Summary
Diese Arbeit stellt eine Mikroskopiemethode vor, die eine Live-Bildgebung einer einzelnen Zelle von Escherichia coli zur Analyse und Quantifizierung des stochastischen Verhaltens synthetischer Genkreise ermöglicht.
Abstract
Das hier entwickelte Protokoll bietet ein Tool, um die Computerverfolgung der Escherichia coli-Division und der Fluoreszenzüberschüsse über mehrere Stunden hinweg zu ermöglichen. Der Prozess beginnt mit einem Screening auf Kolonien, die auf minimalen Medien überleben, vorausgesetzt, dass nur Escherichia coli, die das richtige Plasmid beherbergt, in der Lage sein wird, unter den spezifischen Bedingungen zu gedeihen. Da der Prozess des Aufbaus großer genetischer Schaltkreise, der die Montage vieler DNA-Teile erfordert, eine Herausforderung darstellt, werden Schaltkreiskomponenten oft zwischen mehreren Plasmiden in verschiedenen Kopiernummern verteilt, die den Einsatz mehrerer Antibiotika erfordern. Mutationen im Plasmid können die Transkription der Antibiotikaresistenzgene zerstören und mit Ressourcenmanagement in der Zelle intervenieren, was zu Nekrose führt. Die ausgewählte Kolonie wird auf einer Glasboden-Petrischale gesetzt und einige Fokusebenen werden für die Mikroskopie-Tracking in hellen Feld- und Fluoreszenzdomänen ausgewählt. Das Protokoll behält den Bildfokus für mehr als 12 Stunden unter anfänglichen Bedingungen, die nicht reguliert werden können, was einige Schwierigkeiten verursacht. Zum Beispiel beginnen sich abgestorbene Zellen im Fokusfeld der Linsen nach ein paar Stunden der Bildgebung anzusammeln, was dazu führt, dass sich Giftstoffe ansammeln und das Signal verschwimmt und zerfällt. Der Erschöpfungswert von Nährstoffen führt zu neuen Stoffwechselprozessen und behindert die gewünschte Reaktion des Kreislaufs. Die Temperatur des Experiments senkt die Wirksamkeit von Induktoren und Antibiotika, was die Zuverlässigkeit des Signals weiter beeinträchtigen kann. Das minimale Mediengel schrumpft und trocknet, und dadurch ändert sich der optische Fokus im Laufe der Zeit. Wir haben diese Methode entwickelt, um diese Herausforderungen in Escherichia colizu überwinden, ähnlich wie frühere Arbeiten, die analoge Methoden für andere Mikroorganismen entwickeln. Darüber hinaus bietet diese Methode einen Algorithmus zur Quantifizierung des gesamten stochastischen Rauschens in unveränderten und veränderten Zellen und stellt fest, dass die Ergebnisse mit den Strömungsanalysevorhersagen übereinstimmen, wie ein ähnlicher Variationskoeffizient (CV) zeigt.
Introduction
Synthetische Biologie ist ein multidisziplinäres Feld, das in den letzten zehn Jahren entstanden ist und darauf abzielt, technische Designprinzipien in rationales biologisches Design zu übersetzen1,2,3, in dem Bemühen, Multi-Signal-Integration und Verarbeitung in lebenden Zellen für das Verständnis der grundlegenden Wissenschaft4,5, diagnostische, therapeutische und biotechnologische Anwendungen6,7,8,9,10zu erreichen. Unsere Fähigkeit, die Input-Output-Antwort synthetischer Genkreise zu quantifizieren, wurde durch die jüngsten Fortschritte in der Einzelzelltechnologie, einschließlich des Durchflussanalysators und der Live-Zell-Bildgebung mittels automatisierter Zeitraffermikroskopie11, revolutioniert. Ein Strömungsanalysator wird häufig verwendet, um das Ansprechen dieser Schaltkreise im stationären Zustand1,12, und invertierte Mikroskopie wird verwendet, um die dynamische Reaktion von synthetischen Genkreisen auf der Ebene einer einzelnen Zelle3zu messen. Zum Beispiel, eine der frühen Arbeiten in der synthetischen Biologie beinhaltete den Aufbau von genetischen Oszillator-Netzwerken in lebenden Zellen mit negativen Rückkopplungsschleifen mit einer Verzögerung3. Später wurden die genetischen Oszillator-Schaltungen angewendet, um die metabolische Kontrolle in der dynamischen Umgebung der lebenden Zellen zu verstehen4. Die automatisierte Zeitraffermikroskopie ist eine Methode, um solche Schaltkreise zu charakterisieren. Wir vermuten, dass die Wirtszellen, Escherichia coli, bei der Bildung von Mikrokolonien synchronisieren, was die Messung von Signal und die Berechnung von Rauschen ermöglicht, ohne genaue Mutter-Tochter-Beziehungen zu verfolgen.
Lärm ist ein grundlegender, inhärenter Aspekt biologischer Systeme, die oft aus mehreren Quellen stammen. Man denke beispielsweise an biochemische Reaktionen mit Signalen, die aus dem Transport diskreter Zufälliger Träger wie die Diffusion von Proteinen13stammen. Diese Signale verbreiten sich mit zufälligen Schwankungen14. Weitere Lärmquellen sind Ressourcenverfügbarkeit, Zellteilung und Schwankungen der Umgebungsbedingungen wie Temperatur, Luftfeuchtigkeit und Druck. Biologische Signale, die sich in synthetischen Genkreisen ausbreiten, haben oft ein sehr niedriges Signal-Rausch-Verhältnis (SNR), das die Leistung solcher Schaltkreise stört. Daher bleibt das genetische Schaltungsdesign einer der anspruchsvollsten Aspekte der Gentechnik15. Im Gegensatz zu den meisten Ansätzen, die nur die mittlere Genexpression berechnen (gemessen über die gesamte Zellpopulation), wird die Varianz des gemessenen Signals berücksichtigt, um ein vorhersagbares Verhalten durch synthetische Gennetzwerke zu entwickeln12. Daher spielen die Variabilitäts- oder Rauschengrade in der Proteinexpression eine dominierende Rolle bei der Gestaltung und Leistung analoger und digitaler Genkreise1,16,17.
Viele Ansätze wurden entwickelt, um die Zell-zu-Zell-Variabilität zu quantifizieren, unter anderem in Escherichia coli3,7,18. Diese Methoden werden häufig verwendet, um Genaktivierung und Stoffwechselwege zu studieren, jedoch mit weniger Fokus auf die Untersuchung der stochastischen Lärmdynamik, wie das Messen und Entwirren spezifischer Lärmquellen, insbesondere für genetische Schaltkreise in lebenden Zellen, wo dies eine grundlegende Herausforderung ist19,20,21. Mehrere Faktoren, die sowohl an den Schaltkreis selbst (intrinsisch) vererbt als auch von den Wirtszellen abgeleitet werden (extrinsisch), können die kontinuierliche Leistung genetischer Schaltkreise stören. In diesem Beitrag haben wir ein Protokoll entwickelt, das darauf abzielt, das Gesamtrauschen in Escherichia coli-Zellen zu quantifizieren, einschließlich der intrinsischen und extrinsischen Lärmquellen6,22. Durch quantifizieren des Gesamtrauschens und anschließende Bewertung des SNR23kann die Konstruktion von Genkreisläufen verbessert werden. Diese Methode kann modifiziert werden, um unabhängige Rauschquellen getrennt zu messen, indem mehrere fluoreszierende Proteine6,20überwacht werden. Für das hier beschriebene Protokoll halten wir die Umgebungsbedingungen gut kontrolliert und messen kontinuierlich die Aktivität von Zellen ohne Einfluss externer Faktoren. Wir messen das Signal von fluoreszierenden Proteinen in einzelnen Zellen im Laufe der Zeit und stellen es gleichzeitig unter einem Agarosesubstrat ab. Die resultierenden Bilder werden mit dem kundenspezifischen MATLAB des Labors analysiert.
Im Idealfall wird die kontinuierliche Messung der Echtzeitaktivität von fluoreszierenden Proteinen in einer Zelle genaue Daten durch das Wachstum und die Teilung der Zellen erzeugen. Es ist jedoch schwierig, solche Daten zu erfassen. Dies ist auf den Abbau von fluoreszierenden Proteinen, bekannt als Photobleichung7, zurückzuführen, wenn sie im Anregungsprozess Strahlung ausgesetzt sind. Darüber hinaus sind Escherichia coli Zellen auch empfindlich für die Anregung, die zu Phototoxizität führen könnte7. Beide Ausgaben begrenzen die Anzahl der fotorahmen, die erworben werden können, und die Zeit zwischen den Akquisitionen. Eine entscheidende Rolle spielen auch die Substrat- und Mitteltypen (z.B. Lysogeny-Brühe), die zum Wachstum der Zellen während der Bildgebung verwendet wird. Wir empfehlen dringend die Verwendung von minimalem Medium, das den nicht fluoreszierenden Hintergrund minimiert und die Zellteilungszeit verlängert.
Darüber hinaus muss die Probe unter Berücksichtigung der folgenden Anforderungen vorbereitet werden (1) Niedrige Zellteilungsrate ermöglicht weniger häufige Expositionen für die genaue Abbildung des Teilungszyklus und die Verringerung der Wahrscheinlichkeit von Phototoxizität und Photobleichungen. Wir stellen die Erfassungszeit auf etwa die Hälfte der vorhergesagten Mitosezeit (2) Niedrige Zelldichte zu Beginn des Experiments ermöglicht eine bessere Homogenität und Nachverfolgbarkeit der Teilung. Die Zelldichte wird durch das Verdünnungsverhältnis der Escherichia coli-Zellen beeinflusst, das ein wichtiger Parameter für den Erfolg dieses Protokolls ist und für jedes Labor bestimmt werden muss. Um das Verhältnis zu ermitteln, sollte jeder neue Escherichia coli-Stamm oder jede verwendete Form mit Wachstumsratendiagrammen versehen werden (Zusatzabbildung 1). Ein angemessenes Verhältnis wurde erreicht, wenn Zellen nach einer kurzen Inkubation von einer Anfangsdichte von etwa OD600nm = 0,1 ohne zusätzliches Schütteln wachsen können. Zellen in dieser Phase teilen sich nur nach der Umgebungstemperatur (3) Einschränkung der Zellbewegung: Die Zellbewegung hängt stark von der Festigkeit des Substrats (Agarosepad) ab. Die Festigkeit des Substrats hängt von der Menge der gesamten Agarose und der Gelerstarrungszeit ab. Gele können nicht über Nacht bei Raumtemperatur erstarren, da die Escherichia coli an Einer Mitose erleidet. Andere Faktoren, die die Substratstabilität beeinflussen, sind die Wassermenge in der Probe und die Feuchtigkeit. Weitere Fragen werden in den repräsentativen Ergebnissenausführlich erörtert. Dieses Protokoll bietet viele Details und wechselt schrittweise von einem Schritt zum anderen. Das Protokoll bietet lange Stabilität für Bildgebungsexperimente und bietet ein grundlegendes Bildverarbeitungswerkzeug.
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Protocol
1. Medien- und Kulturvorbereitung
- Bereiten Sie die Stammlösung von 1.000x Carbenicillin (50 mg/ml) oder relevantem Antibiotikum vor.
- . Wiegen Sie 0,5 g Carbenicillin. 10 ml sterilhh2O. vollständig auflösen.
- Sterilisieren Sie Carbenicillin-Lager durch einen 0,22 m Spritzenfilter. Aliquot die Antibiotikum-Lösung und lagern bei -20 °C.
- Zur Herstellung von Lysogeny-Brühe (LB) Platten, mischen 5 g Trypton, 5 g NaCl, 2,5 g Hefeextrakt und 7,5 g Bacto Agar mit 0,5 L sterilhH2O. Autoklavier die Lösung bei 121 °C für 20 min.
- Untertauchen Sie die geschmolzene Gelmischung teilweise in einem 50 °C Wasserbad. Fügen Sie 1.000 l Carbenicillin (50 mg/ml) hinzu.
- Bereiten Sie Petrigerichte in einer sterilen Umgebung zu. Lassen Sie die Teller vor dem Aufbewahren im Kühlschrank.
- Für M9-Mindestmedien separate Lagerlösungen aus den folgenden 5x M9-Salzen (56,4 g/L), 2 M Glukose und 2% biotinfreien Kasaminosäuren zubereiten. Autoclavieren Sie die Lösungen bei 121 °C für 20 min.
- Um 5 Petriplatten herzustellen, mischen Sie 1125 mg niedrigschmelzender Agar und 400 mg Agar mit 89,2 ml minimalem Medium (1x M9). 10 ml 2% Casaminosäuren (2% [vol/vol]) in einen 250 ml ErlenmeyerKolben geben.
HINWEIS: Achten Sie darauf, die Medien auf die inneren Lippen des Kolbens zu gießen. - Mikrowelle der Lösung in kurzen Bursts von 3 bis 4 Sekunden. Wiederholen Sie den Vorgang, bis die Lösung klar ist.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie den Siedepunkt nicht erreichen. - Den 250 ml Erlenmeyerkolben in ein Warmwasserbad (60 °C) legen, um ihn durch Diffusion weiter zu mischen, und ihn abkühlen lassen, bis seine Temperatur auf etwa 45-50°C fällt.
- Zünden Sie die Flamme an der Plattengießbank an.
- Fügen Sie schnell alle Lösungen in der folgenden Reihenfolge hinzu:
800 l von 50% Glycerin (0,4% [vol/vol])
100 l Thiamin (B1)
1100 l Glukose (2M)
100 l Carbenicillin (50 mg/ml). - Wirbeln Sie den Erlenmeyerkolben, um eine gleichmäßige Verteilung aller Zutaten im gesamten Agar zu gewährleisten.
- Öffnen Sie eine Platte nach der anderen neben der Flamme und beginnen Sie zu gießen.
- Lassen Sie die Platten für ein paar Minuten bis zur ersten Erstarrung.
- Drehen Sie die Platten auf den Kopf, um zu verhindern, dass Wasserkondensation auf das Gel tropft.
- Lassen Sie die Platten bei Raumtemperatur für ca. 2 h erstarren.
- Sobald die Platten erstarrt und getrocknet sind, können sie bei 4 °C für ca. 3 Monate gelagert werden.
2. Bakterielle Stämme und Plasmide Konstruktion
ANMERKUNG:Der genetische Kreislauf enthält einen Teil; ein grünes fluoreszierendes Protein (GFP), das von einem PtetO-Promotor angetrieben wird, was zu einer konstitutiven Expression führt. Alle Plasmide in dieser Arbeit wurden mit grundlegenden molekularen Klontechniken konstruiert und mit einem Standard-Wärmeschockprotokoll24in Escherichia coli 10" umgewandelt. Das letzte Konstrukt wurde in Escherichia coli MG1655 Wild-Stamm für Tests umgewandelt.
- Verwandeln Sie das gewünschte Plasmid in Escherichia coli MG1655 Zellen mit dem Standard-Wärmeschockprotokoll24.
- Wachsen Sie die transformierten Zellen auf einer LB-Agarplatte über Nacht bei 37°C.
HINWEIS: Es ist möglich, die Petrischalen von Schritt 2.2 bis zu 3 Tagen für die Mikroskopie zu halten. - Impfen Sie eine einzelne Kolonie in 5 ml LB-Brühe, ergänzt mit den entsprechenden Antibiotika in einem Glasrohr.
- Wachsen Sie Zellen bei 37 °C mit 250 Rpm Schüttelungsgeschwindigkeit im Inkubator für 2 h, bis die Flüssigkeit trüb ist.
- Bereiten Sie 1 ml Verdünnungslösung wie folgt vor:
892 L minimale Medien (1x M9)
8 l von 50% Glycerin (0,4% [vol/vol])
100 l mit 2% Casamino-Säuren (0,2% [wt/vol])
1 L Thiamin (B1)
11 l Glukose (2 M)
1 L relevanter Antibiotika- Mischen und spinnen.
- Verdünnen Sie die Zellkultur (1:30) von Schritt 2,4 in ein 2 ml-Rohr, indem Sie 30 l Escherichia coli-Wachstum zu 1000 l Verdünnungslösung (Schritt 2,5) hinzufügen.
- Inkubieren Sie das Rohr für 1 h mit Schütteln (250 U/min) bei 37 °C.
- Wachsen Sie 40 l - 60 l auf M9-Platten, die in Schritt 1.10 hergestellt werden. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C über Nacht.
HINWEIS: Die optische Dichte (OD600nm) für die Beschichtung sollte um 0,1 betragen. - Legen Sie bis zu drei 35 mm Glasbodenplatten auf die Bank.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Glas der Platte die richtige Dicke für die verwendeten Mikroskoplinsen aufweist. - Bereiten Sie die Kultur für die Aussaat auf Gelplatten vor, wiederholen Sie die Schritte 2.3 bis 2.6 für Kolonien aus Derplatte, die bei Schritt 2.9-Mikroskopmessungen vorbereitet wurden.
- Bereiten Sie die folgende Lösung vor, um drei Mikroskopplatten herzustellen.
- Das Wasserbad auf 60 °C vorheizen.
- Mischen Sie 112,5 mg niedrigschmelzender Agar und 40 mg Agar mit 8,92 ml minimalem Medium (1x M9) und fügen Sie 1 ml 2% Casaminosäuren (0,2% [vol/vol]) in einen 25 ml ErlenmeyerKolben.
HINWEIS: Achten Sie darauf, die Medien auf die inneren Lippen des Kolbens zu gießen.
- Mikrowelle der Lösung in kurzen Bursts von 2 bis 3 Sekunden. Wiederholen Sie den Vorgang, bis die Lösung klar ist.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie den Siedepunkt nicht erreichen. - Den 25 ml Erlenmeyerkolben in ein Warmwasserbad (60 °C) zum weiteren Mischen durch Diffusion legen und auf der Bank abkühlen lassen, bis seine Temperatur auf etwa 45-50 °C sinkt.
3. Herstellung von Agarose-Pads
- Saubere Bank mit 70% Ethanol. Stretchband auf der gereinigten Bank. Stellen Sie sicher, dass das Band glatt und nivelliert ist.
- Bereiten Sie zwei Abdeckungen vor: eine auf dem Band und eine zweite in der Nähe. Bereiten Sie ein Deckel.
- Kolben (vorbereitet bei Schritt 2.14) aus dem Wasserbad nehmen, die Außenseite des Kolbens reinigen und abkühlen lassen, bis die Temperatur auf etwa 45-50 °C fällt.
- Um die Gellösung zu erstellen, mischen Sie schnell alle Lösungen in der folgenden Reihenfolge:
80 l von 50% Glycerin (0,4% [vol/vol])
1 ml 2% Casaminosäuren (0,2% [wt/vol])
10 l Thiamin (B1)
110 l Glukose (2 M)
10 L relevanter Antibiotika. - Gießen Sie 1,5 ml des Gels auf den Deckelund und decken Sie es mit dem zweiten Stück, das ein "Sandwich" macht.
- Den Erlenmeyer ins Warmwasserbad zurückgeben. Bedecken Sie das Sandwich mit dem Deckel und stellen Sie Timer für 20 Minuten.
- Gleichzeitig das Rohr ab Schritt 2.11 für 1 h bei 37 °C mit Schütteln (250 U/min) inkubieren
- Nach 20 Minuten das Sandwich umdrehen (Schritt 3.5), abdecken und 1 H ruhen lassen.
HINWEIS: Für bessere Ergebnisse ruhen sie das "Sandwich" bei 4 °C für die Dauer von Schritt 3.8. - Samen Escherichia coli Kultur von Schritt 3.7 durch Pipettieren der Probe auf die 35 mm Schale.
ANMERKUNG: Das Pipetieren von 6 L Zellen als separate kleine Tropfen liefert die besten Ergebnisse. - Lassen Sie die Tropfen trocknen, für mindestens 15 Minuten und bis zu 30 Minuten.
- Setzen Sie das erstarrte Gel des Sandwiches aus Schritt 3.8 aus, indem Sie den Deckelrutsch wegschieben.
- Sandwich in kleine Einzelpads mit Biopsie-Punch oder Spitze schneiden.
- Lehnen Sie es vorsichtig auf die Probe (Schritt 3.9). Lassen Sie das Gericht für 20 Minuten auf der Bank.
4. Vorbereitung der Probe für die Mikroskopie-Bildgebung
- Entfernen Sie den Kolben aus dem Wasserbad aus Schritt 3.6. Wischen Sie die Außenseite des Kolbens sauber und lassen Sie auf Raumtemperatur (25 °C) abkühlen.
HINWEIS: Entfernen Sie den Kolben bei Schritt 4.1 ca. 3 Minuten vor dem Ende des Timers. - Gießen Sie 3 ml des Gels in einer kreisförmigen Bewegung ständig auf den Plattenumfang. Lassen Sie für ein paar Minuten zu erstarren.
- Platten mit Klebeband versiegeln und mehrere Löcher mit 25 G Nadel durchbohren. Drehen Sie alle Gerichte, um zu verhindern, dass Wasserkondensation auf das Gel tropft.
- Alle Gerichte bei 4 °C für 30 min inkubieren, um eine vollständige Erstarrung zu ermöglichen und gleichzeitig eine Zellmitose zu verhindern.
HINWEIS: Lassen Sie die Proben bei 4 °C für aufeinanderfolgende Messungen, nicht mehr als einen Tag. - Starten Sie das Mikroskop gemäß Herstelleranleitung.
- Finden Sie den Anfangsfokus mit der niedrigsten Amplifikationslinse und greifen Sie auf das automatische Fokussystem (AFS) ein.
- Verwenden Sie Öl, wenn nötig, ertränken Sie die Linse mit Öl und verteilen Sie es sorgfältig, indem Sie die Platte mit einem Plattform-Controller (nicht manuell) bewegen und AFS kann wieder eingeschaltet werden.
- Verwenden Sie den relativen Querschnitt in Z-Richtung, und folgen Sie dem Standardvorschlag für Z-Schrittquerschnitte.
HINWEIS: Wir haben alle 5 Minuten helle Feldbilder und alle 20 Minuten fluoreszierende Bilder aufgenommen. Manchmal muss der Fokus in den ersten 30 Minuten angepasst werden. Die Vorwärmung der Mikroskop-Inkubatorbox und des Öls während der Kühlung der Probe hilft dazu, den anfänglichen Fokusverlust zu reduzieren.
5. Datenanalyse
HINWEIS: Um Mikroskopiedaten zu verarbeiten, haben wir in MATLAB eine computerbasierte Software entwickelt. Diese Software erleichtert die Identifizierung von Zellgrenzen aus hellen Feld-Tiff-Bildern und Segmenten und sortiert Zellen nach Flächen. Der Ausgang dieser Bildanalyse kann als Maske auf fluoreszierenden Tiff-Bildern verwendet werden, um Zellintensitätsniveaus abzuleiten und Artefakte in der fluoreszierenden Domäne wie Zellhalo aufgrund von Mikroskop-Auflösungsgrenzen abzubrechen. Die entwickelte Software wurde von ähnlichen Arbeiteninspiriert 7,25,26,27,28,29,30 und bietet eine elegante Lösung für das Labor zugeschnitten.
- Definieren Sie zunächst die folgenden Parameter in main_code.m.
- Definieren Sie den Ordner der Aufnahmebilder.
- Definieren Sie den Bildzeitraum - heller Feldkanalzeitschritt in Minuten.
- Definieren Sie die GFP-Frequenz - Rate der Erfassung von GFP-Bildern.
- Definieren Sie die Mikroskopauflösung (d. h. wie viele Pixel gleich 1 m sind).
- Definieren Sie den Bereich des Histogramm-Bin-Bereichs - zellbereichsbereich.
ANMERKUNG: Der Prozess der Klassifizierung der Daten nach Zellbereich ähnelt den Prinzipien des Gatings in der Flusszytometrie-Datenanalyse. Gates werden um Populationen von Zellen mit gemeinsamen Eigenschaften platziert, in der Regel vorwärts verstreut und seitlich verstreut, um diese Populationen von Interesse zu isolieren und zu quantifizieren. Die Mikroskopie ermöglicht es, mehrere Zellgruppen zu vereiten, zu untersuchen und zu quantifizieren. - Konvolution-Kernel definieren (3,3) - dieser Parameter erkennt Zellgrenzen durch globale Schwellenwerte (count_cells.m).
HINWEIS: Diese Einrichtung wird nur benötigt, wenn das Labor oder das Mikroskop gewechselt wird. Software erfordert, dass der Eingabe-Lichtfeldkanal mit Index c1, Fluoreszenzkanal mit der Bezeichnung c2 gekennzeichnet ist.
- Führen Sie main_code.m aus,mit dem alle anderen Skripts automatisch ausgeführt werden (count_cells.m, cell_growth_rate.m).
- Programm segmentiert automatisch helle Feldbilder (siehe Ergänzende Abbildung 2-4).
- Kombinieren Sie das Segmentierungsbild mit dem Fluoreszenzbild (GFP), um die Intensitätsstufe pro Zelle zu extrahieren.
- Berechnen Sie das Diagramm der Zellmenge nach Zeit und passen Sie entsprechend dem exponentiellen Wachstum.
- Berechnen Sie den Mittelwert und die Standardabweichung (STD) für jeden Zellbereichsbereich.
- Berechnen Sie das Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) für jeden Zellbereichsbereich.
- Zeichnen und passen Sie die Verteilung der Menge der Zellen nach Intensität an.
- Berechnen Sie den Varianzkoeffizienten (CV) und vergleichen Sie mit Flow Analyzer-Daten.
HINWEIS: Software gibt als Ausgabe die endgültigen Segmentierungsbilder für die Anpassung conv_kernel in einem neuen Ordner "yourfolder/Segmented". Software gibt als Ausgabe die Graphen in einem neuen Ordner "yourfolder/Graphs.
- Um zwischen Experimenten zu vergleichen, verwenden Sie compare_experiments.m.
- Definieren Sie Verzeichnisse für die gespeicherten Diagramme und die Adresse für das Verzeichnis .CompareResult.
- Führen Sie die Datei aus.
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Representative Results
Die Software analysiert helle Feld-Domänenbilder, die nicht weiß und schwarz sind. Die Escherichia coli wird wie schwarze längliche Formen auf einem weißen Hintergrund aussehen und dynamischer Bereich der Luminanz sollte eine Spitze in ihrer Mitte zeigen (Abbildung 1). In fluoreszierenden Bildern können Zellen einen kleinen Halo haben, aber einzelne Zellen mit längigen Formen können immer noch aufgelöst werden. Ein Mitose-Ereignis sollte zuerst nach 30 Minuten erkannt werden. Der Mikroskopfokus sollte im Laufe der Zeit stabil bleiben, und obwohl sich die Zellen während dieser 30 Minuten langsam bewegen könnten, ist es unwahrscheinlich, dass sie das Sichtfeld verlassen. Ein solches Experiment gilt als gut und kann in Abbildung 2eingesehen werden. Zellen sind in der Hellenfelddomäne bei geringer Vergrößerung möglicherweise schwer zu erkennen. Wir empfehlen, den durchschnittlichen Fokusabstand mit einem HCN-Plasmid (High Copy Number) festzulegen, da dies bei geringer Vergrößerung leicht zu bemerken ist. Legen Sie den durchschnittlichen Abstand fest, während Sie ein LCN-Plasmid (Low Copy Number) bei der hohen Vergrößerung im Voraus messen. Dieser Fokusabstand hängt hauptsächlich von den Platten, dem Mikroskopiesystem und dem Öl ab und nicht von der Dicke des Gel- oder Escherichia coli-Stamms.
Bei der Anpassung dieses Protokolls an andere Labore können folgende Probleme auftreten (1) Escherichia coli-Platten (Proben), die bei einem falschen Verdünnungsverhältnis hergestellt werden, können eine unveränderliche Anzahl von Zellen aufweisen (Abbildung 3 und Abbildung 4) (2) Proben, die ohne Versiegelung der Platte hergestellt werden, können eine übermäßige Schrumpfung aufweisen. Dies kann beobachtet werden, wenn Zellen driften (Abbildung 3) oder einen Fokusverlust verursachen (Abbildung 5) (3) Einige Proben können langsam verschiebende "feste" Zellen (in Schwarz) auf einem Hintergrund von Schwimmzellen (in Weiß) aufweisen. Dies ist wahrscheinlich auf eine nasse Probe zurückzuführen und es stabilisiert sich in der Regel, da das überschüssige Wasser vom Gel absorbiert wird (Ergänzendes Video 1) (4) Proben, die nach einigen Minuten Erwärmung keine Zellen aufweisen, könnten falsch vorbereitet worden sein, wahrscheinlich aufgrund: (I) Gel wurde gegossen, während noch zu heiß gegossen, (II) Schutzkappe wurde vergessen, (III) minimale Medien fehlen eine Zutat, (IV) falsche Zelldichte und (V) Gel war zu dicht. Es ist wichtig, Löcher zu stanzen, um den Gasaustausch auf Kosten der Gelschrumpfung zu ermöglichen (Abbildung 5) und (VI) Zellen können das Gel auch auf der Suche nach Nährstoffen einrücken, das eine über dem anderen stapeln, die Zellmonoschicht effektiv verhindern, dass Zellen nachweisen und zuverlässige fluoreszierende Signale messen (ergänzende Abbildung 5).
Wir haben in dieser Arbeit drei Schaltkreise gemessen. Erstens, ein konstitutiver Promotor, der das GFP reguliert,wie in Abbildung 6 dargestellt. Zweitens ein konstitutiver Promotor, der das superfaltige GFP31 (sfGFP) reguliert, dargestellt in Abbildung 7. Ein ssrA Degradation-Tag (AAV) wurde sfGFP hinzugefügt, um seine Halbwertszeit auf Minuten5zu reduzieren. Die dritte Schaltung basiert auf einem positiven Rückkopplungskreis1und wird durch Acyl-Homoserin-Lacton (AHL) induziert. Der PluxR-Promotor reguliert sfGFP und LuxR, eine Transkriptionsfaktorbindung mit AHL zur Aktivierung von PluxR, wie in Abbildung 8dargestellt. Abbildung 9 zeigt die Dynamik des Zellwachstums (Zellzahlen versus Zeit), Abbildung 10 zeigt die Dynamik des gemessenen Signals (mittlere Fluoreszenz versus Zeit) und Abbildung 11 zeigt die Dynamik des bewerteten Gesamtrauschens (Standardabweichung (STD) versus Zeit).
Der SNR (oder CV) ist weit verbreitet bei der Entwicklung analoger elektronischer Schaltungen, um die Präzision und Zuverlässigkeit der Schaltung32auszudrücken. CV bezieht sich auf die Verteilung des Signals zwischen einzelnen Zellen und ermöglicht den Vergleich zwischen Methoden und verschiedenen Geräten wie Mikroskopen und Strömungsanalysatoren. Die Berechnung von SNR aus Mikroskopbildern ermöglicht es uns, Schaltkreise über die Zeit hinweg zu vergleichen, segmentierte Zellen werden gleichzeitig gemessen und bieten gleichzeitig eine Messung für die spezifische Auflösung des Rauschens im Vergleich zum Signal oder ein Rauschintervall für eine bestimmte Zeit und Induktorkonzentration. Dies kann darauf hinweisen, ob Detektorzellen in der Lage sein werden, die genaue Signalreaktion auf die Induktorkonzentration aufzulösen. In dieser Arbeit wurde der Lebenslauf berechnet, indem alle segmentierten Artefakte berücksichtigt wurden, die Zellen sind, unabhängig von der Zellprogression im Divisionszyklus. SNR wurde für einen bestimmten Zellbereichsbereich im Zeitverlauf berechnet und dann für drei wiederholte Experimente gemittelt. Weder das erworbene Signal noch die STD sind allein zuverlässig, da sie spezifisch für das Experiment und die verwendeten Geräte sind. Das Signal wird mit beliebigen Einheiten gemessen, die von der Geräteverstärkung voreingestellt, dem Fotodetektor und der Belichtungszeit abhängen. Die in Abbildung 10 dargestellten Daten deuten darauf hin, dass die Zellenstufe im Teilungszyklus den Geräuschpegel nicht beeinflusst, da verschiedene Flächenbereiche (Punkte im Teilungszyklus) den gleichen Trend aufweisen. Diese Beobachtung könnte die Behauptung stützen, dass die Verfolgung genauer Mutter-Tochter-Beziehungen zur Messung von Lärm vermieden werden kann, und dies könnte die SNR für die vorgestellte Methode verbessern. Es wurde keine wesentliche Veränderung des SNR zwischen GFP und sfGFP beobachtet, wie in Abbildung 12dargestellt. Wir berechnen den SNR (SNR= Mittelwert/ STD) und stellen ihn in Abbildung 12 und Abbildung 13vor.
Wir berechneten dann die Varianz und den Lebenslauf auf der Grundlage der folgenden Gleichungen31
1.1
1.2
Ist die Proteinfaltzeit, Bei T die Zellteilungszeit, und μ die Anzahl der Plasmide vor und nach der Teilung sind, ist die Plasmidkopienummer31. Mit den obigen Gleichungen (1.1 und 1.2) können wir die Daten aus dem Flow Analyzer-Signal für die Gammaverteilung anpassen.
Dann verglichen wir zwischen dem CV, der durch Strömungsanalysator gemessen und berechnet wird (Abbildung 14), und dem Protokoll (Abbildung 15).
Abbildung 1: Helles Feldbelichtungsbild (a) Stabilisierte Erfassung im hellen Feld (b) Segmentierungsbild, nur farbige Zellen geben die Berechnungen ein (c) Pixelhelligkeitskarte der Erfassung, Spitze ist das Hintergrundrauschen. Schwellen durch sie Segmente nur Escherichia coli. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2:Dieses Experiment zeigt gute gesunde Zellen, diesich nach 120 Minuten teilen und reagieren. Die Bilder wurden sukzessive im 20-Minuten-Takt aufgenommen. Kolonien stehen im Fokus, Gel ist stabil zwischen den Proben. Kolonien teilen sich und erzeugen starke Signale. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3:Auswirkungen eines falschen Verdünnungsverhältnisses und einer Gelschrumpfung auf das fluoreszierende Bild. Die Bilder wurden im 20-Minuten-Takt aufgenommen (a) Einzelne Escherichia coli in rot eingekreist (b) Die gleiche Zelle driftet rechts vom Sichtfeld (c) Die Zelle driftet weiter. Die Zellen teilen oder ändern auch keine Positionen, wahrscheinlich aufgrund eines niedrigen Verdünnungsverhältnisses und einer Gelschrumpfung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4:In diesem Experiment wurde keine Aktivität nachgewiesen und fast keine Zellen waren vorhanden. Mögliche Gründe sind, dass das Gel zu heiß ist, die Trocknung der Probe zu aggressiv ist oder keine Schutzkappe (a) Fluoreszierende Bilder hat, die bei 40 Minuten aufgenommen wurden (b) Fluoreszierende Bilder, die in 60 Minuten aufgenommen wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5:Fokusverlust und Photobleichung. Aufeinanderfolgende Bilder von (a) durch (d) wurden in 15-Minuten-Zeitintervallen mit dem Autofokussystem aufgenommen. Siehe Ergänzendes Video 2. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6:Plasmidkarte von Pteto, die GFP reguliert. Ohne den TetR-Repressor fungiert der PtetO-Promoter als konstitutiver Promoter. Die Schaltung wird auf Plasmiden mit niedriger Kopierzahl geklont. Dieses Plasmid dient als Grundlage für die SNR-Messung für jede modifizierte Schaltung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7:Plasmidkarte von Pteto, die sfGFP reguliert. Das gfPwird mit einem AAV-Degradations-Tag verschmolzen. Die Schaltung wird auf Plasmiden mit niedriger Kopierzahl geklont. Die sfGFP-AAV ist eine robustere Variante von GFP, während das AAV-Tag es anfällig für Degradation durch Haushaltsproteasen der Escherichia colimacht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 8: Plasmidkarte der positiven Rückkopplungsschaltung. Die Schaltung wird durch einen AHL-Induktor induziert, der den LuxR-Transkriptionsfaktor bindet. Der PluxR-Promoter, der durch den AHL-LuxR-Komplex reguliert wird, betreibt die Produktion von LuxR und sfGFP-AAV. Die Schaltung wird auf Plasmiden mit niedriger Kopierzahl geklont. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 9:Dynamikdes Escherichia coli MG1655-Stammwachstums in minimalen Medien umfasst (a) PtetO-GFP, exponentielles Wachstum von etwa 35 Minuten. Die Bilder dieses Experiments sind in Abbildung 2 (b) PtetO-sfGFPdargestellt, exponentielles Wachstum von etwa 35 Minuten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 10: Fluoreszenzintensität, normalisiert pro Pixel und erfasst in 20-Minuten-Intervallen.
Zellen werden nach Fläche eingeordnet, um Artefakte zu minimieren. Zellen werden durch ihre Fläche in einem Mikrometer Quadrat geteilt (a) Pteto-GFP Schaltungerste Wiederholung für Intensität bei 210 Minuten ist 0.004 a.u (b) PtetO-sfGFP Schaltung erste Wiederholung für Intensität bei 210 Minuten ist 0.022 a.u (c) Gemessenes Signal von Pteto-GFP Schaltung (d) Gemessenes Signal von PtetO-sfGFP Schaltung. Alle experimentellen Daten stellen den Durchschnitt von drei Experimenten dar. Die Software kann Den Zellbereich in verschiedene Gruppen sortieren (a) und (b) Diagramme für vier Zellbereichsbereiche anzeigen, die den Divisionszyklus darstellen. Die erste Fläche von 14 Mikrometern stellt Zellen nach Division dar, da die Wahrscheinlichkeit, dass Zellen nach Division die kleinste sein werden, am wahrscheinlichsten ist. Der zweite Bereich von 21 m stellt Zellen vor der Teilung dar. Der dritte und der vierte Bereich stellen Zellen in der Teilung dar, da die Gesamtfläche mit zwei (29 und 36 m) multipliziert wird, um Zellen zu berücksichtigen, die länger brauchten, um sich zu teilen. Die Bereiche wurden durch manuelle Auswertung der Daten auf Mikroskopiebildern ausgewählt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 11: Standardabweichung (STD) der einzelligen Fluoreszenzintensitäten für: (a) PtetO-GFP-Schaltung Erste Wiederholung für STD bei 210 Minuten ist 0,001865 a.u (b) Ptet O-sfGFP Schaltung erste Wiederholung für STD bei 210 Minuten ist 0.01477 a.u (c) STD von Pteto-GFP Schaltung (d) STD von PtetO-sfGFP Schaltung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 12:SNR der Einzelzellfluoreszenzintensitäten. Wir berechnen die SNR=Mittel/STD (a) PtetO-GFP Schaltung erste Wiederholung für SNR bei 210 Minuten ist 1.309 a.u (b) PtetO-sfGFP Schaltung erste Wiederholung für SNR bei 210 Minuten ist 1.29 a.u (c) Drei Wiederholungen der GFP-Messung (d) Drei Wiederholungen der sfGFP Messung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 13:SNR der einzelligen Fluoreszenzintensitäten (a)PluxR-sfGFP-Schaltung SNR für Sättigungsreaktion auf AHL (b) PluxR-sfGFP-Schaltung SNR für Halbzeitreaktion auf AHL. Der SNR der positiven Rückmeldung AHL regulierten Schaltung ist höher als SNR für konstitutive sfGFP Schaltung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 14: Histogramme der Genkreise auf Basis des Strömungsanalysators: experimentelle Daten (blau) und stochastische Modelldaten (rot). Die x-Achse stellt beliebige Fluoreszenzeinheiten aus der Durchflusszytometrie dar, und die y-Achse stellt die Frequenz der Zellen dar, die den entsprechenden Fluoreszenzpegel erzeugen. Die Daten wurden nach drei Stunden mit einem Strömungsanalysator gemessen. Die GFP-Fluoreszenz wurde durch Anregung bei einer Wellenlänge von 484 nm und Emission bei einer Wellenlänge von 510 nm quantifiziert. PE-TexasRed Filterspannungen wurden auf einem Probenträger mit hohem Durchsatz verwendet, um GFP-Expressionspegel zu messen. Die Strömungsanalysatorspannungen wurden mit Software so eingestellt, dass die maximalen und minimalen Expressionspegel mit den gleichen Spannungseinstellungen gemessen werden konnten. So wurden in jedem experimentischen Experiment konsistente Spannungen verwendet. Die gleichen Spannungen wurden für nachfolgende Wiederholungen desselben Experiments verwendet. Die Montage erfolgte durch Verwendung der Gammaverteilung31. Bei dieser Methode wird davon ausgegangen, dass das Signal hauptsächlich von der zufälligen Verteilung von Plasmiden abhängt (a) Messung des P-Teto-GFP-Klons auf dem Plasmid mit niedriger Kopierzahl. Experimentelle CV=0.46, Modell CV=0.32 (b) Messung von Pteto-sfGFP-AAV geklont auf niedrigem Kopierzahl Plasmid. Experimentelle CV=0,86, Modell CV=0,44. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 15: Histogramme der Genkreise auf der Grundlage des Mikroskops: experimentelle Daten (gepunktete Linien) und stochastische Modelldaten (feste Linien). Die x-Achse stellt beliebige Fluoreszenzeinheiten aus dem invertierten Mikroskop dar und die y-Achse stellt die Frequenz der Zellen dar, die den entsprechenden Fluoreszenzpegel erzeugen. Die Montage erfolgte mit der MATLAB-Gammaverteilung31,32 (a) Messung des PtetO-GFP-Klonsauf dem Plasmid mit niedriger Kopierzahl (b) Messung von PtetO-sfGFP-AAV auf niedriger Kopierzahl geklont. Der Vergleich zeigt, dass unser Protokoll ähnliche CV-Werte wie im Flow Analyzer-Experiment erhält. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung 1:Vier Verdünnungsverhältnisse zwischen 1:500 und 1:20 für den MG1655-Stamm. Die Grafik zeigt, dass, wenn die anfangsdichte Dichte hoch ist, LB-Nährstoffe reichlich vorhanden sind, was dazu führt, dass sich Zellen schneller teilen. Bei einer Verdünnung von 1:500 blieb die Zelldichte konstant. Bei einer Verdünnung von 1:100 nahm die Zelldichte langsam zu. Bei einer Verdünnung von 1:50 erhöhte sich die Zelldichte bei mäßiger Teilungsrate ohne signifikante Verzögerung bei der Inkubation von 250 RPM. Bei einer Verdünnung von 1:20 erreichte die Zelldichte schnell die Sättigung. Wir haben uns für ein Verdünnungsverhältnis von 1:30 entschieden, was eine kurze Inkubation ermöglicht, um exponentielles Wachstum und einen beträchtlichen Divisionsbereich zu erreichen, um eine hohe Sättigung bei moderater Divisionsrate zu erreichen. Bitte klicken Sie hier, um diese Zahl herunterzuladen
Ergänzende Abbildung 2: Verarbeitung von Hellen Feldbildern. (a) Rohdatenintensitätsbilder aus dem hellen Feldkanal aus dem Mikroskopsystem. (b) Kontrastverbesserungsmanipulation des Bildes, um die Trennung von Zellobjekten vom Hintergrund zu verbessern. (c) Zellgrenzerkennung basierend auf Faltungsfilter33 und Binarisierung basiert globalen Schwellenwert34. (d) Morphologische35 Operationen des Schließens und Füllens zur Identifizierung von Zellkoloniengrenzen. Bitte klicken Sie hier, um diese Zahl herunterzuladen
Ergänzende Abbildung 3: Zellkolonie Hintergrund-Vordergrund-Segmentierung. Um die Auswirkungen des Rauschens zu minimieren, versuchen wir, Zellkoloniengrenzen zu identifizieren und sie aus dem Gelrauschen zu extrahieren. (a) Bild-Binarisierungsvorgang zur Kontrastverbesserung basierend auf adaptiver Schwellenwertierung zum Erkennen von Zellobjekten36. (b) Matrix-Multiplation von Matrixen, die auf S2d und S3a präsentiert werden, filtern erfolgreich die meisten Geräusche heraus und differenzieren Gelgeräusche von Zellen. Einige Grenzen sind nicht vollständig gelöst. (c) Identifizierung von Zellgrenzen mit einem Wendepunktalgorithmus37 basierend auf der Entfernungstransformation38. (d) Matrix-Multiplation von Matrixen, die bei S3b und S3c präsentiert werden, lösen erfolgreich einzelne Zellen auf. Bitte klicken Sie hier, um diese Zahl herunterzuladen
Ergänzende Abbildung 4:Einzelzellsegmentierung. (a) Segmentiertes Produkt eines hellen Feldbildes. Die weitere Reinigung erfolgt auf der Grundlage von Zellflächen-Gating und -Form, die runde Blasen wegwerfen. (b) Fluoreszenzsignalbilder, die vom Mikroskop aufgenommen wurden. (c) Matrix-Multiplation von Matrixen, die bei S4a und S4b vorgestellt wurden, erfolgreich das Signal einzelner Zellen extrahieren. Bitte klicken Sie hier, um diese Zahl herunterzuladen
Ergänzende Abbildung 5: Verlust der Monoschicht. (a) Helles Feldbild einer Zellschicht bei 840 Minuten (14 Stunden) von Pteto, das die gfP-Schaltung reguliert, die in Abbildung 2 des Artikels als gutes Experiment dargestellt ist. Auf der rechten Seite der Mikroskopie kann ein Bildverlust der Monoschicht festgestellt werden. (b) Softwaresegmentierungsbild. Durch den Verlust von Monolayer-Zellen sind fragmentiert und werden Basis auf Flächengating gereinigt werden. (c) Fluoreszenzbild, das zeigt, dass auf der rechten Bildseite keine Zellen aufgelöst werden können und ein niedriges Signal von Zellen auf der linken Seite des Bildes aufgrund des Verlusts der Monoschicht. (d) Segmentierungsbild in Kombination mit Fluoreszenzbild. Bitte klicken Sie hier, um diese Zahl herunterzuladen
Ergänzendes Video 1. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen
Ergänzendes Video 2. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen
Ergänzendes Video 3. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen
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Count_Cells.m. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen
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Discussion
In dieser Arbeit haben wir ein Protokoll entwickelt, das die Computerverfolgung von Escherichia coli-Lebendzellen ermöglicht, die Teilung und Fluoreszenzüberstand über einen Zeitraum von Stunden verfolgen. Dieses Protokoll ermöglicht es uns, die stochastische Dynamik genetischer Schaltkreise in Escherichia coli zu quantifizieren, indem wir den Lebenslauf und SNR in Echtzeit messen. In diesem Protokoll haben wir das stochastische Verhalten von zwei verschiedenen Schaltkreisen verglichen, wie in Abbildung 10dargestellt. Es hat sich gezeigt, dass Plasmide mit niedrigen Kopierzahlen anfälliger für stochastische Effekte sind und weniger von der Zellteilung beeinflusst werden. Der erste zirkativ ausgedrückte GFP -Kreis (Abbildung 10a) und der zweite kreiskonstitutiv ausgedrückte gfPverschmolzen zu einem ssrA-Degradationstag (Abbildung 10b). Um das stochastische Verhalten der fluoreszierenden Proteine zu quantifizieren, haben wir auch die hellen Feldbilder aufgezeichnet. Die Ergebnisse zeigen, dass die Expression von GFP, insbesondere bei seiner Reifung39, die vorherrschende Lärmquelle ist. Das in Abbildung 10a beobachtete Periodische Sägezahnverhaltensmuster kann durch den zufälligen Prozess der Zellteilung und die langzeitige Gfkchenreifung (ca. 50 Minuten) erklärt werden. Im Gegensatz dazu wurde das sfGFP-Signal des zweiten Schaltkreises während der Messung stabilisiert, da die sehr kurze Reifungszeit des sfGFP (ca. 6 Minuten) betrug. Wir haben eine einfache Formel entwickelt, die das GFP-Niveau in beiden Schaltkreisen beschreibt, wenn wir nur den Prozess der Zellteilung und gfP-Reifungszeit betrachten. Zu einem bestimmten Zeitpunkt, t, gehen wir davon aus, dass es x Kopierzahlen von Proteinen gibt, und μ Anzahl von Plasmiden kopieren. Die Proteinkopiernummer kann beschrieben werden durch:
1.3
1.4
Bei der Betrachtung nur Division Ereignisse; 
nach der Proteinreifung und so erhalten wir für die spezifischen Plasmide:
Für GFP ( 
): 1.5
Für sfGFP ( 
):1.6
Dann die entwickelte Serie von sfGFP:
1.7
Für den Fall, 
dass, erhalten wir 
. Dieses Ergebnis lässt sich wie folgt erklären. Wenn x klein ist, erhöhen sich die GFP-Spiegelum einen kleinen Betrag. Wenn x groß ist, wird sfGFP in einen stabilen Zustand degradiert. In ähnlicher Weise enthält jede Zelle für den GfP-Kreis etwa 10 Einheiten GFP, aber da die Reifungszeit für GFP länger ist als die Mitose, werden abbauende Sägezahnmuster von Fluoreszenzintensitäten beobachtet. Im Modell gingen wir davon aus, dass die Replikation des Plasmids schnell genug ist, dass die Plasmidverteilung vor und nach der Teilung konstant bleibt. Das ssrA-Degradations-Tag reduziert oft die Halbwertszeit des Proteins von Stunden auf weniger als eine Stunde5 und führt zu einem schnellen stabilen Zustand. Wir haben gezeigt, dass die Methode auch eine ähnliche Verteilung wie die mit einem hohen Populationsflussanalysator gemessene bietet und dass der CV dieser Verteilung gleich oder kleiner als der Strömungsanalysator CV ist.
Während mehrere Methoden3,7,18 für die Live-Zell-Bildgebung entwickelt wurden, ist die hier vorgestellte Methode speziell auf Escherichia colizugeschnitten. Dieses Bakterium erfordert ein spezielles Medium und einen etwas anderen Ansatz. Das Protokoll weist folgende wichtige Merkmale auf: (1) Ermittlung eines für Bakterien und Dehnungen spezifischen Verdünnungsverhältnisses zu Beginn des exponentiellen Wachstums und nicht im mittleren Stadium (Exponentielles Wachstum ohne Schütteln) (2) Escherichia coli am besten bei 37 °C, aber bei 37 °C verliert das minimale Mediengel schnell Wasser, was zu Schrumpfung und Instabilität führt. Das Protokoll hier überwindet diese Herausforderung (3) Wir wenden zuerst die Bakterienprobe an und versiegeln sie dann mit flüssigem Gel. Da die Probe zwischen Glasboden und Gel eingeschlossen ist, benötigen wir ein Gel, das (I) den Gasaustausch ermöglicht, um das Schneiden von Lufttaschen zu vermeiden, (II) bleibt bei niedrigen Temperaturen flüssig, da Escherichia coli hitzeempfindlich sind und (III) dafür sorgt, dass die Probe nicht in das flüssige Gel gemischt wird. Das Gel bleibt bei 37 °C flüssig, Wir empfehlen jedoch die Verwendung einer Schutzkappe auf der Oberseite der Probe, um übermäßige Hitze und Probenmischung im Gel zu vermeiden (4) Dieser Ansatz erfordert einfache, generische Ausrüstung (5) Proben können direkt ohne Vorwärmung gemessen werden, so dass es keinen Verlust von Divisionsereignissen gibt (6) Das Protokoll, das die Nasslaborschritte und die angepasste automatisierte Software umfasst, kann verwendet werden, um das stochastische Verhalten genetischer Schaltkreise wie quantifizieren. Wir verglichen die Mikroskopie-Methode mit Flow-Analyzer-Ergebnissen, um die Verwendung kleiner Zellpopulationen zu validieren und eine Vergleichsbasis nach CV (7) zu erstellen. Die Software ermöglicht es uns, Zellen auf der Monoschicht ohne menschliches Eingreifen zu erkennen und Gesamtrauschen zu analysieren. Software-Tools wie ImageJ18 oder Schnitzcells erfordern eine manuelle Identifikation von Zellen und sind eine Herausforderung für Anpassungen.
Bei der kontinuierlichen Abbildung lebender Zellkolonien, entwerfen Sie das Experiment unter Berücksichtigung mehrerer komplexer physikalischer Parameter, wie zelluläre Stress und Toxizität, Rate der Ressourcenerschöpfung, Nekrose und Abbauzeit von Induktoren und Chemikalien. Das Protokoll ermöglicht eine zuverlässige Messung von bis zu fünf Stunden. Unsere Experimente deuten darauf hin, dass Escherichia coli bei der Teilung in Mikro-, Monolayer-Kolonien synchronisiert wird (Ergänzendes Video 3). Wir gehen davon aus, dass das Gel in Bezug auf Ressourcen und Zähigkeit einheitlich ist, die Zellen ein ähnliches Verhalten haben und das Beleuchtungsfeld etwas größer aus dem Sichtfeld ist. Daher sollte jede Zelle die gleichen Signal- und statistischen Daten erzeugen, die gesammelt werden können, wie wir gezeigt haben, indem wir cv, der auf diese Weise erhalten wurde, mit einem Strömungsanalysator verglichen. Um Den Lärm bei konstanten Ausgangsbedingungen über längere Zeiträume zu messen, werden wir in Zukunft den Einsatz mikrofluidischer Chips in Betracht ziehen. Weitere Vorteile eines solchen Geräts sind die Aufrechterhaltung fester Positionen der Zellen und der stabile Fokus10. Dennoch erfordern Design, Herstellung von mikrofluidischen Chips und Grundierung für Experimente Training, spezifische Ausrüstung (manchmal maßgeschneidert) und Zeit. Aus diesem Grund ist es vorteilhaft, die Zeitraffermikroskopie, wie in diesem Protokoll gezeigt, zu verwenden, um ein allgemeines Verständnis der Schaltung zu erlangen.
Das vorgeschlagene Protokoll und die entwickelte Software ermöglichen reproduzierbare Messungen, von denen es einfach ist, Graphen abzuleiten. Es ermöglicht auch das Testen und Vergleichen von Gesamtgeräuschen und kann zur Messung von intrinsischem und extrinsischem Rauschen modifiziert werden. Die Methode basiert auf generischen oder einfach zu bestellenden Materialien, offen geteilte, einfach zu bedienende Software und erfordert keine spezifische Schulung. Wir haben gezeigt, dass die durch Mikroskopie gemessene Population groß genug ist, um aussagekräftige Daten zu erhalten, indem wir die Methode CV mit der Methode vergleichen, die mit einem Strömungsanalysator erhalten wurde. Daher können wir erfolgreich eine SNR-Baseline mit diesem Protokoll erstellen und mit komplexeren Genkreisen vergleichen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken Herrn Gil Gelbert (Fakultät für Elektrotechnik, Technion) für die Unterstützung mit dem MATLAB-Code. Wir danken Dr. Ximing Li (Fakultät für biomedizinische Technik, Technion) für die Unterstützung bei der Korrektur dieses Artikels. Diese Forschung wurde teilweise von der Neubauer Family Foundation und dem israelischen Wissenschaftsministerium, Stipendium 2027345, unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35mm glass dish | mattek | P35G-0.170-14-C | thickness corresponding with microscope lense. |
| Agarose | Lonza | 5004 | LB preperation |
| AHL | Sigma-Aldrich | K3007 | inducer |
| Bacto tryptone | BD - Becton, Dickinson and Company | 211705 | LB preperation |
| Carb | Invitrogen | 10177-012 | antibiotic |
| Carb | Formedium | CAR0025 | antibiotic |
| Casamino acids | BD - Becton, Dickinson and Company | 223050 | minimal media solution |
| eclipse Ti | nikon | inverted microscope | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | minimal media solution |
| Glyserol | Bio-Lab | 000712050100 | minimal media substrate |
| Immersol 518F | zeiss | 4449600000000 | immersion oil |
| M9 salt solution | Sigma-Aldrich | M6030 | minimal media solution |
| NaCl | Bio-Lab | 214010 | LB preperation |
| Noble agar | Sigma-Aldrich | A5431 | minimal media substrate |
| parafilm tape | Bemis | PM-996 | refered to as tape in text |
| Seaplaque GTG Agarose | Lonza | 50111 | minimal media substrate |
| thaymine B1 | Sigma-Aldrich | T0376 | minimal media solution |
| Yeast Extract | BD - Becton, Dickinson and Company | 212750 | LB preperation |
References
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