. מעבירים גור אחד מהמדיה של הניתור לצלחת פטרי סטרילית של 150מ"מ 2 פטרי, חצי מלאה בעשייה מוצקה (שעוות פרפין או פולימר מסיליקון), עם משטח הגב שלה על המקום. באמצעות שלוש מחטים סטריליות 23 G, להצמיד את הגור לצלחת עם מחט אחת מתחת לכל זרוע מחט שלישית דרך הפה כדי להגזים בזהירות את הצוואר.
    2. חותכים את העור באזור הצוואר באמצעות מקצות דקים סטריליים (מס ' 4 או לא. 5 מקצות) כדי לחשוף את בלוטות הרוק מתחת. להסיר בלוטות אלה באמצעות מפסים עדינים.
    3. אתר את שרירי הסטרנוקלידומטואיד והאומוהיואידים ליד עצם הבריח וקנה הנשימה, בהתאמה. ראשית לחתוך את שרירי sternocleidomastoid רוחבי ולאחר מכן בזהירות לחתוך את שריר omohyoid דק באמצעות משקולות עדינות. ברגע שרירים אלה מוסרים, bifurcation בעורק הראשי בקצה הקדמי יהיה גלוי משני צידי קנה הנשימה, עם SCG ממוקם תחת זה ממוקם תחת זה פורק בעורק הראשי.
    4. באמצעות משקולות סגורות, הרם בעדינות את העורק הראשי כדי לדמיין את ה-SCG. Using one forceps on either side of the SCG, pull out the carotid and transfer it to the prepared sterile 35 mm2 dishes. רקמה זו תכיל ככל הנראה את SCG עם העורק הראשי, עצב התועה עם גנגליה nodose, כמו גם קטעים אחרים של שריר או שומן באזור.
    5. חזור על תהליך הפירוק בצד השני. הסר SCGs מכל העוברים לפני שתמשיך עם שאר שלבי הפירוק המתוארים להלן. להפיץ את הרקמות המבודדות בין שתיים 35 מ"מ2 כלים כדי להקל על עיבוד של דגימות רקמה.
  3. עיבוד לאחר העיבוד של SCG
    1. כדי להפריד את SCG מן הרקמה הניתח, הראשון להשתמש מלקחיים עדינים כדי להסיר כל רקמה מיותרת, כגון שומן או שריר, טיפול כדי למנוע את האזור ליד bifurcation העורק.
    2. ברגע שהרקמות האלה הוסרו, שתי גנגליה נראות לעין. הגנגליון של הנוקדים קטן ועגול יותר, ואילו ה-SCG הוא בצורת שקד. בעדינות למשוך את העצב vagus להפריד את העצב vagus ואת גנגליה nodose מהעורק הראשי ולאחר מכן להפריד את SCG מהעורק הראשי.
    3. השתמש במנכון כדי להסיר את הקפסולה המקיפה את ה-SCG. העבר את ה-SCG לצלחת תרבות חדשה של 35 מ"מ. חזור על התהליך עם כל דגימות הרקמה הנקטעו.
    4. מעיל פיפטת זכוכית מחטאת מכותנה עם אמצעי פעולה של פירוק כדי למנוע מהרקמות דבקות בקירות הפיפטה. השתמש פיפטה כדי להחליף את מדיית הניתור עם סטרילי 2 מ"ל של קולגנאז סוג II (1 מ"ג / מ"ל)/ dispase סוג II (5 מ"ג / מ"ל) ב HBSS ללא סידן ומגנזיום, דגירה במשך 50 דקות ב 37 ° C כדי לעזור לשבור את הרקמות.
      הערה: ייתכן שיהיה צורך למטב את זמן הדגירה עם אצוות שונות של Collagenase/Dispase ובדרך כלל נע בין 40 דקות לשעה.
    5. במהלך הדגירה, לשאוף DMEM מן הלוחות ולהחליף אותו עם 0.3 מ"ל של מדיה שליטה. לאחסן את הצלחות ב 35.5 ° C תחת 5% CO2 בתא לח.
    6. בעקבות הדגירה, להעביר SCGs קולגנאז / דיפסה לצינור סטרילי 15 מ"ל חסין. השתמשו למדיית הניתור כדי לשטוף את הלוחות ולהעביר את הפתרון לצינור. הוסף מספיק מדיית פירוק כדי להעלות את עוצמת הקול לכ- 10 מ"ל.
    7. צנטריפוגה ב 200 x g (1000 - 1200 סל"ד) במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי גלולת הדגימה. לשאוף את הסופרנטנט, לדאוג לא להוציא את הכדור. תולה מחדש את הכדור עם 10 מ"ל של תקשורת פירוק. חזור על הצנטריפוגה וזרוק את הסופרנטנט.
    8. החלף ב- 1 - 2 מ"ל של תרבות בינונית. באמצעות פיפטה פסטר סטרילי צר-משעמם, עקום קצה סטרילי (מצופה מראש עם מדיום תרבות), מכנית לנתק את הגושים על ידי בעדינות triturating 5-6 פעמים. תנו לגושים הגדולים יותר להסתפק בדקה אחת. העבר את מתלי התא העל-טבעיים לצינור חדש של 10 מ"ל.
    9. חזור על תהליך זה 3 פעמים נוספות, עם כוח גובר של טריטורציה בכל פעם כדי להבטיח ניתור כמעט מלא של SCGs. להעביר את supernatant לאחר כל סיבוב של טריטורציה לצינור 10 מ"ל עם העל-טבעי מהטריטוריה הראשונה.
    10. הוסף מספיק מדיה תרבות כדי להעלות את עוצמת הקול 8 - 10 מ"ל. מערבבים בעדינות את מתלי התא וכמתים את צפיפות התא עם מדים המיוצית.
    11. הפיצו את מתלי התא לבארות בצפיפות התא המתאימה לניסויים. מערבבים את מתלי התא ללא הרף במהלך תהליך הציפוי כדי להבטיח חלוקה שווה של תאים לתוך בארות.
      הערה: לניתוח מורפולוגי, לוח התאים סביב 8,000 תאים / גם ב 24 לוחות באר עבור פרוטוקולים גנומיים ופרוטונומיים, לוח התאים גבוה ככל 30,000 תאים / גם.
    12. מעבירים את הצלחות למתייוש זכוכית עם מים סטריליים בתחתית כדי ליצור תא לח. הזרק מספיק CO2 (סביב 120 מ"ל) כדי להשיג 5% CO2 סביבה במימש, לפני איטום. שמרו על הצלחות ב-35.5 מעלות צלזיוס. תיקרא יום 0 בפרוטוקול.
      הערה: ניתן לשמור על לוחות אלה גם באינקובטור CO2 רגיל של 5%. השיטה המתוארת לעיל ממזערת שינויי טמפרטורה ו-pH וגם מסייעת במניעת זיהום צולב.

5. תחזוקה של נוירונים וטיפולים SCG תרבותיים

  1. ביום הראשון (24 שעות לאחר הציפוי), הסירו בזהירות מחצית מהמדיה של התרבות, והחליפו ב-2 μM Ara-C (ציטוסין β-D-arabinofuranoside, חומר אנטי-מיטוטי). תשאיר את הטיפול בתאים למשך 48 שעות. בדרך כלל, אורך זה של טיפול מספיק כדי לחסל תאים שאינם עצביים בתרבות.
  2. ביום 3, שואפים בעדינות חצי מהמדיום והחלף במדיום שליטה.
  3. ביום ה-4, התאים מוכנים לטיפולים ניסיוניים. מזינים תרביות כל יומיים במדיום המתאים, ומחליף בעדינות חצי מהמדיום בבאר עם מדיום טרי.
  4. נוירונים SCG תרבותיים במדיום ללא סרום להאריך רק אקסונים. אם ניסויים דורשים נוכחות של דנדריטים, לטפל בתאים עם 10% סרום עגל עוברי, 75-100 μg / מ"ל של תמצית מטריצת קרום מרתף או 50 ng/mL של חלבון מורפוגנטי עצם-7. צמיחה דנדריטית נצפתה בתוך 48 שעות של טיפול עם arbor דנדריטי משוכלל שנצפה בתוך שבוע של טיפול.

6. תאי עצב SCG תרבותיים חיסוניים

  1. בהדרגה להחליף את מדיום תרבות התא בבאר עם 4% paraformaldehyde ב 0.1 M פוספט מאגר, pH 7.2 ב מכסה המנוע אדים.
    1. הסר מחצית מהמדיה התרבות בבאר ולהחליף אותו בעדינות עם 4% paraformaldehyde. לאחר מכן, חזור על התהליך לפחות פעמיים נוספות, הסרת שני שלישים של התקשורת בבאר בכל פעם והחלפת עם 4% paraformaldehyde. בסוף תהליך זה, צבע המדיה בבאר היה צריך להשתנות ורוד לצבע.
    2. לאחר שכל המדיום הוחלף ב-4% פארפורמלדהיד, דגירה את הבארים במשך 15-20 דקות בטמפרטורת החדר.
  2. עם תהליך דומה כמתואר לעיל, בהדרגה להחליף את תמיסת paraformaldehyde 4% עם תמיסת מלח פוספט אגירה (PBS), pH 7.2. תעזוב ל-5 דקות. לשטוף את הבארים עוד פעמיים במשך 5 דקות כל אחד עם PBS.
    1. לאחר הסרת 4% paraformaldehyde, להעביר את הצלחות על גבי הספסל לעיבוד נוסף. שלב זה הוא נקודת עצירה טובה שבה ניתן לאחסן צלחות ב-4°C בין לילה.
  3. הסר את כל PBS. הוסף מספיק נפח של 0.1% Triton X-100 ב PBS כדי לכסות את התאים. תשאיר את זה על התרבויות ל-5 דקות כדי לחלחל את הנוירונים. התזמון של שלב זה הוא קריטי כדי להבטיח כתמים טובים תוך שמירה על שלמות התאים.
  4. הסר בזהירות את פתרון Triton X-100 ושטוף את הבארים שלוש פעמים במשך 5 דקות בכל פעם באמצעות PBS. הסר את פתרון PBS.
  5. הוסף מספיק 5% BSA ב PBS כדי לכסות את התאים דגירה בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות כדי להפחית כריכת נוגדנים לא ספציפית.
  6. הסר את פתרון החסימה והחלף אותו במניון חד-קלוני של עכבר מול חלבון MAP-2 מדולל ב-5% BSA ב-PBS. השאר את הנוגדן הראשי על התאים למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.
  7. הסר ושמור את הנוגדן הראשי עבור שימוש חוזר. הנוגדן העיקרי ניתן לעשות בו ערך לפחות פעמיים ללא אובדן עוצמת זיהוי.
  8. לשטוף שלוש פעמים עם מספיק PBS כדי לכסות את התאים. השאר את PBS בתאים למשך 10 דקות לכל שטיפה.
  9. הסר את פתרון PBS והחלף אותו בפרודן איגג אנטי-עכבר ים פלואורסצנטי ב- 1:1000 ב- 5% BSA ב- PBS. דגירה במשך שעתיים בחושך בטמפרטורת החדר.
  10. הסר את הנוגדן המשני והחלף אותו ב- PBS. לשטוף את הבארים שלוש פעמים עם PBS במשך 10 דקות לכל שטיפה. יש לשטוף את הבארות פעם אחת במים כדי להסיר מלחים.
  11. הר את הכיסויים על מגלשות זכוכית המכילות טיפה של mountant מים המתאים לדגימות המסוימות בנתון פלורסנט. אחסן את השקופיות ב- 4°C, בתיקיית שקופיות עד להכנה להדמיה.

7. הכנה לדוגמה לניתוח הפרוטאום באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם ספקטרומטריה מסה

  1. ליסיס של נוירונים תרבותיים
    1. הסר בעדינות את כל אמצעי התקשורת התרבות בארות. החלף אותו בסידן קר, סטרילי ותמיסת מלח ללא פוספט (PBS), pH 7.4. הסר במהירות ולהחליף עם PBS ולתת לו לשבת במשך 5 דקות. שלב זה נעשה כדי להסיר את כל החלבונים הנוכחים בתקשורת התרבות.
    2. בזהירות להסיר את כל PBS מכל הבארים לטיפול מסוים. חזור על התהליך עוד פעם אחת. לשמור על צלחות מעל קרח בעת תסיסת התאים כדי למזער נזק עצבי ופרוטוליזה.
    3. להוסיף 100 - 150 μL של 50 mM אמוניום ביקרבונט, pH 7.5 (NH4HCO3)לאחד הבארים ולגרד תאים באמצעות מגרד תא סטרילי. באמצעות מיקרופיפט, להעביר את הנוזל ולחזור על תהליך גירוד עם כל בארות לטיפול מסוים. בדוק את בארות תחת המיקרוסקופ לאחר גירוד כדי לוודא כי רוב התאים הוסרו.
      1. עם המספר הנמוך של נוירונים, להשתמש בנפח מוגבל כדי lyse התאים כדי להבטיח ריכוז גבוה מספיק לניתוח פרוטאומי.
    4. להקפיא את הפתרון ב -80 מעלות צלזיוס לילה כדי לסייע עם ליזיס התא. בשלב זה ניתן לאחסן את הליזה עד לעיבוד נוסף.
    5. לאחר הפשרה, להשפריץ את הדגימות דרך מזרק עם מחט 26 G או 28 G כדי ללקט את התאים באופן מכני.
    6. Sonicate הדגימות באמבט מים sonicating פעמיים במשך 10 דקות. מוסיפים קרח לאמבט המים כדי למנוע התחממות יתר ופירוק חלבונים. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 4 °C ב 12,000 x g.
    7. למדוד את ריכוז החלבון. ריכוזי חלבון טיפוסיים נעים בין 0.4 - 1 μg/μL
  2. הכנה לדוגמה ועיכול ניסיון לניתוח פרוטאום
    1. להעביר מקסימום של 60 μL של lysate או 50 μg של חלבון לתוך צינור DNase-, RNase- ופרוטאז 1.5 מ"ל. אם נפח lysate הוא פחות מ 60 μL, להוסיף מספיק 50 mM אמוניום ביקרבונט כדי להפוך את הנפח.
    2. להוסיף 25 μL של 0.2% חומצה labile פעילי שטח ומערבולת. דגירה הצינור ב דוד בלוק ב 80 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. צנטריפוגה הצינור ב 12,000 x g עבור 30 s.
    3. הוסף 2.5 μL של 100 mM dithiothreitol ומערבולת. זה הופך את החלבון נגיש יותר עבור אלקילציה ועיכול. דגירה הצינור ב 60 מעלות צלזיוס בתנור בלוק במשך 30 דקות. קריר לטמפרטורת החדר וצנטריפוגה.
    4. להוסיף 2.5 μL של 300 mm iodoacetamide לדגימה ומערבולת. צעד זה מסייע לאקסילציה של ציסטאין ומונע מהם לתקן את איגרות החוב. דגירה את הצינורות בטמפרטורת החדר בחושך במשך 30 דקות.
    5. להוסיף טריפסין כיתה ספקטרומטריה מסה (0.5 μg / μL) לצינור ב שלושה דרך: יחס חלבון של 1:10. לעכל את הדגימות ב 37 מעלות צלזיוס הלילה.
    6. להוסיף 10 μL של 5% חומצה trifluoroacetic (TFA) ומערבולת. מדגירה את הדגימות ב-37°C למשך 90 דקות. שלב זה נחוץ כדי הידרוליזה פעילי שטח labile חומצה כדי למנוע הפרעה במהלך ספקטרומטריית מסה.
    7. צנטריפוגה הדגימות ב 12,000 x g ב 4 ° C במשך 30 דקות ולהעביר supernatant למבחנה זכוכית ברורה מוסמך כרומטוגרפיה עם טפלון חריץ מראש / סיליקון מחיצה כמוסות. ניתן לאחסן דגימות ב-20°C לפני ניתוח ספקטרומטריה מסה.
    8. נושא את הבקבוקונים לדוגמה כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם ספקטרומטריה מסה בהבחנה גבוהה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

בידוד ותחזוקה של תרביות עצביות של נוירונים עובריים SCG
תאים תפורים מSCG עוברי חולדה היו מצופה בצלחת פולי-D-ליסין מצופה או כיסוי ומתוחזק בתקשורת תרבות חופשית סרום המכיל גורם גדילה B-עצב. התאים התופרקים המכילים תערובת של תאי עצב ותאי גליה נראים עגולים עלציפוי (איור 1A). בתוך 24 שעות של ציפוי, הנוירונים להאריך תהליכים סקסוניים קטנים עם תאי גליה שיטוח ומופיע שלב כהה תחת מיקרוסקופ ניגודיות שלב(איור 1B). לאחר הטיפול עם Ara-C, 99% של תאי גליה מסולקים ואת התרבויות מכילים בעיקר תאים עצביים עם גוף תא סגלגל, צמיחה אקסונאלית נרחבת ללא דנדריטים(איור 1C).

כתם חיסוני של חולדה עוברית מתורבית עליונות צוואר הרחם גנגליה נוירונים
מחקרים קודמים הראו כי נוירונים סימפטיים תרבותיים גדל בינוני סרום להאריך רק אקסונים ולהרחיב arbor דנדריטי משוכלל בנוכחות תמצית קרום מרתף, 10% סרום או 50 ng/mL עצם morphogenetic חלבון-7 (BMP-7)2,,12. בהסכמה עם תצפיות אלה, מיקרוסקופ ניגודיות שלב מראה כי נוירונים גדל בנוכחות BMP-7 (50 ng/mL) במשך 5 ימים יש גוף תא שטוח עם תהליכים מחודדים עבה מרובים בהשוואה לנוירונים גדל במדיה שליטה ללא סרום(איור 2). זהותם של תהליכים אלה כמו dendrites מאושר על ידי הנוכחות של MAP-2, חלבון cytoskeletal נמצא בעיקר בגוף התא דנדריטים19,,20. בתנאי בקרה, כתמי פלורסנט עבור MAP-2 נצפתה בתוך ציטופלסמה אקסונים פרוקסימליים ולא נכלל הגרעין (כפי שמעיד תיוג שותף עם כתם גרעיני כדי לדמיין את הגרעין (איור 3A-3D). לאחר טיפול עם BMP-7 ב 50 ng/mL במשך 5 ימים, אימונות עבור MAP-2 נצפתה לא רק ציטופלסמה אלא גם בדנדריטים (איור 3E-3H).

ניתוח פרוטאומי לדוגמה של נוירונים SCG תרבותיים גדל במדיה שליטה
E21 חולדה נוירונים אוהדים היו תרבותיים בתקשורת שליטה במשך 6 ימים במבחנה, lysed נתון לניתוח LC-MS. הדגימה נוהלה בשלושה שכפולים על ספקטרומטר המסה והחלבונים זוהו בהתבסס על מספר הפפטידים המפוצלים שנצפו עבור כל דגימה. השפע של החלבונים (החל 0 כדי מעל 300000 יחידות שרירותיות) וציון הביטחון עבור מזהה חלבון בהתבסס על מספר פפטידים מקוטע שנצפו עבור כל חלבון (החל 5 - 500) חושב. נתונים לדוגמה להגדיר מניתוח ספקטרומטרית מסה של פרוטאום של 30 חלבון μg מנויונים SCG תרבות במדיה שליטה ללא סרום מוצג איור 4.

היו 13, 134 פפטידים שזוהו בדגימה אשר התאימו 1287 חלבונים. מתוך אלה, 1100 מהם היו נוכחים בכל שלושת השכפולים הטכניים עם ערכי שפע מנורמלים הגדולים מ-500. מתוך 1100 חלבונים אלה, 90 חלבונים זוהו על ידי הנוכחות של להיט פפטיד יחיד, אשר כיסה רק חלק קטן של החלבון. לכן, היה קשה לקבוע אם הזיהוי היה נכון וחלבונים אלה היו בעלי ציון ביטחון חלבון נמוך (ציון <10). חלבונים אלה בוטלו מהניתוח ואת 1010 החלבונים הנותרים נותחו עוד יותר באמצעות אונטולוגיה ג'ין כדי לקבוע אם הפרוטוקול הצליח לזהות חלבונים עם התאמה ותפקוד שונים.

ניתוח אונטולוגיה גנטית של ערכת נתונים זו בוצע באמצעות מסד הנתונים סיווג פנתר (http://www.pantherdb.org/) כדי לקבוע אם ערכת נתונים זו כללה חלבונים עם מיקום תאי שונה או פונקציות מולקולריות וביולוגיות ולבחון אם היו הקשרים בין החלבונים שזוהו מסלוליםידועים 21. הניתוח הראה כי למרות מעל 700 החלבונים היו ציטופלסמיים, כי סט הנתונים הכיל חלבונים שהיו מקומיים לאזורים אחרים של התא כולל הגרעין, קרום, מספר organelles הסלולר, וצמתים תא(איור 4A). הניתוח גם גילה כי מעל 400 חלבונים היו פעילות קת ליטית, וכ 300 חלבונים היו מעורבים במסלולי איתות(איור 4B ו איור 4C). בנוסף, ערכת הנתונים הכילה חלבונים המעורבים במסלולי איתות שונים. טבלה 1 מציגה חמישה מהחלבונים בהצתת חלבון G, הדבקת תאים, מסלול איתות גורם גדילה, ומסלולי סחר של שלולית סינפטית, בהתאמה, שזוהו ב- dataset.

Figure 1
איור 1: שינויים מורפולוגיה של נוירונים SCG חולדה E21 תרבותי לאורך זמן. תמונות מיקרוסקופיות ניגודיות שלב נציג ב 10x הגדלה של תאים דיסוציאציה מ E21 חולדה SCG 20 דקות לאחר ציפוי (A), יום אחד לאחר ציפוי (B) ואחרי 48 שעות של טיפול Ara-C (5 ימים לאחר ציפוי) (C). שים לב לנוכחות של תאי גליה (חצים) והרחבה xonal (ראשי חץ) ב (ב),והיעדר תאי גליה ונוירונים המציגים צמיחה אקסונלית נרחבת ב (C). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: שינויים מורפולוגיה עצבית של נוירונים SCG חולדה E21 לאחר טיפול עם BMP-7. בעקבות חיסול של תאים שאינם נוירוניים, נוירונים SCG מתורבות טופלו עם אמצעי שליטה (A) או BMP-7 ב 50 ng/mL (B) במשך 5 ימים. מיקרוגרפים ניגודיות שלב מייצג (הגדלה 10x) להראות את הגוף עגול תא עצבי עם אקסונים ב- נוירונים שליטה (A) ונוירונים עם תהליכים קצרים מרובים כמו דנדריט כאשר מטופלים BMP-7 (חצים, B). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: חיסון לחלבון MAP-2 בנוירונים אוהדים של חולדה עוברית. בעקבות חיסול תאים שאינם נוירוניים, נוירונים SCG תרבותי טופלו עם אמצעי שליטה(A-D)או BMP-7 ב 50 ng/mL(E-H)במשך 5 ימים וחיסונים באמצעות נוגדן חד-קלוני עכבר נגד MAP-2 ו מתויג ים עם סמן גרעיני. מיקרוגרפים מייצגים המציגים כתם חיסוני של הנוירונים עם מיקרוטובולה הקשורה לחלבון-2 (MAP-2) (C,G), כתם גרעיני(D,H)עם מיקרוגרפים ניגודיות פאזה(B,F)ומיזוג של שלושת הערוצים (A,E). כתם חיסוני עבור microtubule הקשורים חלבון-2 קיים בגוף התא אקסונים פרוקסימליים של נוירונים שליטה (ג) וכתמים עבור חלבון MAP-2 בגוף התא דנדריטים ב BMP-7 נוירונים מטופלים (G). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: סיווג והפצה של חלבונים שזוהו בניתוח פרוטאום של נוירונים SCG חולדה E21 תרבותיים. מזהי חלבון עבור 1100 החלבונים היו נתונים לניתוח אונטולוגיה גנים על מערכת סיווג פנתרים כדי לבחון את חלוקת החלבונים בנתונים שנקבעו ביחס למיקום תאי (A), תפקוד תאי ותהליכים ביולוגיים שהם היו מעורבים (B) ומסווג פונקציה מולקולרית המבוססת על מבנה חלבון (C). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

א) חלבונים המעורבים בהדבקה ביולוגית
מזהה גישה של UniProt שם גן סמל גן
Q9Z1Y3 קדרין-2 CDH2 (2)
ת.ג5512 אנטיגן CD166 מוטי אלון
עמ' 49134 (ת"א) בטא-1 של Integrin איגב 1
ד3ZES7 (1100) פלסין A4 תפריט: 33.
44 דולר ל-F1LP44 תת-יחידת משנה של Integrin אלפא L יתגל (100
ב) חלבונים המעורבים בהתגברות גורם גדילה
ת.פ. 35213 14-3-3 חלבון בטא/אלפא יווהאב (119)
Q5BJ92 סרין/ת'ראונין-חלבון פוספטאז 4 תת-יחידת קטליטי תפריט: 333
עמ' 47196 ראק – חלבון אלפא סרין/תרונין קינאז ליאור הירש
ת.פ. 62994 חלבון מאוגד קולטן גורם גדילה 2 ת.ז.
P21708 (P21708) קינאז חלבון המופעל על-ידי מיטוגן 3 ת.ק.ג
ג) חלבונים המעורבים במסלול איתות בשילוב חלבון G
P08753 (ת.פ. גואנין נוקלאוטיד מחייב חלבון G(k) תת-יחידת אלפא גנאי3 (11)
ד4ABV5 (1100) קלמודולין-2 2 מיטות אחדות
P18266 ג'יקוגן סינתאז קינאז-3 בטא ת.ז.
P09456 (ת.פ.) תת-יחידת משנה של קינאז חלבון תלוי-CAMP I-alpha פרקאר1א
ת.פ. 53534 גלוקוגן זרחן פיגב (צורת מוח)
ד) חלבונים המעורבים בסחר בזקין
ת.פ. 47861 סינפטוטגמין-5 ת.ח.ה5
ת.פ. 63045 חלבון קרום הקשור לאסיקל 2 ערפד 2
ת.פ. 61265 סינתקסין-1B Stx1b (12)
ר63537 (117) סיינפסין-2 תס'ין 2
ת.פ. 60881 חלבון הקשורים סינפטוזומלית 25 הצמד25

טבלה 1: חלבונים מייצגים שזוהו בנתוני הפרוטאום מנויני SCG עובריים של חולדות תרבותיות, המסווגים על ידי הפונקציות הביולוגיות שלהם. נתוני הפרוטאום עם 1100 החלבונים היו נתונים לניתוח אונטולוגיה גנטית באמצעות מערכת סיווג הפנתרים. להלן חמשת החלבונים המובילים שזוהו עבור ארבעה מסלולים ביולוגיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

מאמר זה מתאר את הפרוטוקולים לתפירת נוירונים סימפטיים מגנגליה צוואר הרחם מעולה של גורי חולדות עובריות. היתרונות של שימוש במערכת מודל זה הם כי ניתן להשיג אוכלוסייה הומוגנית של נוירונים מתן תגובה דומה גורמי גדילה, ומאז דרישות גורם גדילה עבור נוירונים אלה כבר מאופיין היטב, ניתן לגדל נוירונים אלה במבחנה במדיה מוגדרת, בתנאים ללאסרום 10. למרות הפרוטוקול מתאר את התהליך לבידוד SCG מE21 גורי חולדה, פרוטוקול זה יכול לשמש עבור פירוק של SCG מגורי חולדה מ E17 כדי E21 ולניתוח של העכבר העוברי SCG10,22,23. פרוטוקול ניתוח זה יכול לשמש גם לבידוד SCG מחולדות לאחר הלידה עם שינוי מינורי לצעדים הראשוניים. שינויים אלה כוללים חיסול של הצורך ניתוח קיסרי, המתת חסד של בעלי חיים לאחר הלידה באמצעות פחמן דו חמצני, ועיקור של הגורים לאחר הלידה בעקבות המתת חסד על ידי טבילה של הגורים ב 70% אלכוהול, לפני העברתם לתקשורת10ניתוח . ניתן להתאים פרוטוקול תפירה עצבי זה גם ללימוד הדרכה אקסונאלית, תובלה סקסונית והיווצרות סינפסה באמצעות תאי קמפנוותאים מיקרופלודיים 24,25. נוירונים אלה יכולים גם להיות שיתוף תרבות עם נוירונים מן גנגליה שורש הגב או נוירונים מוטוריים בעמוד השדרה או עם cardiomyocytes כדי ללמוד את האינטראקציות העצביות ונוירון – אינטראקציות היעד במערכת העצביםההיקפית 26,,27,28,29.

השימוש של נוירונים SCG תרבותיים עבור מחקרים חיסוניים מתועד היטב. הפרוטוקול המתואר בעיתון מספק נקודת התחלה טובה לעבודה עם רוב הנוגדנים. עם זאת, ישנם נוגדנים, כגון אלה המזהים חלבונים גרעיניים אשר עשויים לדרוש שינוי פרוטוקול קיבעון ופרוטוקול חפוז. במקרה של נוגדן פוספו-SMAD, טיפול עם 100% מתנול ב -20 °C שימש לתיקון וחלחל הנוירונים30,31.

המגבלות העיקריות של עבודה במערכת מודל זו נובעות מהגודל הקטן של SCGs בגורי חולדות עובריות, מה שתוצאות מספר קטן של נוירונים. התוצאה היא כמות מוגבלת של חומצות גרעין או חלבון שניתן להשיג מניתוק של המלטה אחת של גורים. זה יכול להיות בעייתי עבור ניתוח גנומי ופרוטונומי, במיוחד כאשר משווים בין טיפולים מרובים בניתוח אחד. כמו כן, לא ניתן להשיג תרבויות עצביות SCG מיובר אחד. כל הניסויים מבוצעים לפיכך על דגימות שנערך ב-SCG של כל עוברי החולדות בהמלטה. מגבלה נוספת של המערכת היא כי נוירונים SCG יש יעילות טרנס-תירגם DNA נמוך יותר (10 - 20%, תצפיות שלא פורסם) ורעילות גבוהה יותר לאחר טרנס-עבירת בהשוואה נוירוניםמרכזיים 32. למרות יעילות טרנסאפקט זה הוא בסדר עבור מחקרים מורפולוגיים עם נוירונים בודדים, קשה לבצע מחקרים מולקולריים או ביוכימיים כדי לזהות / לאשר שינויים ביטוי גנים.

עם זאת, בשנים האחרונות, נוירונים SCG תרבותי שימשו עבור מחקרים הבוחנים את המנגנונים הבסיסיים צמיחה דנדריטית עבור transcriptome וניתוח miRNome14,15,33. כפי שצוין קודם לכן, בשל כמויות חלבון נמוכות, נוירונים תרבותיים מ SCG עוברי לא שימשו בעבר לניתוח פרוטאומי. פרוטוקול זה ותוצאות מייצגות לספק ראיות כי גם עם ריכוז נמוך של דגימות, הנוכחי בהבחנה גבוהה מכשירים ספקטרומטריה מסה יכול לשמש עבור מחקרים פרוטאומיים על נוירונים אלה. למרות פרוטוקול הכנת המדגם המתואר כאן הוא עבור נוירונים SCG, פרוטוקול זה יכול לשמש להכנת כל מדגם עם ריכוז חלבון נמוך לניתוח LC-MS. אחת המגבלות היא כי וריאציות קטנות בריכוז חלבון או יעילות של עיכול שלושה נסיפסין יכול לגרום לפיצול לא שלם וירידה דרמטית במספר החלבונים שזוהו על ידי LC-MS. לכן, זה קריטי כדי להבטיח כי ריכוזי חלבון מתחילים הם קרובים ככל 50 μg עם יחס 10:1 של חלבון: שלושה. כמו כן, זה תרגול טוב כדי aliquot את הטריפסין כיתה ספקטרומטריה מסה כדי למנוע מחזורי הקפאה מרובים.

מגבלה נוספת של הפרוטוקול היא כי היו רק מספר מוגבל של חלבוני transmembrane זוהו פרוטאום. בעוד פעילות שטח labile חומצה כבר הראו להיות פעיל יעיל עבור ספקטרומטריה מסה, מחקר קודם על תאים תרבותיים מצאו כי פעילי שטח אלה יכולים להגדיל במקצת את מספר חלבוני ציטופלסמי ולהקטין את חלבוני קרום בפרופיל פרוטאומי34. כמו כן, הוצע כי קדם עיכול באמצעות אנדופפטידס חיידקי כגון Lys-C, לפני עיכול trypsin עשוי לשפר את היעילות של עיכול שלושה נסיפסין של חלבונים ממברנה מאוגדים ולמנוע את שברי חלבון קרום להישמר על עמודות LC35.

לסיכום, מאמר זה מספק פרוטוקולים מפורטים לגידול נוירונים אוהדים עוברי חולדה מתרבות ולביצוע מחקרים מורפולוגיים ופרוטונומיים על נוירונים אלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לסופרים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן לפיתוח הפקולטה ומענק תוכנית מחקר קיץ במכללת סנט מרי של קליפורניה. המחברים גם רוצים להודות ד"ר פמלה לין באוניברסיטת קליפורניה דייוויס וד"ר אנתוני Iavarone באוניברסיטת ברקלי Mass ספקטרומטריה מתקן על עצתם במהלך הפיתוח של פרוטוקולים אלה. המחברים גם רוצים להודות להיילי נלסון במשרד לתקשורת במכללה סנט מרי של קליפורניה על עזרתה בהפקת וידאו ועריכה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2D nanoACQUITY Waters Corporation
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich 9830
BMP-7 R&D Systems 354-BP
Bovine Serum Alumin Sigma-Aldrich 5470
Cell scraper Corning CLS-3010
Collagenase Worthington Biochemical 4176
Corning Costar or Nunc Flat bottomed Cell culture plates Fisher Scientific 07-200, 140675, 142475
Cytosine- β- D-arabinofuranoside Sigma-Aldrich C1768
D-phosphate buffered saline (Calcium and magnesium free) ATCC 30-2200
Dispase II Roche 4942078001
Distilled Water Thermo Fisher Scientific 15230
Dithiothreitol Sigma-Aldrich D0632
DMEM - Low glucose + Glutamine, + sodium pyruvate Thermo Fisher Scientific 11885
Fatty Acid Free BSA Calbiochem 126609 20 mg/mL stock in low glucose DMEM
Fine forceps Dumont no.4 and no.5 Ted Pella Inc 5621, 5622
Forceps and Scissors for Dissection Ted Pella Inc 1328, 1329, 5002
Glass coverlips - 12mm Neuvitro Corporation GG-12
Goat-Anti Mouse IgG Alexa 488 conjugated Thermo Fisher Scientific A32723
Ham's F-12 Nutrient Mix Thermo Fisher Scientific 11765
Hank's balanced salt soltion (Calcium and Magnesium free) Thermo Fisher Scientific 14185
Insulin-Selenium-Transferrin (100X) Thermo Fisher Scientific 41400-045
Iodoacetamide Sigma-Aldrich A3221
L-Glutamine Thermo Fisher Scientific 25030
Leibovitz L-15 medium Thermo Fisher Scientific 11415064
Mounting media for glass coverslips Thermo Fisher Scientific P36931, P36934
Mouse-anti- MAP2 antibody (SMI-52) BioLegend SMI 52
Nerve growth factor Envigo Bioproducts (formerly Harlan Bioproducts) BT5017 Stock 125 μg/mL in 0.2% Prionex in DMEM
Paraformaldehye Spectrum Chemicals P1010
Penicillin-Streptomycin (100X) Thermo Fisher Scientific 15140
Poly-D-Lysine Sigma-Aldrich P0899
Prionex Millipore 529600 10% solution, 100 mL
RapiGest SF Waters Corporation 186001861 5 X 1 mg
Synapt G2 High Definition Mass Spectrometry Waters Corporation
Trifluoro acetic acid - Sequencing grade Thermo Fisher Scientific 28904 10 X 1 mL
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100
Trypsin Promega or NEB V511A, P8101S 100 μg or 5 X 20 mg
Waters Total recovery vials Waters Corporation 186000385c

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rees, R. P., Bunge, M. B., Bunge, R. P. Morphological Changes in the neuritic growth cone and target neuron during synaptic junction development in culture. Journal of Cell Biology. 9, (1976).
  2. Chandrasekaran, V., Lein, P. J. Regulation of Dendritogenesis in Sympathetic Neurons. Autonomic Nervous System. (2018).
  3. Higgins, D., Burack, M., Lein, P., Banker, G. Mechanisms of neuronal polarity. Current Opinion in Neurobiology. 7, (5), 599-604 (1997).
  4. Lein, P., Guo, X., Hedges, A. M., Rueger, D., Johnson, M., Higgins, D. The effects of Extracellular Matrix And Osteogenic Protein-1 on the morphological differentiation of rat sympathetic neurons. International Journal of Developmental Neuroscience. 14, (3), 203-215 (1996).
  5. Kobayashi, M., Fujii, M., Kurihara, K., Matsuoka, I. Bone morphogenetic protein-2 and retinoic acid induce neurotrophin-3 responsiveness in developing rat sympathetic neurons. Molecular Brain Research. 53, (1-2), 206-217 (1998).
  6. Burnham, P., Louis, J. C., Magal, E., Varon, S. Effects of ciliary neurotrophic factor on the survival and response to nerve growth factor of cultured rat sympathetic neurons. Developmental Biology. 161, (1), 96-106 (1994).
  7. Hou, X. E., Li, J. Y., Dahlström, A. Clathrin light chain and synaptotagmin I in rat sympathetic neurons. Journal of the Autonomic Nervous System. 62, (1-2), 13-26 (1997).
  8. Harris, G. M., et al. Nerve Guidance by a Decellularized Fibroblast Extracellular Matrix. Matrix Biology. 176-189 (2017).
  9. Wingerd, K. L., et al. α4 integrins and vascular cell adhesion molecule-1 play a role in sympathetic innervation of the heart. Journal of Neuroscience. 22, (24), 10772-10780 (2002).
  10. Higgins, D., Lein, P., Osterhout, D. J., Johnson, M. Tissue culture of autonomic neurons. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. MIT Press. Cambridge, MA. 177-205 (1991).
  11. Lein, P., Johnson, M., Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 induces dendritic growth in rat sympathetic neurons. Neuron. 15, (3), 597-605 (1995).
  12. Bruckenstein, D. A., Higgins, D. Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. Developmental Biology. 128, (2), 337-348 (1988).
  13. Voyvodic, J. T. Development and regulation of dendrites in the rat superior cervical ganglion. The Journal of Neuroscience. 7, (3), 904-912 (1987).
  14. Garred, M. M., Wang, M. M., Guo, X., Harrington, C. A., Lein, P. J. Transcriptional Responses of Cultured Rat Sympathetic Neurons during BMP-7-Induced Dendritic Growth. PLoS ONE. 6, (7), 21754 (2011).
  15. Pravoverov, K., et al. MicroRNAs are Necessary for BMP-7-induced Dendritic Growth in Cultured Rat Sympathetic Neurons. Cellular and Molecular Neurobiology. 39, (7), 917-934 (2019).
  16. Natera-Naranjo, O., Aschrafi, A., Gioio, A. E., Kaplan, B. B. Identification and quantitative analyses of microRNAs located in the distal axons of sympathetic neurons. RNA (New York, N.Y.). 16, (8), 1516-1529 (2010).
  17. Aschrafi, A., et al. Angiotensin II mediates the axonal trafficking of tyrosine hydroxylase and dopamine β-hydroxylase mRNAs and enhances norepinephrine synthesis in primary sympathetic neurons. Journal of Neurochemistry. 150, (6), 666-677 (2019).
  18. Ghogha, A., Bruun, D. a, Lein, P. J. Inducing dendritic growth in cultured sympathetic neurons. Journal of Visualized Experiments. (61), 4-8 (2012).
  19. Caceres, A., Banker, G., Steward, O., Binder, L., Payne, M. MAP2 is localized to the dendrites of hippocampal neurons which develop in culture. Brain Research. 315, (2), 314-318 (1984).
  20. Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 and related bone morphogenetic proteins regulate dendritic growth and the expression of microtubule-associated protein-2 in rat sympathetic neurons. Neuroscience Letters. 245, (3), 131-134 (1998).
  21. Mi, H., et al. PANTHER version 11: Expanded annotation data from Gene Ontology and Reactome pathways, and data analysis tool enhancements. Nucleic Acids Research. 45, 183-189 (2017).
  22. Chandrasekaran, V., et al. Retinoic acid regulates the morphological development of sympathetic neurons. Journal of Neurobiology. 42, (4), (2000).
  23. Courter, L. A., et al. BMP7-induced dendritic growth in sympathetic neurons requires p75 NTR signaling. Developmental Neurobiology. 76, (9), 1003-1013 (2016).
  24. Lein, P. J., Fryer, A. D., Higgins, D. Cell Culture: Autonomic and Enteric Neurons. Encyclopedia of Neuroscience. 625-632 (2009).
  25. Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In vitro Tools for Neurobiological Research. Journal of Neuroscience. 36, (46), 11573-11584 (2016).
  26. Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9, (1), 82 (2016).
  27. Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. Lectin-based isolation and culture of mouse embryonic motoneurons. Journal of Visualized Experiments. (55), e3200 (2011).
  28. Takeuchi, A., et al. Microfabricated device for co-culture of sympathetic neuron and iPS-derived cardiomyocytes. Proceedings of the Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, EMBS. 2013, 3817-3820 (2013).
  29. Takeuchi, A., et al. Development of semi-separated co-culture system of sympathetic neuron and cardiomyocyte. Proceedings of the 31st Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society: Engineering the Future of Biomedicine, EMBC 2009. 1832-1835 (2009).
  30. Chandrasekaran, V., Lea, C., Sosa, J. C., Higgins, D., Lein, P. J. Reactive oxygen species are involved in BMP-induced dendritic growth in cultured rat sympathetic neurons. Molecular and Cellular Neuroscience. 67, (2015).
  31. Kim, W. Y., et al. Statins decrease dendritic arborization in rat sympathetic neurons by blocking RhoA activation. Journal of Neurochemistry. 108, (4), 1057-1071 (2009).
  32. Dalby, B., et al. Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: Primary neurons, siRNA, and high-throughput applications. Methods. 33, (2), 95-103 (2004).
  33. Szpara, M. L., et al. Analysis of gene expression during neurite outgrowth and regeneration. BMC Neuroscience. 8, (1), 100 (2007).
  34. Pop, C., Mogosan, C., Loghin, F. Evaluation of rapigest efficacy for the digestion of proteins from cell cultures and heart tissue. Clujul Medical. 87, (4), 5 (2014).
  35. Vit, O., Petrak, J. Integral membrane proteins in proteomics. How to break open the black box. Journal of Proteomics. 153, 8-20 (2017).
חולדה Culturing נוירונים סימפטיים מגנגליה צוואר הרחם מעולה עוברית לניתוח מורפולוגי ופרוטונומי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Holt, M., Adams, B., Chandrasekaran, V. Culturing Rat Sympathetic Neurons from Embryonic Superior Cervical Ganglia for Morphological and Proteomic Analysis. J. Vis. Exp. (163), e61283, doi:10.3791/61283 (2020).More

Holt, M., Adams, B., Chandrasekaran, V. Culturing Rat Sympathetic Neurons from Embryonic Superior Cervical Ganglia for Morphological and Proteomic Analysis. J. Vis. Exp. (163), e61283, doi:10.3791/61283 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter