Summary
이 연구는 합성 유전자 회로의 스토카시 거동을 분석하고 정량화하기 위해 대장균의 단일 세포의 라이브 이미징을 허용하는 현미경 방법을 제시합니다.
Abstract
여기에서 개발된 프로토콜은 몇 시간 동안 에샤리치아 대장균 분열 및 형광 농도의 컴퓨터 추적을 가능하게 하는 도구를 제공합니다. 이 과정은 최소한의 미디어에서 살아남은 식민지를 선별하여 시작되며, 정확한 플라스미드를 품고 있는 대장균만이 특정 조건에서 번창할 수 있을 것이라고 가정합니다. 많은 DNA 부품의 조립을 요구하는 대형 유전 회로를 구축하는 과정이 어렵기 때문에 회로 구성 요소는 종종 여러 항생제의 사용을 요구하는 다른 복사 번호로 여러 플라스미드 사이에 분포됩니다. 플라스미드의 돌연변이는 항생제 내성 유전자의 전사를 파괴하고 괴사로 이어지는 세포내 자원 관리와 교차할 수 있다. 선택한 식민지는 유리 바닥 페트리 접시에 설정되며 밝은 필드와 형광 도메인 모두에서 현미경 추적을 위해 몇 가지 초점 평면이 선택됩니다. 이 프로토콜은 규제할 수 없는 초기 조건에서 12시간 이상 이미지 포커스를 유지하여 몇 가지 어려움을 초래합니다. 예를 들어, 죽은 세포는 몇 시간 동안 이미징을 한 후 렌즈의 초점 분야에 축적되기 시작하여 독소가 축적되고 신호가 흐리고 부패합니다. 영양소의 고갈은 새로운 신진 대사 과정을 소개하고 회로의 원하는 반응을 방해합니다. 실험의 온도는 유도제와 항생제의 효과성을 낮춥니다, 이는 신호의 신뢰성을 더욱 손상시킬 수 있습니다. 최소한의 미디어 젤은 수축되고 건조되며, 그 결과 시간이 지남에 따라 광학 초점이 변경됩니다. 우리는 다른 미생물을 위한 유사한 방법을 개발하는 이전 작품과 유사한 대장균에있는 이 도전을 극복하기 위하여 이 방법을 개발했습니다. 또한, 이 방법은 변경되지 않은 변경되지 않은 세포에서 총 금세 노이즈를 정량화하는 알고리즘을 제공하여, 결과가 유사한 변동 계수(CV)에 의해 도시된 바와 같이 유량 분석기 예측과 일치한다는 것을 발견한다.
Introduction
합성 생물학은 지난 10년 동안 등장한 다분야 분야로, 기초과학4,5,진단, 치료 및 생명공학적 응용 분야6,7,8,9,10을이해하기 위해 살아있는 세포에서 다중 신호 통합 및 처리를 달성하기 위한 노력의 일환으로 엔지니어링 설계 원리를 합리적 생물학적 설계1,2,3으로변환하는 것을 목표로 하고 있다. 합성 유전자 회로의 입력 출력 반응을 정량화하는 당사의 능력은 자동화된 시간 경과 현미경검사법(11)을이용한 유량 분석기 및 라이브 세포 이미징을 포함한 단일 세포 기술의 최근 발전에 의해 혁명을 일으켰습니다. 유량 분석기는 종종 정상 상태1,12에서이러한 회로의 반응을 측정하는 데 사용되며, 반전된 현미경 검사는 단일 세포3의수준에서 합성 유전자 회로의 동적 반응을 측정하는 데 사용된다. 예를 들어, 합성 생물학의 초기 작업 중 하나는 지연3와부정적인 피드백 루프를 사용하여 살아있는 세포에서 유전 발진기 네트워크의 건설을 포함했다. 나중에, 유전 발진기 회로는 살아있는 세포의 동적 환경에서 대사 조절을 이해하기 위해 적용되었다4. 자동 시간 경과 현미경 검사는 이러한 회로를 특성화하는 하나의 방법입니다. 우리는 숙주 세포, 대장균이미세 식민지를 형성 할 때 동기화되어 정확한 어머니 - 딸 관계를 추적하지 않고 신호 및 소음 계산을 허용한다고 가설합니다.
소음은 종종 여러 소스에서 발생하는 생물학적 시스템의 근본적이고 내재된 측면입니다. 예를 들어,단백질(13)의확산과 같은 임의의 임의 운반선의 수송에서 비롯된 신호를 포함하는 생화학반응을 고려한다. 이러한 신호는 임의변동(14)으로전파됩니다. 다른 소음원은 온도, 습도 및 압력과 같은 환경 조건의 자원 가용성, 세포 분열 및 변화입니다. 합성 유전자 회로에서 전파되는 생물학적 신호는 종종 이러한 회로의 성능을 방해하는 매우 낮은 신호 대 잡음 비(SNR)를 가지고 있습니다. 따라서 유전 회로 설계는 유전 공학15의가장 어려운 측면 중 하나입니다. 예를 들어, 평균 유전자 발현(전체 세포 집단에 걸쳐 측정됨)만 계산하는 대부분의 접근법과는 달리, 측정된 신호의 분산은 합성 유전자네트워크(12)를통해 예측 가능한 동작을 설계하기 위해 고려된다. 이와 같이, 단백질 발현에서의 가변성 또는 노이즈의 수준은 아날로그 및 디지털 유전자 회로1,16,17의설계 및 성능에 지배적인 역할을 한다.
에체리치아 대장균3,7,18을포함한 세포 간 가변성을 정량화하기 위한 많은 접근법이 개발되었다. 이러한 방법은 종종 유전자 활성화 및 대사 경로를 연구하는 데 사용되지만, 특히 이것이 근본적인 도전인 살아있는 세포에서 유전 회로를 측정하고 분열시키는 것과 같은 스토샤스 잡음 역학연구에 덜 초점을 맞추고 있다19,20,21. 회로 자체에 상속된 몇몇 요인(본질적인) 및 숙주 세포(외수성)에서 파생된 몇몇 요인은 유전 회로의 지속적인 성능을 방해할 수 있습니다. 본 논문에서는 내재및 외장소음원을 포함한 대장균 세포의 총 소음을 정량화하는 것을 목표로 하는 프로토콜을개발하였다 6,22. 총 노이즈를 정량화한 다음 SNR23을평가함으로써 유전자 회로의 설계를 개선할 수 있다. 이 방법은 여러 형광 단백질6,20을모니터링하여 독립적인 소음원을 별도로 측정하도록 수정할 수 있다. 여기에 설명된 프로토콜의 경우, 외부 요인의 영향 없이 환경 조건을 잘 제어하고 지속적으로 세포의 활성을 측정합니다. 우리는 시간이 지남에 따라 단일 세포에서 형광 단백질에서 신호를 측정하고 동시에 아가로즈 기판 에서 그들을 이미지. 결과 이미지는 실험실의 사용자 지정 MATLAB을 사용하여 분석됩니다.
이상적으로, 세포 내부의 형광 단백질의 실시간 활성을 지속적으로 측정하면 세포의 성장과 분열을 통해 정확한 데이터를 생성할 것이다. 그러나 이러한 데이터를 획득하는 것은 어렵습니다. 이것은 광 표백7로알려진 형광 단백질의 저하로 인해 흥분 과정에서 방사선에 노출됩니다. 더욱이, 대장균 세포는 또한 광독성7로이어질 수 있는 여기에 민감하다. 두 문제 모두 획득할 수 있는 사진 프레임의 양과 인수 사이의 시간을 제한합니다. 이미징 중에 세포를 성장시키는 데 사용되는 기판 및 중간 유형 (예를 들어, 리소제니 국물)은 또한 중요한 역할을 합니다. 비형광 배경을 최소화하고 세포 분할 시간을 연장하는 최소한의 매체를 사용하는 것이 좋습니다.
더욱이, 샘플은 다음과 같은 요구 사항(1) 낮은 세포 분열율을 고려하여 세분화 주기를 밀접하게 이미징하고 광독성 및 광표백 의 가능성을 감소시키기 위해 덜 빈번한 노출을 허용한다. 우리는 실험의 시작 부분에서 예측 된 미토시스 시간 (2)의 약 절반으로 획득 시간을 설정하여 분열의 균일성과 추적성을 향상시합니다. 세포 밀도는 이 프로토콜의 성공을 위한 중요한 매개변수이며 모든 실험실에 대해 결정되어야 하는 대장균 세포의 희석 비율에 의해 영향을 받습니다. 비율을 확립하기 위해, 사용되는 각 새로운 대장균 균주 또는 매체에는 성장률그래프(보충 도 1)가장착되어야 한다. 약600nm = 0.1의 초기 밀도로부터 짧은 배양 후 세포가 추가 흔들림 없이 성장할 수 있다면 적절한 비율이 달성되었습니다. 이 단계에서세포는 환경 온도에 따라 분할됩니다 (3) 세포 운동의 제한: 세포 운동은 기판에 크게 의존 (아가로즈 패드) 탄력. 기판 의 견고함은 총 아가로즈의 양과 겔 응고 시간에 따라 달라집니다. 에체리치아 대장균은 미토시스를 앓기 때문에 젤은 실온에서 하룻밤 동안 고화하도록 방치할 수 없습니다. 기판 안정성에 영향을 미치는 다른 요인은 시료 및 습도의 물의 양을 포함한다. 추가 문제는 대표 결과에대해 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 많은 세부 정보를 제공하고 점차적으로 한 단계에서 다른 단계로 이동합니다. 이 프로토콜은 이미징 실험에 대한 긴 안정성을 제공하며 기본 이미지 처리 도구를 제공합니다.
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Protocol
1. 미디어 및 문화 준비
- 1,000x 카베니실린(50 mg/mL) 또는 관련 항생제의 재고 용액을 준비합니다.
- . 스카베니실린 의 무게 0.5 g. 멸균 H2O. 완전히 용해 10 mL를 추가합니다.
- 0.22 μm 주사기 필터를 통해 카베니실린 재고를 살균합니다. 항생제 용액을 알리쿼트하고 -20 °C에 보관하십시오.
- 리소제니 국물(LB) 플레이트를 준비하려면 트립톤 5g, NaCl 5g, 효모 추출물 2.5g, 바토 아가르 7.5g을 멸균 H2O. Autoclave용 121°C에서 20분 동안 121°C로 섞는다.
- 50°C 수조에 용융 젤 믹스를 부분적으로 담급니다. 카베니실린 1,000 μL(50 mg/mL)을 추가합니다.
- 멸균 환경에서 페트리 요리를 준비합니다. 냉장고에 보관하기 전에 접시를 놓습니다.
- M9 최소 매체의 경우 5x M9 염(56.4g/L), 2M 포도당 및 2% 비오틴 프리 카산산과 같은 별도의 스톡 솔루션을 준비하십시오. 20 분 동안 121 °C에서 솔루션을 오토 클레이브합니다.
- 5 페트리 플레이트를 준비하려면 1125 mg의 저용 한천과 400 mg의 한고를 89.2 mL의 최소 미디어 (1x M9)로 섞습니다. 250mL 에렌마이어 플라스크에 2% 카산산(2% [vol/vol])의 10mL를 추가합니다.
참고: 플라스크의 안쪽 입술에 미디어를 부어야 합니다. - 3~4초의 짧은 버스트에서 솔루션을 전자레인지에 연결합니다. 솔루션이 명확해질 때까지 반복합니다.
참고: 비등점에 도달하지 않도록 하십시오. - 250mL 에를렌마이어 플라스크를 온수 욕조(60°C)에 놓고 확산에 의해 더 섞어 온도가 약 45-50°C까지 떨어질 때까지 식힙니다.
- 접시가 쏟아지는 벤치에서 불꽃을 밝아보며 불을 붙인다.
- 다음 순서로 모든 솔루션을 신속하게 추가합니다.
글리세롤 800 μL (0.4% [vol/vol])
티아민 100 μL (B1)
포도당 1100 μL (2M)
카베니실린 100 μL (50 mg/mL). - 에를렌마이어 플라스크를 소용돌이치며 모든 재료가 한천 전체에 분포되도록 합니다.
- 화염 옆에 한 번에 한 접시를 열고 붓기 시작합니다.
- 초기 응고될 때까지 몇 분 동안 접시를 벤치에 둡니다.
- 물 응축이 젤에 떨어지는 것을 방지하기 위해 접시를 거꾸로 설정합니다.
- 플레이트를 실온에서 약 2시간 동안 고화시도록 둡니다.
- 플레이트가 고화되고 건조되면 약 3 개월 동안 4 °C에서 저장할 수 있습니다.
2. 세균 균주와 플라스미드 건설
참고: 유전 회로는 한 부분을 포함; PtetO 프로모터에 의해 구동되는 녹색 형광 단백질(GFP)은 구성식 발현을 초래합니다. 이 작업의 모든 플라스미드는 기본 분자 복제 기술을 사용하여 시공되었고 표준 열 충격프로토콜(24)을사용하여 대장균 10β로 변형되었다. 최종 구조는 시험을 위한 대장균 MG1655 야생형 변형으로 변형되었다.
- 표준 열 충격프로토콜(24)으로원하는 플라스미드를 대장균 MG1655 세포로 변환한다.
- 37°C에서 하룻밤 사이에 LB 한천 플레이트에서 변형된 세포를 성장시키면 됩니다.
참고: 페트리 요리를 현미경 사용시 최대 2.2일에서 3일까지 유지할 수 있습니다. - 유리 튜브에 관련 항생제로 보충 된 LB 국물의 5 mL로 단일 식민지를 접종.
- 액체가 흐릴 때까지 2 시간 동안 인큐베이터에서 250 rpm 흔들림 속도로 37 °C에서 세포를 성장시킵니다.
- 다음과 같이 희석 솔루션 1mL을 준비하십시오.
최소 용지 892 μL (1x M9)
글리세롤 8μL (0.4% [vol/vol])
100 μL 2% 카산산 (0.2% [wt/vol])
티아민 1μL (B1)
포도당 11 μL (2M)
관련 항생제의 1 μL- 혼합하고 아래로 회전.
- 에셀리치아 대장균의 30 μL을 희석용액의 1000 μL로 추가하여 2.4단계에서 세포 배양(1:30)을 희석한다(단계 2.5).
- 37°C에서 흔들림(250rpm)으로 튜브를 1시간 동안 배양한다.
- 1.10 단계에서 준비된 M9 플레이트에 40 μL - 60 μL을 성장시다. 하룻밤 사이에 37 °C에서 플레이트를 배양하십시오.
참고: 도금용 광학 밀도(OD600nm)는약 0.1이어야 합니다. - 벤치에 최대 35mm 유리 바닥 플레이트를 놓습니다.
참고: 플레이트의 유리에 사용되는 현미경 렌즈에 대한 정확한 두께가 있는지 확인하십시오. - 젤 플레이트에 파종에 대한 배양을 준비하고, 2.9 단계 현미경 측정에서 제조 된 플레이트에서 콜로니에 대한 2.3 에서 2.6 단계를 반복합니다.
- 다음 솔루션을 준비하여 세 개의 현미경 플레이트를 만듭니다.
- 수조를 60°C로 예열합니다.
- 112.5 mg의 저용 한천과 40 mg의 한고를 최소 미디어(1x M9)로 혼합하고 25mL 에렌마이어 플라스크에 2% 카산산(0.2% [vol/vol])의 1mL를 추가합니다.
참고: 플라스크의 안쪽 입술에 미디어를 부어야 합니다.
- 2~3초의 짧은 버스트에서 솔루션을 전자레인지에 연결합니다. 솔루션이 명확해질 때까지 반복합니다.
참고: 비등점에 도달하지 않도록 하십시오. - 25mL 에렌마이어 플라스크를 온수 욕조(60°C)에 놓고 확산에 의한 혼합을 더 하고, 온도가 약 45-50°C까지 떨어질 때까지 벤치에 식힙니다.
3. 아가로즈 패드 준비
- 70%의 에탄올로 깨끗한 벤치. 청소 된 벤치에 스트레치 테이프. 테이프가 매끄럽고 수평이 있는지 확인합니다.
- 테이프에 하나, 두 번째 커버립을 준비합니다. 커버리드를 준비합니다.
- 물 목욕에서 플라스크 (2.14 단계에서 준비)를 제거하고 플라스크의 외부를 깨끗하게 닦고 온도가 약 45-50 °C로 떨어질 때까지 식힙니다.
- 젤 용액을 만들려면 다음 순서로 모든 솔루션을 빠르게 혼합하십시오.
글리세롤 80μL (0.4% [vol/vol])
2% 카산산 1mL (0.2% [wt/vol])
티아민 10 μL (B1)
포도당 110 μL (2M)
관련 항생제의 10 μL. - 커버슬립에 젤 1.5mL를 붓고 두 번째 조각으로 덮어 "샌드위치"를 만듭니다.
- 에를렌마이어를 온수 욕조로 되돌려 보시면 됩니다. 뚜껑으로 샌드위치를 덮고 타이머를 20분 동안 설정합니다.
- 동시에, 튜브를 흔들림으로 37°C에서 1h로 2.11단계로부터 배양(250rpm)
- 20 분 후 샌드위치 (단계 3.5)를 뒤집고 덮고 1 시간 동안 그대로 둡니다.
참고: 더 나은 결과를 위해 "샌드위치"는 단계 3.8의 기간 동안 4 °C에서 휴식을 둡니다. - 35mm 접시에 샘플을 배관하여 3.7 단계에서 종자 대장균 배양.
참고: 별도의 작은 방울로 셀의 6 μL을 파이프팅하면 최상의 결과를 제공합니다. - 방울이 건조되도록 허용하여 최소 15분, 최대 30분 간 건조시다.
- 커버슬립을 멀리 밀어 3.8 단계에서 샌드위치의 고화 된 젤을 노출.
- 생검 펀치 또는 팁으로 작은 개별 패드로 샌드위치를 잘라.
- 샘플(3.9단계)에 부드럽게 기대어 두십시오. 벤치에 20 분 동안 접시를 둡니다.
4. 현미경 이미징샘플 준비
- 3.6 단계에서 수조에서 플라스크를 제거합니다. 플라스크의 바깥쪽을 깨끗하게 닦고 실온(25°C)으로 식힙니다.
참고: 타이머가 끝나기 약 3분 전에 4.1 단계에서 플라스크를 제거합니다. - 젤의 3mL를 원형 운동으로 플레이트 둘레에 지속적으로 붓습니다. 몇 분 동안 굳어 둡니다.
- 테이프로 플레이트를 밀봉하고 25G 바늘로 여러 구멍을 관통하십시오. 모든 접시를 뒤집어 서 물 응축이 젤에 떨어지는 것을 방지합니다.
- 모든 접시를 4°C에서 30분 동안 배양하여 세포 미토시스를 방지하면서 완전한 고형화를 허용합니다.
참고: 샘플을 4°C로 남겨 서 연속측정을 위해 하루이상 방치하십시오. - 제조업체 지침당 현미경을 시작합니다.
- 가장 낮은 증폭 렌즈를 사용하여 초기 포커스를 찾고 자동 초점 시스템(AFS)을 참여시다.
- 필요한 경우 오일을 사용하고, 렌즈를 오일로 익사시키고 플랫폼 컨트롤러(수동으로 는 아님)로 플레이트를 이동하여 조심스럽게 확산시키고 AFS는 다시 참여할 수 있습니다.
- Z 단계 단면에 대한 기본 제안에 따라 Z 방향으로 상대 단면을 사용합니다.
참고: 5분마다 밝은 필드 이미지와 20분마다 형광 이미지를 찍었습니다. 때로는 처음 30 분 동안 초점을 조정해야합니다. 현미경 인큐베이터 상자와 오일을 예열하면서 샘플을 냉장보관하면서 초기 초점 손실을 줄이는 경향이 있습니다.
5. 데이터 분석
참고: 현미경 데이터를 처리하기 위해 MATLAB에서 컴퓨터 기반 소프트웨어를 설계했습니다. 이 소프트웨어는 밝은 필드 티프 이미지와 세그먼트에서 셀 경계를 식별하고 영역별로 셀을 정렬합니다. 이 영상 분석의 출력은 현미경 해상도 한계로 인해 세포 후광과 같은 형광 영역에서 세포 강도 수준을 도출하고 유물을 취소하기 위해 형광 티프 이미지에 대한 마스크로 사용될 수 있다. 개발된 이 소프트웨어는7,25,26,27,28,29,30과 유사한 작품에서 영감을 받았으며 실험실에 맞는 우아한 솔루션을 제공합니다.
- 먼저 main_code.m다음 매개 변수를 정의합니다.
- 획득 이미지의 폴더를 정의합니다.
- 이미지 기간 - 몇 분 만에 밝은 필드 채널 시간 단계를 정의합니다.
- GFP 주파수 - GFP 이미지의 수집 속도를 정의합니다.
- 현미경 해상도(즉, 픽셀 수가 1 μm와 같음)를 정의합니다.
- 히스토그램 빈 범위 - 셀 영역 범위를 정의합니다.
참고: 세포 영역에 따라 데이터를 분류하는 프로세스는 유동 세포 측정 데이터 분석에서 게이팅의 원리와 유사합니다. 게이트는 공통의 특성을 가진 세포의 인구 주위에 배치됩니다, 일반적으로 앞으로 흩어져 측면 흩어져, 분리하고 관심의 이 인구를 정량화하기 위해. 현미경 검사는 여러 세포 그룹을 게이트, 조사 및 정량화 할 수 있습니다. - 컨볼루션 커널(3,3) 정의 -이 매개 변수는 전역임계값(count_cells.m)에의해 셀 경계를 감지합니다.
참고: 이 설정은 실험실 또는 현미경을 변경할 때만 필요합니다. 소프트웨어는 입력 밝은 필드 채널이 인덱스 c1, 형광 채널로 c2로 레이블을 지정해야 합니다.
- 다른 모든 스크립트를 자동으로 실행하는 main_code.m실행합니다(count_cells.m,cell_growth_rate.m).
- 프로그램은 자동으로 밝은 필드 이미지를 세그먼트(보충 그림 2-4참조).
- 분할 영상을 형광 영상(GFP)과 결합하여 셀당 강도 수준을 추출합니다.
- 시간별 셀의 양 그래프를 계산하고 기하급수적 성장에 따라 적합합니다.
- 각 셀 영역 범위에 대한 평균 및 표준 편차(STD)를 계산합니다.
- 각 셀 영역 범위에 대한 신호 대 노이즈 비율(SNR)을 계산합니다.
- 강도에 의해 셀의 양을 플롯하고 맞춥시다.
- 분산(CV)의 계수를 계산하고 흐름 분석기 데이터와 비교합니다.
참고: 소프트웨어는 새로운 폴더 "폴더/분할"에서 conv_kernel 조정하기 위한 최종 세분화 이미지를 출력으로 제공합니다. 소프트웨어는 새로운 폴더 "당신의 폴더 / 그래프의 출력으로 표시됩니다.
- 실험 을 비교하려면 compare_experiments.m사용하십시오.
- 저장된 그래프에 대한 디렉토리와 \Compare결과 디렉터리에 대한 주소를 정의합니다.
- 파일을 실행합니다.
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Representative Results
이 소프트웨어는 흰색과 검은색이 아닌 밝은 필드 도메인 이미지를 분석합니다. 대장균은 오프 화이트 배경에 검은 직사각형 모양처럼 보일 것이며, 휘도의 동적 범위는 중앙(그림 1)에스파이크를 표시해야합니다. 형광 이미지에서 세포는 작은 후광을 가질 수 있지만 직사각형 모양을 가진 개별 세포는 여전히 해결 될 수 있습니다. 미토시스 이벤트는 30분 후에 먼저 검출되어야 합니다. 현미경 초점 시간이 지남에 따라 안정적으로 유지되어야하며 세포가 30 분 동안 천천히 움직일 수 있지만 시야를 떠날 가능성은 낮습니다. 이러한 실험은 좋은 것으로 간주되며 그림 2에서볼 수 있습니다. 셀은 낮은 배율에서 밝은 필드 도메인에서 감지하기 어려울 수 있습니다. 낮은 배율로 쉽게 알 수 있기 때문에 높은 복사 번호(HCN) 플라스미드로 평균 초점 거리를 설정하는 것이 좋습니다. 높은 배율에서 낮은 복사 번호(LCN) 플라스미드를 미리 측정하면서 평균 거리를 설정합니다. 이 초점 거리는 주로 플레이트, 현미경 시스템 및 오일에 의존하며 젤 또는 대장균 균주의 두께가 아닙니다.
이 프로토콜을 다른 실험실에 적응할 때, 다음과 같은 문제가 발생할 수 있습니다 (1) 대장균 플레이트 (샘플) 잘못된 희석 비에 제조 된 세포의 변하지 않는 수를 나타낼 수 있습니다(도 3 및 도 4) (2)플레이트를 밀봉하지 않고 제조 샘플은 과도한 수축을 나타낼 수 있습니다. 이는 세포드(도3)로관찰될 수 있거나 초점 상실을 야기(도5)(3) 일부 샘플은 수영 세포의 배경(흰색)에서 느린 이동 '고정' 세포(black)를 나타낼 수 있다. 이는 젖은 시료로 인해 일반적으로젤(보충 비디오 1)(4) 몇 분 후에 세포를 전시하지 않는 샘플이 잘못 제조되었을 수 있으므로 안정화됩니다: (I) 젤은 여전히 너무 뜨겁게 부어졌으며, (III) 최소한의 매체는 성분이 부족하고(IV) 밀도가 너무 단단하게 유지되었다. 젤수축(도 5)과(VI) 세포의 희생으로 가스 교환을 허용하는 구멍을 뚫는 것이 중요하며, 다른 쪽 위에 하나를 쌓아, 세포 단층이 효과적으로 세포를 손상시키고 신뢰할 수 있는 형광 신호(보충도 5)를검출하는 것이 중요하다.
우리는이 작품에서 세 가지 회로를 측정했습니다. 먼저, 도 6에표시된 GFP를 조절하는 구성적인 프로모터. 둘째, 도 7에도시된 초배GFP(31)(sf GFP)를 조절하는 구성적인 프로모터. ssrA 분해 태그(AAV)를 sfGFP에 추가하여 수명을 분5로줄였습니다. 제3 회로는 양성 피드백 회로1을기반으로 하며, 아실-호모세린-락톤(AHL)에 의해 유도된다. PluxR 프로모터는 도 8에도시된 바와 같이 P럭스R을 활성화하기 위해 AHL과 결합하는 전사 인자 SfGFP 및 LuxR을 조절합니다. 도 9는 세포 성장의 역학(세포 수 대 시간), 도 10은 측정된 신호(평균 형광 대 시간)의 역학을 나타내며, 도 11은 평가된 총 잡음(표준 편차(STD)과 시간 대 시간의 역학을 나타낸다.
SNR(또는 CV)은회로(32)의정밀도와 신뢰성을 표현하기 위해 아날로그 전자 회로를 설계하는 데 널리 사용된다. CV는 단일 세포 간의 신호 분포와 관련이 있으며 현미경 및 유량 분석기와 같은 방법과 다른 장비에 걸쳐 비교할 수 있습니다. 현미경 심볼 이미지에서 SNR을 계산하면 시간에 걸쳐 회로를 비교할 수 있으며, 분할 된 세포는 신호에 비해 소음의 특정 해상도에 대한 측정을 제공하는 것과 동시에 측정되거나 특정 시간 동안 잡음 간격을 유도하고 농도를 유도할 수 있습니다. 이는 검출기 세포가 유도제 농도에 대한 정확한 신호 반응을 해결할 수 있는지를 나타낼 수 있다. 이 작품에서, CV는 분할 주기의 세포 진행에 관계없이 세포인 모든 분할된 아티팩트를 고려하여 계산하였다. SNR은 시간이 지남에 따라 특정 세포 영역 범위에 대해 계산된 다음 세 번의 반복된 실험에 대해 평균화되었습니다. 획득한 신호나 STD는 사용되는 실험 및 장비에 특정하기 때문에 단독으로 신뢰할 수 없습니다. 신호는 장비 게인 프리셋, 사진 감지기 및 노출 시간에 따라 임의단위로 측정됩니다. 도 10에 제시된 데이터는 다른 범위(분할 주기의 점)가 동일한 추세를 나타내기 때문에 분할 주기의 세포 단계가 노이즈 레벨에 영향을 미치지 않는다는 것을 시사한다. 이 관찰은 정확한 어머니를 추적하는 주장을 지원할 수 있습니다 - 딸 관계는 소음을 측정하기 위해 피할 수 있으며, 이것은 제시 된 방법에 대한 SNR을 향상시킬 수 있습니다. 도 12에도시된 바와 같이 GFP에서 sfGFP로 의 한 실질적인 변화는 관찰되지 않았다. 우리는 SNR (SNR = 평균 / STD)를 계산하고 그림 12 및 도 13에제시한다.
그런 다음 다음 방정식31을 기반으로 분산 및 CV를 계산했습니다.
1.1
1.2
λ는 단백질 접이식 시간인 경우, T는 세포 분단 시간, θ 및 μ 분할 전후의 플라스미드의 수, 플라스미드 카피번호(31)이다. 상기 방정식(1.1 및 1.2)을 사용하여 감마 분포를 위한 유량 분석기 신호로부터의 데이터를 맞출 수 있다.
그런 다음 유량 분석기(도14)에의해 측정및 계산되는 CV와 프로토콜(도15)을비교하였다.
도 1: 밝은 필드 노출 이미지 (a) 밝은 필드 (b)세분화 이미지에서 안정화 된 획득, 만 색깔의 셀은 획득의 계산(c)픽셀 밝기지도를 입력, 스파이크는 배경 잡음이다. 그것에 의해 임계값은 단지 에슈리치아 대장균을분할. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 이 실험은 120 분 후에 분할하고 반응하는 좋은 건강한 세포를 보여줍니다. 이미지는 20분 간격으로 연속적으로 획득되었습니다. 콜로니는 초점에, 젤은 샘플링 사이에 안정적이다. 식민지는 분열하고 강한 신호를 생성합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 형광 이미지에 잘못된 희석 비 및 젤 수축의 효과. 이미지는 20분 간격으로획득하였다(a)개별 대장균은 빨간색으로 동그라미를 치고(b)동일한 세포가 시야의 오른쪽으로 표류(c) 세포가 더 표류한다. 세포는 또한 낮은 희석 비 및 젤 수축 때문에, 분할하거나 위치를 변경하지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 이 실험에서는 활동이 검출되지 않았으며 세포가 거의 존재하지 않았다. 젤이 너무 뜨겁거나, 샘플의 건조가 너무 공격적이거나 보호 캡이 없는(a)40분(b)형광성 이미지에서 촬영한 형광이미지가 60분 에서 촬영되는 것이 가능한 이유이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 초점 손실 및 광표백. (a)통해(d)의연속된 이미지는 자동 초점 시스템을 사용하여 15 분 간격으로 획득되었다. 보충 비디오 2를참조하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: GFP를 조절하는 P테토의 플라스미드 맵. TetR 억압자가 없으면 PtetO 프로모터는 구성 프로모터 역할을 합니다. 회로는 낮은 복사 번호 플라스미드에 복제됩니다. 이 플라스미드는 모든 변형 회로에 대한 SNR 측정의 기초 역할을합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: SfGFP를 조절하는 P테토의 플라스미드 맵. SfGFP는 AAV 분해 태그에 융합됩니다. 회로는 낮은 복사 번호 플라스미드에 복제됩니다. SfGFP-AAV는 GFP의 보다 견고한 변형이며, AAV 태그는 대장균의가사 프로테아제에 의해 저하되기 쉽다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8:긍정적 인피드백 회로의 플라스미드지도. 회로는 LuxR 전사 인자를 결합하는 AHL 유도자에 의해 유도됩니다. AHL-LuxR 컴플렉스가 규제하는 PluxR 프로모터는 LuxR 및 SfGFP-AAV생산을 활성화합니다. 회로는 낮은 복사 번호 플라스미드에 복제됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 9:최소 매체에서 대장균 MG1655 균주 성장의 역학은 (a)PtetO-GFP, 약 35 분의 기하급수적 인 성장을 포함한다. 본 실험의 이미지는 도 2 (b)P tetO-sfGFP, 약 35분의 기하급수적 성장으로 도시된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 10: 형광 강도 수준, 픽셀당 정규화 및 20 분 간격으로 획득.
셀은 아티팩트를 최소화하기 위해 영역에 따라 비닝됩니다. 세포는 마이크로미터 정사각형(a)P테토-GFP회로제1회 강도에 대한 강도에 대한 첫 번째 반복은 0.004 a.u(b)PtetO-sfGFP 회로 210분에서 강도에 대한 첫 번째 반복은 0.022 a.u(c)Pteto-GFP회로(dFP) PF-TFp 회로의 측정신호(dFP) 측정신호로 나뉜다. 모든 실험 데이터는 세 가지 실험의 평균을 나타냅니다. 소프트웨어는 셀 영역을 상이한그룹(a)으로정렬하고(b)분할 주기를 나타내는 4개의 셀 영역 범위에 대한 그래프를 표시할 수 있다. 14 마이크로미터의 첫 번째 영역은 분열 후 세포가 가장 작을 가능성이 가장 높은 분할 후 세포를 나타냅니다. 21 μm의 두 번째 영역은 분할 전에 세포를 나타냅니다. 제3 및 제4 영역은 분할하는 데 시간이 오래 걸린 세포를 고려하기 위해 총 면적이 2개(29 및 36 μm)로 곱함에 따라 분열시 세포를 나타낸다. 이 영역은 현미경 이미지를 조사하는 데이터를 수동으로 평가하여 선택되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 11:단세포 형광 강도의 표준 편차(STD): (a)PtetO-GFP회로 최초 반복 210분에서 STD에 대한 회식은 0.001865 a.u(b)PtetO- 210 분에 STD에 대한sfGFP 회로 첫 번째 반복은 0.01477 a.u(c)P테토-GFP 회로의 STD(d)PtetO-sfGFP 회로. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 12:단세포 형광 강도의 SNR. SNR=평균/STD(a)PtetO-GFP회로 먼저 210분에서 SNR에 대한 첫 번째 반복은 1.309 a.u(b)P tetO -ptetO-sfGFP 회로 제1 반복을 210분에 210분에 계산합니다.29 a.u(c)GFP 측정의3회 반복(d d) 3회 반복GFP(d) 3회 반복) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 13:단일 세포 형광 강도의 SNR (a)PluxR-SfGFP 회로 SNR AHL(b)PluxR-sfGFP 회로 SNRAHL에 대한 반시간 응답을 위한. 양성 피드백 AHL 규제 회로의 SNR은 구성 sfGFP 회로에 대한 SNR보다 높다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 14: 유량 분석기를 기반으로 하는 유전자 회로의 히스토그램: 실험 데이터(파란색) 및 스토세스 모델 데이터(적). 상기 x축은 유동 세포측정에서 임의형형 단위를 나타내고, y축은 해당 형광 수준을 생성하는 세포의 주파수를 나타낸다. 데이터는 3시간 후에 유동 분석기를 사용하여 측정되었습니다. GFP 형광은 484 nm의 파장에서 발산하고 510 nm의 파장에서 방출함으로써 정량화되었다. PE-TexasRed 필터 전압은 높은 처리량 샘플러에서 GFP 발현 수준을 측정하는 데 사용되었습니다. 유량 분석기 전압은 소프트웨어를 사용하여 조정되어 동일한 전압 설정으로 최대 및 최소 식 수준을 측정할 수 있었습니다. 따라서 각 실험에서 일관된 전압이 사용되었습니다. 동일한 실험의 후속 반복에 동일한 전압이 사용되었습니다. 피팅은 감마분포(31)를사용하여 만들어졌습니다. 이 방법은 신호가 주로 플라스미드(a)낮은 복사 번호 플라스미드에 P테토-GFP 클론의 측정의 임의 분포에 따라 달라집니다 가정한다. 실험 CV=0.46, 모델 CV=0.32(b)P테토의측정 - 낮은 복사 번호 플라스미드에 복제된SfGFP-AAV. 실험 CV=0.86, 모델 CV=0.44. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 15: 현미경을 기반으로 유전자 회로의 히스토그램 : 실험 데이터 (점선) 및 스토세스 모델 데이터 (고선). 상기 x축은 반전된 현미경으로부터 임의형경전성 단위를 나타내고 y축은 해당 형광 수준을 생성하는 세포의 주파수를 나타낸다. 피팅은 낮은 복사 번호 플라스미드(b)PtetO의측정에 대한 PtetO-GFP 클론의 측정 -sfGFP-AAV를 낮은 복사 번호로 복제하여 MATLAB 감마 분포31,32 (a)측정을 사용하여 만들어졌다. 비교는 우리의 프로토콜이 흐름 분석기 실험과 유사한 CV 값을 얻는 것을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 1: MG1655 균주에 대해 1:500에서 1:20 사이의 4 개의 희석 비율. 그래프는 초기 밀도가 높은 경우 LB 영양소가 풍부하여 세포가 더 빨리 분할되는 것을 보여줍니다. 1:500 희석의 경우 세포 밀도는 일정하게 유지되었습니다. 1:100 희석의 경우 세포 밀도가 느리게 증가했습니다. 1:50 희석의 경우, 세포 밀도는 250 RPM 배양에서 상당한 지연 없이 적당한 분할 속도로 증가했습니다. 1:20 희석의 경우 세포 밀도가 빠르게 포화 상태에 도달했습니다. 우리는 1:30의 희석 비율을 선택하여 기하급수적 성장에 도달하기위한 짧은 인큐베이션과 적당한 분할 비율로 높은 채도를 달성하기위한 실질적인 분할 범위에 도달할 수 있었습니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 2: 밝은 필드 이미지 처리. (a)현미경 시스템에서 밝은 필드 채널에서 원시 데이터 강도 이미지. (b)배경으로부터 셀 객체의 분리를 개선하기 위해 이미지의 대비 향상 조작. (c)컨볼루션필터(33) 및 바이너화 기반 글로벌임계값(34)을기반으로 한 세포 경계 인식. (d)세포 식민지 경계를 식별하기 위해 폐쇄 및 충전의 형태학적35 개 작업. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 3: 세포 식민지 배경 \전경 세분화. 소음의 영향을 최소화하기 위해 우리는 셀 콜로니 경계를 식별하고 젤 잡음에서 추출하려고합니다. (a)셀오브젝트(36)를검출하기 위한 적응형 임계값에 기초한 대비 향상에 대한 이미지 바이나화 동작. (b)S2d 및 S3a에서 제시된 매트릭스의 매트릭스 곱화는 대부분의 소음을 성공적으로 필터링하고 세포로부터 젤 노이즈를 분화합니다. 일부 경계는 완전히 해결되지 않습니다. (c)비거리변환(38)을기반으로 한 분수령알고리즘(37)을 이용한 세포 경계 식별. (d)S3b 및 S3c에서 제시된 매트릭스의 매트릭스 곱화는 단일 세포를 성공적으로 해결한다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 4: 단일 세포 세분화. (a)밝은 필드 이미지의 분할 된 제품. 추가 청소는 둥근 거품을 버리고, 세포 영역 게이팅 및 모양에 따라 미리 형성된다. (b)현미경으로부터 획득한 형광 신호 영상. (c)S4a 및 S4b에서 제시된 매트릭스의 매트릭스 곱화는 단일 세포의 신호를 성공적으로 추출한다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 5: 단층의 손실. (a)P테토의 840분(14시간)에서 세포층의 밝은 필드 영상을 통해 도 2에 도시된 GFP 회로를 조절하는 것이 좋은 실험으로. 단일 층의 현미경 이미지 손실의 오른쪽에서 감지 할 수 있습니다. (b) 소프트웨어 세분화 이미지. 단층 세포의 손실로 인해 단편화되고 영역 게이팅에 기반을 청소합니다. (c)형광 화상의 오른쪽에 는 단층의 손실로 인해 이미지의 왼쪽에 있는 세포의 낮은 신호와 셀의 낮은 신호를 확인할 수 없다는 것을 보여주는 형광 영상. (d)형광 이미지와 결합된 세분화 이미지. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 비디오 1. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 비디오 2. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 작업에서, 우리는 시간의 기간 동안 분할 및 형광 수준에 따라, 대장균 라이브 세포의 컴퓨터 추적을 가능하게하는 프로토콜을 개발했다. 이 프로토콜을 통해 우리는 CV와 SNR을 실시간으로 측정하여 대장균의 유전 회로의 궤적 역학을 정량화할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 도 10에표시된 두 개의 서로 다른 회로의 스토세스 동작을 비교했습니다. 그것은 낮은 복사 번호를 가진 플라스미드는 금세 효과 경향이 있고 세포 분열에 의해 더 적은 영향을 받는 것으로 나타났습니다. 제1 회로는 GFP(도10a)를구성하고, 제2 회로는 ssrA 분해태그(도 10b)에융합된 sfGFP를 구성적으로 표현하였다. 형광 단백질의 황변 적 행동을 정량화하기 위해 밝은 필드 이미지도 기록했습니다. 결과는 GFP의 발현, 특히성숙39에서지배적인 소음원임을 보여준다. 도 10a에서 관찰된 주기적인 톱니 거동 패턴은 세포 분열의 무작위 과정과 GFP 성숙의 장시간 스케일(~50분)에 의해 설명될 수 있다. 대조적으로, 제2 회로의 SfGFP 신호는 SfGFP(~6분)의 매우 짧은 성숙 시간 때문에 측정 중에 안정화되었다. 우리는 세포 분열과 GFP 성숙 시간의 과정만 고려할 때 두 회로모두에서 GFP의 수준을 설명하는 간단한 공식을 개발했습니다. 주어진 시간에, t,우리는 단백질의 x 복사 번호가 있다고 가정하고, 플라스미드의 μ 복사 번호. 단백질 복사 번호는 다음을 설명할 수 있습니다.
1.3
1.4
분할 이벤트만 고려할 때; 
단백질 성숙 후 등 특정 플라스미드에 대 한 우리가 얻을:
GFP 
(): 1.5
SFGFP 
():1.6
그런 다음, SfGFP의 개발 시리즈 :
1.7
이 
경우, 우리는 얻을 
. 이 결과는 다음과 같이 설명 할 수 있습니다. x가 작으면 SfGFP 수준이 소량 증가합니다. x가 크면 SfGFP가 정상 상태로 저하됩니다. 유사하게, GFP의 회로를 위해, 각 세포는 GFP의 대략 10 단위를 포함하지만, GFP를 위한 성숙 시간은 미토시스 보다는 길기 때문에, 형광 긴장의 톱톱 치아 패턴을 저하시키는 것이 관찰됩니다. 모델에서 플라스미드의 복제는 분할 전후에 플라스미드 분포가 일정하게 유지될 만큼 빠르다고 가정했습니다. ssrA 분해 태그는 종종 단백질 반감기 시간을 시간에서 1 시간5 미만으로 감소시키고 빠른 안정된 상태로 이어집니다. 우리는 또한 이 방법이 높은 인구 흐름 분석기로 측정된 것과 유사한 분포를 제공하고 이 분포의 CV가 유량 분석기 CV와 같거나 작다는 것을 보여주었다.
몇몇 방법3,7,18은 살아있는 세포 화상 진찰을 위해 개발되었지만, 여기에 제시된 방법은 대장균에 특별히 맞추어졌습니다. 이 박테리아는 특별한 미디어와 약간 다른 접근이 필요합니다. 프로토콜은 다음과 같은 중요한 특징을 갖는다: (1) 중간 단계보다는 기하급수적 성장의 시작 부분에 박테리아와 균주에 특이적 희석 비율을 확립 (흔들림없이 지수 성장) (2) 대장균은 37 °C에서 가장 잘 분할, 하지만 37 °C에서 최소 미디어 젤은 급격히 수축 및 불안정에 이르게 물을 잃는다. 여기서 프로토콜은 이 도전을 극복합니다 (3) 우리는 먼저 박테리아 샘플을 적용한 다음 액체 젤로 밀봉합니다. 샘플이 유리 바닥과 젤 사이에 갇혀 있기 때문에 우리는 (I) 가스 교환이 공기 주머니를 절단하지 않도록 하는 젤을 필요로 하며, (II) 대장균이 열에 민감하고 (III)가 액체 젤 내부에 혼합되지 않도록 하여 저온에서 액체로 남아 있다. 젤은 37°C에서 액체로 남아 있으며, 그러나, 우리는 젤 내부의 과도한 열 및 샘플 혼합을 방지하기 위해 샘플 위에 보호 캡을 사용하는 것이 좋습니다 (4) 이러한 방법은 간단한 필요, 일반 장비 (5) 샘플은 사전 가열없이 직접 측정 할 수 있습니다, 그래서 분열 이벤트의 손실이 없다 (6) 부속 이벤트의 손실이 없다 (6) 부속 의 손실 (6) 습식 실험실 단계및 사용자 정의 자동화 소프트웨어를 포함하는 프로토콜, 이러한 회로 의 SNR 회로의 stochastic 동작을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 현미경 검사법을 비교하여 세포의 작은 집단의 사용을 검증하고 CV (7)에 따른 비교 기준을 확립하기 위해 분석기 결과를 유량하여 인간의 개입없이 단층의 세포를 감지하고 총 소음을 분석할 수 있도록 합니다. ImageJ18 또는 Schnitzcells와 같은 소프트웨어 도구는 셀을 수동으로 식별해야 하며 조정에 어려움을 겪고 있습니다.
살아있는 세포 식민지를 지속적으로 이미징할 때, 세포 스트레스 및 독성, 자원 고갈 속도, 괴사 및 유도제 및 화학 물질의 저하 시간과 같은 몇 가지 복잡한 물리적 매개 변수를 고려하면서 실험을 설계하십시오. 이 프로토콜을 통해 최대 5시간의 안정적인 측정이 가능합니다. 우리의 실험은 대장균이 마이크로, 단층 식민지(보충 비디오 3)로나눌 때 동기화하는 것이 좋습니다. 우리는 젤이 자원과 인성의 관점에서 균일하고, 세포는 유사한 행동을 가지고 있으며, 조명 분야가 시야에서 약간 더 크다고 가정합니다. 따라서, 각 셀은 동일한 신호 및 통계 데이터를 생성해야 하며, 이는 이러한 방식으로 얻은 CV를 유량 분석기로 측정하여 얻은 CV를 비교하여 우리가 보여준 바와 같이 수집될 수 있다. 일정한 초기 조건에서 장시간 소음을 측정하기 위해 향후 미세 유체 칩을 사용하는 것이 좋습니다. 이러한 장치의 추가 이점은 세포의 고정 된 위치와 안정적인 초점(10)을유지한다. 그럼에도 불구하고, 미세 유체 칩의 설계, 제조 및 실험을 위한 프라이밍에는 교육, 특정 장비(시간에 맞게 사용자 지정)가 필요합니다. 이러한 이유로, 회로의 일반적인 이해를 얻기 위해이 프로토콜에 표시된 바와 같이 시간 경과 현미경 검사를 사용하는 것이 유익하다.
제안된 프로토콜과 개발된 소프트웨어는 재현 가능한 측정을 허용하며 그래프를 파생하는 것이 간단합니다. 또한 총 소음을 테스트하고 비교할 수 있으며 본질및 외외 노이즈를 측정하기 위해 수정할 수 있습니다. 이 방법은 일반 또는 주문하기 쉬운 재료를 기반으로하며 공개적으로 공유되고 사용하기 쉬우며 특정 교육이 필요하지 않습니다. 우리는 현미경 검사법에 의해 측정된 인구가 유동 분석기로 얻은 방법 CV를 비교해서 의미 있는 데이터를 얻기 위하여 충분히 크다는 것을 보여주었습니다. 따라서, 우리는 성공적으로 이 프로토콜을 사용하여 SNR 기준선을 설치하고 더 복잡한 유전자 회로에 비교할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 MATLAB 코드를 지원길 겔버트 (전기 공학 학부, 테크니온)에 감사드립니다. 이 기사를 증명하는 데 도움을 주신 시밍 리 박사(생명의학 공학부, 테크니온 교수)에게 감사드립니다. 이 연구는 부분적으로 노이바우어 가족 재단과 과학의 이스라엘 부에 의해 지원되었다, 보조금 2027345.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35mm glass dish | mattek | P35G-0.170-14-C | thickness corresponding with microscope lense. |
| Agarose | Lonza | 5004 | LB preperation |
| AHL | Sigma-Aldrich | K3007 | inducer |
| Bacto tryptone | BD - Becton, Dickinson and Company | 211705 | LB preperation |
| Carb | Invitrogen | 10177-012 | antibiotic |
| Carb | Formedium | CAR0025 | antibiotic |
| Casamino acids | BD - Becton, Dickinson and Company | 223050 | minimal media solution |
| eclipse Ti | nikon | inverted microscope | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | minimal media solution |
| Glyserol | Bio-Lab | 000712050100 | minimal media substrate |
| Immersol 518F | zeiss | 4449600000000 | immersion oil |
| M9 salt solution | Sigma-Aldrich | M6030 | minimal media solution |
| NaCl | Bio-Lab | 214010 | LB preperation |
| Noble agar | Sigma-Aldrich | A5431 | minimal media substrate |
| parafilm tape | Bemis | PM-996 | refered to as tape in text |
| Seaplaque GTG Agarose | Lonza | 50111 | minimal media substrate |
| thaymine B1 | Sigma-Aldrich | T0376 | minimal media solution |
| Yeast Extract | BD - Becton, Dickinson and Company | 212750 | LB preperation |
References
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