Summary
ここで提示される電子顕微鏡法と組み合わせてネイティブ細胞膜ナノ粒子系を利用する膜蛋白質のオリゴマー状態の決定のためのプロトコルです。
Abstract
細胞膜系におけるタンパク質間相互作用は、細胞間相互作用からシグナル伝達まで、幅広い生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たします。環境信号のセンシングから生物学的応答まで代謝調節から発達制御へ。タンパク質相互作用の正確な構造情報は、膜タンパク質複合体の分子機構を理解し、これらのタンパク質を調節する非常に特異的な分子の設計に不可欠です。インビボおよびインビトロアプローチの多くは、タンパク質とタンパク質相互作用の検出と分析のために開発されています。その中でも構造生物学のアプローチは、原子レベルでタンパク質とタンパク質相互作用の直接的な構造情報を提供できる点でユニークです。しかし、現在の膜タンパク質構造生物学は、依然として洗剤ベースの方法に限られています。洗剤ベースの方法の主な欠点は、彼らのネイティブ脂質二重層環境が洗剤分子によって除去されると、しばしば膜タンパク質複合体を解別または変性させることです。膜蛋白質構造生物学のネイティブ細胞膜ナノ粒子系を開発しています。ここでは、AcrBのオリゴマー状態のケーススタディを用いて細胞膜上でのタンパク質相互作用の解析におけるこのシステムの使用を実証する。
Introduction
タンパク質相互作用(PPI)は、タンパク質の構造と機能の維持からシステム全体の調節に至る生物学全体で重要な役割を果たします。PPI はさまざまな形式で提供され、どのような種類の相互作用を形成するかに基づいて分類できます。そのような分類の1つは、同一のサブユニットまたはサブユニットとして作用する異なるタンパク質間の相互作用であるかどうかに基づくホモオリゴメリックまたはヘテロオリゴメリックである。別の分類は、相互作用が安定した複合体または過渡的な複雑な状態の形成につながる場合の相互作用の強さに基づいています。タンパク質間のPPIに関する構造情報は、タンパク質が機能するメカニズムを理解する上で非常に重要です。タンパク質の80%以上が、その機能的役割を果たすために複雑な形成に依存していると推定されている。生物学におけるその重要性を適切に機能させるためにPPIに依存することが観察されたタンパク質の割合を考えると、容易に明らかであるが、タンパク質がPPIを形成しているときに実験的に観察できる技術の限界のために、これらの相互作用に関与するタンパク質を適切に調査できることは依然として困難である。
ノイズ、偽陽性、および偽陰性の高い量が現在利用可能なPPI決定技術の多くから導き出されるため、多くの実験的に決定されたPPIの結果の間には、高い意見の相違があります。これは特に酵母ツーハイブリッド(Y2H)系では、タンデムアフィニティー精製質量分析(TAP-MS)、蛍光共鳴エネルギー伝達(FRET)、PPI測定2、3、4、5、6、7に最も一般的に使用される方法の3つを表す。それに比べて、核磁気共鳴(NMR)、X線結晶学、電子顕微鏡(EM)などのタンパク質構造生物学技術を用いて、タンパク質とタンパク質の相互作用に関する高解像構造情報を原子レベルまで得ることができ、目的のタンパク質に対して発生する相互作用の直接的な視覚的確認を可能にする。現在利用可能な非構造ベースPPI決定研究技術(例えば、Y2H、TAP-MS、およびFRET)の全てがこの能力を欠き、さらにタンパク質間の弱い相互作用および一過性相互作用を同定するのが困難に苦しむ5。これらの欠点は、適切な第四級構造およびヘテロマー錯体集合体の形成に影響を与える脂質環境の追加変数によってもたらされる複雑性の増大に起因する膜タンパク質を研究する際にさらに強化される。
膜タンパク質はプロテオームの大部分を占めており、すべての生物の中で適切な細胞機能において多くの重要な役割を果たすことが知られています。膜タンパク質はヒトゲノムの27%を占め、現在の薬物標的の60%程度を占めると推定されているにもかかわらず、全ての公表タンパク質構造の約2.2%を占める膜タンパク質の解剖モデルの数に大きな異常がある。構造情報の入手可能性の不一致の主な原因は、膜タンパク質自体の本質的な特性にあります。溶解性が悪く、天然の構造や機能を維持するための脂質環境との相互作用に依存し、脂質膜自体の様々な物理化学的特性を研究する際に、膜タンパク質は大きな問題を引き続き表しています。これらの固有特性の中で、正確な構造情報を得るために最も重要なのは、天然の脂質環境との相互作用を持つことで、天然の構造と機能を維持する必要があります。脂質環境は膜蛋白質の構造や機能の一部としてこのような不可欠な部分であり、膜蛋白質の構造と機能11の基本単位としてメムテイン(膜とタンパク質との組み合わせ)の概念が提案されている。脂質とタンパク質の相互作用の重要性にもかかわらず、現在利用可能な構造ベースのPPI決定技術は、多くの場合、研究されているタンパク質が溶解しているか、洗剤で可溶化されている必要があります。過酷な洗剤への暴露は、タンパク質を変性させたり、脂質異常による偽陽性および陰性を引き起こし、凝集、タンパク質の変性、非共有結合相互作用の解離、人工オリゴマー状態の形成を誘発する可能性があります。膜蛋白質のネイティブオリゴマー状態を正確に決定するために自然な脂質環境を維持する必要性のために、我々は、以前に報告されたスチレンマレイン酸脂質粒子(SMALP)13法に基づいてネイティブ細胞膜ナノ粒子システム(NCMNs)12を開発した。
SMALPは、膜活性ポリマーとしてスチレンマレイン酸共重合体を使用して、膜タンパク質を抽出し、可溶化します。ポリ(スチレン-コマレイン酸)(SMA)は、その疎水性スチレン部分と正反対の親水性マレイン酸部分に起因するユニークな両親媒性ポリマーです。pH依存機構14に吸着し、不安定化し、細胞膜を破壊することによってナノ粒子を形成する。SMAのこの機能活性は、膜タンパク質抽出および可溶化のための洗浄剤フリーシステムとして利用することを可能にするものである。NCMNシステムは、いくつかの側面でSMALPシステムとは異なります。NCMNシステムの最もユニークな特徴は、安定性とネイティブ機能のために異なる条件を必要とする多くの異なる膜タンパク質の単離に適したユニークな特性を有する多数のポリマーを有する膜活性ポリマーライブラリーを有することである。NCMNシステムは、ナノ粒子の調製に関しては、SMALP法と比較して異なるプロトコルを有する。そのような例の1つは、NCMNsが高分解能構造の決定のために単一ステップニッケル親和性カラム精製を使用することです。これらの異なるプロトコルの効果は、3.2および3.0 Å cryo-EM AcrB構造を生成したNCMNsプロトコルを比較する際に、SMALP法を用いた同様の研究を行い、8.8Å解像度12,15でクライオEMAcrB構造を生じさせた。NCMNシステムのこれらのユニークな特徴は、以前に確立されたSMALP法で行われた改善であり、PPIの研究のための理想的な候補になります。
多剤流出トランスポーターAcrBは、大腸菌12において機能的なホモトリマーとして存在する。変異原性分析は、AcrBトリマーの安定性を担うループ上に位置する単一のP223G点突然変異が、三量体状態を不安定化させ、天然の青いゲル電気泳動16で検出できる洗剤DDMで調製するとAcrBモノマーを生じさせることを示唆した。しかし、AcrB-P223G変異体のFRET分析は、天然細胞膜脂質二重層環境において、変異型AcrB-P223Gの大部分が依然として三量体として存在し、野生型AcrBおよびAcrB-P223Gの両方の発現レベルが類似していることを示唆した。しかしFRET分析結果にもかかわらず、変異型トランスポーターの活性アッセイは、野生型16と比較すると活性が劇的に低下することを示した。FRET技術はタンパク質とタンパク質相互作用の分析に広く使用されてきたが、研究は、しばしば偽陽性17、18、19、20を与えることができることを示している。
最近、AcrBトリマーの高解像度クライオEM構造は、NCMNs12の使用を通じてAcrBと関連する天然細胞膜脂質二重層との相互作用を示す決定された。原則として、NCMNsは、天然細胞膜に見られるタンパク質とタンパク質の相互作用の分析に容易に利用することができます。本システムの試験では、天然細胞膜ナノ粒子と陰性染色電子顕微鏡を用いてAcrB-P223Gのオリゴマー状態を直接観察する実験を行った。野生型AcrBナノ粒子と比較するために、NCMNライブラリー12に見られるAcrBおよび代替ポリマーの高解像度クライオEM構造決定に用いられている同じ膜活性ポリマー(NCMNライブラリでNCMNP1-1としてインデックス化された研究室製のSMA2000)を用いた。先に報告された結果に基づいて、AcrB-P223G変異体の大部分が三量体天然細胞膜ナノ粒子21の形で存在することが期待された。しかし、野生型AcrBで観察されたものなど、サンプルにはAcrB三分子は見つからなかった。これは、AcrB-P223Gの大部分が、以前に示唆されたように、ネイティブ細胞膜に三量子を形成しないことを示唆している。
ここでは、NCMを用いた野生型 大腸菌 AcrBとの比較における変異型 大腸 菌AcrB-P223Gの詳細な分析を報告する。AcrBのこのケーススタディは、NCMNがタンパク質とタンパク質相互作用分析に適したシステムであることを示唆しています。
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Protocol
1. タンパク質発現
- BL21(DE3)PLysS細胞を含むプラスミドを含む素晴らしいブロス(TB)培地を15mLで37°Cで一晩で37°Cで250rpmで振盪させた。
- 600 nm (OD600)での一晩培養の光学濃度を確認し、2.0 を超えるようにしてください。
- プラスミドに特異的な抗生物質を含む結核培地の1Lに5mLの細胞培養を希釈し、OD600=0.8まで振盪して37°Cでインキュベートし、最終的な濃度が1mMのIPTGで誘導する。
- 20°Cで20時間振る回して誘導を行います。
- 4°Cおよび4,000 x gで15分間の遠心分離を使用して細胞を下にペレット.
2. 細胞のリシスと膜の分離
- バッファーA内の細胞ペレットを再懸濁(表1、DDM バッファAまたはNCMNsバッファAに従う精製スキームに応じて)を用いて、細胞ペレットの20gごとに80 mLを使用する。
- ガラスDounceホモジナイザーを4°Cで使用するか、室温であれば、再懸濁セルペレットを均質化し、すぐに氷の上に置いてください。
- サンプルを氷の上の金属ビーカーに移し、4°Cおよび1,500棒で高圧ホモジナイザーにセットして細胞を溶解させる。
- ホモジナイザーに細胞をロードし、ホモジナイザーを通過させて3〜4サイクル、またはリセートが明確になるまで通過させるプロセスを繰り返します。
- 4°Cで30分間15,000xgでリセートを遠心分離する。
- 上清を収集し、4 °Cで1時間215,000 x g で超遠心チューブと遠心分離機に負荷を入れ.
- 上清を捨てて、超遠心チューブから膜ペレットを収集します。過剰な膜ペレットを-80°Cで保存します。
3. 天然細胞膜ナノ粒子の調製
- 10 mL NCMNsバッファA中の膜ペレット1gを再懸濁する(表1)。
- 再懸濁した細胞膜試料をガラスDounceホモジナイザーを20°Cで均質化する。
- 懸濁膜試料を50 mLポリプロピレンチューブに移し、膜活性ポリマーストック溶液および追加のNCMNsバッファAを加えて、最終濃度2.5%(w/v)膜活性ポリマー(NCMNP1-1またはNCMNP5-2)にサンプルを持ち込みます。
注:膜活性ポリマーのストック溶液は、二重蒸留水で作られ、様々な濃度で保つことができますが、通常は10%(w/v)です。 - 試料を20°Cで2時間振る。
- サンプルを超遠心分離機にロードし、20°Cで1時間150,000 x g で回転させます。
- サンプルが超遠分化されている間にNCMNsバッファAの25 mLと5 mL Ni-NTAカラムを平衡化し始める。
- 超遠心分離が完了した後に上清を収集し、シリンジポンプを使用して0.5 mL /minの流量で室温でNi-NTAカラムの5mLにロードします。
- 高速タンパク質液体クロマトグラフィー (FPLC) ラインを十分な NCMNs バッファ B (表 1)で洗浄し、システムを完全にフラッシュしてから、カラムを FPLC マシンに接続します。
- 30 mLのNCMNsバッファBで1mL/minの流量でカラムを洗浄し、流れを通して集めます。
- 30 mLのNCMNsバッファC(表1)で流量1 mL/minでカラムを洗い、流れを通して集めます。
- 20 mL の NCMNs バッファ D (表 1)を流量 0.5 mL/min で溶出し、分画コレクタと画分をそれぞれ 1.0 mL に設定してサンプルを収集します。
- タンパク質サンプルを4°Cに保存してください。
- FPLC溶出グラフで観測されたピークに対応するサンプルを確認するために、SDS-PAGEゲル電気泳動アッセイを実行します。
4. SDS-ページゲル電気泳動
- ガラスを鋳造装置にクランプして鋳造室を準備します。
- 表1に示したレシピに従って12%分離ゲルを調製する。
注:TEMEDが追加されると、ゲルはすぐに重合するので、ゲルを注ぐ準備ができたらこれを追加するだけです。 - ゲルを注ぎ、櫛の底から2cm下に2cm残して、スタッキングジェルを出します。
- ゲルの上部に100%イソプロパノールを重ねて気泡を取り除き、分離ゲルが重合するのを待ちます。
- イソプロパノールを取り除き、蒸留水でイソプロパノールの痕跡を洗い流します。
- 表 1に示したレシピに従って、スタックゲルを準備します。
注:TEMEDが追加されると、ゲルはすぐに重合するので、ゲルを注ぐ準備ができたらこれを追加するだけです。 - 分離ゲルの上に積み重ねゲルを注ぎます。
- ウェルを形成するために部屋に櫛を追加し、積層ゲルが完全に重合するのを待ちます。
- ゲル上で実行する必要がある各画分サンプルのマイクロ遠心分離チューブに1 M DTTの1 μLを入れる。
- 各チューブに4x負荷バッファの7 μLを追加します。
- ゲル上で実行する必要のある分数から各マイクロ遠心チューブに20 μLのサンプルを加えます。
- サンプルを含むチューブを渦出します。
- 3 sの卓上マイクロ遠心分離機を使用してサンプルチューブをスピンダウンし、すべてのサンプルがチューブの底に戻っていることを確認してください。
- ゲル電気泳動セルを調製するために、12%ポリアクリルアミドゲルカセットを所定の位置に固定し、細胞の内側および外側のチャンバーをトリス-酢酸EDTA(TAE)バッファで満たします(表1)。
- 指示に必要な適切な体積で、ゲルの最初のレーンに分子量マーカーをロードします。
- DTTと負荷バッファを混合した各チューブからサンプルの28 μLをロードします。
- 電気泳動セルの蓋を箱の上に置き、蓋を電源に差し込みます。
- 電源を入れ、100 Vに設定し、20分間稼働します。
- 20分後、電源電流を140Vに上げ、さらに30〜40分間、またはローディングバッファ色のバンドがゲルカセットの底に達するまでそれを実行し続けます。
- 電気泳動染色を完了した後、ゲルを脱染色して、ゲル内に含まれるタンパク質バンドを可視化する。
5. DDMを用いたタンパク質精製
注:この精製プロセスを実施する目的は、膜活性ポリマーを利用した実験の制御として機能することです。
- 6〜10gの膜ペレットを再懸濁し、ステップ2.6から、5mL/gの膜ペレットを用いてDDMバッファA(表1)に入れる。
- 再懸濁試料をガラスDounceホモジナイザーを4°Cで均質化するか、室温であれば、すぐに氷の上に置いてください。
- サンプルをポリプロピレンチューブ50 mLに移し、DDMとDDMバッファAを追加して、サンプルを2%DDMの最終濃度にします。
- サンプルを4°Cで2時間振ります。
- 4 °Cおよび150,000 x gで1時間超遠心チューブと遠心分離機にサンプルをロードします。
- 試料が超遠心状態にある間、25mLのDDMバッファAで洗浄してNi-NTAカラムの5mLを調製し始める(表1)。
- 超遠心分離が完了したら、上清を集め、シリンジポンプを使用して0.5 mL/minの流量で4°Cの5 mL Ni-NTAカラムに積み込みます。
- 十分な DDM バッファ B + 0.05% DDM (表 1) で FPLC ラインを洗浄し、システムを完全にフラッシュしてから、FPLC マシンにカラムを取り付けます。
- 30 mLのDDMバッファB + 0.05%DDMで、流量1 mL/minで洗浄し、流れを通して集めます。
- 30 mLのDDMバッファC + 0.05%DDM(表1)の流量を1 mL/minで洗浄し、流れを通して集めます。
- 20 mL の DDM バッファー D + 0.05% DDM (表 1) の流量 0.5 mL/min でタンパク質を溶出し、分画コレクタと各画分を使用して流れを 1.0 mL に設定して流れを収集します。
- 500 μLに達するまで4,000 x g および4°Cで遠心濃縮器と遠心を使用して、プールおよび濃縮のための溶出ピークを含む分数を選択します。
- 500 μL ループを使用して、サンプルを FPLC マシンにロードし、4 °C の 25 mL サイズの除外カラムに積み込みます。 30 mL の DDM バッファ E + 0.05% DDM (表 1) を流速 0.5 mL/min で使用し、分数サイズが 1 分あたり 0.5 mL に設定された分数として収集します。
- 画分を取り、FPLC溶出グラフからUV-Vis曲線を確認するために280 nmの吸光度を使用してタンパク質濃度を測定する。
- FPLC溶出グラフで観測されたピークに対応する各サンプル画分から20μLを収集し、吸光度試験で正確であることが確認されました。
- 必要なアリコートで液体窒素またはドライアイスを使用してこれらのサンプル画分の残りを凍結し、-80°Cでタンパク質サンプルを保存します。
- 前述のとおり、SDS-PAGEゲル電気泳動アッセイを実行して、FPLC溶出グラフで観測されたピークに対応するサンプルを確認します。
6. 陰性染色グリッドの準備
- サンプル調製に使用するグリッドを、フィルターペーパーで包んだガラススライドに、カーボン側を上に向けて配置します。
- 電子顕微鏡グリッドを備えたガラススライドを2つの電極間のグロー放電器のチャンバーに入れ、ガラス蓋を交換して、中央に収まり、密閉されていることを確認します。
- グロー放電機を実行し、プラズマによって生成された紫色の光が見えるようにします。
- 機械の走行が終わったら、チャンバーが大気圧に達するまで待ってガラス蓋を取り外し、サンプルが積み込まれるベンチにグリッド付きのスライドを戻します。
- 適切なバッファーでサンプルを希釈するか、遠心濃縮器を使用して濃縮することにより、精製されたタンパク質サンプルの濃度を約 0.1 mg/mL に調整します。
- 3.5 μLのタンパク質サンプルを10 nm厚いカーボングリッドに積み込み、1分待ちます。
- フィルターペーパーでEMグリッドの表面から液体を取り除きます。
- グリッドで3μLの水滴を拾い、各滴を拾う間にフィルターペーパーでグリッドから水を取り除くことによって、グリッド表面3倍を洗浄します。
- 3 μLの新鮮な、ろ過された2%の酢酸ウランの液滴を拾ってグリッド表面2xを洗浄し、各滴を拾う間にフィルターペーパーでグリッド上の洗浄液を取り除きます。
- 3 μLの新鮮な、濾過された2%酢酸ウランの1分間のグリッドを染色します。
- EMグリッドの表面にある酢酸ウラン溶液を濾紙で取り除き、空気乾燥してグリッドを少なくとも1分間乾燥させます。
- 後で使用するためにグリッド ボックスにグリッドを格納します。
7. EMイメージング
- 準備したグリッドを安全なワークベンチのグリッドホルダーに積み込みます。
- 顕微鏡をポリスチレンボックスに入れ、液体窒素の3/4を満たして顕微鏡を準備します。
- 顕微鏡窓のゴムカバーが覆っていることを確認し、プラットフォームに収まるまで銅線をデュワーに入れて顕微鏡にロードします。
- 残りの残りの部分を液体窒素で満たし、それをカバーするためにデュワーの上にキャップを置きます。
- ハイテンションをオンにし、顕微鏡を調整し、顕微鏡がウォームアップし、使用するための安全な真空レベルを確立するのを待ちます。
- 顕微鏡が準備ができたら、カラムバルブを開き、顕微鏡ウィンドウのゴムカバーを取り外してビームが存在することを確認します。
- ビームの強度を調整して、広がってビームの汚名を確認します。乱視が存在する場合、ビームはクロスオーバーから離れて移動し、ビームは両側で同じ楕円形でなければならないので、楕円形になります。
- 顕微鏡双眼鏡を、観察者の目に合わせて正しい高さと距離に調整します。
- 3 つのモードすべてを循環して、ビームの位置を 検索、 フォーカス、 および露出 モードで確認します。
- カラムバルブを閉じて、グリッドホルダーを電子顕微鏡にロードします。
- 顕微鏡のウォブラー特徴を使用し、中央にサンプルの左右の動きがなくなるまでZ軸を使用してステージの動きを調整することにより、マイクロスコープをユーセントリックな高さに調整します。
- 顕微鏡上の低用量 検索 モードを使用して、サンプルに焦点を当てるために存在するサンプル分子との妥当な対比の望ましい領域をグリッドを検索します。
- サンプルが見えるまで高いステップサイズを使用して 、フォーカス モードでサンプルに焦点を当て、次にステップを減らすことで正しいフォーカスレベルを見つけます。
- ゼロとビームをブランクし、ゴムパッドが顕微鏡の窓を覆っていることを確認してください。
- 露出モードを使用して、62,000x倍率で1s露光のために目的のグリッド領域の画像を取り、取得した画像を確認します。
- グリッドのイメージングが完了したら、列バルブを閉じ、グリッドホルダを列から取り外します。
- 目的のすべてのグリッドのイメージングが終了すると、フィラメント電源をオフにして、顕微鏡から液体窒素デュワーを除去することによって、顕微鏡をシャットダウンします。
- 顕微鏡の銅コイルから結露をキャッチするために、デュワーが座ったスタンドに水分を吸収するために何かを置きます。
- クライオサイクルモードを有効にして、ターボポンプがオフになっていることを確認します。
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Representative Results
ここで提示した手順を用いて、 大腸菌 AcrB野生型および 大腸菌 変異体AcrB-P223Gのサンプルを精製した。次いで、試料を、カーボンネガティブ染色電子顕微鏡グリッドに吸着し、ウラニル酢酸を使用して、サイドブロッティング法22で染色した。負の染色画像は透過型電子顕微鏡を用いて収集した。DDMで精製されたAcrB野生型試料の陰性染色像は、明確に定義された三量体四晶構造を示すタンパク質を有する単分散粒子の均質な溶液を明らかにする(図1A)。これらの三量体構造は、精製時の観察サイズ排除クロマトグラムに対応する(補足図1)。これに対して、AcrB-P223G変異体の陰性染色像を見ると、DDMで精製しても、凝集に向かう傾向を持つ多分散ナノ粒子の不均一な溶液を観察することができるが、観察可能なネイティブ三量体はない(図1B)。これらの結果は、サイズ排除クロマトグラフィーを実施する際に観察された溶出プロファイルによっても支持される(補足図1)。変異体の三量体状態タンパク質の欠如が、洗浄剤による処理によるものであったのか、またはP223Gの不安定性変異によってのみ引き起こされたのかを判断するために、NCMNsライブラリー内の膜活性ポリマーの1つであるNCMNP1-1を用いてタンパク質も精製した。NCMNP1-1で精製したAcrB野生型試料の陰性染色像は、再び、明確に定義された三量体四晶構造を示すタンパク質を有する単分散粒子の均質な溶液を明らかにする(図1C)。そして、DDM精製と同様に、AcrB-P223G変異体をNCMNP1-1で精製すると、負の染色像は凝集に向かう傾向を持つ多分散ナノ粒子の不均一な溶液を示すが、観察可能なネイティブ三量体はない(図1D)。P223G変異が細胞膜上のAcrB三分子を破壊することをさらに確認するために、異なるポリマー(NCMNP5-2)を独自のNCMNs膜活性ポリマーライブラリーから選択した。NCMNP5-2は、より大きなサイズでネイティブ細胞膜ナノ粒子を形成することができ、したがって、単一のネイティブ細胞膜粒子で複数のAcrBトリマーを画像化することができます。その結果、複数の野生型AcrBトリマーが単一粒子に含まれていることが観察された(図1E)。しかし、野生型AcrBによって形成されたようなAcrB-P223G三小粒子は、大きなネイティブ細胞膜二層パッチを見ても観察されなかった(図1F)。これは、AcrB-P223Gが以前に示唆された21 のように細胞膜上に三分体として存在しないことを示唆し、AcrB-P223Gがアッセイ時に活性の劇的な低下を示す理由についての論理的な説明を提供する。正しいタンパク質のサンプルの純度および存在を確認するために、すべての精製タンパク質サンプルに対して電気泳動ゲルを実行した。得られた染色物は、全てのサンプル中にAcrBの存在を確認し、その中に>95%の純度を有し、その染色の位置はAcrBの予測分子量に対応した(図1G)。我々の研究の結果は、膜タンパク質AcrB-P223G16のオリゴマー状態を決定することに関して、前述のFRETアッセイと矛盾している。プロトコルに記載された膜活性ポリマーおよび電子顕微鏡を利用することにより、タンパク質の天然オリゴマー状態を直接観察することができた。タンパク質のモノマーが互いにどのように相互作用するかをより正確に決定するには、高解像度のクライオEM構造の決定が必要です。
図1:精製されたAcrB構築物の陰性染色および電気泳動ゲル画像。(A)DDMで精製した野生型AcrB用に撮影した陰性染色画像。(B) DDMで精製したAcrB-P223Gタンパク質構築物に対して撮影した陰性染色画像。(C)NCMNP1-1で精製した野生型AcrB用に撮影した陰性染色画像。(D) NCMNP1-1で精製したAcrB-P223Gコンストラクト用に撮影した陰性染色画像。(E)NCMNP5-2で精製した野生型AcrB用に撮影した陰性染色像(赤色のボックスは、画像で観察された三量体ナノ粒子の一部を強調する)。(F)NCMNP5-2で精製したAcrB-P223G用に撮影した陰性染色画像(緑色のボックスは、画像中で観察されたNCMNP5-2で捕捉された脂質パッチの一部を強調する)。(G) SDS-PAGEゲルは、DDM(レーン1)、NCMNP1-1(レーン2)、(H)SDS-PAGEゲルランを用いたAcrB-P223Gの精製から、NCMNP5-2を用いた最終製品を用いたAcrB-P223Gの精製から最終製品を用いた最終製品を用いて、最終製品を用いて実行します。(I) F から強調表示された機能の拡大表示を図 1E. (J) で表示します。図 1 の負の染色イメージはすべて、同じスケール バーが 50 nm です。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| DDM精製バッファー | ポリマー精製バッファー | ゲル電気泳動バッファー | |||
| バッファ A | 50 mM ヘペス、pH 7.8 | NCMN バッファ A | 50 mMヘペス、pH 8.4 | TAE バッファ | 40 mM トリスベース |
| 300 mM ナクル | 500 mM ナクル | 1 mM EDTA | |||
| 5% グリセロール | 5% グリセロール | 20 mM 酢酸 | |||
| 20 mM イミダゾール | 20 mM イミダゾール | ||||
| 1 mM MgCl2-6 H2O | 0.1 mM TCEP | ||||
| 0.1 mM TCEP | |||||
| バッファB | 50 mM ヘペス、pH 7.8 | NCMN バッファ B | 25 mM ヘペス、pH 7.8 | デステインバッファ | 40% メタノール |
| 300 mM ナクル | 500 mM ナクル | 10% 酢酸 | |||
| 5% グリセロール | 5% グリセロール | ||||
| 40 mM イミダゾール | 40 mM イミダゾール | ||||
| 1 mM MgCl2-6 H2O | 0.1 mM TCEP | ||||
| 0.1 mM TCEP | |||||
| バッファC | 50 mM ヘペス、pH 7.8 | NCMN バッファ C | 25 mM ヘペス、pH 7.8 | スタッキングジェル | 1.5 M トリス pH 8.8 (0.63 ml) |
| 300 mM ナクル | 500 mM ナクル | 30% アクリルアミド/ビス (0.43 ml) | |||
| 5% グリセロール | 5% グリセロール | 10% SDS (0.025 ml) | |||
| 75 mM イミダゾール | 75 mM イミダゾール | 10% APS (0.025 ml) | |||
| 1 mM MgCl2-6 H2O | 0.1 mM TCEP | テムド(4 μl) | |||
| 0.1 mM TCEP | H2O (1.39 ml) | ||||
| バッファ D | 50 mM ヘペス、pH 7.8 | NCMN バッファ D | 25 mM ヘペス、pH 7.8 | 12% 分離ゲル | 1.5 M トリス pH 8.8 (1.3 ml) |
| 300 mM ナクル | 500 mM ナクル | 30% アクリルアミド/ビス (2 ml) | |||
| 5% グリセロール | 5% グリセロール | 10% SDS (0.05 ml) | |||
| 300 mM イミダゾール | 300 mM イミダゾール | 10% APS (0.05 ml) | |||
| 1 mM MgCl2-6 H2O | 0.1 mM TCEP | テムド(5 μl) | |||
| 0.1 mM TCEP | H2O (1.6 ml) | ||||
| バッファ E | 40 mM ヘペス、pH 7.8 | NCMN バッファ E | 40 mM ヘペス、pH 7.8 | ||
| 200 mM ナクル | 200 mM ナクル | ||||
| 0.1 mM TCEP | 0.1 mM TCEP | ||||
表1:カラムクロマトグラフィーおよびゲル電気泳動に使用される精製バッファーのリスト。
補足図1:サイズ排除クロマトグラフィー溶出プロファイル。(A)DDMおよび野生型AcrB(オレンジ)およびDDMおよび変異体AcrB-P223G(青)で精製する際に行われるサイズ排除クロマトグラフィー実験のために観察された2つの溶出プロファイルのオーバーレイグラフ。(B)DDM実験に利用されるサイズ除外カラムのカラム較正プロファイル。
1:チログロブリン(Mr 669 000)、2:フェリチン(Mr 440 000)、3:アルドラーゼ(Mr 158 000)、4:コンアルブミン(Mr 75 000)、5:オブアルブミン(Mr 44 000)、6:炭酸無水酵素(Mr 29 000)、7:リボンクランジ(733氏) こちらをダウンロードしてください。
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Discussion
タンパク質とタンパク質の相互作用は、膜タンパク質の構造と機能の完全性にとって重要です。タンパク質とタンパク質の相互作用を調べるアプローチが数多く開発されています。可溶性タンパク質と比較すると、膜タンパク質およびそのPPIは、膜タンパク質の固有の本質的な特性のために研究することがより困難です。この難しさは、主に構造安定性と機能性のためのネイティブ脂質二重層環境に埋め込まれる膜タンパク質の要件から来ています.タンパク質の高解像度構造を決定するためには細胞膜から抽出する必要があるため、これは問題になります。FRETは細胞膜上のタンパク質とタンパク質相互作用を調べる一般的な技術であったが、解像度は低く、しばしば偽陽性17、18、19、20を産生する。ここでは、天然細胞膜上の野生型AcrBトリマーとAcrB-P223Gモノマーを構造的に分析し、FRETを用いた以前の分析結果と比較することで、NCMNを使用して膜タンパク質相互作用を研究できることが初めて実証されています。野生型AcrBとAcrB-P223Gの電子顕微鏡単粒子画像を比較することにより、NCMNP1-1やNCMNP5-2のような膜活性ポリマーを用いて精製した場合、AcrB-P223Gの大部分が野生型AcrBタンパク質のような大腸菌細胞膜上にトリマーを形成しないことが示唆される。ここでは、FRET解析の結果が、FRETアプローチの解像度制限に起因する誤検出である可能性があることを提案する。AcrB-P223Gトリマを安定化させた人工ジスルフィド結合は、溶液21で発生した人工的な人工的な二硫化物結合もまた、人工的に起こる人工的な結合である可能性がある。陰性染色画像は、P223G変異がAcrBトリマーの形成を妨げ、AcrBの単量体形態がその三量体の形態で観察されたのと同じ立体構造にとどまることができないことを示唆している。この変異を含むループは、変異原性および構造解析を通じた三量体の形成にとって絶対に重要であることが以前に示されたが、これは隣接するAcrB単量体23に埋め込んで各ループが相互作用に起因する構造的意義を示した。
タンパク質相互作用の検出と分析のためにネイティブ細胞膜ナノ粒子システムを利用することにより、膜タンパク質を真にネイティブな細胞膜環境に保つことによってタンパク質のオリゴマー状態を直接検出することができ、サンプルの単一粒子クライオEM分析を通じて原子レベルで高分解能の構造情報を得ることができます。NCMNシステムは、洗浄剤24で試料を処理することによって生じるPPI検出で観察される頻繁な偽陽性および偽陰性を避けるのに役立つ。これらの偽の結果は、通常、凝集、タンパク質サンプルの変性、非共有結合相互作用の解離、および洗剤の脱脂作用によって引き起こされる人工オリゴマー状態の形成のために生じる。さらに、NCMNsと組み合わせて構造解析を使用すると、追加の構造情報が提供され、PPIを理解する上で重要であり、PPI検出の以前に確立された方法を利用する際に通常失われる分子相互作用の直接観察が可能になります。この方法は野生型AcrBの構造研究にうまく使用されており、X線結晶学や固体NMRなどの他の形態の構造解析に広く適用可能であり、新しいタンパク質標的によって表示される相互作用を決定しようとする他の研究で使用されている多くの異なるタンパク質を有する。
高純度の合理的なタンパク質収率で再現性のある結果を得るためには、膜活性ポリマーを用いた精製プロセスにおいて、いくつかの重要なステップが必要です。最初の重要なステップは膜単離のプロセスであり、したがって細胞のライセートを15,000 x g で遠心分離し、細胞の残りの部分から細胞膜を真に分離するために215,000 x g で超遠心分離を行ってこのステップに従う必要があります。次の重要なステップは、膜活性ポリマーで膜分率を室温で2時間2.5%の濃度で可溶化することです。精製の最適化実験を行い、この工程でこれらのパラメータを利用して、AcrBの最適量が膜から抽出され、天然細胞膜ナノ粒子の適切な形成が起こることを確実にすることが示された。精製プロセスの最後の重要なステップは、室温でNi-NTAカラムにサンプルをロードすることです。膜活性ポリマーは4°Cよりも室温でより可溶性であるため、室温での負荷は、アフィニティーカラムへのタンパク質結合量を増加させ、不溶性ポリマーの蓄積によって引き起こされる高圧を避け、カラムを損傷する可能性があるため、これが必要です。正確な構造情報を得るために重要であるのと同様に、前述の負の染色手順に含まれるステップです。この手順の最も重要な側面は、10 nm厚孔質炭素グリッドの使用、水の量および酢酸ウラニル、およびサンプル吸着と染色のための時間の長さです。サンプル調製中にこれらの主要なパラメータを使用することで、画像化されるサンプルのオリゴマー状態を正確に評価するために使用できる品質の構造データが保証されます。精製プロトコルの変更は、さまざまなポリペプチドの固有の特性に起因する問題をトラブルシューティングするために、異なるタンパク質を使用する場合に必要な場合があります。十分な量のタンパク質サンプルを得るのが難しい場合に変更を検討する主な要因は、誘導ステップで使用されるパラメータ、可溶化工程で使用される膜分率の量、および可溶化プロセスの時間と温度の長さである必要があります。純度に問題がある場合は、精製のためにNi-NTAカラムを使用する代わりに、ビオチン親和性カラムなどの代替親和性カラムを利用する必要があります。同様に、弱い/一過性のタンパク質相互作用の維持が必要な場合、NI-NTAカラムをTAPタグアフィニティーカラムに交換することは、最適な結果を得るには有益です。最後に、哺乳類のタンパク質を研究する際に、哺乳類発現系は、タンパク質の自然オリゴマー状態を正確に決定するために必要な真のネイティブ細胞膜脂質組成物を維持するために使用されるべきである。これは、このプロトコルのタンパク質発現および細胞のリシスステップを完全に見直す必要があります。このような場合、対象となる標的タンパク質に必要な発現系に対応するタンパク質発現および細胞ライシスに関する既に確立されたプロトコルに従うべきである。
電子顕微鏡でのNCMNの使用は、PPIの検出に使用するFRETと比較すると大きな利点を示します。本研究の結果が示すように、以前に実施したFRET実験は、AcrB変異タンパク質21のオリゴマー構造の構造解析と矛盾していた。これは、負染色電子顕微鏡で撮影した画像によって明確に示され、直接確認されたが、これは、変異型AcrB−P223G16に対する前述の活性の喪失と一致している。AcrB-P223Gが生体内でトリマーを形成した場合、NCMNP5-2ポリマーは、それが抽出する大きなネイティブ細胞膜パッチでそれらを捕まえたであろう。変異型AcrBのFRET分析は、この技術が依存する物理的プロセスに固有のいくつかの制限と蛍光共鳴エネルギー移動を測定するために利用される技術のために偽陽性をもたらした可能性があります。FRETの1つの大きな制限は、共焦点顕微鏡の分解限界であり、これはFRETアッセイ19で解決され得る分子間距離における重大な限界をもたらす。これに対し、NCMを電子顕微鏡と組み合わせて利用することは、前述のFRETの制限の対象ではなく、共焦点顕微鏡と比較すると解像度限界が著しく高い。前述したFRETアッセイに潜在的な影響を及ぼすこれらの制限に基づいて、我々は、生体内でのAcrB-P223Gトリマの誤検出がFRET21の低解像度制限から生ずったことを示唆している。本論文が直接指摘したFRETに対する利点とは別に、NCMNを電子顕微鏡と組み合わせて使用することは、Y2H系やTAP-MSなどの現在のタンパク質相互作用技術よりも利点があり、高分解能でネイティブ細胞膜環境におけるタンパク質とタンパク質の相互作用を直接観察するために使用することができ、原子構造を決定するために使用される可能性を有する。
膜活性ポリマーおよび電子顕微鏡法も制限がないわけではない。現在、NCMN精製の主な課題は、洗浄剤ベースの方法(NCMNライブラリのポリマーディスプレイからDDMの抽出効率が70%程度)と比較した場合の抽出効率が低い点です。また、マルトース バインド列など、一部のアフィニティ列との互換性の問題もあります。さらに、NCMN精製は、高ダイナミック膜タンパク質または複合体(未公開データ)ではまだあまり成功していません。膜活性ポリマーと電子顕微鏡を用いたオリゴマー状態の測定実験では、天然細胞環境からタンパク質を除去する必要がありますが、FRETは生体内で行われます。しかし、膜活性ポリマーによって形成されたナノ粒子は、細胞からタンパク質を抽出する際に可能な最も天然の環境を可能にし、タンパク質の抽出および精製によって引き起こされることが知られている潜在的な実験的に誘導された不正確さを低減させる。さらに、透過電子顕微鏡の限界としての分解能と粒子径の問題は過去10年間で著しく減少していますが、負の染色分析にまだ使用されている顕微鏡は、一般的に約0.1-0.3 nm25の情報制限を有するため、依然としてより大きな分子または分子複合体(>200 kDa)に比較的限定されます。SMALPは、アプリケーションの面でも非常に柔軟であることが示されていますが、NCMNsよりもさらに大きな制限を表示します。SMAによって形成されたナノディスクは、およそ15nmの最大直径を有し、したがって、400kDa26を超えるタンパク質およびタンパク質複合体を抽出するのに一般的には効果がない。この制限に加えて、SMAは低pH環境に存在するタンパク質を扱ったり、構造上および機能的な目的のために二価イオンを利用することもできません。SMALPsの作用機序はpH依存性であるため、pH条件が低く、2価イオンをキレートして使用することはできません。SMILPおよびDIBMAの方法はこれらの限界を克服することに関して約束を提供しているが、多様なセットタンパク質への適用可能性は27、28の目に見えないままである。NCMNsは、構造活性関係(SAR)分析を用いて、より大きなナノ粒子を形成し、低pH条件で機能し、二価イオンをキレートすることを避けることができる代替ポリマーを作成することによって、これらの制限を克服することを目指しています。NCMNs用に開発されたポリマーのそのような例の1つは、図1E,Fに示すように、より大きなナノ粒子を作成する能力を示すNCMNP5-2ポリマーである。
ナノ粒子技術の進歩に加えて、NCMNsの将来の方向性は、NCMNsポリマーライブラリに抽出効率の向上と、すべての異なる膜貫通領域サイズのタンパク質を操作する能力、はるかに広いpHレベルで機能する能力、またはその構造および機能の維持のために任意のタイプのイオンに依存する、さらに膜活性ポリマーを開発することです。これにより、すべての膜タンパク質研究者は、この技術を実験に活用し、より正確で生物学的に関連する結果にアクセスできるようになります。ポリマーナノ粒子の利点を幅広いタンパク質に持ち込むことで、天然の膜タンパク質複合体の高解像度構造を原子レベルで解き明かし、これらの複合体の維持に入る分子内原子相互作用を決定することが期待されます。このような進歩は、構造ベースの薬物設計の取り組みを通じて、膜タンパク質創薬の発見と開発の面で多くの新しい可能性を可能にします。膜タンパク質の構造ベースの薬物設計技術の利用は、望ましくない副作用と所望の治療効果を引き出すために必要な化合物の量を減らすために薬物結合特異性および有効性を高め、したがって、膜タンパク質を標的とする薬物をより安全かつ効果的なものにするため、医療業界にとって大きな利益となるであろう。ネイティブ細胞膜ナノ粒子システムは、まだその発達段階にありますが、真に在来する状態で膜タンパク質の研究を初めて可能にし、細胞膜上で起こる天然のタンパク質とタンパク質の相互作用を解明することによって、すでに信じられないほど強力であることが証明されています。
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Disclosures
Y.Gは、膜活性ポリマーNCMNP5-2およびNCMN系の発明者としてリストされている。
Acknowledgments
この研究は、VCUスタートアップファンド(Y.G.へ)と国立衛生研究所の国立総合医学研究所が賞番号R01GM132329(Y.G.に)によって支援されました。コンテンツは著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。モンセラート・サムソとケビン・マクロバーツがビデオ録画を惜しんでサポートしてくれたことに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| 30% Acrylamide/BIS SOL (37.5:1) | Bio-Rad | 161-0158 | |
| 4x Laemmli Sample Buffer (Loading Buffer) | Bio-Rad | 1610747 | |
| Acetic Acid Glacial | ThermoFisher Scientific | A38S-212 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Bio-Rad | 161-0700 | |
| Chloramphenicol | Goldbio | C-105-5 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 protein stain powder | Bio-Rad | 161-0400 | |
| DTT (Dithiothreitol) (> 99% pure) Protease free | Goldbio | DTT10 | |
| Glycerol | ThermoFisher Scientific | G33-4 | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | BP310-1 | |
| Imidazole | Affymetrix | 17525 1 KG | |
| IPTG | Goldbio | I2481C100 | |
| Kanamycin | Goldbio | K-120-25 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | ThermoFisher Scientific | AA3622636 | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | A412-4 | |
| N,N-dimethylethylenediamine (EDTA) | Merck | 8.03779.0100 | |
| NCMNS-P5-2 | Not commercially available yet | Submit request for obtaining to corresponding author | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standard | Bio-Rad | 161-0374 | |
| SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | Bio-Rad | 161-0301 | |
| SMA2000 | Cray Valley | Submit request for obtaining to corresponding author | |
| Sodium Chloride | ThermoFisher Scientific | S271-10 | |
| TCEP-HCl | Goldbio | TCEP25 | |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| Terrific Broth Media | Affymetrix | 75856 1 KG | |
| Tris Base | Bio-Rad | 161-0719 | |
| Uranyl Acetate | Ambinter | Amb22348393 | |
| Equipment | |||
| Avanti J-26S XPI | Beckman Coulter | B14538 | |
| Avanti JXN-30 | Beckman Coulter | B34193 | |
| Carbon Electron Microscope Grids (10 nm) | Electron Microscopy Sciences | CF300-Cu-TH | |
| Con-Torque Tissue Homogenizer | Eberbach | E7265 | |
| Corning LSE Mini Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 07-203-954 | |
| EmulsiFlex-C3 | Avestin | ||
| Fraction Collector F9-R | GE Healthcare Life Sciences | 29003875 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 165-8004 | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | PN LL-IM-12AB | |
| PELCO easiGlow Glow Discharge Cleaning System | Ted Pella | 91000S-230 | |
| Potter-Elvehjem Safe Grind Tissue Grinder | Wheaton | 358013 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 164-5050 | |
| Razel R99-E Variable Speed Syringe Pump | Razel Scientific Instruments | ||
| Superdex 200 Increase 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 28990944 | |
| Tecnai F20 200kV | FEI | ||
| Type 70 Ti Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | ||
| General Materials | |||
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 05-408-129 | |
| 4 ml Amicon Ultra-4 30 kDa | Millipore Sigma | UFC803024 | |
| AKTA pure 25 L1 FPLC | GE Healthcare Life Sciences | 29018225 | |
| BL21(DE3)pLysS Cells | ThermoFisher Scientific | C606003 | |
| Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | |
| HisTrap HP 5 ml Column | GE Healthcare Life Sciences | 17524802 | |
| pET-24a | EMD Biosciences | 69749-3 |
References
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