Summary
Эта работа представляет собой метод микроскопии, который позволяет живую визуализацию одной клетки кишечной палочки для анализа и количественной оценки стохастичного поведения синтетических цепей генов.
Abstract
Разработанный здесь протокол предлагает инструмент, позволяющий компьютерному слежению за делением кишечной палочки и флуоресцентными уровнями в течение нескольких часов. Процесс начинается с скрининга для колоний, которые выживают на минимальных средств массовой информации, предполагая, что только Escherichia coli укрывательство правильной плазмиды сможет процветать в конкретных условиях. Поскольку процесс построения больших генетических схем, требующих сборки многих частей ДНК, является сложной задачей, компоненты цепи часто распределяются между несколькими плазмидами на разных числах копий, требующих использования нескольких антибиотиков. Мутации в плазмиде могут разрушить транскрипцию генов устойчивости к антибиотикам и вставить с ресурсами управления в клетке, что приводит к некрозу. Выбранная колония установлена на стеклянном дне чашки Петри и несколько плоскостей фокусировки выбраны для отслеживания микроскопии как в ярком поле, так и в флуоресцентных областях. Протокол сохраняет фокус изображения в течение более 12 часов при первоначальных условиях, которые не могут регулироваться, создавая некоторые трудности. Например, мертвые клетки начинают накапливаться в поле фокусировки линз после нескольких часов визуализации, что приводит к накоплению токсинов и сигналу к размытию и распаду. Истощение питательных веществ вводит новые метаболические процессы и препятствует желаемой реакции цепи. Температура эксперимента снижает эффективность индукторов и антибиотиков, что может еще больше повредить надежность сигнала. Минимальный медиа гель сжимается и высыхает, и в результате оптический фокус меняется с течением времени. Мы разработали этот метод для преодоления этих проблем в Escherichia coli, по аналогии с предыдущими работами разработки аналогичных методов для других микроорганизмов. Кроме того, этот метод предлагает алгоритм количественной оценки общего стохастичного шума в неизмененные и измененные клетки, вывод о том, что результаты согласуются с прогнозами анализатора потока, как показано на аналогичном коэффициенте изменения (CV).
Introduction
Синтетическая биология является междисциплинарной области, которая возникла в последнее десятилетие и направлена на перевод инженерных принциповпроектирования в рациональном биологическом дизайне 1,2,3, в попытке достичь мульти-сигнал интеграции и обработки в живыхклетках для понимания фундаментальных наук 4,5 ,диагностических,терапевтических и биотехнологических приложений 6,7,8,9,10. Наша способность количественно ввода-выходной реакции синтетических генных цепей была революционизирована в результате недавних достижений в одноклеточной технологии, включая анализатор потока и живую визуализацию клеток с помощью автоматизированной микроскопиизамедленного действия 11. Анализатор потока часто используется для измерения реакции этих цепей вустойчивом состоянии 1,12, и перевернутая микроскопия используется для измерения динамической реакции синтетических цепей генов на уровне одной клетки3. Например, одна из ранних работ в синтетической биологии включала строительство генетических осцилляторных сетей в живых клетках с использованием циклов отрицательной обратной связи сзадержкой 3. Позже, генетические схемы осциллятора были применены, чтобы понять метаболический контроль в динамической среде живыхклеток 4. Автоматизированная микроскопия замедленного действия является одним из методов характеристики таких схем. Мы предполагаем, что клетки-хозяина, Escherichia coli, синхронизируют при формировании микро колоний, позволяя измерять сигнал и расчет шума без отслеживания точных отношений матери и дочери.
Шум является фундаментальным, неотъемлемым аспектом биологических систем, часто вытекающих из нескольких источников. Рассмотрим, например, биохимические реакции, связанные с сигналами, которые возникают от транспортировки дискретных случайных носителей, таких какдиффузия белков 13. Эти сигналы распространяются со случайными колебаниями14. Другими источниками шума являются наличие ресурсов, деление клеток и изменения в условиях окружающей среды, таких как температура, влажность и давление. Биологические сигналы, которые распространяются в синтетических генных схемах, часто имеют очень низкий коэффициент сигнала к шуму (SNR), что нарушает производительность таких схем. Таким образом, генетическая схема дизайна остается одним из самых сложных аспектов геннойинженерии 15. Например, в отличие от большинства подходов, которые вычисляют только среднее выражение гена (измеряется по всей популяции клеток), разница измеренного сигнала считается для того, чтобы инженер предсказуемого поведения через синтетическиесети генов 12. Таким образом, уровни изменчивости или шума в экспрессии белка играют доминирующую роль в проектировании и производительности аналоговых и цифровыхгенных схем 1,16,17.
Многие подходы были разработаны для количественной оценки изменчивости клеток к клетке, в том числе в Escherichia coli3,7,18. Эти методы часто используются для изучения активации генов и метаболических путей, однако с меньшим акцентом на изучение стохастичной динамики шума, как измерение и разобщание конкретных источников шума, особенно для генетических схем в живых клетках, где это фундаментальная проблема19,20,21. Несколько факторов, оба унаследованных к самой цепи (внутренне) и выведенных от клеток хозяина (внешних), могут нарушить непрерывную работу генетических цепей. В этой статье мы разработали протокол, который направлен на количественную оценку общего шума в клетках кишечной палочки, включая внутренние и внешниеисточники шума 6,22. Путем количественной оценки общего шума, а затем оценки SNR23, дизайн генных схем может быть улучшена. Этот метод может быть изменен для измерения независимых источников шума отдельно, путем мониторинга нескольких флуоресцентныхбелков 6,20. Для протокола, описанного здесь, мы держим условия окружающей среды хорошо контролируемыми и постоянно измеряем активность клеток без влияния внешних факторов. Мы измеряем сигнал от флуоресцентных белков в одиночных клетках с течением времени и одновременно изымаем их под подложку агарозы. Полученные изображения анализируются с помощью пользовательского MATLAB лаборатории.
В идеале, непрерывное измерение активности флуоресцентных белков в клетке в режиме реального времени будет производить точные данные через рост и деление клеток. Однако получение таких данных является сложной задачей. Это связано с деградацией флуоресцентных белков, известных какфотоотбеление 7, когда они подвергаются воздействию радиации в процессе возбуждения. Кроме того, клетки кишечной палочки Escherichia также чувствительны для возбуждения, что может привести к фототоксичности7. Оба вопроса ограничивают количество фоторамок, которые могут быть приобретены, и время между приобретениями. Субстрат и средние типы (например, лизегенный бульон), который используется для выращивания клеток во время визуализации, также играют решающую роль. Мы настоятельно рекомендуем использовать минимальную среду, которая сводит к минимуму нефлуоресцентный фон и расширяет время деления клеток.
Кроме того, образец должен быть подготовлен с учетом следующих требований (1) Низкий уровень деления клеток позволяет менее частые воздействия для тщательного изображения цикла деления и снижения вероятности фототоксичности и фотоотчивания. Мы установили время приобретения примерно на половину прогнозируемого времени митоза (2) Низкая плотность клеток в начале эксперимента позволяет лучше единообразие и отслеживаемость деления. Плотность клеток зависит от коэффициента разбавления клеток кишечной палочки, что является важным параметром успеха этого протокола и должно быть определено для каждой лаборатории. Для того, чтобы установить соотношение, каждый новый штамм кишечной палочки или используемых средств массовой информации должны быть оснащены графиками темповроста (Дополнительный рисунок 1). Соответствующее соотношение было достигнуто, если клетки могут расти без дополнительной тряски после короткой инкубации от первоначальнойплотности около OD 600nm и 0,1. Клетки на этом этапе будут делиться в зависимости от температуры окружающей среды только (3) Ограничение движения клеток: движение клеток сильно зависит от упрямости субстрата (агарозной площадки). Твердость субстрата зависит от количества общей агарозы и времени затвердевания геля. Гели не могут быть оставлены для затвердеть на ночь при комнатной температуре, так как кишечная палочка Escherichia будет проходить митоз. Другие факторы, влияющие на стабильность субстрата, включают количество воды в образце и влажность. Дополнительные вопросы подробно обсуждаются в результатах представительов. Этот протокол содержит множество деталей и постепенно переходит от одного шага к другому. Протокол обеспечивает долгосрочную стабильность для экспериментов с изображениями и обеспечивает базовый инструмент обработки изображений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка средств массовой информации и культуры
- Подготовка запасов раствор 1000x карбенициллин (50 мг/мл) или соответствующие антибиотики.
- . Вес 0,5 г карбенициллина. Добавьте 10 мл стерильного H2O. Полностью растворите.
- Стерилизовать запас карбенициллина через фильтр шприца 0,22 мкм. Aliquot раствор антибиотика и хранить при -20 градусов по Цельсию.
- Для приготовления лизогенного бульона (LB) пластины смешайте 5 г триптона, 5 г NaCl, 2,5 г дрожжевого экстракта и 7,5 г бакто-агара с 0,5 л стерильного H2O. Автоклав раствор при 121 градусе по Цельсию в течение 20 мин.
- Частично погрузите расплавленный гель-микс в водяную баню на 50 градусов Цельсия. Добавьте 1000 л карбенициллина (50 мг/мл).
- Приготовьте блюда Петри в стерильной среде. Оставьте тарелки установить перед хранением их в холодильнике.
- Для минимальных медиа M9 приготовьте отдельные стоковые растворы: соли 5x M9 (56,4 г/л), 2 М глюкозы и 2% биотин-бесплатных казамино-кислот. Автоклав растворов при 121 градусе по Цельсию в течение 20 мин.
- Для приготовления 5 пластин Петри смешайте 1125 мг низкоплавильного агара и 400 мг агара с 89,2 мл минимального м.с. (1x M9). Добавьте 10 мл 2% казамино-кислот (2% «vol/vol») в колбу Erlenmeyer длиной 250 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь в том, чтобы налить средства массовой информации на внутренние губы колбы. - Микроволновая печь раствор короткими очередями от 3 до 4 секунд. Повторяйте до тех пор, пока решение не будет ясным.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что не достичь точки кипения. - Поместите колбу Erlenmeyer 250 мл в ванну с горячей водой (60 градусов по Цельсию) для дальнейшего смешивания путем диффузии, и оставьте его остыть, пока его температура не упадет примерно до 45-50 градусов по Цельсию.
- Зажми пламя на скамейке для заливки тарелки.
- Быстро добавьте все решения в следующем порядке:
800 йл 50% глицерол (0,4% «vol/vol»)
100 МКЛ тиамина (B1)
1100 МЛ глюкозы (2M)
100 мкл карбенициллина (50 мг/мл). - Закружить колбу Erlenmeyer, чтобы обеспечить равномерное распределение всех ингредиентов по всему агару.
- Откройте одну тарелку в то время, рядом с пламенем и начать заливки.
- Оставьте тарелки на скамейке на несколько минут до первоначальной затвердевания.
- Переверни пластины вверх дном, чтобы предотвратить капание конденсата воды на гель.
- Оставьте пластины затвердевать при комнатной температуре около 2 ч.
- После того, как пластины затвердевли и высохли, они могут храниться при 4 градусов по Цельсию в течение 3 месяцев.
2. Бактериальные штаммы и плазмиды строительства
ПРИМЕЧАНИЕ: Генетическая схема содержит одну часть; зеленый флуоресцентный белок (GFP), управляемый промоутером PtetO, что приводит к составной экспрессии. Все плазмиды в этой работе были построены с использованием основных методов молекулярного клонирования и были преобразованы в Escherichia coli 10 ", используя стандартный протокол теплового удара24. Окончательная конструкция была преобразована в штамм дикого типа Escherichia coli MG1655 для тестирования.
- Превратите желаемую плазмиду в клетки Escherichia coli MG1655 со стандартным протоколом теплового удара24.
- Выращиваем преобразованные клетки на Агарной пластине LB на ночь при 37 градусах Цельсия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Можно держать чашки Петри от шага 2,2 до 3 дней для использования микроскопии. - Привить одну колонию в 5 мл бульона LB, дополненного соответствующими антибиотиками в стеклянной трубке.
- Выращиваем клетки при 37 градусах Цельсия при скорости встряхивания 250 об/мин в инкубаторе в течение 2 ч, пока жидкость не будет облачной.
- Подготовка 1 мл раствора разбавления следующим образом:
892 МКЛ минимальных средств массовой информации (1x M9)
8 МКЛ 50% глицерол (0,4% «vol/vol»)
100 йл 2% кислот Казамино (0,2% «wt/vol»)
1 мл тиамина (B1)
11 МКЛ глюкозы (2 М)
1 мл соответствующих антибиотиков- Смешайте и спина вниз.
- Разбавить клеточной культуры (1:30) от шага 2,4 в 2 мл трубки, добавив 30 йл роста кишечной палочки до 1000 йл раствора разбавления (шаг 2,5).
- Инкубировать трубку в течение 1 ч при тряске (250 об/мин) при 37 градусах Цельсия.
- Рост 40 МКЛ - 60 МКЛ на пластинах M9, подготовленных в шаге 1.10. Инкубировать пластину при 37 градусов по Цельсию на ночь.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оптическая плотность (OD600nm) для покрытия должна быть около 0,1. - Поместите на скамейку до трех стеклянных нижних пластин диаметром до 35 мм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что стекло пластины имеет правильную толщину для используемых линз микроскопа. - Подготовь культуру для посева на гелеобразных пластинах, повторите шаги от 2,3 до 2,6 для колоний из пластины, подготовленной на этапе 2,9 измерения микроскопа.
- Подготовьте следующее решение, чтобы сделать три микроскопа пластин.
- Разогреть водяную баню до 60 градусов по Цельсию.
- Смешайте 112,5 мг низкоплавильного агара и 40 мг агара с 8,92 мл минимальных средств массовой информации (1x M9) и добавьте 1 мл 2% казамино кислот (0,2% «vol/vol») в колбе 25 мл Эрленмейера.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь в том, чтобы налить средства массовой информации на внутренние губы колбы.
- Микроволновая печь раствор короткими очередями от 2 до 3 секунд. Повторяйте до тех пор, пока решение не будет ясным.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что не достичь точки кипения. - Поместите колбу Erlenmeyer 25 мл в ванну с горячей водой (60 градусов по Цельсию) для дальнейшего смешивания путем диффузии, и оставьте его остыть на скамейке, пока его температура не упадет примерно до 45-50 градусов по Цельсию.
3. Подготовка агарозных прокладок
- Чистая скамейка с 70% этанола. Растянуть ленту на очищенной скамейке. Убедитесь, что лента гладкая и выровнялась.
- Подготовь два обложки: один на ленте и второй рядом. Подготовь прикрытие.
- Снимите колбу (подготовленную на шаге 2.14) с водяной ванны, протрите внешнюю часть колбы чистой и оставьте ее остыть, пока ее температура не упадет примерно до 45-50 градусов по Цельсию.
- Чтобы сделать гель решение, быстро смешать все решения в следующем порядке:
80 йл 50% глицерол (0,4% «vol/vol»)
1 мл 2% казамино-кислот (0,2% «wt/vol»)
10 йл тиамина (B1)
110 МКЛ глюкозы (2 М)
10 мл соответствующих антибиотиков. - Налейте 1,5 мл геля на крышку и накройте его второй частью, сделав "сэндвич".
- Верните Эрленмайера на горячую водяную баню. Накройте сэндвич крышкой и установите таймер на 20 минут.
- В то же время, инкубировать трубку от шага 2.11 для 1 ч при 37 C со тряской (250 об/мин)
- Через 20 минут переверните сэндвич (шаг 3.5), накройте его и оставьте на 1 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения лучших результатов оставьте "сэндвич" на отдых при 4 градусов по Цельсию в течение шага 3,8. - Семя Escherichia coli культуры от шага 3.7 путем трубопроводов образца на 35 мм блюдо.
ПРИМЕЧАНИЕ: Трубопровод 6 йл клеток, как отдельные маленькие капли дает лучшие результаты. - Разрешить капли высохнуть, по крайней мере 15 минут и до 30 минут.
- Выставить затвердеть гель бутерброда от шага 3.8 путем скольжения крышки прочь.
- Вырезать бутерброд на небольшие отдельные прокладки с биопсией удар или наконечник.
- Аккуратно наклоните его на образец (шаг 3.9). Оставьте блюдо на 20 минут на скамейке запасных.
4. Подготовка образца для микроскопии изображений
- Снимите колбу с водяной бани с 3,6 шага. Протрите внешнюю часть колбы чистой и дайте остыть до комнатной температуры (25 градусов по Цельсию).
ПРИМЕЧАНИЕ: Удалите колбу на шаге 4.1 примерно за 3 минуты до окончания таймера. - Налейте 3 мл геля постоянно по периметру пластины круговыми движениями. Оставьте затвердеть на несколько минут.
- Печать пластин с лентой и проколоть несколько отверстий с 25 G иглы. Переверните все блюда, чтобы предотвратить конденсат воды капает на гель.
- Инкубировать все блюда при 4 градусов по Цельсию в течение 30 минут, чтобы обеспечить полную затвердевание при предотвращении клеточного митоза.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оставьте образцы при 4 градусов по Цельсию для последовательных измерений, не более одного дня. - Запустите микроскоп в соответствии с инструкциями производителя.
- Найдите начальную фокусировку с помощью объектива наименьшего усиления и завемите автоматическую фокус-систему (AFS).
- Используйте масло, если это необходимо, утопить объектив с маслом и распространять его тщательно, перемещая пластины с контроллером платформы (не вручную) и AFS может быть вовлечен снова.
- Используйте относительное поперечное сечение в направлении q, следуя предложению по умолчанию для поперечных сечений шага.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы принимали яркие изображения поля каждые 5 минут и флуоресцентные изображения каждые 20 минут. Иногда фокус должен быть скорректирован в течение первых 30 минут. Подогрев окна инкубатора микроскопа и масла, в то время как охлаждение образца, как правило, помогает уменьшить первоначальную потерю фокуса.
5. Анализ данных
ПРИМЕЧАНИЕ: Для обработки данных микроскопии мы разработали компьютерное программное обеспечение в MATLAB. Это программное обеспечение облегчает идентификацию границ клеток от ярких изображений tiff поля и сегментов и сортирует ячейки по площади. Выход этого анализа изображений может быть использован в качестве маски на флуоресцентных изображениях tiff для получения уровней интенсивности клеток и отмены артефактов в флуоресцентном домене, таких как ореол клеток из-за ограничений разрешения микроскопа. Разработанное программное обеспечение было вдохновленоаналогичными работами 7,25,26,27,28,29,30 и обеспечивает элегантное решение с учетом лаборатории.
- Во-первых, определить следующие параметры в main_code.m.
- Определите папку изображений приобретения.
- Определите период времени изображения - яркий шаг времени канала поля в минутах.
- Определите частоту GFP - скорость приобретения изображений GFP.
- Определите разрешение микроскопа (т.е. сколько пикселей равно 1 мкм).
- Определите диапазон гистограммы бен - диапазон области ячейки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс классификации данных в зависимости от области ячейки аналогичен принципам gating в анализе данных цитометрии потока. Ворота расположены вокруг популяций клеток с общими характеристиками, как правило, вперед разбросаны и стороны рассеяны, чтобы изолировать и количественно этих групп, представляющих интерес. Микроскопия позволяет ворота, исследовать и количественно несколько групп клеток. - Определить ядро свертки (3,3) - этот параметр определяет границы клеток путем глобального порога(count_cells.m).
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта установка необходима только при смене лаборатории или микроскопа. Программное обеспечение требует, чтобы входной яркий полевой канал был помечен индексом c1, флуоресцентным каналом, помеченным как c2.
- Запуск main_code.m, который будет работать все другие скриптыавтоматически (count_cells.m, cell_growth_rate.m).
- Программа автоматически сегменты яркие изображения поля (см. Дополнительный рисунок 2-4).
- Объедините изображение сегментации с флуоресцентным изображением (GFP) для извлечения уровня интенсивности на ячейку.
- Рассчитайте график количества ячеек по времени и в соответствии с экспоненциальным ростом.
- Рассчитайте среднее и стандартное отклонение (ЗППП) для диапазона каждой области ячейки.
- Рассчитайте соотношение сигнала к шуму (SNR) для каждого диапазона области ячейки.
- Участок и подходят распределения количества клеток по интенсивности.
- Рассчитайте коэффициент дисперсии (CV) и сравните с данными анализатора потока.
ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение даст в качестве выхода окончательные изображения сегментации для conv_kernel в новой папке "ваш фолдер / сегментированный". Программное обеспечение даст в качестве вывода графики в новой папке "вашfolder / Графики.
- Для сравнения между экспериментами используйте compare_experiments.m.
- Определите каталоги сохраненных графиков и адрес каталога «CompareResult».
- Вы запустите файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Программное обеспечение анализирует яркие изображения домена поля, которые являются небелые и черные. Escherichia coli будет выглядеть как черные продолговатые формы на белом фоне и динамический диапазон яркости должны показать всплеск в его центре (Рисунок 1). В флуоресцентных изображений клетки могут иметь небольшой ореол, но отдельные клетки с продолговатыми формами все еще могут быть решены. Событие митоза должно быть впервые обнаружено через 30 минут. Фокус микроскопа должен оставаться стабильным с течением времени, и хотя клетки могут медленно двигаться в течение этих 30 минут, они вряд ли покинут поле зрения. Такой эксперимент будет считаться хорошим и может быть просмотрен на рисунке 2. Клетки могут быть трудно обнаружить в ярком поле домена при низком увеличении. Мы рекомендуем установить среднее расстояние фокусировки с высоким числом копий (HCN) плазмид, так как это легко заметить при низком увеличении. Установите среднее расстояние при измерении низкого числа копий (LCN) плазмида при высоком увеличении заранее. Это расстояние фокуса зависит главным образом в плитах, системе микроскопии и масле, и не толщине напряжения палочки геля или Escherichia.
При адаптации этого протокола к другим лабораториям могут возникнуть следующие проблемы (1) пластины кишечной палочки (образцы), подготовленные при неправильном соотношении разбавления, могут показывать неизменное количество клеток(рисунок 3 и рисунок 4) (2) Образцы, подготовленные без уплотнения пластины, могут показать чрезмерную усадку. Это может наблюдаться как дрейф клеток(рисунок 3) или вызвать потерюфокуса (рисунок 5) (3) Некоторые образцы могут проявлять медленное смещение "фиксированных" клеток (в черном) на фоне плавательных клеток (в белом). Это, вероятно, из-за мокрой образца, и это обычно стабилизируется, как избыток воды поглощается гель (Дополнительное видео 1) (4) Образцы, которые не проявляют никаких клеток после нескольких минут разогрева, возможно, были подготовлены неправильно, вероятно, из-за: (I) Гель был налил в то же время слишком жарко, (II) защитная крышка была забыта, (III) минимальные средства массовой информации не хватает ингредиента, (IV) неправильной плотности клеток, и (V) была запечатана слишком туго. Важно пробить отверстия, чтобы газозаменить за счетусадки геля (рисунок 5)и (VI) клетки могут также indent гель в поисках питательных веществ, укладка один на другой, ставя под угрозу монослой клетки эффективно предотвращения обнаружения клеток и измерения надежного флуоресцентного сигнала ( Дополнительныйрисунок 5).
Мы измерили три схемы в этой работе. Во-первых, составной промоутер, который регулирует GFP показано на рисунке 6. Во-вторых, составной промоутер, который регулирует супер-фолд GFP31 (SFGFP), показанный на рисунке 7. Тег деградации ssrA (AAV) был добавлен в SFGFP, чтобы уменьшить срок службы до5 минут. Третья схема основана на положительной схемеобратной связи 1, и индуцируется азил-гомозерин-лактон (AHL). PluxR промоутер регулирует SFGFP и LuxR, транскрипционный фактор связывания с AHL для активации PluxR, как показано на рисунке 8. На рисунке 9 представлена динамика роста клеток (число клеток по сравнению со временем), на рисунке 10 показана динамика измеренного сигнала (средняя флуоресценция по отношению к времени), а на рисунке 11 показана динамика оцениваемого общего шума (стандартное отклонение (ЗППП) по отношению к времени).
SNR (или CV) широко используется при проектировании аналоговых электронных схем, чтобы выразить точность и надежность цепи32. CV относится к распределению сигнала между одиночными ячейками и позволяет сравнивать между методами и различным оборудованием, таким как микроскопы и анализаторы потока. Расчет SNR из изображений микроскопа позволяет нам сравнивать схемы во времени, сегментированные ячейки измеряются одновременно с предоставлением измерения для конкретного разрешения шума по сравнению с сигналом, или интервал шума в течение определенного времени и концентрации индуктора. Это может указывать на то, смогут ли клетки-детекторы решить точную реакцию сигнала на концентрацию индуктора. В этой работе резюме было рассчитано с учетом всех сегментированных артефактов, которые являются ячейками, независимо от прогрессирования клеток в цикле деления. SNR был рассчитан для определенного диапазона области ячейки с течением времени, а затем он был усредн в течение трех повторных экспериментов. Ни приобретенный сигнал, ни ЗППП не являются надежными сами по себе, поскольку они специфичны для эксперимента и используемого оборудования. Сигнал измеряется произвольными единицами, которые зависят от оборудования получить предустановленной, фото-детектор и время экспозиции. Данные, представленные на рисунке 10, свидетельствуют о том, что этап деления ячеек не влияет на уровень шума, поскольку различные диапазоны областей (точки в цикле деления) показывают одинаковую тенденцию. Это наблюдение может поддержать утверждение о том, что отслеживания точных отношений между матерью и дочерью можно избежать для измерения шума, и это могло бы улучшить SNR для представленного метода. Никаких существенных изменений в SNR не наблюдалось между GFP к sfGFP, как показано на рисунке 12. Мы вычисляем SNR (среднее SNR/ STD) и представляем его на рисунке 12 и рисунке 13.
Затем мы вычислили дисперсию и резюме на основе следующихуравнений 31
1.1
1.2
В тех случаях, когда время складывания белка, T является время деления клеток, θ и μ количество плазмидов до и после деления, плазмидная копияномер 31. Используя вышеперечисленные уравнения (1.1 и 1.2), мы можем поместить данные из сигнала анализатора потока для гамма-распределения.
Затем мы сравнили между резюме, которое измеряется и рассчитывается анализаторомпотока (рисунок 14), и протоколом(рисунок 15).
Рисунок 1: Яркое изображение экспозиции поля (a) Стабилизированное приобретение вярком поле (b)Сегментация изображения, только цветные ячейки вводят расчеты (c) Пиксельная карта яркости приобретения, шип фоновый шум. Пороговые по нему сегменты только Escherichia coli. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Этот эксперимент показывает хорошие здоровые клетки деления и реагирования после 120 минут. Изображения приобретались последовательно с интервалом в 20 минут. Колонии находятся в фокусе, гель стабилен между пробами. Колонии делятся и производят сильные сигналы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Влияние неправильного соотношения разбавления и усадки геля на флуоресцентное изображение. Изображения были получены с интервалом в 20 минут(a) Индивидуальная кишечная палочка Escherichia, обведенная красным цветом(b)Одна и та же клетка дрейфует справа от полязрения( c) Клетка дрейфует дальше. Клетки также не делят и не меняют позиции, вероятно, из-за низкого соотношения разбавления и усадки геля. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: В этом эксперименте не было обнаружено никакой активности и почти не было клеток. Возможные причины геля слишком жарко, сушка образца слишком агрессивным или не имеющих защитной крышкой() Флуоресцентные изображения, сделанные на 40 минут (b) Флуоресцентные изображения, сделанные на 60 минут. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Фокус потери и фотоотвечивания. Последовательные изображения(a) через ( d )былиприобретены с интервалом в 15 минут с использованием автоматической фокус-системы. Смотрите дополнительное видео 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6:Плазмидная карта Pteto, которая регулирует GFP. Без TetR репрессатор, PtetO промоутер выступает в качестве составного промоутера. Схема клонирована на плазмидах с низким числом копий. Эта плазмида служит основой для измерения SNR для любой модифицированной схемы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 7:Плазмидная карта Pteto, которая регулирует SFGFP. SFGFP сливается с тегом деградации AAV. Схема клонирована на плазмидах с низким числом копий. SFGFP-AAV является более надежным вариантом GFP, в то время как тег AAV делает его восприимчивым к деградации по хозяйству proteases Escherichia coli. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 8: Плазмидная карта положительной обратной связи цепи. Схема индуцируется индуктором AHL, который связывает фактор транскрипции LuxR. Промоутер PluxR, который регулируется комплексом AHL-LuxR, активно работает в производстве LuxR и SFGFP-AAV. Схема клонирована на плазмидах с низким числом копий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 9:Динамика роста штамма Escherichia coli MG1655 в минимальных медиа включает в себя (a)PtetO-GFP,экспоненциальный рост около 35 минут. Изображения этого эксперимента показаны на рисунке 2 (b)PtetO-sfGFP, экспоненциальный рост около 35 минут. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 10: Уровень флуоресцентной интенсивности, нормализованный на пиксель и приобретенный с интервалом в 20 минут.
Клетки связаны в зависимости от области, чтобы свести к минимуму артефакты. Клетки делятся по площади в квадрате микрометра(a)Pteto-GFPцепи первого повторениядля интенсивности на 210 минут 0.004 a.u (b) PtetO-SFGFP цепи первого повторения для интенсивности на 210 минут 0.022 a.u (c) Измеренный сигнал Pteto-GFPцепи (d) Измеренный сигнал PtetO-sfGFP цепи. Все экспериментальные данные представляют собой в среднем три эксперимента. Программное обеспечение может сортировать область ячейки по различным группам(a) иb) показывают графики для четырех диапазонов области ячейки, представляющих цикл деления. Первая область в 14 микрометров представляет клетки после деления, как наиболее вероятно, что клетки после деления будет самым маленьким. Вторая область в 21 мкм представляет клетки перед делением. Третья и четвертая области представляют клетки в дележении, поскольку общая площадь умножается на две (29 и 36 мкм) для того, чтобы рассмотреть клетки, которые заняли больше времени, чтобы разделить. Области были выбраны путем ручной оценки данных, глядя на микроскопии изображений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 11:Стандартное отклонение (ЗППП) интенсивности одноклеточной флуоресценции для:(a ) PtetO-GFPцепи первого повторения ЗППП в 210 минут составляет 0,001865 a.u (b) PtetO-SFGFP цепи первого повторения для ЗППП на 210 минут 0,01477 a.u (c) ЗППП Pteto-GFPцепи ( d )ЗПППPtetO-SFGFP цепи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 12:SNR одноклеточной интенсивности флуоресценции. Мы вычисляем SNR-Mean/STD (a) PtetO-GFPцепи первого повторения для SNR на 210 минут 1.309 a.u (b) PtetO-SFGFP цепи первого повторения для SNR на 210 минут 1.29 a.u (c) Три повторения измерения GFP (d) Три повторения SFGFP измерения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 13:SNR одноклеточной интенсивности флуоресценции (a)PluxR-SFGFP цепи SNR для насыщения ответ на AHL (b) PluxR-SFGFP цепи SNR в течение половины времени ответ на AHL. SNR положительной обратной связи AHL регулируется схема выше, чем SNR для составной SFGFP цепи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 14: Гистограммы генных цепей на основе анализатора потока: экспериментальные данные (синие) и стохастические данные модели (красный). Ось x представляет произвольные флуоресценции единиц из цитометрии потока, и у оси представляет частоту клеток, производящих соответствующий уровень флуоресценции. Данные были измерены с помощью анализатора потока через три часа. Флуоресценция GFP была количественно оценена возбуждением на длине волны 484 нм и выбросом на длине волны 510 Нм. Для измерения уровней экспрессии GFP для измерения уровня экспрессии GFP использовались напряжения фильтра PE-TexasRed. Напряжения анализатора потока были скорректированы с помощью программного обеспечения, чтобы максимальные и минимальные уровни выражения могли быть измерены с теми же настройками напряжения. Таким образом, последовательное напряжение использовалось в каждом эксперименте. Те же напряжения использовались для последующих повторений того же эксперимента. Установка была сделана с помощью гамма-распределения31. Этот метод предполагает, что сигнал зависит в основном от случайного распределения плазмидов(a) Измерение Pteto-GFPклона на низкой плазмиде числа копий. Экспериментальный CV-0.46, Модель CV-0.32(b)Измерение Pteto-sfGFP-AAV клонировано на плазмиде номера низкой копии. Экспериментальный CV-0.86, Модель CV-0.44. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 15: Гистограммы генных цепей на основе микроскопа: экспериментальные данные (пунктирные линии) и стохастические данные модели (твердые линии). Ось x представляет произвольные флуоресценции единиц из перевернутого микроскопа и у оси представляет частоту клеток, производящих соответствующий уровень флуоресценции. Установка была сделана с помощью ГАММА-распределения MATLAB31,32 ( a ) Измерение клона PtetO-GFPна плазмиде номера низкой копии(b)Измерение PtetO-SFGFP-AAV клонировано на низком количестве копий. Сравнение показывает, что наш протокол получает те же значения резюме, что и в эксперименте по анализатору потока. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительная цифра 1: Четыре коэффициента разбавления, между 1:500 и 1:20, для штамма MG1655. График показывает, что если начальная плотность высока, LB питательные вещества в изобилии в результате чего клетки делятся быстрее. Для разбавления 1:500 плотность клеток оставалась неизменной. Для разбавления 1:100 плотность клеток увеличивалась медленно. Для разбавления 1:50 плотность клеток увеличивалась при умеренной скорости деления без значительной задержки в инкубации 250 об/мин. Для разбавления 1:20 плотность клеток быстро достигла насыщения. Мы выбрали коэффициент разбавления 1:30, что позволило короткой инкубации для достижения экспоненциального роста и существенного диапазона деления для достижения высокой насыщенности при умеренной скорости деления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру
Дополнительная цифра 2: Обработка ярких полевых изображений. a) Необработанныеизображения интенсивности данных из яркого полевого канала из микроскопной системы. b)Контрастные манипуляции с улучшением изображения для улучшения отделения объектов ячейки от фона. c) распознаваниеграниц ячеей на основе фильтра свертки33 и бинаризации на основе глобального порога34. d)Морфологические35 операций закрытия и заполнения для определения границ клеточной колонии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру
Дополнительная цифра 3: Сегментация ячейки колонии background'foreground. Чтобы свести к минимуму воздействие шума, мы пытаемся определить границы клеточной колонии и извлечь их из геля шума. a) Операциябинаризации изображений на повышение контрастности на основе адаптивного порога для обнаружения объектовячейки 36. b)Матрица мультиплетации матриц, представленных на S2d и S3a, успешно отфильтровывает большинство шумов и отличает гелевый шум от ячеек. Некоторые границы не полностью решены. c) Определениеграниц ячеев с помощью алгоритма водораздела37, основанного на преобразованиирасстояния 38. d)Матрица мультиплетации матриц, представленных на S3b и S3c, успешно разрешающих одиночные ячейки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру
Дополнительная цифра 4: Сегментация одной ячейки. а)Сегментированный продукт яркого полевого изображения. Дальнейшая очистка предварительно формируется на основе области ячейки gating и формы, отбрасывая круглые пузыри. b)сигнальныеизображения флуоресценции, полученные из микроскопа. c)Матрица мультиплетации матриц, представленных на S4a и S4b, успешно извлекает сигнал одиночных ячеек. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру
Дополнительная цифра 5: Потеря однослойного. a)Яркое полевое изображение клеточного слоя на 840 минут (14 часов) Pteto, которое регулирует схему GFP, показанную на рисунке 2 в статье как хороший эксперимент. На правой стороне микроскопии может быть обнаружена потеря монослойного изображения. b) изображение сегментации программного обеспечения. В связи с потерей монослой клетки фрагментированы и будут очищены базы на области gating. c)Флуоресценция изображения, показывающее, что на правой стороне изображения не могут быть решены клетки и низкий сигнал клеток на левой стороне изображения из-за потери монослоя. d) Сегментацияизображения в сочетании с изображением флуоресценции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру
Дополнительное видео 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео
Дополнительное видео 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео
Дополнительное видео 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео
cell_growth_rate_fit.m. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл
compare_experiments.m. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл
Count_Cells.m. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл
main_code.m. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой работе мы разработали протокол, который позволяет компьютерной трассировки Escherichia coli живых клеток, после деления и флуоресцентных уровней в течение нескольких часов. Этот протокол позволяет количественно оценить стохастичную динамику генетических схем в кишечной палочке путем измерения CV и SNR в режиме реального времени. В этом протоколе мы сравнили стохастичное поведение двух различных схем, как показано на рисунке 10. Было показано, что плазмиды с низким количеством копий более склонны к стохастическим эффектам и в меньшей степени подвержены воздействию деления клеток. Первая схема, составно выраженная GFP (Рисунок 10a), а вторая схема, составно выраженная sfGFP, сливается с тегом деградации ssrA(рисунок 10b). Для количественной оценки стохастичного поведения флуоресцентных белков мы также зафиксировали яркие полевые изображения. Результаты показывают, что выражение GFP, в частности, при его созревании39, является доминирующим источником шума. Периодическая модель поведения зубов, наблюдаемая на рисунке 10a, может быть объяснена случайным процессом деления клеток и долгосрочной шкалой созревания GFP (50 минут). В отличие от этого, сигнал SFGFP о втором замыкании стабилизировался во время измерения, так как очень короткое время созревания SFGFP (6 минут). Мы разработали простую формулу, которая описывает уровень GFP в обеих схемах, если рассматривать только процесс деления клеток и время созревания GFP. В данный момент времени, т, мы предполагаем, что Есть х копировать номера белков, μ копировать номера плазмидов. Номер копии протеина можно описать:
1.3
1.4
При рассмотрении только событий разделения; 
после созревания белка и так для конкретных плазмидов мы получаем:
Для GFP ( 
: 1.5
Для SFGFP ( 
:1.6
Затем разработана серия SFGFP:
1.7
В случае, 
если, мы получаем 
. Этот результат можно объяснить следующим образом. Когда x мал, уровни SFGFP увеличиваются на небольшое количество. Когда x большой, SFGFP деградирует до стабильного состояния. Аналогичным образом, для цепи GFP, каждая клетка содержит около 10 единиц GFP, но так как время созревания для GFP больше, чем митоз, унижающие пилы зуба наблюдаются накаливания флуоресценции. В модели мы предположили, что репликация плазмиды достаточно быстра, чтобы распределение плазмиды остается постоянным до и после деления. Тег деградации ssrA часто сокращает время полуимперии белка от часов доменее чем часа 5 и приводит к быстрому устойчивому состоянию. Мы показали, что метод также обеспечивает распределение, аналогичное тому, которое измеряется с помощью анализа потока населения, и что резюме этого распределения равно или меньше, чем cv анализатора потока.
Хотя несколькометодов 3,7,18 были разработаны для живой визуализации клеток, метод, представленный здесь специально для Escherichia coli. Эта бактерия требует специальных средств массовой информации и несколько иной подход. Протокол имеет следующие важные особенности: (1) Установление коэффициента разбавления, специфичного для бактерий и деформации в начале экспоненциального роста, а не на средней стадии (Экспоненциальный рост без встряхивания) (2) Escherichia coli лучше всего разделить на 37 градусов по Цельсию, но при 37 градусов по Цельсию минимальный медиа гель теряет воду быстро, что приводит к усадки и нестабильности. Протокол здесь преодолевает эту проблему (3) Мы сначала применить образец бактерий, а затем запечатать его жидким гелем. Так как образец находится в ловушке между стеклянным дном и гелем, мы требуем гель, который (I) позволяет газообмену, чтобы избежать резки воздушных карманов, (II) остается жидким при низких температурах, так как кишечная палочка Escherichia чувствительна к теплу и (III) гарантирует, что образец не будет смешан внутри жидкого геля. Гель остается жидким при 37 градусах Цельсия, тем не менее, мы рекомендуем использовать защитную крышку в верхней части образца, чтобы избежать чрезмерного тепла и смешивания образцов внутри геля (4) Этот подход требует простого, общего оборудования (5) Образцы могут быть измерены непосредственно без подогрева, так что нет потери событий деления (6) Протокол, который включает в себя шаги мокрой лаборатории и индивидуальное автоматизированное программное обеспечение, может быть использовано для изучения стохастичного поведения генетических схем, таких как количественная оценка сигналов SNR. Мы сравнили метод микроскопии с результатами анализатора потока, чтобы проверить использование небольших популяций клеток и установить базовый уровень для сравнения в соответствии с CV (7) Программное обеспечение позволяет нам обнаруживать клетки на монослой без вмешательства человека и анализировать общий шум. Программные средства, такие как ImageJ18 или Schnitzcells требуют ручной идентификации ячеек и являются сложными для корректировки.
При непрерывном изображении колоний живых клеток, разработать эксперимент при рассмотрении нескольких сложных физических параметров, таких как клеточный стресс и токсичность, скорость истощения ресурсов, некроз и время деградации индукторов и химических веществ. Протокол позволяет надежно измерять до пяти часов. Наши эксперименты показывают, что Escherichia coli синхронизировать при делении в микро, монослойныхколоний (Дополнительное видео 3). Мы предполагаем, что гель однороден с точки зрения ресурсов и прочности, клетки имеют аналогичное поведение, а поле освещения немного больше с поля зрения. Таким образом, каждая ячейка должна производить те же данные сигнала и статистические данные, которые могут быть собраны, как мы показали, сравнивая резюме, полученное таким образом, для измерения с анализатором потока. Для того, чтобы измерить шум в постоянных начальных условиях в течение более длительных периодов времени, мы рассмотрим возможность использования микрофлюидных чипов в будущем. Дальнейшими преимуществами такого устройства являются поддержание фиксированного положения ячеек и стабильный фокус10. Тем не менее, дизайн, изготовление микрофлюидных чипов и грунтовка для экспериментов требуют обучения, специального оборудования (на заказ в разы) и времени. По этой причине, полезно использовать микроскопию промежуток времени, как показано в этом протоколе, чтобы получить общее понимание схемы.
Предлагаемый протокол и разработанное программное обеспечение позволяют воспроизводить измерения, из которых просто получить графики. Он также позволяет тестировать и сравнивать общий шум и может быть изменен для измерения внутреннего и внешних шумов. Метод основан на общих или простых в заказе материалах, открыто общих, простых в использовании программ и не требует конкретной подготовки. Мы показали, что популяция, измеряемая микроскопией, достаточно велика, чтобы получить значимые данные, сравнив метод CV с полученным с анализатором потока. Таким образом, мы можем успешно установить базовый уровень SNR с помощью этого протокола и сравнить его с более сложными схемами генов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторов нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим г-на Гила Гелберта (факультет электротехники, Technion) за помощь в разработке кода MATLAB. Мы благодарим д-ра Симин Ли (факультет био-медицинской инженерии, Technion) за помощь в проверке этой статьи. Это исследование было частично поддержано Фондом семьи Нойбауэр и Министерством науки Израиля, грант 2027345.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35mm glass dish | mattek | P35G-0.170-14-C | thickness corresponding with microscope lense. |
| Agarose | Lonza | 5004 | LB preperation |
| AHL | Sigma-Aldrich | K3007 | inducer |
| Bacto tryptone | BD - Becton, Dickinson and Company | 211705 | LB preperation |
| Carb | Invitrogen | 10177-012 | antibiotic |
| Carb | Formedium | CAR0025 | antibiotic |
| Casamino acids | BD - Becton, Dickinson and Company | 223050 | minimal media solution |
| eclipse Ti | nikon | inverted microscope | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | minimal media solution |
| Glyserol | Bio-Lab | 000712050100 | minimal media substrate |
| Immersol 518F | zeiss | 4449600000000 | immersion oil |
| M9 salt solution | Sigma-Aldrich | M6030 | minimal media solution |
| NaCl | Bio-Lab | 214010 | LB preperation |
| Noble agar | Sigma-Aldrich | A5431 | minimal media substrate |
| parafilm tape | Bemis | PM-996 | refered to as tape in text |
| Seaplaque GTG Agarose | Lonza | 50111 | minimal media substrate |
| thaymine B1 | Sigma-Aldrich | T0376 | minimal media solution |
| Yeast Extract | BD - Becton, Dickinson and Company | 212750 | LB preperation |
References
- Daniel, R., Rubens, J. R., Sarpeshkar, R., Lu, T. K. Synthetic analog computation in living cells. Nature. 497, 619-623 (2013).
- Yang, X. S. Y., L, A. B. Imaging Bacterial Molecules, Structures and Cells. Harwood, C., Jensen, G. , (2016).
- Joyce, G., Robertson, B. D., Williams, K. J. A modified agar pad method for mycobacterial live-cell imaging. Biomedcentral Research Notes. , (2011).
- Cotlet, M., Goodwin, P. M., Waldo, G. S., Werner, J. H. A comparison of the fluorescence dynamics of single molecules of a green fluorescent protein: One- versus two-photon excitation. ChemPhysChem. , (2006).
- Andersen, J. B., et al. New unstable variants of green fluorescent protein for studies of transient gene expression in bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 64, 2240-2246 (1998).
- Barger, N., Litovco, P., Li, X., Habib, M., Daniel, R. Synthetic metabolic computation in a bioluminescence-sensing system. Nucleic Acids Research. , (2019).
- Young, J. W., et al. Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy. Nature Protocols. , (2012).
- Swain, P. S., Elowitz, M. B., Siggia, E. D. Intrinsic and extrinsic contributions to stochasticity in gene expression. Proceedings of the National Academy of Science United States. , (2002).
- Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic gene expression in a single cell. Science. , (2002).
- Baumgart, L., Mather, W., Hasty, J. Synchronized DNA cycling across a bacterial population. Nature Genetics. , (2017).
- Arriaga, E. A. Determining biological noise via single cell analysis. Analytical and Bioanalytical Chemistry. , (2009).
- Nielsen, A. A. K., et al.
- Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. Regulation of noise in the expression of a single gene. Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).
- Pedraza, J. H., Van Oudenaarden, A. Noise propagations in gene networks. Science. , (2005).
- Jennifer, A. N. B., Christopher, A. V.
- Aoki, S. K., et al. A universal biomolecular integral feedback controller for robust perfect adaptation. Nature. , (2019).
- Hanna, H. A., Danial, L., Kvatinsky, S., Daniel, R. Cytomorphic Electronics with Memristors for Modeling Fundamental Genetic Circuits. 4545, (2020).
- de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. W. Live cell imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using automated time-lapse microscopy. Journal of Visualized Experiments. , (2011).
- Eling, N., Morgan, M. D., Marioni, J. C. Challenges in measuring and understanding biological noise. Nature Reviews Genetics. , (2019).
- Thattai, M., Van Oudenaarden, A. Attenuation of noise in ultrasensitive signaling cascades. Biophysical Journal. , (2002).
- Thattai, M., Van Oudenaarden, A. Intrinsic noise in gene regulatory networks. Proceedings of the National Academy of Science United States. , (2001).
- Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene regulation at the single-cell level. Science. , (2005).
- Van Der Ziel, A. Noise in Measurements. , Wiley & Sons Inc. (1976).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. , (1989).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: Image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. , (2006).
- Paintdakhi, A., et al. Oufti: An integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis. Molecular Microbiology. , (2016).
- Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis. Nature Microbiology. , (2016).
- Stylianidou, S., Brennan, C., Molecular, S. B. N. SuperSegger: robust image segmentation, analysis and lineage tracking of bacterial cells - Stylianidou - 2016 - Molecular Microbiology. , Wiley Online Library. (2016).
- Balomenos, A. D., et al. Image analysis driven single-cell analytics for systems microbiology. Biomedcentral System Biology. , (2017).
- Smit, J. H., Li, Y., Warszawik, E. M., Herrmann, A., Cordes, T. Colicoords: A Python package for the analysis of bacterial fluorescence microscopy data. PLoS One. , (2019).
- Guido, N. J., et al. A bottom-up approach to gene regulation. Nature. , (2006).
- Beal, J. Signal-to-noise ratio measures efficacy of biological computing devices and circuits. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. , (2015).
- Marr, D., Hildreth, E.
- Otsu, N. Threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Transactions Systems Man Cybernetics. , (1979).
- Soille, P. Morphological Image Analysis: Principles and Applications, Second edition. , (2000).
- Bradley, D., Roth, G. Adaptive Thresholding using the Integral Image. Journal of Graphics Tools. , (2007).
- Meyer, F. Topographic distance and watershed lines. Signal Processing. , (1994).
- Maurer, C. R., Qi, R., Raghavan, V. A linear time algorithm for computing exact Euclidean distance transforms of binary images in arbitrary dimensions. IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine. , (2003).
- Millo, R., Phillips, R. What is the maturation time for fluorescent proteins. Cell Biology by Numbers. , (2015).
