Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de bepaling van oligomere toestand van membraaneiwitten dat gebruik maakt van een inheems celmembraan nanodeeltjessysteem in combinatie met elektronenmicroscopie.
Eiwit-eiwitinteracties in celmembraansystemen spelen een cruciale rol in een breed scala aan biologische processen, van cel-tot-celinteracties tot signaaltransductie; van het detecteren van omgevingssignalen tot biologische respons; van metabole regulatie tot ontwikkelingscontrole. Nauwkeurige structurele informatie over eiwit-eiwitinteracties is cruciaal voor het begrijpen van de moleculaire mechanismen van membraaneiwitcomplexen en voor het ontwerp van zeer specifieke moleculen om deze eiwitten te moduleren. Er zijn veel in vivo en in vitro benaderingen ontwikkeld voor de detectie en analyse van eiwit-eiwit interacties. Onder hen is de structurele biologiebenadering uniek omdat het directe structurele informatie kan geven over eiwit-eiwitinteracties op atomair niveau. De huidige structurele biologie van membraaneiwitten is echter nog steeds grotendeels beperkt tot methoden op basis van detergentia. Het grote nadeel van methoden op basis van detergentia is dat ze vaak membraaneiwitcomplexen dissocieren of denatureren zodra hun inheemse lipide-bilayeromgeving wordt verwijderd door wasmiddelmoleculen. We hebben een native cell membrane nanodeeltjes systeem ontwikkeld voor membraan eiwit structurele biologie. Hier demonstreren we het gebruik van dit systeem bij de analyse van eiwit-eiwitinteracties op het celmembraan met een case study van de oligomere toestand van AcrB.
Eiwit-eiwit interacties (PPI) spelen een cruciale rol in de biologie, van het behoud van de structuur en functie van eiwitten tot de regulering van hele systemen. PPR’s zijn er in veel verschillende vormen en kunnen worden gecategoriseerd op basis van welke soorten interacties ze vormen. Een dergelijke categorisatie is homooligomerisch of heterooligomerisch, gebaseerd op de vraag of de interacties tussen identieke subeenheden of verschillende eiwitten zijn die als subeenheden werken. Een andere categorisatie is gebaseerd op de kracht van de interactie als de interacties leiden tot de vorming van stabiele complexen of voorbijgaande complexe toestanden. Structurele informatie over de PPR’s tussen eiwitten is cruciaal om het mechanisme te begrijpen waarmee eiwitten hun functie uitvoeren. Geschat wordt dat meer dan 80% van de eiwitten afhankelijk is van complexe vorming om hun functionele rol uit te voeren1. Gezien het percentage waargenomen eiwitten dat afhankelijk is van PPR’s voor een goede aangeboren werking, is hun betekenis in de biologie duidelijk, maar het goed kunnen onderzoeken van de eiwitten die deelnemen aan deze interacties is een uitdaging gebleven vanwege beperkingen in de technieken die beschikbaar zijn om experimenteel te observeren wanneer eiwitten PPR’s vormen.
Er is een grote mate van onenigheid tussen de resultaten voor veel experimenteel bepaalde PPR’s vanwege de hoge hoeveelheid ruis, valse positieven en valse negatieven die zijn afgeleid van veel van de momenteel beschikbare PPI-bepalingstechnieken. Dit geldt met name voor het gist tweehybride (Y2H)-systeem, tandemaffiniteitzuiveringsmassaspectrometrie (TAP-MS) en fluorescentieresonantie-energieoverdracht (FRET), die drie van de meest gebruikte methoden voor PPI-bepaling2,3,4,5,6,7vertegenwoordigen . Ter vergelijking: eiwitstructuurbiologietechnieken, zoals nucleaire magnetische resonantie (NMR), röntgenkristallografie en elektronenmicroscopie (EM), kunnen worden gebruikt om structurele informatie in hoge resolutie over eiwit-eiwitinteracties tot op atomair niveau te verkrijgen en de directe visuele bevestiging mogelijk te maken van de interacties die optreden voor een doeleiwit van belang. Alle momenteel beschikbare niet-structuurgebaseerde PPI-bepalende onderzoekstechnieken (bijv. Y2H, TAP-MS en FRET) missen dit vermogen en hebben bovendien moeite met het identificeren van zwakke en voorbijgaande interacties tussen eiwitten5. Deze tekortkomingen worden verder versterkt bij het bestuderen van membraaneiwitten vanwege de extra complexiteit veroorzaakt door de extra variabele van de lipideomgeving die de vorming van de juiste quaternaire structuur en heteromere complexe assemblage beïnvloedt.
Membraaneiwitten vormen een groot deel van het proteoom en staan erom bekend dat ze veel cruciale rollen spelen bij het goed functioneren van cellen in alle levende organismen. Ondanks het feit dat membraaneiwitten naar schatting 27% van het menselijk genoom uitmaken en ~ 60% van alle huidige medicijndoelenvormen,is er een grote anomalie in het aantal opgeloste modellen voor membraaneiwitten die slechts ~ 2,2% van alle gepubliceerde eiwitstructurenuitmaken 8,9,10. De belangrijkste oorzaak van de discrepantie in de beschikbaarheid van structurele informatie ligt in de intrinsieke eigenschappen van membraaneiwitten zelf. Vanwege hun slechte oplosbaarheid, afhankelijkheid van interacties met een lipideomgeving voor het behoud van de inheemse structuur en functie, en verschillende fysisch-chemische eigenschappen van het lipidemembraan zelf, blijven membraaneiwitten een aanzienlijk probleem vormen bij het implementeren van structurele biologietechnieken om ze te bestuderen. Van deze intrinsieke eigenschappen is de belangrijkste voor het verkrijgen van nauwkeurige structurele informatie de vereiste van interacties met hun natuurlijke lipideomgeving om hun oorspronkelijke structuur en functie te behouden. De lipideomgeving is zo’n integraal onderdeel van de structuur en functie van membraaneiwitten dat het concept memteïne (een combinatie van de woorden membraan en eiwit) is voorgesteld als de fundamentele eenheid van membraan-eiwitstructuur en functie11. Ondanks het belang van lipide-eiwitinteracties vereisen de momenteel beschikbare structuurgebaseerde PPI-bepalingstechnieken vaak dat de bestudeerde eiwitten oplosbaar zijn of worden opgelost met detergentia. Blootstelling aan agressieve detergentia kan de eiwitten denatureren of valse positieven en negatieven veroorzaken als gevolg van delipidatie, wat aggregatie, denaturatie van eiwitten, dissociatie van niet-covalente interacties en vorming van kunstmatige oligomere toestanden kan veroorzaken. Vanwege de noodzaak van het handhaven van een natuurlijke lipideomgeving voor nauwkeurige bepaling van de inheemse oligomere toestand van membraaneiwitten hebben we een Native Cell Membrane Nanoparticles system (NCMNs)12 ontwikkeld op basis van de eerder gerapporteerde Styreen Maleic Acid Lipid Particles (SMALP)13-methode.
SMALP gebruikt styreen maleïnezuurcopolymeer als een membraan actief polymeer om membraaneiwitten te extraheren en op te slubiliseren. Poly (Styreen-co-Maleic Acid) (SMA) is een uniek amfifiel polymeer vanwege zijn hydrofobe styreen moiety en diametraal tegengestelde hydrofiele maleïnezuur moiety. Het vormt nanodeeltjes door het celmembraan te adsorberen, destabiliseren en verstoren in een pH-afhankelijk mechanisme14. Deze functionele activiteit van SMA maakt het mogelijk om het te gebruiken als een wasmiddelvrij systeem voor membraaneiwitextractie en oplosbaarheid. Het NCMN-systeem onderscheidt zich in verschillende aspecten van het SMALP-systeem. Het meest unieke kenmerk van het NCMN-systeem is dat het een membraan actieve polymeerbibliotheek heeft met een veelheid aan polymeren die unieke eigenschappen hebben die ze geschikt maken voor de isolatie van veel verschillende membraaneiwitten die verschillende omstandigheden voor stabiliteit en native werking vereisen. Het NCMN-systeem heeft ook verschillende protocollen in vergelijking met de SMALP-methode als het gaat om het voorbereiden van de nanodeeltjes. Een voorbeeld hiervan is dat NCMN’s een kolomzuivering met nikkelaffiniteit in één stap gebruiken voor de bepaling van de structuur met hoge resolutie; het effect van deze verschillende protocollen kan worden waargenomen bij het vergelijken van het NCMNs-protocol, dat 3,2 en 3,0 Å cryo-EM AcrB-structuren genereerde, met een vergelijkbare studie met behulp van de SMALP-methode, wat resulteerde in een cryo-EM AcrB-structuur met een resolutie van 8,8 Å12,15. Deze unieke kenmerken van het NCMN-systeem zijn de verbeteringen die zijn aangebracht op de eerder vastgestelde SMALP-methode en maken het een ideale kandidaat voor de studie van PPR’s.
De multidrug efflux transporter AcrB bestaat als functionele homotrimeer in E. coli12. Een mutagene analyse suggereerde dat een enkele P223G-puntmutatie, gelegen op een lus die verantwoordelijk is voor de stabiliteit van de AcrB-trimer, de trimertoestand destabiliseert en een AcrB-monomeer oplevert wanneer deze wordt bereid met het wasmiddel DDM, dat kan worden gedetecteerd met native blue gel electrophoresis16. De FRET-analyse van de AcrB-P223G-mutant suggereerde echter dat in de oorspronkelijke celmembraanlipide-bilayeromgeving de meerderheid van mutant AcrB-P223G nog steeds als trimer bestond en dat de expressieniveaus voor zowel wild type AcrB als AcrB-P223G vergelijkbaar zijn. Maar ondanks de resultaten van de FRET-analyse toonde een activiteitstest voor de mutante transporter aan dat de activiteit drastisch daalde in vergelijking met het wilde type16. Hoewel FRET-technologie in de volksmond is gebruikt voor de analyse van eiwit-eiwitinteracties, heeft onderzoek aangetoond dat het vaak valse positieven kan geven17,18,19,20.
Onlangs werden cryo-EM-structuren met hoge resolutie van de AcrB-trimer bepaald die de interactie van AcrB met de bijbehorende inheemse celmembraanlipide-bilayer lieten zien door het gebruik van de NCMNs12. In principe kunnen de NCMN’s gemakkelijk worden gebruikt voor de analyse van eiwit-eiwitinteracties op het inheemse celmembraan. In een test van dit systeem werden experimenten uitgevoerd om de oligomere toestand van AcrB-P223G direct te observeren met behulp van native cell membrane nanodeeltjes en negatieve vlekkende elektronenmicroscopie. Om te vergelijken met het wilde type AcrB nanodeeltjes, gebruikten we hetzelfde membraan actieve polymeer (SMA2000 gemaakt in ons laboratorium, dat is geïndexeerd als NCMNP1-1 in de NCMN-bibliotheek) gebruikt voor hoge resolutie cryo-EM structuurbepaling van AcrB en alternatieve polymeren gevonden in de NCMN’s bibliotheek12. Op basis van de eerder gerapporteerde resultaten werd verwacht dat de meerderheid van de AcrB-P223G-mutant zou bestaan in de vorm van trimerische inheemse celmembraan nanodeeltjes21. Er werden echter geen AcrB-trimers in het monster gevonden, zoals die welke werden waargenomen met het wilde type AcrB. Dit suggereert dat de meerderheid van AcrB-P223G geen trimers vormt op het oorspronkelijke celmembraan zoals eerder gesuggereerd.
Hier rapporteren we een gedetailleerde analyse van de mutant E. coli AcrB-P223G in een vergelijking met het wilde type E. coli AcrB met behulp van de NCMNs. Deze case study van AcrB suggereert dat NCMNs een goed systeem is voor eiwit-eiwit interactie analyse.
Eiwit-eiwit interacties zijn belangrijk voor de integriteit van de structuur en functie van membraaneiwitten. Er zijn veel benaderingen ontwikkeld om eiwit-eiwitinteracties te onderzoeken. In vergelijking met oplosbare eiwitten zijn membraaneiwitten en hun PPR’s moeilijker te bestuderen vanwege de unieke intrinsieke eigenschappen van membraaneiwitten. Deze moeilijkheid komt voornamelijk voort uit de eis van membraaneiwitten om te worden ingebed in een inheemse lipide-bilayeromgeving voor structurele stabiliteit en functi…
The authors have nothing to disclose.
Dit onderzoek werd ondersteund door het VCU startup fund (aan Y.G.) en het National Institute Of General Medical Sciences van de National Institutes of Health onder Award Number R01GM132329 (to Y.G.) De inhoud valt uitsluitend onder de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health. We danken Montserrat Samso en Kevin McRoberts voor hun gulle steun voor video-opname.
Chemicals | |||
30% Acrylamide/BIS SOL (37.5:1) | Bio-Rad | 161-0158 | |
4x Laemmli Sample Buffer (Loading Buffer) | Bio-Rad | 1610747 | |
Acetic Acid Glacial | ThermoFisher Scientific | A38S-212 | |
Ammonium Persulfate (APS) | Bio-Rad | 161-0700 | |
Chloramphenicol | Goldbio | C-105-5 | |
Coomassie Brilliant Blue R-250 protein stain powder | Bio-Rad | 161-0400 | |
DTT (Dithiothreitol) (> 99% pure) Protease free | Goldbio | DTT10 | |
Glycerol | ThermoFisher Scientific | G33-4 | |
HEPES | ThermoFisher Scientific | BP310-1 | |
Imidazole | Affymetrix | 17525 1 KG | |
IPTG | Goldbio | I2481C100 | |
Kanamycin | Goldbio | K-120-25 | |
Magnesium chloride hexahydrate | ThermoFisher Scientific | AA3622636 | |
Methanol | ThermoFisher Scientific | A412-4 | |
N,N-dimethylethylenediamine (EDTA) | Merck | 8.03779.0100 | |
NCMNS-P5-2 | Not commercially available yet | Submit request for obtaining to corresponding author | |
Precision Plus Protein Dual Color Standard | Bio-Rad | 161-0374 | |
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | Bio-Rad | 161-0301 | |
SMA2000 | Cray Valley | Submit request for obtaining to corresponding author | |
Sodium Chloride | ThermoFisher Scientific | S271-10 | |
TCEP-HCl | Goldbio | TCEP25 | |
TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
Terrific Broth Media | Affymetrix | 75856 1 KG | |
Tris Base | Bio-Rad | 161-0719 | |
Uranyl Acetate | Ambinter | Amb22348393 | |
Equipment | |||
Avanti J-26S XPI | Beckman Coulter | B14538 | |
Avanti JXN-30 | Beckman Coulter | B34193 | |
Carbon Electron Microscope Grids (10 nm) | Electron Microscopy Sciences | CF300-Cu-TH | |
Con-Torque Tissue Homogenizer | Eberbach | E7265 | |
Corning LSE Mini Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 07-203-954 | |
EmulsiFlex-C3 | Avestin | ||
Fraction Collector F9-R | GE Healthcare Life Sciences | 29003875 | |
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 165-8004 | |
NanoDrop 2000 Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | PN LL-IM-12AB | |
PELCO easiGlow Glow Discharge Cleaning System | Ted Pella | 91000S-230 | |
Potter-Elvehjem Safe Grind Tissue Grinder | Wheaton | 358013 | |
PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 164-5050 | |
Razel R99-E Variable Speed Syringe Pump | Razel Scientific Instruments | ||
Superdex 200 Increase 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 28990944 | |
Tecnai F20 200kV | FEI | ||
Type 70 Ti Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | ||
General Materials | |||
1.5 ml Microcentrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 05-408-129 | |
4 ml Amicon Ultra-4 30 kDa | Millipore Sigma | UFC803024 | |
AKTA pure 25 L1 FPLC | GE Healthcare Life Sciences | 29018225 | |
BL21(DE3)pLysS Cells | ThermoFisher Scientific | C606003 | |
Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | |
HisTrap HP 5 ml Column | GE Healthcare Life Sciences | 17524802 | |
pET-24a | EMD Biosciences | 69749-3 |