Summary
עבודה זו מציגה שיטת מיקרוסקופיה המאפשרת הדמיה חיה של תא יחיד של Escherichia coli לניתוח וכימות של ההתנהגות הסטוקסטית של מעגלי גנים סינתטיים.
Abstract
הפרוטוקול שפותח כאן מציע כלי המאפשר מעקב ממוחשב אחר חטיבת קולי Escherichia ורמות פלואורסצנט על פני מספר שעות. התהליך מתחיל בסינון מושבות ששורדות על מדיה מינימלית, בהנחה שרק Escherichia coli מחסה פלסמיד הנכון יוכל לשגשג בתנאים הספציפיים. מכיוון שתהליך בניית מעגלים גנטיים גדולים, הדורש הרכבה של חלקי דנ"א רבים, הוא מאתגר, רכיבי מעגלים מופצים לעתים קרובות בין פלסמידים מרובים במספרי העתק שונים הדורשים שימוש במספר אנטיביוטיקה. מוטציות בפלסמיד יכולות להרוס את שעתוק הגנים של עמידות לאנטיביוטיקה ולהצטלב עם ניהול משאבים בתא המוביל לנמק. המושבה שנבחרה ממוקמת על צלחת פטרי עם תחתית זכוכית וכמה מישורי מיקוד נבחרים למעקב אחר מיקרוסקופיה הן בתחומים בהירים והן בתחומים פלואורסצנטיים. הפרוטוקול שומר על מוקד התמונה במשך יותר מ -12 שעות בתנאים ראשוניים שלא ניתן לווסת, ויוצר כמה קשיים. לדוגמה, תאים מתים מתחילים להצטבר בשדה המיקוד של העדשות לאחר כמה שעות של הדמיה, מה שגורם לרעלים להצטבר והאות לטשטש ולהתנוון. דלדול של חומרים מזינים מציג תהליכים מטבוליים חדשים לעכב את התגובה הרצויה של המעגל. טמפרטורת הניסוי מורידה את ההשפעה של גורם ואנטיביוטיקה, אשר יכול לפגוע עוד יותר את האמינות של האות. ג'ל המדיה המינימלי מתכווץ ומתייבש, וכתוצאה מכך המיקוד האופטי משתנה עם הזמן. פיתחנו שיטה זו כדי להתגבר על אתגרים אלה Escherichia coli, בדומה לעבודות קודמות פיתוח שיטות אנלוגיות עבור מיקרו אורגניזמים אחרים. בנוסף, שיטה זו מציעה אלגוריתם לכימות הרעש הסטוצ'סטי הכולל בתאים ללא שינוי ושינוי, ומוצאת כי התוצאות עולות בקנה אחד עם תחזיות מנתח זרימה כפי שמוצג על ידי מקדם דומה של וריאציה (CV).
Introduction
ביולוגיה סינתטית היא תחום רב תחומי שהתגלה בעשור האחרון ומטרתו לתרגם עקרונות תכנון הנדסי לתכנון ביולוגי רציונלי1,2,3 , במאמץ להשיגאינטגרציהועיבוד רב-תחומי בתאים חיים להבנת המדע הבסיסי4,5, יישומים אבחון, טיפולי וביוטכנולוגי6,7,8,9,10. היכולת שלנו לכמת את תגובת פלט הקלט של מעגלי גנים סינתטיים עברה מהפכה על ידי ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיה חד-תאית, כולל מנתח הזרימה והדמיה של תאים חיים באמצעות מיקרוסקופיה אוטומטית של זמן לשגות11. מנתח זרימה משמש לעתיםקרובותכדי למדוד את התגובה של מעגלים אלה במצב יציב 1,12, מיקרוסקופיה הפוכה משמשת למדידת התגובה הדינמית של מעגלי גנים סינתטיים ברמה של תא יחיד3. לדוגמה, אחת העבודות המוקדמות בביולוגיה סינתטית כללה בניית רשתות מתנד גנטיות בתאים חיים באמצעות לולאות משוב שליליות עם עיכוב3. מאוחר יותר, מעגלי המתנד הגנטי הוחלו כדי להבין שליטה מטבולית בסביבה הדינמית של תאיםחיים 4. מיקרוסקופיה אוטומטית של זמן לשגות היא שיטה אחת לאפיין מעגלים כאלה. אנו משערים כי התאים המארחים, Escherichia coli, לסנכרן בעת יצירת מושבות מיקרו, המאפשר מדידה של אות וחישוב של רעש מבלי לעקוב אחר יחסי אם ובת מדויקים.
רעש הוא היבט בסיסי, אינהרנטי של מערכות ביולוגיות הנובעות לעתים קרובות ממקורות מרובים. קחו לדוגמה, תגובות ביוכימיות המערבות אותות שמקורם בהובלת נשאים אקראיים נפרדים כגון דיפוזיה של חלבונים13. אותות אלה מתפשטים עם תנודות אקראיות14. מקורות רעש אחרים הם זמינות משאבים, חלוקת תאים ושינויים בתנאים סביבתיים כגון טמפרטורה, לחות ולחץ. אותות ביולוגיים המתפשטים במעגלי גנים סינתטיים לעיתים קרובות יש אות נמוך מאוד יחס רעש (SNR), אשר מפריע לביצועים של מעגלים כאלה. לכן, תכנון מעגל גנטי נשאר אחד ההיבטים המאתגרים ביותר שלהנדסה גנטית 15. לדוגמה, בניגוד לרוב הגישות המחשבות רק את ביטוי הגנים הממוצע (הנמדד על פני אוכלוסיית התאים כולה), השונות של האות הנמדד נחשבת על מנת להנדס התנהגות צפויה באמצעות רשתות גנים סינתטיות12. ככזה, רמות השונות או הרעש בביטוי החלבון ממלאות תפקיד דומיננטי בעיצוב וביצועים של מעגלי גנים אנלוגיים ודיגיטליים1,16,17.
גישות רבות פותחו כדי לכמת את השונות בין תא לתא, כולל ב Escherichia coli3,7,18. שיטות אלה משמשות לעתים קרובות לחקר הפעלת גנים ומסלולים מטבוליים, אולם עם פחות התמקדות בחקר דינמיקת רעש סטוכסטי, כמו מדידה והתנתקות של מקורות רעש ספציפיים, במיוחד עבור מעגלים גנטיים בתאים חיים שבהם זהו אתגר בסיסי19,20,21. מספר גורמים, שניהם תורשתיים למעגל עצמו (מהותי) ונגזרים מהתאים המארחים (חיצוניים), יכולים להפריע לביצועים המתמשכים של מעגלים גנטיים. במאמר זה, פיתחנו פרוטוקול שמטרתו לכמת את הרעש הכולל בתאי קולי Escherichia, כולל מקורות רעש מהותיים ו extrinsic6,22. על ידי כימות הרעש הכולל ולאחר מכן הערכת SNR23, העיצוב של מעגלי גנים ניתן לשפר. שיטה זו ניתנת לשינוי כדי למדוד מקורות רעש עצמאיים בנפרד, על ידי ניטור מספר חלבונים פלואורסצנטיים6,20. עבור הפרוטוקול המתואר כאן, אנו שומרים על התנאים הסביבתיים מבוקרים היטב ומודדים ללא הרף את פעילות התאים ללא השפעה של גורמים חיצוניים. אנו מודדים את האות מחלבונים פלואורסצנטיים בתאים בודדים לאורך זמן ובו זמנית מדימויים אותם תחת מצע אגרוז. התמונות המתקבלות מנותחות באמצעות MATLAB המותאם אישית של המעבדה.
באופן אידיאלי, מדידה רציפה של הפעילות בזמן אמת של חלבונים פלואורסצנטיים בתוך התא תייצר נתונים מדויקים באמצעות הצמיחה והחלוקה של התאים. עם זאת, זה מאתגר לרכוש נתונים כאלה. זאת בשל השפלה של חלבונים פלואורסצנטיים, המכונה הלבנת תמונות7, כאשר הם נחשפים לקרינה בתהליך העירור. יתר על כן, תאי קולי Escherichia רגישים גם עבור עירור, אשר עלול להוביל phototoxicity7. שתי הבעיות מגבילות את כמות מסגרות התמונות שניתן להשיג ואת הזמן בין רכישות. מצע וסוגים בינוניים (למשל, מרק lysogeny) המשמש לגידול התאים במהלך ההדמיה יש גם תפקיד קריטי. מומלץ מאוד להשתמש במדיום מינימלי, הממזער רקע שאינו פלואורסצנטי ומאריך את זמן חלוקת התאים.
יתר על כן, המדגם צריך להיות מוכן בהתחשב בדרישות הבאות (1) שיעור חלוקת תאים נמוך מאפשר חשיפות תכופות פחות עבור הדמיה צמודה מחזור החלוקה והפחתת ההסתברות של phototoxicity ו photobleaching. הגדרנו את זמן הרכישה לכמחצית מזמן המיטוזיס החזוי (2) צפיפות תאים נמוכה בתחילת הניסוי מאפשרת אחידות ויכולת מעקב טובות יותר של החלוקה. צפיפות התאים מושפעת מיחס הדילול של תאי קולי Escherichia, המהווה פרמטר משמעותי להצלחת פרוטוקול זה ויש לקבוע אותו עבור כל מעבדה. על מנת לקבוע את היחס, כל זן קולי חדש של Escherichia או מדיה בשימוש צריך להיות מצויד גרפים קצב הצמיחה (איור משלים 1). יחס מתאים הושג אם תאים יכולים לגדול ללא רעידות נוספות לאחר דגירה קצרה מתוך צפיפות ראשונית של כ OD600nm = 0.1. תאים בשלב זה יתחלקו בהתאם לטמפרטורת הסביבה בלבד (3) הגבלת תנועת התאים: תנועת התאים תלויה מאוד בתקיפות המצע (כרית agarose). מוצקות המצע תלויה בכמות ההתעוררות הכוללת ובזמן התמצקות הג'ל. ג'לים לא ניתן להשאיר כדי לחזק את הלילה בטמפרטורת החדר, כמו קולי Escherichia יעבור מיטוזה. גורמים אחרים המשפיעים על יציבות המצע כוללים את כמות המים במדגם והלחות. נושאים נוספים נידונים בפירוט בתוצאות הנציגות. פרוטוקול זה מספק פרטים רבים ועובר בהדרגה משלב אחד למשנהו. הפרוטוקול מציע יציבות ארוכה לניסויי הדמיה ומספק כלי בסיסי לעיבוד תמונה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת מדיה ותרבות
- הכן פתרון מלאי של 1,000x קרבניצילין (50 מ"ג / מ"ל) או אנטיביוטיקה רלוונטית.
- . שוקל 0.5 גרם של קרבניצילין. הוסף 10 מ"ל של סטרילי H2O. להתמוסס לחלוטין.
- לעקר מניית קרבניצילין באמצעות מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר. Aliquot פתרון אנטיביוטי ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.
- כדי להכין מרק lysogeny (LB) צלחות, לערבב 5 גרם של טריפטון, 5 גרם של NaCl, 2.5 גרם של תמצית שמרים ו 7.5 גרם של אגר Bacto עם 0.5 L של H סטרילי2O. Autoclave הפתרון ב 121 °C (60 °F) במשך 20 דקות.
- שקועים חלקית בתערובת הג'ל המותכת באמבט מים של 50 מעלות צלזיוס. הוסף 1,000 μL של קרבניצילין (50 מ"ג / מ"ל).
- מכינים מנות פטרי בסביבה סטרילית. השאירו את הצלחות כדי להגדיר לפני אחסון אותם במקרר.
- למדיה מינימלית M9, הכינו פתרונות מלאי נפרדים של הדברים הבאים: 5x מלחי M9 (56.4 גרם לליטר), 2 מ' גלוקוז ו-2% חומצות קאסאמינו נטולות ביוטין. מובלעת אוטומטית את הפתרונות ב 121 °C (69 °F) במשך 20 דקות.
- להכנת 5 צלחות פטרי, מערבבים 1125 מ"ג של אגר נמס נמוך ו 400 מ"ג אגר עם 89.2 מ"ל של מדיה מינימלית (1x M9). הוסיפו 10 מ"ל של 2% חומצות קאסאמינו (2% [vol/vol]) בבקבוק ארלנמאייר של 250 מ"ל.
הערה: הקפד לשפוך את המדיה על השפתיים הפנימיות של הבקבוק. - מיקרוגל הפתרון בצרורות קצרים של 3 עד 4 שניות. חזור על הפעולה עד שהפתרון יתבהר.
הערה: הקפד לא להגיע לנקודת רתיחה. - מניחים את הבקבוק ארלנמאייר 250 מ"ל באמבט מים חמים (60 מעלות צלזיוס) כדי לערבב עוד יותר על ידי דיפוזיה, ולהשאיר אותו להתקרר עד הטמפרטורה שלה יורדת על 45-50 מעלות צלזיוס.
- הדליקו את הלהבה על ספסל היציקה.
- הוסף במהירות את כל הפתרונות בסדר הבא:
800 μL של 50% גליצרול (0.4% [vol/vol])
100 μL של תיאמין (B1)
1100 μL של גלוקוז (2M)
100 μL של קרבניצילין (50 מ"ג / מ"ל). - מערבולת בקבוק ארלנמייר כדי להבטיח הפצה שווה של כל החומרים ברחבי אגר.
- פותחים צלחת אחת בכל פעם ליד הלהבה ומתחילים לשפוך.
- השאירו את הצלחות על הספסל במשך כמה דקות עד התגבשות ראשונית.
- הופכים את הצלחות כדי למנוע עיבוי מים לטפטף על הג'ל.
- השאירו את הצלחות כדי לחזק בטמפרטורת החדר במשך כ 2 שעות.
- לאחר הצלחות יש מוצק ומיובש, הם יכולים להיות מאוחסנים ב 4 מעלות צלזיוס במשך כ 3 חודשים.
2. זני חיידקים ובניית פלסמידים
הערה: המעגל הגנטי מכיל חלק אחד; חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) המונע על ידי מקדם PtetO וכתוצאה מכך ביטוי מכונן. כל הפלסמידים בעבודה זו נבנו בטכניקות שיבוט מולקולריות בסיסיות והפכו לאשריצ'יה קולי 10β, באמצעות פרוטוקול זעזוע חום סטנדרטי24. המבנה הסופי הפך Escherichia coli MG1655 סוג הבר זן לבדיקה.
- להפוך את הפלסמיד הרצוי לתאי Escherichia coli MG1655 עם פרוטוקול זעזוע חום סטנדרטי24.
- לגדל את התאים שהשתנו על צלחת אגר LB לילה ב 37 מעלות צלזיוס.
הערה: ניתן לשמור על מנות פטרי משלב 2.2 עד 3 ימים לשימוש מיקרוסקופי. - לחסן מושבה אחת לתוך 5 מ"ל של מרק LB בתוספת אנטיביוטיקה רלוונטית בצינור זכוכית.
- לגדל תאים ב 37 °C (69 °F) עם 250 סל"ד רועד מהירות באינקובטור במשך 2 שעות עד הנוזל מעונן.
- הכן 1 מ"ל של פתרון דילול כדלקמן:
892 μL של מדיה מינימלית (1x M9)
8 μL של 50% גליצרול (0.4% [vol/vol])
100 μL של 2% חומצות קאסאמינו (0.2% [wt/vol])
1 μL של תיאמין (B1)
11 μL של גלוקוז (2 מטר)
1 μL של אנטיביוטיקה רלוונטית- מערבבים ומסתובבים.
- לדלל את תרבות התא (1:30) משלב 2.4 לתוך צינור 2 מ"ל על ידי הוספת 30 μL של צמיחת קולי Escherichia ל 1000 μL של פתרון דילול (שלב 2.5).
- דגירה הצינור במשך 1 שעה עם רועד (250 סל"ד) ב 37 מעלות צלזיוס.
- לגדול 40 μL - 60 μL על לוחות M9 מוכן בשלב 1.10. דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס לילה.
הערה: הצפיפות האופטית (OD600nm)לציפוי צריכה להיות סביב 0.1. - מניחים עד שלוש צלחות זכוכית 35 מ"מ התחתון על הספסל.
הערה: ודא שלזכוכית הצלחת יש את העובי הנכון עבור עדשות המיקרוסקופ המשמשות. - הכינו את התרבות לזריעת צלחות ג'ל, חזרו על שלבים 2.3 עד 2.6 למושבות מהצלחת שהוכנו במדידות מיקרוסקופ בשלב 2.9.
- הכינו את הפתרון הבא להכנת שלוש לוחות מיקרוסקופ.
- מחממים את אמבט המים ל 60 מעלות צלזיוס.
- יש לערבב 112.5 מ"ג של אגר נמס נמוך ו-40 מ"ג אגר עם 8.92 מ"ל של מדיה מינימלית (1x M9) ולהוסיף 1 מ"ל של 2% חומצות קאסאמינו (0.2% [vol/vol]) בבקבוק ארלנמייר של 25 מ"ל.
הערה: הקפד לשפוך את המדיה על השפתיים הפנימיות של הבקבוק.
- מיקרוגל הפתרון בצרורות קצרים של 2 עד 3 שניות. חזור על הפעולה עד שהפתרון יתבהר.
הערה: הקפד לא להגיע לנקודת רתיחה. - מניחים את הבקבוק ארלנמאייר 25 מ"ל באמבט מים חמים (60 מעלות צלזיוס) לערבוב נוסף על ידי דיפוזיה, ולהשאיר אותו להתקרר על הספסל עד הטמפרטורה שלה יורדת על 45-50 מעלות צלזיוס.
3. הכנת רפידות agarose
- ספסל נקי עם 70% אתנול. סרט מתיחה על הספסל הנקי. ודא שהקלטת חלקה ומפולסת.
- הכינו שני כיסויים: אחד בקלטת והשני בקרבת מקום. הכינו כיסוי.
- הסר בקבוקון (מוכן בשלב 2.14) מאמבט מים, לנגב את החלק החיצוני של הבקבוק נקי ולהשאיר אותו להתקרר עד הטמפרטורה שלה יורדת על 45-50 מעלות צלזיוס.
- כדי להפוך את פתרון הג'ל, לערבב במהירות את כל הפתרונות בסדר הבא:
80 μL של 50% גליצרול (0.4% [vol/vol])
1 מ"ל של 2% חומצות קאסאמינו (0.2% [wt/vol])
10 μL של תיאמין (B1)
110 μL של גלוקוז (2 M)
10 μL של אנטיביוטיקה רלוונטית. - יוצקים 1.5 מ"ל של הג'ל על העטיפה ומכסים אותו בחתיכה השנייה מכינים "כריך".
- החזירו את הארלנמייר לאמבטיית המים החמים. מכסים את הכריך עם המכסה ומגדירים טיימר במשך 20 דקות.
- במקביל, דגירה הצינור משלב 2.11 עבור 1 שעה ב 37 °C (69 °F) עם רועד (250 סל"ד)
- לאחר 20 דקות להפוך את הכריך (שלב 3.5), לכסות אותו ולהשאיר לנוח במשך 1 שעה.
הערה: לקבלת תוצאות טובות יותר להשאיר את "כריך" לנוח ב 4 מעלות צלזיוס למשך שלב 3.8. - זרע Escherichia coli תרבות משלב 3.7 על ידי pipeting המדגם על צלחת 35 מ"מ.
הערה: Pipeting 6 μL של תאים כמו טיפות קטנות נפרדות נותן את התוצאות הטובות ביותר. - אפשר את הטיפות להתייבש, לפחות 15 דקות ועד 30 דקות.
- לחשוף את הג'ל המוצק של הכריך משלב 3.8 על ידי החלקת הכיסוי משם.
- חותכים כריך לרפידות בודדות קטנות עם פונץ' ביופסיה או טיפ.
- להישען אותו בעדינות על המדגם (שלב 3.9). השאירו את המנה במשך 20 דקות על הספסל.
4. הכנת המדגם להדמיית מיקרוסקופיה
- הסר את הבקבוק מאמבט מים משלב 3.6. לנגב את החלק החיצוני של הבקבוק נקי ולתת מגניב לטמפרטורת החדר (25 מעלות צלזיוס).
הערה: הסר את הבקבוק בשלב 4.1 כ-3 דקות לפני סיום שעון העצר. - יוצקים 3 מ"ל של הג'ל כל הזמן להיקף הצלחת בתנועה מעגלית. השאירו להתמצק במשך כמה דקות.
- לאטום צלחות עם קלטת לנקב כמה חורים עם מחט 25 G. הופכים את כל הכלים כדי למנוע עיבוי מים נוטף על הג'ל.
- דגירה כל הכלים ב 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות כדי לאפשר התמצקות מלאה תוך מניעת מיטוזה התא.
הערה: השאירו דגימות ב-4°C למדידות רצופות, לא יותר מיום אחד. - הפעל את המיקרוסקופ לפי הוראות היצרן.
- מצא את המוקד הראשוני באמצעות עדשת ההגברה הנמוכה ביותר ונהל מערכת מיקוד אוטומטית (AFS).
- השתמש בשמן במידת הצורך, להטביע את העדשה עם שמן ולהפיץ אותו בזהירות על ידי הזזת הצלחת עם בקר פלטפורמה (לא באופן ידני) ו AFS יכול להיות מעורב שוב.
- השתמש חתך יחסית בכיוון Z, בעקבות הצעת ברירת המחדל עבור חתכים שלב Z.
הערה: צילמנו תמונות שדה בהירות כל 5 דקות ותמונות פלואורסצנטיות כל 20 דקות. לפעמים המיקוד צריך להיות מותאם במהלך 30 הדקות הראשונות. חימום מראש של קופסת החממה והשמן של המיקרוסקופ, תוך קירור המדגם נוטה לסייע בהפחתת אובדן המיקוד הראשוני.
5. ניתוח נתונים
הערה: כדי לעבד נתוני מיקרוסקופיה, עיצבנו תוכנה מבוססת מחשב ב- MATLAB. תוכנה זו מאפשרת זיהוי של גבולות התא מתמונות tiff שדה בהיר ומקטעים וממיין תאים לפי אזור. הפלט של ניתוח תמונה זה יכול לשמש כמסכה על תמונות טיפ פלואורסצנטיות כדי להפיק רמות עוצמת תא ולבטל חפצים בתחום הפלואורסצנטי כגון הילה של התא עקב מגבלות רזולוציית מיקרוסקופ. התוכנה שפותחה נוצרה בהשראת עבודותדומות 7,25,26,27,28,29,30 ומספק פתרון אלגנטי המותאם למעבדה.
- תחילה, הגדר את הפרמטרים הבאים main_code.m.
- הגדר את התיקיה של תמונות הרכישה.
- הגדר את פרק הזמן של התמונה - שלב זמן ערוץ שדה בהיר בדקות.
- הגדר את תדירות GFP - קצב הרכישה של תמונות GFP.
- הגדר את רזולוציית המיקרוסקופ (כלומר, כמה פיקסלים שווים ל- μm אחד).
- הגדר טווח סל היסטוגרמה - טווח אזור תאים.
הערה: תהליך סיווג הנתונים לפי אזור התא דומה לעקרונות של גטינג בניתוח נתוני cytometry זרימה. שערים ממוקמים סביב אוכלוסיות של תאים בעלי מאפיינים משותפים, בדרך כלל מפוזרים קדימה וצדדים מפוזרים, כדי לבודד ולכמת אוכלוסיות אלה של עניין. מיקרוסקופיה מאפשרת שער, לחקור ולכמת מספר קבוצות תאים. - הגדר ליבת קונבולוציה (3,3) - פרמטר זה מזהה גבולות תאים על ידי סף כללי (count_cells.m).
הערה: התקנה זו נדרשת רק בעת שינוי המעבדה או המיקרוסקופ. התוכנה דורשת את ערוץ שדה בהיר הקלט להיות מסומן עם אינדקס c1, ערוץ פלואורסצנטי שכותרתו c2.
- הפעל main_code.m, אשר יפעיל את כל קבצי ה- Script האחרים באופן אוטומטי (count_cells.m, cell_growth_rate.m).
- התוכנית מקטעת באופן אוטומטי תמונות שדה בהיר (ראה איור משלים 2.4).
- שלב את תמונת הפילוח עם תמונת פלואורסצנט (GFP) כדי לחלץ את רמת העוצמה לכל תא.
- חשב את הגרף של כמות התאים לפי זמן והתאם בהתאם לצמיחה מעריכית.
- חשב את הממוצע וסטיית התקן (STD) עבור כל טווח אזור תאים.
- חשב את יחס האות לרעש (SNR) עבור כל טווח אזור תא.
- התווה והתאם את התפלגות כמות התאים לפי עוצמה.
- חשב את מקדם השונות (CV) והשווה לנתוני מנתח הזרימה.
הערה: התוכנה תעניק כפלט את תמונות הפילוח הסופיות להתאמת conv_kernel בתיקיה חדשה "folder/Segmented". התוכנה תיתן כפלט את הגרפים בתיקיה חדשה "folder /Graphs שלך.
- על מנת להשוות בין ניסויים, להשתמש compare_experiments.m.
- הגדר ספריות עבור הגרפים השמורים והכתובת עבור הספריה \CompareResult.
- הפעל את הקובץ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התוכנה מנתחת תמונות תחום שדה בהיר כי הם מחוץ לבן ושחור. קולי Escherichia ייראה כמו צורות מלבניות שחורות על רקע לבן מחוץ למגוון דינמי של זוהר צריך להראות ספייק במרכזו (איור 1). בתמונות פלואורסצנטיות תאים עשויים להיות הילה קטנה, אך עדיין ניתן לפתור תאים בודדים עם צורות מלבניות. אירוע מיטוזה צריך להיות מזוהה תחילה לאחר 30 דקות. מיקוד המיקרוסקופ צריך להישאר יציב לאורך זמן ולמרות שהתאים עשויים לנוע לאט במהלך 30 הדקות האלה, הם לא צפויים לעזוב את שדה הראייה. ניסוי כזה ייחשב טוב וניתן לצפות בו באיור 2. ייתכן שיהיה קשה לזהות תאים בתחום השדות הבהירים בהגדלה נמוכה. אנו ממליצים לקבוע את מרחק המיקוד הממוצע עם מספר עותק גבוה (HCN) פלסמיד, כפי שקל להבחין בהגדלה נמוכה. הגדר את המרחק הממוצע בעת מדידת מספר עותק נמוך (LCN) פלסמיד בהגדלה הגבוהה מראש. מרחק מיקוד זה תלוי בעיקר בצלחות, במערכת המיקרוסקופיה והשמן, ולא בעובי הג'ל או בזן קולי Escherichia.
בעת התאמת פרוטוקול זה למעבדות אחרות, עלולות להתעורר (1) לוחות קולי Escherichia (דגימות) שהוכנו ביחס דילול שגוי יכולים להראות מספרים בלתי משתנים של תאים (איור 3 ואיור 4) (2) דגימות שהוכנו מבלי לאטום את הצלחת יכולות להראות התכווצות מוגזמת. ניתן לראות זאת כתאים נסחפים (איור 3)או גורמים לאובדן מיקוד (איור 5)(3) דגימות מסוימות עשויות להציג תאים 'קבועים' משתנים באיטיות (בשחור) על רקע של תאי שחייה (בלבן). זה כנראה בגלל מדגם רטוב וזה בדרך כלל מתייצב כמו מים עודפים נספג על ידי הג'ל(וידאו משלים 1)(4) דגימות המציגות תאים לאחר כמה דקות של התחממות אולי הוכן בצורה שגויה, סביר להניח בגלל: (I) ג'ל נשפך בעוד עדיין חם מדי, (II) כובע מגן נשכח, (III) מדיה מינימלית חסר מרכיב, (IV) צפיפות תאים שגויה, ו (V) ג'ל היה אטום מדי חשוב לנקב חורים כדי לאפשר החלפת גזים על חשבון כיווץ ג'ל (איור 5) ותאי (VI) יכולים גם לדחוק פנימה את הג'ל בחיפוש אחר חומרים מזינים, לערום אחד על גבי השני, להתפשר על מונולאייר התא ביעילות מניעת זיהוי של תאים ומדידת אות פלואורסצנטי אמין (איור משלים 5).
מדדנו שלושה מעגלים בעבודה הזאת. ראשית, פרומוטור מכונן המסדיר את GFP המוצג באיור 6. שנית, פרומוטור מכונן המסדיר את GFP31 (SFGFP) בעל קיפול-על מוצג באיור 7. תג השפלה ssrA (AAV) נוסף ל- SFGFP כדי להפחית את חיי ה- ssrA לדקות5. המעגל השלישי מבוסס על מעגל משוב חיובי1, והוא המושרה על ידי acyl-homoserine-לקטון (AHL). מקדם PluxR מווסת את SFGFP ו- LuxR, גורם שעתוק המחייב את AHL להפעיל את PluxR כפי שמוצג באיור 8. איור 9 מציג את הדינמיקה של צמיחת תאים (מספרי תאים לעומת זמן), איור 10 מציג את הדינמיקה של האות הנמדד (פלואורסצנטיות ממוצעת לעומת זמן) ואיור 11 מציג דינמיקה של רעש כולל מוערך (סטיית תקן (STD) לעומת זמן).
SNR (או CV) נמצא בשימוש נרחב בתכנון מעגלים אלקטרוניים אנלוגיים כדי לבטא את הדיוק והאמינות של המעגל32. CV מתייחס לחלוקת האות בין תאים בודדים ומאפשר השוואה בין שיטות וציוד שונה כגון מיקרוסקופים ומנתחי זרימה. חישוב SNR מתמונות מיקרוסקופ מאפשר לנו להשוות מעגלים לאורך זמן, תאים מקוטעים נמדדים בו זמנית כמו מתן מידה לרזולוציה הספציפית של הרעש בהשוואה לאות, או מרווח רעש לזמן מסוים ולריכוז לגרום. הדבר עשוי להצביע על כך שתאי גלאי יוכלו לפתור את תגובת האות המדויקת לריכוז האינדוצדור. בעבודה זו, קורות החיים חושבו על-ידי התחשבות בכל הממצאים המפולחים שהם תאים, ללא קשר להתקדמות התא במחזור החלוקה. SNR חושב עבור טווח אזור תאים ספציפי לאורך זמן, ואז זה היה ממוצע לשלושה ניסויים חוזרים ונשנים. לא האות הנרכש ולא STD הם אמינים לבד, כפי שהם ספציפיים לניסוי וציוד בשימוש. האות נמדד ביחידות שרירותיות התלויות בציוד צובר קביעה מוגדרת מראש, גלאי תמונות וזמן חשיפה. הנתונים המוצגים באיור 10 מצביעים על כך ששלב התאים במחזור החלוקה אינו משפיע על רמת הרעש, שכן טווחי שטח שונים (נקודות במחזור החלוקה) מראים מגמה זהה. תצפית זו עשויה לתמוך בטענה כי מעקב אחר יחסי אם ובת מדויקים ניתן להימנע למדידת רעש וזה יכול לשפר את SNR עבור השיטה המוצגת. לא נצפה שינוי מהותי ב-SNR בין GFP ל-SfGFP כפי שמוצג באיור 12. אנו מחשבים את ה- SNR (SNR = ממוצע / STD) ומציגים אותו באיור 12 ובאיור 13.
לאחר מכן חישבנו את השונות ואת קורות החיים בהתבסס על המשוואות הבאות31
1.1
1.2
כאשר λ הוא זמן קיפול חלבון, T הוא זמן חלוקת התא, θ μ הם מספר פלסמידים לפני ואחרי החלוקה, עותק פלסמיד מספר31. באמצעות המשוואות לעיל (1.1 ו- 1.2) אנו יכולים להתאים את הנתונים מאות מנתח הזרימה להתפלגות גמא.
לאחר מכן השווינו בין קורות החיים, הנמדדים ומחושבים לפי מנתח זרימה (איור 14),לבין הפרוטוקול (איור 15).
איור 1: תמונת חשיפה לשדה בהיר (א) רכישה מיוצמת בשדה בהיר (b) תמונת פילוח, רק תאים צבעוניים מזינים את מפת הבהירות של הפיקסלים של הרכישה, ספייק הוא רעש הרקע. סף על ידי זה קטעים רק Escherichia קולי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ניסוי זה מראה תאים בריאים טובים המתחלקים ומגיבים לאחר 120 דקות. התמונות נרכשו ברצף במרווחים של 20 דקות. המושבות בפוקוס, הג'ל יציב בין הדגימות. מושבות מתחלקות ומייצרות אותות חזקים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: השפעות של יחס דילול שגוי והצטמקות ג'ל בתמונת הפלואורסצנט. התמונות נרכשו במרווחים של 20 דקות (א)אישי Escherichia coli מוקף באדום (ב) אותו תא נסחף מימין לשדה הראייה (ג) התא נסחף עוד יותר. התאים גם אינם מחלקים או משנים תנוחות, כנראה בשל יחס דילול נמוך והצטמקות ג'ל. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: בניסוי זה לא זוהתה פעילות וכמעט ולא היו תאים. סיבות אפשריות הן הג'ל להיות חם מדי, ייבוש של המדגם להיות אגרסיבי מדי או ללא כובע מגן (א)תמונות פלואורסצנטיות שצולמו ב 40 דקות(ב)תמונות פלואורסצנטיות שצולמו ב 60 דקות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: אובדן מיקוד וצילום. תמונות עוקבות של (a) עד (d) נרכשו במרווחי זמן של 15 דקות באמצעות מערכת מיקוד אוטומטית. ראה וידאו משלים 2. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6:מפת פלסמיד של Pteto המסדירה את GFP. ללא מדכא TetR, מקדם PtetO פועל כמקדם מכונן. המעגל משוכפל על פלסמידים של מספר עותק נמוך. פלסמיד זה משמש כבסיס למדידת SNR עבור כל מעגל שהשתנה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7:מפת פלסמיד של Pteto המסדירה את SFGFP. ה- SFGFP מותך לתג השפלה של AAV. המעגל משוכפל על פלסמידים של מספר עותק נמוך. SFGFP-AAV הוא גרסה חזקה יותר של GFP, בעוד תג AAV מה שהופכים אותו רגישים השפלה על ידי פרוטאזות משק הבית של קולי Escherichia. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8: מפת פלסמיד של מעגל משוב חיובי. המעגל הוא המושרה על ידי מדר AHL, אשר קושר גורם שעתוק LuxR. מקדם PluxR, אשר מוסדר על ידי קומפלקס AHL-LuxR, פעיל הייצור של LuxR ו SFGFP-AAV. המעגל משוכפל על פלסמידים של מספר עותק נמוך. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 9:הדינמיקה של צמיחת זן Escherichia coli MG1655 במדיה מינימלית כוללת (א)PtetO-GFP, צמיחה אקספוננציאלית של כ -35 דקות. התמונות של ניסוי זה מוצגות באיור 2 (ב)PtetO-sfGFP, גידול אקספוננציאלי של כ-35 דקות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 10: רמת עוצמת פלואורסצנט, מנורמלת לפיקסל ונרכשת במרווחים של 20 דקות.
תאים מאויתים לפי אזור, כדי למזער ממצאים. התאים מחולקים על ידי האזור שלהם בריבוע מיקרומטר (a) Pteto- GFP מעגלהחזרה הראשונה לעוצמה ב 210 דקות הוא 0.004 a.u (b) PtetO-SfG החזרה הראשונה במעגל ה-PFP לעוצמה של 210 דקות היא אות 0.022 a.u(c)נמדד של מעגל Pteto-GFP (ד)אות נמדד של מעגל PtetO-SFGFP. כל הנתונים הניסיוניים מייצגים ממוצע של שלושה ניסויים. התוכנה יכולה למיין אזור תא לקבוצות שונות (a) ו - (b) להציג גרפים עבור ארבעה טווחי אזור תא המייצגים את מחזור החלוקה. האזור הראשון של 14 מיקרומטר מייצג תאים לאחר החלוקה, שכן סביר להניח שתאים לאחר החלוקה יהיו הקטנים ביותר. האזור השני של 21 מיקרומטר מייצג תאים לפני החלוקה. אזורים שלישיים ורביעיים מייצגים תאים בחלוקה מכיוון שהאזור הכולל מוכפל בשניים (29 ו- 36 מיקרומטר) כדי לשקול תאים שלקח להם זמן רב יותר להתחלק. האזורים נבחרו על ידי הערכה ידנית של הנתונים השמסתכלים על תמונות מיקרוסקופיות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 11: סטיית תקן (STD) של עוצמות פלואורסצנטיות של תא יחיד עבור: (a) PtetO-GFP מעגל החזרה הראשונה עבור STD ב 210 דקות הוא 0.001865 a.u (b) PtetO-SFGFP מעגל החזרה הראשונה עבור STD ב 210 דקות הוא 0.01477 a.u(c)STD של מעגל Pteto-GFP (ד)STD של PtetO- מעגל GFPSF. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 12: SNR של עוצמות פלואורסצנטיות של תא יחיד. אנו מחשבים את SNR = ממוצע / STD (א)PtetO- GFP מעגל החזרה הראשונה עבור SNR ב 210 דקות הוא 1.309 a.u(b)PtetO-sהחזרה הראשונה של מעגל GFP עבור SNR ב- 210 דקות היא 1.29 a.u (c) שלוש חזרות של מדידת GFP (ד) שלוש חזרות של מדידת SFGFP. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 13: SNR של עוצמות פלואורסצנטיות של תא יחיד (a)PluxR-SFGFP מעגל SNR לתגובת רוויה AHL (b) PluxR-SFGFP מעגל SNR לתגובה במחצית זמן AHL. SNR של משוב חיובי מעגל מוסדר AHL גבוה יותר SNR עבור מעגל GFP SFמכונן. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 14: היסטוגרמות של מעגלי הגנים המבוססות על מנתח הזרימה: נתונים ניסיוניים (כחול) ונתוני מודל סטוכסטי (אדום). ציר x מייצג יחידות פלואורסצנטיות שרירותיות מציטומטריית זרימה, וציר y מייצג את תדירות התאים המייצרים את רמת הפלואורסצנטיות המתאימה. הנתונים נמדדו באמצעות מנתח זרימה לאחר שלוש שעות. פלואורסצנטיות GFP כמתה על ידי עירור באורך גל של 484 ננומטר ופליטה באורך גל של 510 ננומטר. מתחי סינון PE-TexasRed שימשו בדוגמת תפוקה גבוהה למדידת רמות ביטוי GFP. מתחי מנתח הזרימה הותאמו באמצעות תוכנה כך שניתן יהיה למדוד את רמות הביטוי המרביות והמינימליות באותן הגדרות מתח. לכן, מתחים עקביים שימשו על פני כל ניסוי. אותם מתחים שימשו לחזרות הבאות של אותו ניסוי. ההתאמה נעשתה על ידי שימוש בהפצת גמא31. שיטה זו מניחה כי האות תלוי בעיקר בהפצה אקראית של פלסמידים ( a )מדידהשל Pteto-GFP שיבוט על פלסמיד מספר עותק נמוך. ניסוי CV =0.46, דגם CV = 0.32 (ב) מדידה של Pteto-SFGFP-AAV משובט על פלסמיד מספר עותק נמוך. CV ניסיוני = 0.86, דגם CV = 0.44. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 15: היסטוגרמות של מעגלי הגנים המבוססות על מיקרוסקופ: נתונים ניסיוניים (קווים מנוקדים) ונתוני מודל סטוכסטי (קווים מוצקים). ציר x מייצג יחידות פלואורסצנטיות שרירותיות ממיקרוסקופ הפוך וציר y מייצג את תדירות התאים המייצרים את רמת הפלואורסצנטיות המתאימה. ההתאמה נעשתה באמצעות התפלגות גמא MATLAB31,32 ( a )מדידהשל PtetO-GFP שיבוט על פלסמיד מספר עותק נמוך (ב) מדידה של PtetO-SFGFP-AAV משובט על מספר עותק נמוך. ההשוואה מראה שהפרוטוקול שלנו מקבל ערכי CV דומים כמו בניסוי מנתח זרימה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור משלים 1: ארבעה יחסי דילול, בין 1:500 ל- 1:20, עבור זן MG1655. הגרף מראה כי אם הצפיפות הראשונית גבוהה, חומרים מזינים LB הם בשפע וכתוצאה מכך תאים מתחלקים מהר יותר. לדילול של 1:500, צפיפות התאים נותרה קבועה. עבור דילול 1:100, צפיפות התא גדלה לאט. עבור דילול של 1:50, צפיפות התאים עלתה בקצב חלוקה מתון ללא עיכוב משמעותי בדגירה של 250 סל"ד. לדילול של 1:20, צפיפות התא הגיעה מהר לרוויה. בחרנו ביחס דילול של 1:30, המאפשר דגירה קצרה להגעה לצמיחה אקספוננציאלית וטווח חלוקה משמעותי להשגת רוויה גבוהה בשיעור חלוקה מתון. אנא לחץ כאן כדי להוריד דמות זו
איור משלים 2: עיבוד תמונות שדה בהיר. (א)תמונות בעוצמת נתונים גולמית מערוץ השדה הבהיר ממערכת המיקרוסקופ. (ב)טיפול בשיפור הניגודיות של התמונה כדי לשפר את ההפרדה בין אובייקטי התא מהרקע. (ג)זיהוי גבולות תאים בהתבסס על מסנן קונבולוציה33 ועל סף כללי מבוסס בינאריזציה34. (ד)35 פעולות מורפולוגיות של סגירה ומילוי לזיהוי גבולות מושבת התאים. אנא לחץ כאן כדי להוריד דמות זו
איור משלים 3: רקע מושבת תאים\פילוח קידמה. כדי למזער את השפעת הרעש אנו מנסים לזהות גבולות מושבת תאים ולחלץ אותם מרעש הג'ל. (א)פעולת בינאריזציה של תמונה על שיפור ניגודיות המבוססת על סף מסתגל לזיהוי אובייקטי תא36. (ב)כפל מטריקס של מטריצות המוצגות ב- S2d ו- S3a מסננות בהצלחה את רוב הרעשים ומבדילות רעשי ג'ל מתאים. גבולות מסוימים אינם נפתרים במלואם. (ג)זיהוי גבולות תא באמצעות אלגוריתם קו פרשת מים37 המבוסס על המרת מרחק38. (ד)כפל מטריקס של מטריצות המוצגות ב- S3b וב- S3c פותרות בהצלחה תאים בודדים. אנא לחץ כאן כדי להוריד דמות זו
איור משלים 4: פילוח תא בודד. (א)מוצר מקוטע של תמונת שדה בהיר. ניקוי נוסף הוא preformed מבוסס על אזור התא gating וצורה, השלכת בועות עגולות. (ב)תמונות אות פלואורסצנטיות שנרכשו ממיקרוסקופ. (ג)כפל מטריקס של מטריצות המוצגות ב- S4a וב- S4b מחלץ בהצלחה את האות של תאים בודדים. אנא לחץ כאן כדי להוריד דמות זו
איור משלים 5: אובדן מונולייר. (a)תמונת שדה בהירה של שכבת תא ב-840 דקות (14 שעות) של Pteto המווסתת את מעגל GFP המוצג באיור 2 במאמר כניסוי טוב. בצד ימין של אובדן תמונה מיקרוסקופי של monolayer ניתן לזהות. (ב) תמונת פילוח תוכנה. עקב אובדן של תאים monolayer מפוצלים ינוקה בסיס על gating באזור. (ג) תמונת פלואורסצנטיות מראה כי בצד ימין של התמונה אין תאים ניתן לפתור אות נמוך של תאים בצד שמאל של התמונה עקב אובדן של monolayer. (ד)תמונת פילוח בשילוב עם תמונת פלואורסצנטיות. אנא לחץ כאן כדי להוריד דמות זו
וידאו משלים 1. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה
וידאו משלים 2. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה
וידאו משלים 3. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה
cell_growth_rate_fit.m, cell_growth_rate_fit.m. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה
compare_experiments.m. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה
Count_Cells.m. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה
main_code.m. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בעבודה זו פיתחנו פרוטוקול המאפשר מעקב ממוחשב אחר תאים חיים של Escherichia coli, בעקבות חלוקה ורמות פלואורסצנטיות על פני תקופה של שעות. פרוטוקול זה מאפשר לנו לכמת את הדינמיקה הסטוצ'סטית של מעגלים גנטיים ב Escherichia coli על ידי מדידת CV ו SNR בזמן אמת. בפרוטוקול זה השווינו את ההתנהגויות הסטוצ'סטיות של שני מעגלים שונים כפי שמוצג באיור 10. הוכח כי פלסמידים עם מספרי עותק נמוך נוטים יותר אפקטים stochastic ופחות מושפע חלוקת התא. המעגל הראשון ביטא באופן מכונן GFP (איור 10a), והמעגל השני ביטא באופן מכונן GFP SFהתמזגו לתג השפלה ssrA (איור 10b). על מנת לכמת את ההתנהגות הסטוצ'סטית של חלבוני הפלואורסצנט, הקלטנו גם את תמונות השדה הבהיר. התוצאות מראות כי הביטוי של GFP, במיוחד בגיל ההתבגרות שלה39, הוא מקור הרעש הדומיננטי. דפוס התנהגות השן התקופתי שנצפה באיור 10a יכול להיות מוסבר על ידי התהליך האקראי של חלוקת התאים והקנה מידה ארוך השנים של התבגרות GFP (~ 50 דקות). לעומת זאת, אות ה- SFGFP של המעגל השני התייצב במהלך המדידה, מכיוון שזמן ההתבגרות הקצר מאוד של ה- SFGFP (~ 6 דקות). פיתחנו נוסחה פשוטה המתארת את רמת ה- GFP בשני המעגלים כאשר אנו לוקחים בחשבון רק את תהליך חלוקת התאים וזמן ההתבגרות של GFP. בזמן נתון, t, אנו מניחים כי ישנם x מספרי עותק של חלבונים, μ מספרי עותק של פלסמידים. ניתן לתאר את מספר עותק החלבון על ידי:
1.3
1.4
כאשר בוחנים רק אירועי חלוקה; 
לאחר התבגרות החלבון וכך עבור פלסמידים ספציפיים אנו מקבלים:
עבור GFP ( 
): 1.5
עבור SFGFP ( 
):1.6
לאחר מכן, הסדרה המפותחת של SFGFP:
1.7
במקרה זה 
, אנו משיגים 
. תוצאה זו יכולה להיות מוסברת כדלקמן. כאשר x קטן, רמות SFGFP גדלות בכמות קטנה. כאשר x גדול, SFGFP מתפרק למצב יציב. באופן דומה, עבור המעגל של GFP, כל תא מכיל כ 10 יחידות של GFP, אבל מאז זמן התבגרות עבור GFP הוא ארוך יותר מאשר מיטוזה, דפוסי שיניים מסור משפיל של עוצמות פלואורסצנטיות נצפו. במודל, הנחנו כי שכפול של plasmid הוא מהיר מספיק כי חלוקת פלסמיד נשאר קבוע לפני ואחרי החלוקה. תג ההשפלה ssrA מפחית לעתים קרובות את זמן מחצית החיים של החלבון משעות לפחות משעה5 ומוביל למצב יציב ומהיר. הראינו שהשיטה מספקת גם התפלגות דומה לזו הנמדדת עם מנתח זרימת אוכלוסייה גבוהה וכי קורות החיים של התפלגות זו שווים או קטנים יותר מאשר קורות החיים של מנתח הזרימה.
בעוד מספר שיטות3,7,18 פותחו להדמיית תאים חיים, השיטה המוצגת כאן מותאמת במיוחד Escherichia coli. חיידק זה דורש מדיה מיוחדת וגישה שונה במקצת. לפרוטוקול יש את התכונות החשובות הבאות: (1) קביעת יחס דילול ספציפי לחיידקים ולמתח בתחילת הצמיחה המעריכית ולא בשלב האמצעי (צמיחה אקספוננציאלית ללא טלטול) (2) Escherichia coli החלוקה הטובה ביותר ב 37 °C (69 °F), אבל ב 37 °C (69 °F) ג'ל מדיה מינימלי מאבד מים במהירות מה שמוביל הצטמקות וחוסר יציבות. הפרוטוקול כאן מתגבר על אתגר זה (3) תחילה אנו מיישמים את דגימת החיידקים ולאחר מכן אוטמים אותה בג'ל נוזלי. מאז המדגם לכוד בין תחתית הזכוכית ג'ל אנו דורשים ג'ל כי (I) מאפשר חילופי גזים כדי למנוע חיתוך כיסי אוויר, (II) נשאר נוזלי בטמפרטורות נמוכות כמו Escherichia coli רגישים לחום ו (III) מוודא המדגם לא יהיה מעורבב בתוך הג'ל הנוזלי. הג'ל נשאר נוזלי ב 37 מעלות צלזיוס, עם זאת, אנו ממליצים להשתמש בכובע מגן על גבי המדגם כדי למנוע חום מוגזם וערבוב מדגם בתוך הג'ל (4) גישה זו דורשת ציוד פשוט וגנרי (5) ניתן למדוד דגימות ישירות ללא התחממות מוקדמת, כך שאין אובדן אירועי חלוקה (6) הפרוטוקול, הכולל את שלבי המעבדה הרטובה ואת התוכנה האוטומטית המותאמת אישית, יכול לשמש לחקר ההתנהגות הסטוצ'סטית של מעגלים גנטיים כגון כימות ה- SNR וה- CV השווינו את שיטת המיקרוסקופיה לתוצאות מנתח זרימה על מנת לאמת את השימוש באוכלוסיות קטנות של תאים ולהקים בסיס להשוואה על פי CV (7) התוכנה מאפשרת לנו לזהות תאים על המונולאייר ללא התערבות אנושית ולנתח רעש מוחלט. כלי תוכנה כגון ImageJ18 או Schnitzcells דורשים זיהוי ידני של תאים ומאתגרים להתאמות.
כאשר באופן רציף הדמיה של מושבות תאים חיים, לתכנן את הניסוי תוך התחשבות במספר פרמטרים פיזיים מורכבים, כגון מתח הסלולר ורעילות, קצב דלדול משאבים, נמק זמן השפלה של מעוררים וכימיקלים. הפרוטוקול מאפשר מדידה אמינה של עד חמש שעות. הניסויים שלנו מראים כי Escherichia coli לסנכרן בעת חלוקה במושבות מיקרו, monolayer (וידאו משלים 3). אנו מניחים כי הג'ל אחיד מבחינת משאבים וקשיחות, לתאים יש התנהגות דומה, ותחום התאורה מעט גדול יותר משדה הראייה. לכן, כל תא צריך לייצר את אותו אות ונתונים סטטיסטיים, אשר ניתן לאסוף כפי שהראינו על ידי השוואת CV שהושג בדרך זו למדידה עם מנתח זרימה. על מנת למדוד רעש בתנאים ראשוניים קבועים לפרקי זמן ארוכים יותר, נשקול להשתמש בשבבים מיקרופלואידיים בעתיד. יתרונות נוספים של מכשיר כזה הם שמירה על עמדות קבועות של תאים מיקוד יציב10. ובכל זאת, עיצוב, ייצור של שבבים מיקרופלואידיים ו priming לניסויים דורשים הכשרה, ציוד ספציפי (מותאם אישית בזמנים) וזמן. מסיבה זו, כדאי להשתמש במיקרוסקופיה לשגות זמן כפי שמוצג בפרוטוקול זה כדי לרכוש הבנה כללית של המעגל.
הפרוטוקול המוצע והתוכנה המפותחת מאפשרים מדידות הניתנות לשחזור, מהן פשוט להפיק גרפים. זה גם מאפשר בדיקה והשוואה של רעש מוחלט ניתן לשנות למדידת רעש מהותי ו extrinsic. השיטה מבוססת על חומרים גנריים או קלים להזמנה, משותפת בגלוי, קל לשימוש תוכנה ואינה דורשת הכשרה ספציפית. הראינו כי האוכלוסייה הנמדדת על ידי מיקרוסקופיה גדולה מספיק כדי להשיג נתונים משמעותיים על ידי השוואת השיטה CV לזה שהושג עם מנתח זרימה. לכן, אנו יכולים להקים בהצלחה בסיס SNR באמצעות פרוטוקול זה ולהשוות אותו למעגלי גנים מורכבים יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים למר גיל גלברט (הפקולטה להנדסת חשמל בטכניון) על הסיוע בקוד MATLAB. אנו מודים לד"ר שימינג לי (הפקולטה להנדסה ביו-רפואית בטכניון) על שסייע בהגהה של מאמר זה. מחקר זה נתמך בחלקו על ידי קרן משפחת נויבאואר ומשרד המדע הישראלי, מענק 2027345.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35mm glass dish | mattek | P35G-0.170-14-C | thickness corresponding with microscope lense. |
| Agarose | Lonza | 5004 | LB preperation |
| AHL | Sigma-Aldrich | K3007 | inducer |
| Bacto tryptone | BD - Becton, Dickinson and Company | 211705 | LB preperation |
| Carb | Invitrogen | 10177-012 | antibiotic |
| Carb | Formedium | CAR0025 | antibiotic |
| Casamino acids | BD - Becton, Dickinson and Company | 223050 | minimal media solution |
| eclipse Ti | nikon | inverted microscope | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | minimal media solution |
| Glyserol | Bio-Lab | 000712050100 | minimal media substrate |
| Immersol 518F | zeiss | 4449600000000 | immersion oil |
| M9 salt solution | Sigma-Aldrich | M6030 | minimal media solution |
| NaCl | Bio-Lab | 214010 | LB preperation |
| Noble agar | Sigma-Aldrich | A5431 | minimal media substrate |
| parafilm tape | Bemis | PM-996 | refered to as tape in text |
| Seaplaque GTG Agarose | Lonza | 50111 | minimal media substrate |
| thaymine B1 | Sigma-Aldrich | T0376 | minimal media solution |
| Yeast Extract | BD - Becton, Dickinson and Company | 212750 | LB preperation |
References
- Daniel, R., Rubens, J. R., Sarpeshkar, R., Lu, T. K. Synthetic analog computation in living cells. Nature. 497, 619-623 (2013).
- Yang, X. S. Y., L, A. B. Imaging Bacterial Molecules, Structures and Cells. Harwood, C., Jensen, G. , (2016).
- Joyce, G., Robertson, B. D., Williams, K. J. A modified agar pad method for mycobacterial live-cell imaging. Biomedcentral Research Notes. , (2011).
- Cotlet, M., Goodwin, P. M., Waldo, G. S., Werner, J. H. A comparison of the fluorescence dynamics of single molecules of a green fluorescent protein: One- versus two-photon excitation. ChemPhysChem. , (2006).
- Andersen, J. B., et al. New unstable variants of green fluorescent protein for studies of transient gene expression in bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 64, 2240-2246 (1998).
- Barger, N., Litovco, P., Li, X., Habib, M., Daniel, R. Synthetic metabolic computation in a bioluminescence-sensing system. Nucleic Acids Research. , (2019).
- Young, J. W., et al. Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy. Nature Protocols. , (2012).
- Swain, P. S., Elowitz, M. B., Siggia, E. D. Intrinsic and extrinsic contributions to stochasticity in gene expression. Proceedings of the National Academy of Science United States. , (2002).
- Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic gene expression in a single cell. Science. , (2002).
- Baumgart, L., Mather, W., Hasty, J. Synchronized DNA cycling across a bacterial population. Nature Genetics. , (2017).
- Arriaga, E. A. Determining biological noise via single cell analysis. Analytical and Bioanalytical Chemistry. , (2009).
- Nielsen, A. A. K., et al. Genetic circuit design automation. Science. , (2016).
- Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. Regulation of noise in the expression of a single gene. Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).
- Pedraza, J. H., Van Oudenaarden, A. Noise propagations in gene networks. Science. , (2005).
- Jennifer, A. N. B., Christopher, A. V. Principles of genetic circuit design. Nature Methods. , (2014).
- Aoki, S. K., et al. A universal biomolecular integral feedback controller for robust perfect adaptation. Nature. , (2019).
- Hanna, H. A., Danial, L., Kvatinsky, S., Daniel, R. Cytomorphic Electronics with Memristors for Modeling Fundamental Genetic Circuits. 4545, (2020).
- de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. W. Live cell imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using automated time-lapse microscopy. Journal of Visualized Experiments. , (2011).
- Eling, N., Morgan, M. D., Marioni, J. C. Challenges in measuring and understanding biological noise. Nature Reviews Genetics. , (2019).
- Thattai, M., Van Oudenaarden, A. Attenuation of noise in ultrasensitive signaling cascades. Biophysical Journal. , (2002).
- Thattai, M., Van Oudenaarden, A. Intrinsic noise in gene regulatory networks. Proceedings of the National Academy of Science United States. , (2001).
- Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene regulation at the single-cell level. Science. , (2005).
- Van Der Ziel, A. Noise in Measurements. , Wiley & Sons Inc. (1976).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. , (1989).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: Image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. , (2006).
- Paintdakhi, A., et al. Oufti: An integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis. Molecular Microbiology. , (2016).
- Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis. Nature Microbiology. , (2016).
- Stylianidou, S., Brennan, C., Molecular, S. B. N. SuperSegger: robust image segmentation, analysis and lineage tracking of bacterial cells - Stylianidou - 2016 - Molecular Microbiology. , Wiley Online Library. (2016).
- Balomenos, A. D., et al. Image analysis driven single-cell analytics for systems microbiology. Biomedcentral System Biology. , (2017).
- Smit, J. H., Li, Y., Warszawik, E. M., Herrmann, A., Cordes, T. Colicoords: A Python package for the analysis of bacterial fluorescence microscopy data. PLoS One. , (2019).
- Guido, N. J., et al. A bottom-up approach to gene regulation. Nature. , (2006).
- Beal, J. Signal-to-noise ratio measures efficacy of biological computing devices and circuits. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. , (2015).
- Marr, D., Hildreth, E. Theory of edge detection. Proceedings of the Royal Society - Biology Science. 207, 187-217 (1980).
- Otsu, N. Threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Transactions Systems Man Cybernetics. , (1979).
- Soille, P. Morphological Image Analysis: Principles and Applications, Second edition. , (2000).
- Bradley, D., Roth, G. Adaptive Thresholding using the Integral Image. Journal of Graphics Tools. , (2007).
- Meyer, F. Topographic distance and watershed lines. Signal Processing. , (1994).
- Maurer, C. R., Qi, R., Raghavan, V. A linear time algorithm for computing exact Euclidean distance transforms of binary images in arbitrary dimensions. IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine. , (2003).
- Millo, R., Phillips, R. What is the maturation time for fluorescent proteins. Cell Biology by Numbers. , (2015).
