Summary
この研究は、合成遺伝子回路の確率的挙動の分析と定量化のために 、大腸菌 の単一細胞の生画像化を可能にする顕微鏡法を提示する。
Abstract
ここで開発されたプロトコルは、数時間にわたって 大腸菌 部門と蛍光レベルのコンピュータ追跡を可能にするツールを提供しています。このプロセスは、正しいプラスミドを抱える 大腸菌 だけが特定の条件で繁栄することができると仮定して、最小限の媒体で生き残るコロニーのスクリーニングから始まります。多くのDNA部品の組み立てを必要とする大規模な遺伝子回路を構築するプロセスは困難であるため、回路部品は、多くの場合、いくつかの抗生物質の使用を必要とする異なるコピー番号で複数のプラスミド間で分布しています。プラスミドの突然変異は、抗生物質耐性遺伝子の転写を破壊し、壊死につながる細胞内の資源管理と介入する可能性がある。選択されたコロニーはガラス底のペトリ皿にセットされ、明るい分野および蛍光領域の両方の顕微鏡追跡のためにいくつかの焦点面が選ばれる。このプロトコルは、規制できない初期条件下で 12 時間以上画像のフォーカスを維持し、いくつかの困難を生み出します。例えば、死んだ細胞は、数時間のイメージングの後にレンズの焦点分野に蓄積し始め、毒素が蓄積し、信号がぼやけて減衰する原因となります。栄養素の枯渇は、新しい代謝プロセスを導入し、回路の所望の応答を妨げます。実験の温度は、誘導剤および抗生物質の有効性を低下させ、信号の信頼性をさらに損なう可能性がある。最小のメディアゲルが収縮し、乾燥し、その結果、光学的焦点は時間の経過とともに変化します。我々は、他の微生物に対する類似法を開発した以前の作品と同様に、 大腸菌でこれらの課題を克服するためにこの方法を開発しました。さらに、この方法は、変化しない細胞および変化した細胞の総確率的ノイズを定量化するアルゴリズムを提供し、同様の変動係数(CV)で示されるように、結果がフローアナライザ予測と一致していることを発見する。
Introduction
合成生物学は、過去10年間に出現した学際的な分野であり、工学設計原理を合理的な生物学的設計1、2、3に変換し、基本科学4、5、診断、治療およびバイオテクノロジーアプリケーション6、7、8、9、10を理解するために、生体細胞における多信号統合と処理を達成することを目指しています。合成遺伝子回路の入力出力応答を定量化する当社の能力は、自動タイムラプス顕微鏡11を用いたフローアナライザやライブセルイメージングを含む単細胞技術の最近の進歩によって革命化されている。フローアナライザは、定常状態1、12においてこれらの回路の応答を測定するためによく使用され、反転顕微鏡は、単一細胞3のレベルでの合成遺伝子回路の動的応答を測定するために使用される。例えば、合成生物学の初期の研究の1つは、遅延3を伴う負のフィードバックループを使用して生きている細胞における遺伝的発振器ネットワークの構築を含んでいた。その後、生細胞4の動的環境における代謝制御を理解するために、遺伝的発振回路を適用した。自動時間経過顕微鏡は、このような回路を特徴付ける方法の1つです。我々は、宿主細胞である大腸菌がマイクロコロニーを形成する際に同期し、正確な母娘関係を追跡することなく、信号の測定とノイズの計算を可能にすることを仮説とする。
ノイズは、多くの場合、複数のソースから生じる生物学的システムの基本的な、固有の側面です。例えば、タンパク質13の拡散のような離散的なランダムキャリアの輸送に由来するシグナルを含む生化学的反応を考えてみましょう。これらの信号はランダムな変動14で伝播する。その他のノイズ源としては、資源の利用可能性、細胞分裂、温度、湿度、圧力などの環境条件の変動があります。合成遺伝子回路で伝播する生体信号は、多くの場合、このような回路の性能を乱す非常に低い信号対雑音比(SNR)を有する。したがって、遺伝子回路設計は、遺伝子工学15の最も困難な側面の1つです。例えば、平均遺伝子発現のみを計算する(細胞全体の母集団にわたって測定される)ほとんどのアプローチとは対照的に、測定されたシグナルの分散は、合成遺伝子ネットワーク12を介して予測可能な行動を設計するために考慮される。したがって、タンパク質発現における変動性またはノイズのレベルは、アナログおよびデジタル遺伝子回路1、16、17の設計と性能において支配的な役割を果たす。
大腸菌3、7、18を含む細胞間変動を定量化するために多くのアプローチが開発されている。これらの方法は、遺伝子の活性化と代謝経路を研究するためによく使用されるが、特にこれが基本的な課題である生細胞における遺伝的回路に対して、特定のノイズ源の測定や分断のような確率的ノイズダイナミクスの研究にあまり焦点を当てずに使用される。いくつかの要因は、回路自体に継承され(組み込み)、宿主細胞(外因)から派生し、遺伝的回路の連続的な性能を乱す可能性があります。本論文では、固有および外因性ノイズ源6,22を含む大腸菌細胞の全雑音を定量化することを目的としたプロトコルを開発した。全ノイズを定量化し、SNR23を評価することで、遺伝子回路の設計を改善することができます。この方法は、いくつかの蛍光タンパク質6,20を監視することにより、独立したノイズ源を別々に測定するように改変することができる。ここで説明するプロトコルについては、環境条件を十分に制御し、外部要因の影響を受けることなく細胞の活性を継続的に測定します。一つの細胞内の蛍光タンパク質からのシグナルを時間の経過とともに測定し、同時にアガロース基板の下で画像化します。結果の画像は実験室のカスタムMATLABを使用して分析される。
理想的には、細胞内の蛍光タンパク質のリアルタイム活性を連続的に測定すると、細胞の増殖と分裂を通じて正確なデータが生成されます。しかし、そのようなデータを取得することは困難です。これは、励起プロセスで放射線にさらされたときの蛍光タンパク質(光漂白7)の分解によるものです。さらに、 大腸菌 細胞も興奮に敏感であり、光毒性7を引き起こしうる。どちらの問題でも、取得できるフォトフレームの量と取得までの時間が制限されます。イメージング中に細胞を増殖させるために使用される基質および培地タイプ(例えば、リソゲニーブロス)も重要な役割を有する。蛍光性を最小限に抑え、細胞分裂時間を延長する最小限の培地を使用することを強くお勧めします。
さらに、サンプルは、以下の要件を考慮して調製する必要があります(1)低細胞分割率は、分割サイクルを密接にイメージングし、光毒性および光漂白の確率を低減するためのより少ない頻度の露出を可能にします。(2)実験の初めに、取得時間を約半分のマイルス化時間(2)低い細胞密度に設定することで、分裂の均一性と追跡性を向上させます。細胞密度は、このプロトコルの成功のための重要なパラメータであり、すべてのラボのために決定する必要がある 大腸菌 細胞の希釈比の影響を受けます。比率を確立するために、新しい 大腸菌 株または使用される媒体のそれぞれは、成長率グラフを取り付ける必要があります(補足図1)。OD600nm = 0.1程度の初期密度から短いインキュベーション後に細胞が追加の揺れなしで成長できる場合、適切な比率が達成されました。この段階での細胞は、環境温度のみに応じて分裂する(3)細胞の動きの制限:細胞の動きは基質(アガロースパッド)の硬さに強く依存する。基材のハリは、総アガロースの量とゲル凝固時間に依存します。 エシェリヒア大腸菌 は有糸分裂を起じるように、ゲルを室温で一晩固化させることはできません。基板の安定性に影響を与える他の要因は、サンプルおよび湿度中の水の量を含む。その他の問題については、「代表結果」で詳しく説明します。このプロトコルは、多くの詳細を提供し、徐々に別のステップから移動します。このプロトコルは、イメージング実験に長い安定性を提供し、基本的な画像処理ツールを提供します。
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Protocol
1.メディアと文化の準備
- 1,000xカルベニシリン(50mg/mL)または関連する抗生物質のストック溶液を調製する。
- .カルベニシリンの重量を0.5g。滅菌H2 O.の10 mLを加える完全に溶解します。
- 0.22 μmシリンジフィルターを使用してカルベニシリンストックを殺菌します。抗生物質溶液をアリコートし、-20°Cで貯蔵する。
- リソゲニーブロス(LB)プレートを調製するには、トリプトン5g、NaCl5g、酵母エキス2.5g、バクト寒天7.5g、0.5Lの無菌H2O.オートクレーブで溶液を121°Cで20分間混ぜます。
- 溶融ゲル混合を50°Cの水浴に部分的に浸す。カルベニシリン(50mg/mL)を1,000μL加えます。
- 滅菌環境でペトリ皿を準備します。冷蔵庫に保管する前にプレートをセットしておきなさい。
- M9の最小媒体の場合は、M9塩5x(56.4 g/L)、2Mグルコース、2%ビオチンフリーカザミノ酸の別々のストック溶液を調製してください。121°Cで20分間、ソリューションをオートクレーブします。
- 5ペトリプレートを調製するには、低融解寒天の1125mgと寒天400mgを最小限の培地(1x M9)の89.2 mLと混合します。250 mL のエルレンマイヤーフラスコに2%カザミノ酸(2%[vol/vol])の10 mLを加えます。
注:フラスコの内側の唇にメディアを注ぐことを確認してください。 - 3~4秒の短いバーストで溶液をマイクロ波します。解がクリアになるまで繰り返します。
注:沸点に達しないようにしてください。 - 250 mL のエルレンマイヤーフラスコを温水浴(60°C)に入れて拡散してさらに混ぜ、温度が約45~50°Cになるまで冷まします。
- プレートを注ぐベンチで炎を点灯します。
- すべてのソリューションを次の順序ですばやく追加します。
800 μL の 50% グリセロール (0.4% [vol/vol])
チアミン(B1)の100 μL
1100 μL のグルコース (2M)
カルベニシリン100μL(50mg/mL)。 - アーレンマイヤーフラスコを旋回して、寒天全体のすべての成分の均等な分布を確保します。
- 炎の隣に一度に1枚のプレートを開け、注ぎ始めます。
- プレートを最初の固化するまで数分間ベンチに置いたままにしておきます。
- 水の凝縮がゲルに滴り落ちないように、プレートを逆さまにします。
- プレートを室温で約2時間固化したままにしておきます。
- プレートが固まり乾燥したら、4°Cで約3ヶ月間保存することができます。
2.細菌株およびプラスミドの構造
注:遺伝的回路は、1つの部分が含まれています。Pテトオ プロモーターによって駆動される緑色蛍光タンパク質(GFP)で、構成的な発現を生じる。この研究における全てのプラスミドは、基本的な分子クローニング技術を用いて構築され、 エシェリヒア・コリ 10βに変換され、標準のヒートショックプロトコル24を用いた。最終的な構造はテストのために 大腸菌 MG1655野生型株に変換されました。
- 標準のヒートショックプロトコル24で、所望のプラスミドを大腸菌MG1655細胞に変換する。
- LB寒天プレート上の形質転換細胞を37°Cで一晩成長させます。
注:ペトリ皿はステップ2.2から顕微鏡使用のために3日まで保つことが可能です。 - 単一コロニーを5 mLのLBスープに接種し、関連する抗生物質をガラス管に含める。
- 液体が濁るまで2時間インキュベーターで250rpmの揺れの速度で37°Cで細胞を成長させます。
- 次のように希釈液の1 mLを準備します。
最小メディアの892 μL(1x M9)
グリセロール50%8 μL(0.4%[vol/vol])
100 μL の 2% カザミノ酸 (0.2% [wt/vol])
チアミン(B1)の1 μL
11 μL のグルコース (2 M)
関連する抗生物質の1 μL- ミックスしてスピンダウンします。
- ステップ2.4から2mLチューブに細胞培養液(1:30)を希釈し、30μLの 大腸菌 成長を希釈液1000μLに加えます(ステップ2.5)。
- 37°Cで振る(250rpm)でチューブを1時間インキュベートします。
- ステップ1.10で調製したM9プレート上で40 μL - 60 μLを成長させます。プレートを一晩37°Cでインキュベートします。
注: めっきの光密度 (OD600nm)は 0.1 前後である必要があります。 - 35mmのガラス底板を3枚までベンチに置きます。
メモ:プレートのガラスの厚さが、使用されている顕微鏡レンズに適していることを確認してください。 - ゲルプレートに播種するための培養を準備し、ステップ2.9顕微鏡測定で調製したプレートからコロニーについてステップ2.3〜2.6を繰り返す。
- 3つの顕微鏡プレートを作るために、次の溶液を準備します。
- 水浴を60°Cに予熱する。
- 低融解寒天の112.5mgと寒天40mgを8.92mLの最小限の培地(1x M9)と混ぜ、25mLのエルレンマイヤーフラスコに2%のカザミノ酸(0.2%[vol/vol])の1 mLを加えます。
注:フラスコの内側の唇にメディアを注ぐことを確認してください。
- 2~3秒の短いバーストで溶液をマイクロ波します。解がクリアになるまで繰り返します。
メモ:沸点に達しないように注意してください。 - 25 mL のエルレンマイヤーフラスコを温水浴(60°C)に入れて拡散してさらに混合し、温度が約45~50°Cになるまでベンチで冷却します。
3.アガロースパッドの作成
- 70%エタノールのクリーンベンチ。クリーニングされたベンチの伸張テープ。テープが滑らかで、平らになっていることを確認します。
- テープに1つ、近くに2つカバーリップを用意します。カバーリッドを準備します。
- 水浴からフラスコ(ステップ2.14で準備)を取り出し、フラスコの外側をきれいに拭き取り、温度が約45〜50°Cになるまで冷却します。
- ゲル溶液を作るために、次の順序ですべての溶液を素早く混ぜます:
グリセロール50%80μL(0.4%[vol/vol])
2%カザミノ酸の1 mL(0.2%[wt/vol])
チアミン(B1)の10 μL
110 μL のグルコース (2 M)
関連する抗生物質の10 μL。 - カバースリップにゲル1.5mLを注ぎ、2枚目の「サンドイッチ」で覆います。
- エルレンマイヤーを湯風呂に戻します。蓋でサンドイッチを覆い、タイマーを20分間セットします。
- 同時に、37°Cでステップ2.11から1時間(250rpm)でチューブをインキュベートする
- 20分後にサンドイッチをひっくり返し(ステップ3.5)、それを覆い、1時間休ませます。
注意:より良い結果のためにステップ3.8の間4 °Cで休むために「サンドイッチ」を残します。 - 種子 エシェリヒア大腸菌 は、35ミリメートル皿にサンプルをピペットすることによってステップ3.7から培養します。
注:細胞の6 μLを別々の小さな滴としてピペット処理すると、最良の結果が得られます。 - 滴を少なくとも15分間、最大30分間乾燥させます。
- ステップ3.8からサンドイッチの固化ゲルを、カバースリップを滑り落とすことによって露出させる。
- 生検パンチまたはチップでサンドイッチを小さな個々のパッドにカットします。
- サンプルにやさしく傾きます(ステップ3.9)。皿をベンチに20分間置いておきなさい。
4.顕微鏡イメージング用サンプルの準備
- ステップ3.6から水浴からフラスコを取り除きます。フラスコの外側をきれいに拭き、室温(25°C)まで冷まします。
メモ:タイマーが終了する約3分前にステップ4.1でフラスコを取り外します。 - 円運動でプレート周囲にゲルの3mLを絶えず注ぎます。数分間固めるために残します。
- テープでプレートをシールし、25 G針で穴を開けます。水の凝縮がゲルに滴り落ちるのを防ぐために、すべての皿を反転させます。
- 4°Cで全ての料理を30分間インキュベートし、細胞の糸球菌を防ぎながら完全な固化を可能にします。
注:連続測定のために4°Cにサンプルを残し、1日以下。 - メーカーの指示に従って顕微鏡を起動します。
- 最も低い増幅レンズを使用して初期フォーカスを見つけ、自動フォーカスシステム(AFS)をエンゲージします。
- 必要に応じてオイルを使用し、オイルでレンズを溺れ、プラットフォームコントローラ(手動ではない)でプレートを移動することによって慎重に広げ、AFSは再び従事することができます。
- Z ステップ断面の既定の提案に従って、Z 方向の相対断面を使用します。
注:5分ごとに明るいフィールド画像と20分ごとに蛍光画像を撮影しました。場合によっては、最初の 30 分間にフォーカスを調整する必要があります。顕微鏡インキュベーターボックスとオイルを予熱しながら、サンプルを冷蔵しながら、焦点の初期損失を減らすのに役立つ傾向があります。
5.データ分析
メモ:顕微鏡データを処理するために、MATLABでコンピュータベースのソフトウェアを設計しました。このソフトウェアは、明るいフィールドのtiff画像とセグメントからの細胞境界の識別を容易にし、領域によって細胞をソートします。この画像解析の出力は、蛍光TIFF画像のマスクとして使用して、細胞の強度レベルを導出し、顕微鏡の分解能限界による細胞ハローなどの蛍光領域のアーチファクトを取り消すことができます。開発されたソフトウェアは、同様の作品7、25、26、27、28、29、30からインスピレーションを得て、ラボに合わせたエレガントなソリューションを提供します。
- まず 、main_code.mで次のパラメータを定義します。
- 取得イメージのフォルダを定義します。
- イメージの時間の期間を定義する - 明るいフィールド チャネルの時間ステップ (分単位)。
- GFP イメージの取得速度 - GFP 周波数を定義します。
- 顕微鏡の解像度を定義します(つまり、1 μmのピクセル数)。
- ヒストグラムビン範囲 - セル領域範囲を定義します。
注: 細胞領域に従ってデータを分類するプロセスは、フローサイトメトリーデータ分析における格数化の原理に似ています。ゲートは、通常は前方散乱し、側面が散乱し、関心のあるこれらの集団を分離して定量化するために、共通の特性を持つ細胞の集団の周りに配置されます。顕微鏡検査は、ゲート、調査、いくつかの細胞群を定量化することができます。 - 畳み込みカーネル (3,3) を定義する - このパラメータは、グローバルなしきい値(count_cells.m)によってセル境界を検出します。
注: このセットアップは、ラボまたは顕微鏡を交換する場合にのみ必要です。ソフトウェアでは、入力明視野チャンネルにインデックスc1、c2とラベル付けされた蛍光チャネルが必要です。
- main_code.m を実行すると、他のすべてのスクリプト (count_cells.m、 cell_growth_rate.m) が自動的に実行されます。
- プログラムは、明視野画像を自動的にセグメント化します( 補足図2-4を参照)。
- セグメンテーション画像と蛍光画像(GFP)を組み合わせて、細胞あたりの強度レベルを抽出します。
- 時間によって細胞の量のグラフを計算し、指数的な成長に応じてフィットします。
- 各セル領域の範囲の平均と標準偏差 (STD) を計算します。
- 各セル領域の範囲に対する信号対雑音比(SNR)を計算します。
- 強度別のセル量の分布をプロットして適合させます。
- 分散係数 (CV) を計算し、フローアナライザデータと比較します。
注:ソフトウェアは、新しいフォルダ「あなたのフォルダ/セグメント化」でconv_kernelを調整するための最終的なセグメンテーション画像を出力として提供します。ソフトウェアは、新しいフォルダ「あなたのフォルダ/グラフ」内のグラフを出力として与えます。
- 実験を比較するには 、compare_experiments.mを使用します。
- 保存されたグラフのディレクトリと \CompareResult ディレクトリのアドレスを定義します。
- ファイルを実行します。
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Representative Results
ソフトウェアは、オフホワイトとブラックの明るいフィールドドメイン画像を分析します。 大腸菌 は、オフホワイトの背景に黒い楕円形のように見え、輝度のダイナミックレンジは、その中心にスパイクを示す必要があります(図1)。蛍光画像では、細胞は小さなハローを有するが、楕円形の個々の細胞はまだ解決することができる。有糸分裂イベントは、最初に30分後に検出される必要があります。顕微鏡の焦点は時間の経過とともに安定している必要があり、細胞はこれらの30分間にゆっくりと動くかもしれませんが、視野を離れる可能性は低いです。このような実験は良いと考えられ、 図2で見ることができます。低倍率で明視野領域で細胞を検出するのは難しい場合があります。高いコピー数(HCN)プラスミドで平均焦点距離を確立することをお勧めします。低コピー数(LCN)プラスミドを高倍率で事前に測定しながら、平均距離を設定します。この焦点距離は、主にプレート、顕微鏡システムおよび油、ゲルまたは 大腸菌 株の厚さではないに依存します。
このプロトコルを他のラボに適応させると、(1)誤った希釈比で調製した(1)大腸菌プレート(サンプル)が、不変の細胞数を示すことができる(図3および図4)(2)プレートを密封せずに調製したサンプルは過度の収縮を示すことができる。 これは、細胞がドリフト(図3)として観察されたり、焦点の喪失を引き起こしたりする(図5)(3)一部のサンプルは、泳動細胞の背景(白色)にゆっくりと変化する「固定」細胞(黒色)を示す場合がある。これは、湿ったサンプルが原因である可能性が高く、過剰な水がゲル(補足ビデオ1)(4)数分後に細胞を示さないサンプルが誤って調製された可能性があるため、通常は安定します:(I)ゲルはまだ熱すぎる間に注がれた、(II)保護キャップが忘れられ、(III)最小限の培地は成分を欠き、(IV)誤った細胞密度、(IV)ゲルが密に密閉された。ゲル収縮を犠牲にしてガス交換を可能にする穴を開けるのが重要です (図 5) および (VI) 細胞は、栄養素を求めてゲルをインデントし、一方を他方の上に積み重ね、細胞の検出を効果的に防止し、信頼性の高い蛍光シグナルの測定を効果的に細胞単層に妥協します(補足図 5)。
今回の研究では3回路を測定しました。まず、図6に示すGFPを調節する構成的なプロモートレーター。第2に、図7に示す超倍級GFP31(sfGFP)を調節する構成的なプロモートレーターである。ssrA 劣化タグ (AAV) をsfGFP に追加して、半減期を5分に減らしました。第3回路は、正帰還回路1に基づいており、アシルホモセリンラクトン(AHL)によって誘導される。PluxRプロモーターは、図8に示すようにP luxRを活性化するためにAHLと結合する転写因子であるsfGFPおよびLuxRを調節する。図9は細胞増殖のダイナミクス(細胞数対時間)を示し、図10は測定された信号のダイナミクス(平均蛍光対時間)を示し、図11は評価された全雑音(標準偏差(STD)対時間のダイナミクスを示す)
SNR(またはCV)は、回路32の精度と信頼性を表現するアナログ電子回路の設計に広く使用されている。CVは単一細胞間の信号分布に関し、顕微鏡や流量分析装置などの方法や装置間での比較を可能にします。顕微鏡画像からSNRを計算することで、時間をまたいで回路を比較することができ、セグメント化された細胞は、信号と比較してノイズの特定の解像度の尺度を提供することと同時に測定されるか、または特定の時間および誘導器濃度のノイズ間隔を提供する。これは、検出器細胞が誘導体濃度に対する正確な信号応答を解決できるかどうかを示す可能性がある。本研究では、CVは、分割周期における細胞の進行に関係なく、細胞である全てのセグメント化されたアーチファクトを考慮して計算した。SNRは、時間の経過に関する特定の細胞領域範囲について計算し、次いで3回の繰り返し実験のために平均化した。取得した信号もSTDも、使用する実験や機器に固有のものであるため、単独で信頼性が高い信号ではありません。信号は装置の利得の事前設定、光検出器および露出時間に依存する任意の単位で測定される。図 10に示すデータは、異なる面積範囲(除算サイクル内のポイント)が同じ傾向を示すため、除算サイクルのセル ステージがノイズ レベルに影響しないことを示しています。この観察は、正確な母親と娘の関係を追跡することは騒音を測定するために避けることができるという主張を支持するかもしれないし、これは提示された方法のSNRを改善するかもしれない。図 12に示すように、GFP からsfGFPへの SNR の実質的な変化は認められなかった。SNR (SNR= 平均/STD) を計算し、図 12および図 13に示します。
次に、以下の式に基づいて分散とCVを計算します。
1.1
1.2
ここで λ はタンパク質折りたたみ時間 、T は細胞分裂時間 、θ 及び μ は分裂前後のプラスミド数であり、プラスミドコピー番号31である。上記の式(1.1、1.2)を使用して、ガンマ分布のためのフローアナライザ信号からのデータを適合させることができます。
次に、フローアナライザ(図14)によって測定および計算されるCVとプロトコル(図15)を比較した。
図1:明視野露光画像(a)明視野(b)セグメンテーション画像での取得安定化、色付きセルのみが計算に入り(c)取得のピクセル明るさマップ、スパイクがバックグラウンドノイズである。それによってしきい値は、唯一の大腸菌をセグメント.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2: この実験は、正常な細胞が120分後に分裂し反応することを示しています。画像は20分間隔で連続的に取得した。 コロニーは焦点を合わせ、ゲルはサンプリング間安定である。コロニーは分裂し、強いシグナルを生成します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:誤希釈比とゲル収縮率が蛍光画像に及ぼす影響画像は20分間隔(a)赤で囲まれた個々の大腸菌(b)同じセルが視野の右側に漂う(c)細胞がさらにドリフトする。細胞はまた、おそらく低い希釈比とゲル収縮のために、位置を分割または変更しません。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4: この実験では活性が検出されず、細胞がほとんど存在しなかった。 考えられる理由は、ゲルが熱すぎる、サンプルの乾燥が攻撃的すぎるか、または保護キャップを持っていない(a)40分で撮影された蛍光画像(b)60分で撮影された蛍光画像である。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5: フォーカス損失とフォトブリーチ(a)から (d) までの連続画像は、オートフォーカスシステムを用いて 15 分間隔で取得した。補足ビデオ 2を参照してください。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6: GFPを調節するPテトのプラスミドマップTetRリプレッサーがなければ、Pテトオプロモーターは構成プロモーターとして作用する。回路は、低コピー数プラスミド上でクローン化されます。このプラスミドは、任意の変更回路のSNR測定の基礎として機能します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7: SFGFPを調節するPテトのプラスミドマップsfGFP は AAV 劣化タグに融合されます。回路は、低コピー数プラスミド上でクローン化されます。SfGFP-AAVはGFPのより堅牢な変種であり、AAVタグは大腸菌のハウスキーピングプロテアーゼによる劣化の影響を受けやすい。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図8: プラスミドマップの正帰還回路 回路は、LuxR転写因子を結合するAHLインデューサーによって誘導される。AHL-LuxR複合体によって調節されるPluxR プロモーターは、LuxRおよび sfGFP-AAVの生産を活性する。回路は、低コピー数プラスミド上でクローン化されます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図9:最小培地における大腸菌MG1655株の成長のダイナミクスは、(a)Pテト-GFP、約35分の指数成長を含む。 この実験の画像は、図2(b)Pテト-sfGFP、約35分の指数成長に示されている。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図10:蛍光強度レベルは、ピクセル当たり正規化され、20分間隔で取得した。
細胞は、アーチファクトを最小限に抑えるために、領域に従ってビン分割されます。細胞はマイクロメートルの正方形(a)のPテト-GFP回路が210分での強度の最初の繰り返しは0.004 a.u(b)210分での強度の最初の繰り返しである0.022 a.u(c)Ptet-GFP回路の測定信号で除算される。すべての実験データは、3つの実験の平均を表す。ソフトウェアは、セル領域を別のグループにソートすることができます (a) と (b) 除算サイクルを表す 4 つのセル領域範囲のグラフを表示します。14マイクロメートルの最初の面積は、分裂後の細胞が最も小さくなる可能性が最も高いように、分裂後の細胞を表します。21 μmの2番目の面積は、分割前の細胞を表します。第3領域と第4領域は、分割に時間がかかった細胞を考慮するために、総面積に2(29μmと36μm)を掛けるため、分裂時の細胞を表します。領域は、顕微鏡画像を調べているデータを手動で評価することによって選択されました。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図11:単一細胞蛍光強度の標準偏差(STD):(a)210分でSTDの最初の繰り返しは0.001865 a(b)Pテット 210分でSTDに対するsfGFP回路の最初の繰り返しは、Pテト-GFP回路のSTD(d)Pテト-sfGFP回路の0.01477 a.u(c)STDである。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図12:単細胞蛍光強度のSNR SNR=平均/STD (a) Pテト -GFP回路が210分でSNRの最初の繰り返しは1.309 a.u (b) PtetO-sfGFP回路の最初の 210 分における SNR の繰り返しは 1.29 a.u (c) 3 回の GFP 測定の繰り返し (d) SF測定の 3 回の繰り返しを計算します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図13:単一細胞蛍光強度(a)のSNR(A)P luxR-SFGFP回路SNRはAHLに対する飽和応答(b)PluxR−SFGFP回路SNRのAHLへの半時間応答に対する。正のフィードバックAHL調節回路のSNRは、構成sfGFP回路のSNRよりも高い。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図14:フロー分析装置に基づく遺伝子回路のヒストグラム:実験データ(青)と確率モデルデータ(赤)。x軸はフローサイトメトリーからの任意の蛍光単位を表し、y軸は対応する蛍光レベルを産生する細胞の頻度を表す。データは3時間後にフローアナライザを用いて測定した。GFP蛍光は、波長484nmで励起し、波長510nmで発光することにより定量化した。PE-TexasRedフィルター電圧は、GFP発現レベルを測定するためにハイスループットサンプラーで使用されました。フローアナライザの電圧は、最大および最小の発現レベルを同じ電圧設定で測定できるように、ソフトウェアを使用して調整しました。したがって、各実験全体で一貫した電圧が使用されました。同じ実験のその後の繰り返しに同じ電圧が使用されました。フィッティングはガンマ分布31を用いて作られた。この方法は、シグナルが主にプラスミドのランダム分布に依存することを前提とします(a)低コピー数プラスミド上のPテト-GFPクローンの測定.実験的CV=0.46,モデルCV=0.32(b)Pテトの測定 -sfGFP-AAVは低コピー数プラスミドにクローン化された。実験 CV=0.86,モデル CV=0.44.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図15:顕微鏡に基づく遺伝子回路のヒストグラム:実験データ(点線)と確率モデルデータ(実線)。x軸は、反転顕微鏡からの任意の蛍光単位を表し、y軸は対応する蛍光レベルを産生する細胞の周波数を表す。フィッティングはMATLABガンマ分布31、32(a)低コピー数プラスミド上のPテト-GFPクローンの測定(b)Pテトの測定-低コピー数でクローン化されたSFGFP-AAVを用いて行った。比較は、我々のプロトコルがフローアナライザ実験と同様のCV値を得るということを示している。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足 図1:MG1655株の場合、1:500~1:20の4希釈比。 グラフは、初期密度が高い場合、LB栄養素が豊富であり、細胞がより速く分裂することを示しています。1:500希釈の場合、細胞密度は一定のままでした。1:100希釈の場合、細胞密度はゆっくりと増加した。1:50希釈の場合、細胞密度は250RPMインキュベーションで著しい遅延なしに適度な分割速度で増加した。1:20希釈の場合、細胞密度は急速に飽和に達した。我々は、1:30の希釈比を選択し、指数成長に達するための短いインキュベーションと、適度な分割率で高い飽和度を達成するための実質的な分割範囲を可能にした。この図をダウンロードするには、ここをクリックしてください
補助図2: 明視野画像の処理() 顕微鏡システムからの明視野チャネルからの生データ強度画像。(b) 背景から細胞オブジェクトの分離を改善するために画像のコントラスト強化操作。(c)畳み込みフィルタ33とグローバル閾値34に基づくセル境界認識。(d) 細胞コロニー境界を識別するために閉じると充填する形態学的35の操作。この図をダウンロードするには、ここをクリックしてください
補助図3:セルコロニー背景\前景セグメンテーションノイズの影響を最小限に抑えるために、細胞コロニー境界を特定し、ゲルノイズから抽出します。( a ) 細胞物体36を検出するための適応的閾値に基づくコントラスト強化に対する画像のバイナリ化操作。(b) S2dとS3aで提示されたマトリックスの行列乗算は、ほとんどのノイズをフィルタリングし、細胞からのゲルノイズを区別することに成功した。一部の境界は完全に解決されません。(c) 距離変換38に基づく集水域アルゴリズム37を用いたセル境界の同定(d) S3bとS3cで提示された行列の行列乗算が単一セルの解決に成功した。この図をダウンロードするには、ここをクリックしてください
補助図4: 単一細胞セグメンテーション() 明視野画像のセグメント化された製品。さらなる洗浄は、細胞面積の格子および形状に基づいて前形成され、丸い気泡を廃棄する。(b)顕微鏡から取得した蛍光シグナル画像。(c)S4aとS4bで提示された行列の行列乗算は、単一細胞のシグナルを抽出することに成功した。この図をダウンロードするには、ここをクリックしてください
補助図5:単層の喪失。(a)本稿の図2に示すGFP回路を調節するPテトの840分(14時間)における細胞層の明視野画像を良い実験として示す。顕微鏡の右側では単層の画像損失が検出できる。(b) ソフトウェアセグメンテーションイメージ。単層細胞の損失のために断片化され、領域の格言に基づいて洗浄されます。(c)画像の右側に細胞が分解され得ないこと、および単層の喪失による画像の左側の細胞の低いシグナルを示す蛍光画像。(d) 蛍光画像と組み合わせたセグメンテーション画像。この図をダウンロードするには、ここをクリックしてください
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Discussion
本研究では、エ シェリヒア・コリ 生細胞のコンピュータトレースを可能にするプロトコルを開発し、時間の経過に従って分裂および蛍光レベルを追った。このプロトコルは、我々はリアルタイムでCVとSNRを測定することにより 、大腸菌 の遺伝的回路の確率的ダイナミクスを定量化することができます。このプロトコルでは、 図 10に示すように、2 つの異なる回路の確率的な動作を比較しました。コピー数の少ないプラスミドは、確率的効果を起こしやすく、細胞分裂の影響を受けにくいことが示されています。第1回路は構成的にGFP(図10a)を構成的に発現し、第2回路は sfGFPをssrA分解タグに融合して構成的に表現した(図10b)。蛍光タンパク質の確率的挙動を定量化するため、明視野画像も記録しました。結果は、GFPの発現、特にその成熟39において、支配的なノイズ源であることを示している。 図10a で観察された周期的に鋸歯の挙動パターンは、細胞分裂のランダムなプロセスとGFP成熟の長期スケール(〜50分)によって説明することができる。これに対して、測定中に第2回路の sfGFP信号が安定化したのは 、sfGFPの成熟時間が非常に短い(〜6分) ためである。細胞分裂とGFP成熟時間のプロセスだけを考える際に、両方の回路におけるGFPのレベルを記述する簡単な式を開発しました。ある時点で 、tは 、x コピー数のタンパク質があり、プラスミドの数 μ コピーすると仮定します。タンパク質コピー数は、次のように記述できます。
1.3
1.4
除算イベントのみを考慮する場合。 
タンパク質成熟後、我々は得る特定のプラスミドのために:
GFP の場合 ( 
1.5 )
sfGFP の場合 ( 
:1.6
次に 、sfGFP の開発シリーズ:
1.7
その場合 
、我々は得る 
。この結果は以下のように説明できる。 x が小さい場合 、sfGFP レベルは少量増加します。 x が大きいと 、sfGFPは定常状態に劣化する。同様に、GFPの回路については、各細胞はGFPの約10単位を含むが、GFPの成熟時間は有糸分裂よりも長いため、蛍光強度の歯のパターンを分解して見た。モデルでは、プラスミドの複製は、プラスミド分布が分裂前後で一定のままであるほど速いと仮定した。ssrA分解タグは、多くの場合、時間から時間未満の時間から5 時間未満にタンパク質の半減時間を減少させ、高速定常状態につながります。この方法は、高い人口フローアナライザで測定したものと同様の分布を提供し、この分布のCVがフローアナライザCVと等しいか小さいことを示した。
いくつかの方法3、7、18は、ライブ細胞イメージングのために開発されたが、ここで提示される方法は、特に大腸菌に合わせて調整されています。この細菌は、特別な媒体とわずかに異なるアプローチを必要とします。プロトコルは、次の重要な特徴を有する:(1)中期ではなく、指数成長の開始時に細菌および株に特異的な希釈比を確立する(2)大腸菌は37°Cで最もよく分裂するが、37°Cでは最小限の培地ゲルが急速に水を失い、収縮および不安定につながる。ここでのプロトコルは、この課題を克服する(3)我々はまず細菌サンプルを適用し、液体ゲルでそれを密封する。サンプルはガラス底部とゲルの間に閉じ込められているため、(I)ガス交換がエアポケットの切断を避けるゲルが必要であり、(II)エシェリヒア大腸菌は熱に敏感であり、(III)サンプルが液体ゲルの中に混入しないことを確認するため、低温で液体を保持します。ゲルは37°Cで液体のまま、 しかし、サンプルの上に保護キャップを使用してゲル内の過度の熱とサンプル混合を避けることをお勧めします(4)このアプローチでは、簡単で一般的な機器(5)サンプルを予熱せずに直接測定できるため、分割イベントの損失はありません(6)ウェットラボのステップとカスタマイズされた自動化されたソフトウェアを含むプロトコルは、遺伝子回路の確率的挙動を研究するために使用できます。細胞の小集団の使用を検証し、CV(7)に従って比較するためのベースラインを確立するために、顕微鏡法をフローアナライザの結果と比較しました。ImageJ18や Schnitzcells などのソフトウェア ツールでは、細胞を手動で識別する必要があり、調整に挑戦しています。
生きた細胞コロニーを連続的にイメージングする場合、細胞ストレスや毒性、資源枯渇率、誘導剤および化学物質の分解時間など、いくつかの複雑な物理的パラメータを考慮しながら実験を設計します。このプロトコルは、最大5時間の信頼性の高い測定を可能にします。我々の実験は、 大腸菌 がマイクロ、単層コロニーに分割するときに同期することを示唆している(補足ビデオ3)。我々は、ゲルが資源と靭性の点で均一であり、細胞は同様の挙動を有し、照明の分野は視野から少し大きいと仮定する。したがって、各セルは、フローアナライザを用いて測定にこのように得られたCVを比較することによって示したように、我々が示したように、同じ信号と統計データを生成する必要があります。一定初期条件でのノイズを長期間測定するために、今後マイクロ流体チップの使用を検討します。このような装置のさらなる利点は、細胞の固定位置および安定した焦点10を維持する。それでも、マイクロ流体チップの設計、製造、実験用のプライミングには、トレーニング、特定の機器(時にはカスタムメイド)、時間が必要です。このため、このプロトコルに示すようにタイムラプス顕微鏡を使用して、回路の一般的な理解を得ることが有益である。
提案されたプロトコルおよび開発されたソフトウェアは、グラフを導き出すのが簡単な再現可能な測定を可能にする。また、全ノイズのテストと比較が可能で、固有および外因性ノイズの測定に変更できます。この方法は、一般的または簡単に材料を注文し、公然と共有され、使いやすいソフトウェアに基づいており、特定のトレーニングを必要としません。我々は、顕微鏡で測定された母集団が、その方法CVをフローアナライザで得られたものと比較することによって、意味のあるデータを得るのに十分な大きさであることを示した。したがって、このプロトコルを使用してSNRベースラインを確立し、より複雑な遺伝子回路と比較することができます。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
MATLABコードを支援してくれたギル・ゲルバート氏(電気工学部、テクニオン)に感謝します。この記事の校正を支援してくれたXiming Li博士(バイオメディカル工学部、テクニオン)に感謝します。この研究は、ノイバウアー家財団とイスラエル科学省が2027345を助成金として支えたものです。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35mm glass dish | mattek | P35G-0.170-14-C | thickness corresponding with microscope lense. |
| Agarose | Lonza | 5004 | LB preperation |
| AHL | Sigma-Aldrich | K3007 | inducer |
| Bacto tryptone | BD - Becton, Dickinson and Company | 211705 | LB preperation |
| Carb | Invitrogen | 10177-012 | antibiotic |
| Carb | Formedium | CAR0025 | antibiotic |
| Casamino acids | BD - Becton, Dickinson and Company | 223050 | minimal media solution |
| eclipse Ti | nikon | inverted microscope | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | minimal media solution |
| Glyserol | Bio-Lab | 000712050100 | minimal media substrate |
| Immersol 518F | zeiss | 4449600000000 | immersion oil |
| M9 salt solution | Sigma-Aldrich | M6030 | minimal media solution |
| NaCl | Bio-Lab | 214010 | LB preperation |
| Noble agar | Sigma-Aldrich | A5431 | minimal media substrate |
| parafilm tape | Bemis | PM-996 | refered to as tape in text |
| Seaplaque GTG Agarose | Lonza | 50111 | minimal media substrate |
| thaymine B1 | Sigma-Aldrich | T0376 | minimal media solution |
| Yeast Extract | BD - Becton, Dickinson and Company | 212750 | LB preperation |
References
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