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Biochemistry

Système de nanoparticules de membrane cellulaire indigène pour l’analyse d’interaction protéine-protéine de membrane

doi: 10.3791/61298 Published: July 16, 2020

Summary

Présenté ici est un protocole pour la détermination de l’état oligomérique des protéines membranaires qui utilise un système de nanoparticules de membrane cellulaire indigène en conjonction avec la microscopie électronique.

Abstract

Les interactions protéine-protéine dans les systèmes membranaires cellulaires jouent un rôle crucial dans un large éventail de processus biologiques, des interactions cellule à cellule à la transduction du signal; de la détection des signaux environnementaux à la réponse biologique; de la régulation métabolique au contrôle du développement. Des informations structurelles précises sur les interactions protéine-protéine sont cruciales pour comprendre les mécanismes moléculaires des complexes protéiques membranaires et pour la conception de molécules très spécifiques pour moduler ces protéines. De nombreuses approches in vivo et in vitro ont été développées pour la détection et l’analyse des interactions protéine-protéine. Parmi eux, l’approche de biologie structurelle est unique en ce qu’elle peut fournir des informations structurelles directes sur les interactions protéines-protéines au niveau atomique. Cependant, la biologie structurale des protéines membranaires actuelles est encore largement limitée aux méthodes à base de détergent. L’inconvénient majeur des méthodes à base de détergent est qu’elles dissocient ou dnaturent souvent les complexes protéiques membranaires une fois que leur environnement de bicouche lipidique indigène est éliminé par des molécules détergentes. Nous avons développé un système de nanoparticules de membrane cellulaire indigène pour la biologie structurale de protéine de membrane. Ici, nous démontrons l’utilisation de ce système dans l’analyse des interactions protéine-protéine sur la membrane cellulaire avec une étude de cas de l’état oligomérique de l’AcrB.

Introduction

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Les interactions protéine-protéine (IPP) jouent un rôle central tout au long de la biologie, depuis le maintien de la structure et de la fonction des protéines jusqu’à la régulation de systèmes entiers. Les IPP se sous de nombreuses formes différentes peuvent être classés en fonction des types d’interactions qu’ils forment. L’une de ces catégorisations est homooligomérique ou hétérooligomérique, selon que les interactions sont entre des sous-unités identiques ou différentes protéines agissant sous-units. Une autre catégorisation est basée sur la force de l’interaction si les interactions conduit à la formation de complexes stables ou d’états complexes transitoires. L’information structurelle sur les IPP entre les protéines est cruciale pour comprendre le mécanisme par lequel les protéines effectuent leur fonction. On estime que plus de 80 % des protéines reposent sur une formation complexe pour s’acquitter de leurs rôles fonctionnels1. Étant donné le pourcentage de protéines observées comme dépendant des IPP pour un bon fonctionnement inné, leur importance en biologie est évidente, mais être en mesure d’étudier correctement les protéines qui s’engagent dans ces interactions est resté difficile en raison des limitations dans les techniques disponibles pour observer expérimentalement lorsque les protéines forment des IPP.

Il y a un degré élevé de désaccord entre les résultats pour beaucoup d’IPP expérimentalement déterminés en raison de la quantité élevée de bruit, de faux positifs, et de faux négatifs qui sont dérivés de beaucoup des techniques de détermination actuellement disponibles de PPI. C’est particulièrement le cas pour le système de levure à deux hybrides (Y2H), la spectrométrie de purification de masse d’affinité en tandem (TAP-MS) et le transfert d’énergie par résonance fluorescence (FRET), qui représentent trois des méthodes les plus couramment utilisées pour la détermination PPI2,3,4,5,6,7. En comparaison, les techniques de biologie structurale protéique, telles que la résonance magnétique nucléaire (RM), la cristallographie aux rayons X et la microscopie électronique (EM), peuvent être utilisées pour obtenir des informations structurelles à haute résolution sur les interactions protéine-protéine jusqu’au niveau atomique et permettre la confirmation visuelle directe des interactions se produisant pour une protéine cible d’intérêt. Toutes les techniques de recherche non fondées sur la structure actuellement disponibles (p. ex., Y2H, TAP-MS et FRET) n’ont pas cette capacité et souffrent en outre de la difficulté à identifier les interactions faibles et transitoires entre les protéines5. Ces lacunes sont encore améliorées lors de l’étude des protéines membranaires en raison de la complexité supplémentaire provoquée par la variable supplémentaire de l’environnement lipidique qui influence la formation d’une structure quaternaire appropriée et d’un assemblage complexe hétéromérique.

Les protéines membranaires composent une grande partie du protéome et sont connues pour jouer de nombreux rôles cruciaux dans le bon fonctionnement cellulaire dans tous les organismes vivants. Malgré le fait que les protéines membranaires représentent 27 % du génome humain et constituent environ 60 % de toutes les cibles actuelles en matière demédicaments,il existe une anomalie majeure dans le nombre de modèles résolus pour les protéines membranaires qui ne représentent que ~2,2 % de toutes les structuresprotéiques publiées 8,9,10. La principale cause de l’écart dans la disponibilité de l’information structurelle réside dans les propriétés intrinsèques des protéines membranaires elles-mêmes. En raison de leur faible solubilité, de leur dépendance à l’égard des interactions avec un environnement lipidique pour maintenir la structure et la fonction indigènes, et des diverses propriétés physicochimiques de la membrane lipidique elle-même, les protéines membranaires continuent de représenter un problème important lors de la mise en œuvre de techniques de biologie structurelle pour les étudier. De ces propriétés intrinsèques, la plus importante pour obtenir des informations structurelles précises est l’exigence d’avoir des interactions avec leur environnement lipidique naturel pour qu’ils maintiennent leur structure et leur fonction indigènes. L’environnement lipidique fait tellement partie intégrante de la structure et de la fonction des protéines membranaires que le concept de mémtéine (une combinaison des mots membrane et protéine) a été proposé comme unité fondamentale de la structure membranaire-protéique et de lafonction 11. Malgré l’importance des interactions lipidiques-protéines, les techniques de détermination de l’IPP basées sur la structure actuellement disponibles exigent souvent que les protéines étudiées soient solubles ou solubilisées avec des détergents. L’exposition à des détergents durs peut dénaturer les protéines ou causer de faux positifs et négatifs dus à la délipidation, qui peut induire l’agrégation, la dénaturation des protéines, la dissociation des interactions non covalentes et la formation d’états oligomériques artificiels. En raison de la nécessité de maintenir un environnement lipidique naturel pour la détermination précise de l’état oligomérique indigène des protéines membranaires, nous avons développé un système de nanoparticules de membrane cellulaire indigène (NCMNs)12 basé sur les particules de lipides mâles mâles (SMALP) précédemment rapportées (SMALP)13 méthode.

SMALP utilise le copolymère acide masculin styrène comme polymère actif membranaire pour extraire et solubiliser les protéines membranaires. Poly (Styrene-co-Maleic Acid) (SMA) est un polymère amphiphilique unique en raison de sa mastic styrène hydrophobe et diamétralement opposée à la moiety acide masculin hydrophilique. Il forme des nanoparticules en adsorber, déstabilisant et perturbant la membrane cellulaire dans un mécanisme dépendant du pH14. Cette activité fonctionnelle de SMA est ce qui lui permet d’être utilisé comme un système sans détergent pour l’extraction des protéines membranaires et la solubilisation. Le système NCMN est distinct du système SMALP à plusieurs égards. La caractéristique la plus unique du système NCMN est qu’il dispose d’une bibliothèque de polymères actifs membranaires avec une multitude de polymères qui ont des propriétés uniques qui les rendent adaptés à l’isolement de nombreuses protéines membranaires différentes qui nécessitent des conditions différentes pour la stabilité et le fonctionnement natif. Le système NCMN a également des protocoles différents par rapport à la méthode SMALP quand il s’agit de préparer les nanoparticules. Un tel exemple est que les NCMN utilisent une purification de colonne d’affinité de nickel en une seule étape pour la détermination de la structure à haute résolution; l’effet de ces différents protocoles peut être observé lors de la comparaison du protocole NCMNs, qui a généré 3.2 et 3.0 Å cryo-EM AcrB structures, avec une étude similaire utilisant la méthode SMALP, qui a abouti à une structure cryo-EM AcrB à une résolution 8.8 Å12,15. Ces caractéristiques uniques du système NCMN sont les améliorations apportées à la méthode SMALP précédemment établie et en font un candidat idéal pour l’étude des IPP.

Le transporteur multidrogue efflux AcrB existe en tant qu’homotrimère fonctionnel dans E. coli12. Une analyse mutagène a suggéré qu’une mutation unique de point de P223G, située sur une boucle qui est responsable de la stabilité du trimer d’AcrB, déstabilise l’état de trimer et donne un monomère d’AcrB une fois préparé avec le DDM détergent, qui pourrait être détecté avec l’électrophoresis bleu indigène de gel16. Cependant, l’analyse fret du mutant AcrB-P223G a suggéré que lorsque dans l’environnement de la bicouche lipidique de la membrane cellulaire indigène, la majorité des mutants AcrB-P223G existaient encore en tant que trimer et que les niveaux d’expression pour les deux types sauvages AcrB et AcrB-P223G sont similaires. Pourtant, malgré les résultats de l’analyse fret, un essai d’activité pour le transporteur mutant a montré que l’activité a considérablement diminué par rapport au typesauvage 16. Bien que la technologie FRET ait été populairement utilisée pour l’analyse des interactions protéines-protéines, la recherche a montré qu’elle peut souvent donner de faux positifs17,18,19,20.

Récemment, des structures cryo-EM à haute résolution du trimer AcrB ont été déterminées qui ont montré l’interaction de l’AcrB avec sa bicouche lipidique de membrane cellulaire indigène associée par l’utilisation des NCMNs12. En principe, les NCMN peuvent facilement être utilisés pour l’analyse des interactions protéine-protéine trouvées sur la membrane cellulaire indigène. Lors d’un test de ce système, des expériences ont été menées pour observer directement l’état oligomérique de l’AcrB-P223G avec l’utilisation de nanoparticules de membrane cellulaire indigène et de microscopie électronique colorante négative. Afin de comparer avec les nanoparticules sauvages de type AcrB, nous avons utilisé le même polymère actif membranaire (SMA2000 fabriqué dans notre laboratoire, qui est indexé comme NCMNP1-1 dans la bibliothèque NCMN) utilisé pour la détermination de la structure cryo-EM à haute résolution de l’AcrB et des polymères alternatifs trouvés dans la bibliothèquenCMNs 12. D’après les résultats précédemment rapportés, on s’attendait à ce que la majorité du mutant AcrB-P223G existe sous forme de nanoparticules de membrane cellulaire indigène trimeric21. Cependant, aucun trimers AcrB n’a été trouvé présent dans l’échantillon, comme ceux qui ont été observés avec le type sauvage AcrB. Ceci suggère que la majorité d’AcrB-P223G ne forme pas de garnitures sur la membrane cellulaire indigène comme précédemment suggéré.

Ici, nous rapportons une analyse détaillée du mutant E. coli AcrB-P223G dans une comparaison avec le type sauvage E. coli AcrB en utilisant les NCMN. Cette étude de cas de l’AcrB suggère que les NCMN sont un bon système pour l’analyse d’interaction protéine-protéine.

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Protocol

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1. Expression protéique

  1. Inoculer 15 mL de bouillon formidable (TB) médias avec des antibiotiques spécifiques aux plasmides avec BL21 (DE3) cellules pLysS contenant l’AcrB exprimant des plasmides dans des tubes de 50 mL pendant la nuit à 37 °C avec secousse à 250 rpm.
  2. Vérifiez la densité optique de la culture nocturne à 600 nm (OD600) et assurez-vous qu’elle est de plus de 2,0.
  3. Diluer 5 mL de culture cellulaire en 1 L de médias antituberculeux contenant des antibiotiques spécifiques aux plasmides et incuber à 37 °C en secouantjusqu’à 600OD =0,8, puis induire avec iPTG qui a une concentration finale de 1 mM.
  4. Effectuer l’induction à 20 °C en secouant pendant 20 h.
  5. Pelleter les cellules à l’aide de centrifugation pendant 15 min à 4 °C et 4 000 x g.

2. Lyse cellulaire et isolement membranaire

  1. Resuspendez la pastille cellulaire dans le tampon A(tableau 1, utilisez le tampon A du DDM A ou le tampon A des NCMNs selon le schéma de purification qui doit suivre) en utilisant 80 mL pour chaque 20 g de granulés cellulaires.
  2. Homogénéisez les granulés de cellules résuspendus à l’aide d’un homogénéiseur Dounce en verre à 4 °C ou si, à température ambiante, assurez-vous de mettre sur la glace immédiatement après.
  3. Transférer l’échantillon dans un bécher métallique sur la glace et lyser les cellules en les chargeant dans un homogénéiseur haute pression à 4 °C et 1 500 barres.
    1. Répétez le processus de chargement des cellules dans l’homogénéisant et leur permettant de passer à travers l’homogénéiseur pendant 3-4 cycles ou jusqu’à ce que le lysate commence à clarifier.
  4. Centrifugeuse le lysate à 15.000 x g pendant 30 min à 4 °C.
  5. Recueillir le supernatant et charger dans des tubes d’ultracentrifugeuse et une centrifugeuse à 215 000 x g pendant 1 h à 4 °C.
  6. Jetez le supernatant et recueillez les granulés membranaires des tubes d’ultracentrifugeuse. Conserver tout excès de granulés membranaires à -80 °C.

3. Préparation de nanoparticules de membrane cellulaire indigène

  1. Resuspendez 1 g de granulés membranaires dans le tampon A de 10 mL NCMNs (tableau 1).
  2. Homogénéiser l’échantillon de membrane cellulaire résuspendée à l’homogénéiseur dounce en verre à 20 °C.
  3. Transférer l’échantillon de membrane en suspension dans un tube de polypropylène de 50 mL et ajouter une solution de stock de polymères actifs membranaires et d’autres NCMN Tampon A pour amener l’échantillon à une concentration finale de 2,5 % (w/v) de polymère actif membranaire (NCMNP1-1 ou NCMNP5-2).
    REMARQUE : Les solutions de stock de polymères actifs membranaires doivent être faites dans de l’eau distillée double et peuvent être conservées à des concentrations variables, mais généralement à 10 % (w/v).
  4. Agiter l’échantillon pendant 2 h à 20 °C.
  5. Chargez l’échantillon dans une ultracentrifugeuse et tournez à 150 000 x g pendant 1 h à 20 °C.
  6. Alors que l’échantillon est ultra-centrifugé commencent à équilibrer une colonne Ni-NTA de 5 mL avec 25 mL de NCMNs Tampon A.
  7. Recueillir le supernatant après l’ultracentrifugation est terminé et le charger sur 5 mL de colonne Ni-NTA à température ambiante avec un débit de 0,5 mL/min à l’aide d’une pompe à seringues.
  8. Lavez les lignes de chromatographie liquide à protéine rapide (FPLC) avec suffisamment de NCMNs Buffer B (Tableau 1) pour rincer complètement le système, puis connectez la colonne à la machine FPLC.
  9. Lavez la colonne avec 30 mL de NCMNs Buffer B avec un débit de 1 mL/min et recueillez le flux à travers.
  10. Lavez la colonne avec 30 mL de NCMNs Buffer C (Tableau 1) avec un débit de 1 mL/min et de recueillir le flux à travers.
  11. Elutez la protéine avec 20 mL de NCMNs Buffer D (Tableau 1) à un débit de 0,5 mL/min et recueillez l’échantillon à l’aide d’un collecteur de fractions et les fractions étant chacune réglées à 1,0 mL.
  12. Conserver les échantillons de protéines à 4 °C.
  13. Exécutez un test d’électrophoresis gel SDS-PAGE afin de vérifier les échantillons qui correspondent aux pics observés sur le graphique d’élitution FPLC.

4. Électrophoresis gel SDS-PAGE

  1. Préparer la chambre de coulée en serrant le verre à l’appareil de coulée.
  2. Préparez le gel de séparation de 12 % selon la recette énumérée dans le tableau 1.
    REMARQUE : Une fois que temed est ajouté le gel polymérisera rapidement ainsi ajoutez seulement ceci une fois prêt à verser le gel.
  3. Verser le gel, en laissant 2 cm sous le fond du peigne pour le gel d’empilage.
  4. Enlevez les bulles en superposant le dessus du gel avec 100% isopropanol et attendez que le gel de séparation polymérise.
  5. Retirer l’isopropanol et laver toute trace de l’isopropanol avec de l’eau distillée.
  6. Préparer le gel d’empilage selon la recette énumérée dans le tableau 1.
    REMARQUE : Une fois que temed est ajouté le gel polymérisera rapidement ainsi ajoutez seulement ceci une fois prêt à verser le gel.
  7. Verser le gel d’empilage sur le gel de séparation.
  8. Ajouter un peigne à la chambre pour former les puits et attendre que le gel empilage soit complètement polymérisé.
  9. Placer 1 μL de 1 M de TNT dans un tube de microcentrifugeuse pour chaque échantillon de fraction qui doit être exécuté sur le gel.
  10. Ajoutez également 7 μL de tampon de chargement 4x à chaque tube.
  11. Ajouter 20 μL d’échantillon à partir des fractions qui doivent être exécutés sur le gel à chaque tube de microcentrifugeuse.
  12. Vortex les tubes contenant les échantillons.
  13. Faites tourner les tubes de l’échantillon à l’aide d’une microcentrifugeuse de table de 3 s et assurez-vous que tout l’échantillon est retourné au fond des tubes.
  14. Préparer la cellule d’électrophoresis gel en sécurisant une cassette de gel polyacrylamide de 12% en place et en remplissant les chambres intérieures et externes de la cellule avec Tris-acétate-EDTA (TAE) Buffer (Tableau 1).
  15. Chargez le marqueur de poids moléculaire dans la première voie du gel avec le volume approprié requis par ses instructions.
  16. Chargez 28 μL de l’échantillon de chaque tube mélangé à la TNT et au tampon de chargement.
  17. Placez le couvercle de la cellule électrophoresis sur le dessus de la boîte et branchez le couvercle dans l’alimentation électrique.
  18. Allumez l’alimentation électrique et réglez-la à 100 V et laissez-la fonctionner pendant 20 min.
  19. Après 20 min, augmenter le courant d’alimentation à 140 V et continuer à l’exécuter pendant encore 30-40 min ou jusqu’à ce que la bande de colorant tampon de chargement atteint le fond de la cassette de gel.
  20. Après avoir complété la tache d’électrophorésie et de détenir le gel pour visualiser les bandes protéiques contenues dans le gel.

5. Purification des protéines à l’aide de DDM

REMARQUE : Le but de ce processus de purification est de servir de contrôle pour les expériences utilisant les polymères actifs membranaires.

  1. Resuspendez 6-10 g de granulés membranaires, à partir de l’étape 2.6, dans le tampon A du DDM (tableau 1) à l’aide de 5 mL/g de granulés membranaires.
  2. Homogénéisez l’échantillon resuspendi avec un homogénéiseur dounce en verre à 4 °C ou si à température ambiante assurez-vous de mettre sur la glace immédiatement après.
  3. Transférer l’échantillon dans un tube de polypropylène de 50 mL et ajouter le DDM et le tampon A additionnel de DDM pour amener l’échantillon à une concentration finale de 2 % de DDM.
  4. Agiter l’échantillon pendant 2 h à 4 °C.
  5. Charger l’échantillon dans des tubes d’ultracentrifugeuse et une centrifugeuse de 1 h à 4 °C et 150 000 x g.
  6. Alors que l’échantillon est ultra-centrifugé commencer à préparer les 5 mL de colonne Ni-NTA en se lavant avec 25 mL de tampon DDM A (tableau 1).
  7. Une fois l’ultracentrifugation terminée, recueillez le supernatant et chargez-le sur la colonne Ni-NTA de 5 mL à 4 °C avec un débit de 0,5 mL/min à l’aide d’une pompe à seringues.
  8. Lavez les lignes FPLC avec suffisamment de DDM Buffer B + 0,05% DDM (Tableau 1) pour rincer complètement le système, puis fixez la colonne à la machine FPLC.
  9. Lavez la colonne avec 30 mL de Tampon B DDM + 0,05% DDM avec un débit de 1 mL/min et recueillez le flux à travers.
  10. Lavez la colonne avec 30 mL de Tampon DDM C + 0,05% DDM (Tableau 1) avec un débit de 1 mL/min et de recueillir le flux à travers.
  11. Elute la protéine avec 20 mL de DDM Buffer D + 0,05% DDM (Tableau 1) à un débit de 0,5 mL/min et de recueillir le flux à l’aide d’un collecteur de fractions et les fractions étant ensemble à 1,0 mL.
  12. Sélectionnez les fractions contenant le pic d’élitution pour la mise en commun et la concentration à l’aide d’un concentrateur centrifuge et d’une centrifugeuse à 4 000 x g et 4 °C jusqu’à atteindre 500 μL.
  13. À l’aide d’une boucle de 500 μL, chargez l’échantillon dans la machine FPLC, puis sur la colonne d’exclusion de taille de 25 mL à 4 °C. Elute utilisant 30 mL de Tampon DDM E + 0,05% DDM (Tableau 1) à un débit de 0,5 mL/min et de recueillir en fractions avec les tailles de fraction s’est fixé à être de 0,5 mL par fraction.
  14. Prenez les fractions et mesurez la concentration en protéines à l’aide de l’absorption de 280 nm pour confirmer la courbe UV-Vis à partir du graphique d’élitution FPLC.
  15. Recueillir 20 μL à partir de chaque fraction d’échantillon qui correspond aux pics observés sur le graphique d’élitution fplc et ont été confirmés pour être précis avec le test d’absorption.
  16. Congeler le reste de ces fractions d’échantillon à l’aide d’azote liquide ou de glace sèche dans les aliquots désirés et conserver les échantillons de protéines à -80 °C.
  17. Exécutez un test d’électrophoresis gel SDS-PAGE tel que décrit précédemment pour vérifier les échantillons qui correspondent aux pics observés sur le graphique d’élitution FPLC.

6. Préparation négative de grille de tache

  1. Placez les grilles qui vont être utilisées pour la préparation de l’échantillon sur une glissière en verre enveloppée dans du papier filtre avec le côté carbone face vers le haut.
  2. Placez la glissière de verre avec les grilles de microscope électronique dans la chambre d’un déchargeur de lueur entre les deux électrodes et remplacez le couvercle en verre en s’assurant qu’il est centré et bien scellé.
  3. Exécutez la machine de déchargement de lueur et assurez-vous que la lumière pourpre générée par le plasma est visible.
  4. Lorsque la machine est terminée en marche, attendez que la chambre ait atteint la pression atmosphérique pour enlever le couvercle en verre, puis retournez la glissière avec les grilles sur le banc où les échantillons seront chargés sur eux.
  5. Ajuster la concentration des échantillons de protéines purifiées à environ 0,1 mg/mL en diluant l’échantillon avec le tampon approprié ou en se concentrant à l’aide d’un concentrateur centrifuge.
  6. Chargez 3,5 μL d’échantillon de protéines sur la grille de carbone de 10 nm d’épaisseur et attendez 1 min.
  7. Retirez le liquide de la surface de la grille EM à l’aide d’un papier filtre.
  8. Lavez la surface de la grille 3x en ramassant 3 gouttelettes d’eau de μL avec la grille et en enlevant l’eau de la grille avec du papier filtre entre la cueillette de chaque gouttelette.
  9. Lavez la surface de la grille 2x en ramassant 3 gouttelettes de μL d’acétate d’uranium frais filtré à 2 % et enlevez les solutions de lavage sur la grille avec du papier filtre entre la cueillette de chaque gouttelette.
  10. Tacher la grille avec une gouttelette de 3 μL d’acétate d’uranium frais filtré à 2 % pendant 1 min.
  11. Retirez la solution d’acétate d’uranium à la surface du réseau EM avec du papier filtre et séchez la grille pendant au moins 1 min.
  12. Conservez la grille dans une boîte de grille pour une utilisation ultérieure.

7. Imagerie EM

  1. Chargez la grille préparée dans le support du réseau à un établi sécuritaire.
  2. Préparer le microscope en plaçant les microscopes dewar dans une boîte en polystyrène et remplir la dewar 3/4e pleine d’azote liquide.
  3. Confirmez que le couvercle en caoutchouc de la fenêtre du microscope le recouvre, puis chargez la dewar sur le microscope en plaçant les fils de cuivre dans la dewar jusqu’à ce qu’il s’adapte sur la plate-forme.
  4. Remplissez le reste de la dewar d’azote liquide et placez un bouchon sur le dessus de la dewar pour le couvrir.
  5. Allumez la haute tension, conditionner le microscope, et attendre que le microscope se réchauffe et d’établir un niveau de vide sûr pour une utilisation.
  6. Une fois que le microscope est prêt, ouvrez la valve de la colonne et confirmez que le faisceau est présent en enlevant le couvercle en caoutchouc sur la fenêtre du microscope.
  7. Vérifiez la stigmatisation du faisceau en vous répandant dans et hors en ajustant l’intensité du faisceau. Si l’astigmatisme est présent, le faisceau aura une forme elliptique que l’on s’éloigne de cross-over et le faisceau doit être la même forme ovale des deux côtés.
  8. Ajustez les jumelles au microscope pour qu’ils soient de la bonne hauteur et de la bonne distance selon les yeux de l’observateur.
  9. Vérifiez le positionnement du faisceau pour les modes Recherche, Focuset Exposition en parcyclant les trois modes jusqu’à ce que le faisceau soit centré dans chacun d’eux.
  10. Fermez la valve de la colonne et chargez le support de grille dans le microscope électronique.
  11. Réglez le microscope à la hauteur eucentrique en utilisant la fonction wobbler microscopes et en ajustant le mouvement de la scène en utilisant l’axe Z jusqu’à ce qu’il n’y ait pas de mouvement d’un côté à l’autre de l’échantillon au centre.
  12. En utilisant le mode de recherche à faible dose sur le microscope rechercher la grille pour une zone souhaitable de contraste raisonnable avec les molécules échantillon présentes pour se concentrer sur l’échantillon.
  13. Concentrez-vous sur l’échantillon en mode Focus en utilisant une taille d’étape élevée jusqu’à ce que l’échantillon soit vu, puis diminuez les étapes pour trouver le niveau de mise au point correct.
  14. Zéro et vider le faisceau, puis assurez-vous que le tampon en caoutchouc couvre la fenêtre du microscope.
  15. En utilisant le mode Exposition prendre l’image de la zone de grille désirée pour une exposition de 1 s à 62.000x grossissement et vérifier l’image obtenue.
  16. Une fois l’imagerie effectuée, une grille ferme les vannes de colonne et retire le support de grille de la colonne.
  17. Une fois terminé l’imagerie de toutes les grilles d’intérêt arrêter le microscope en éteignent la puissance de filament et en enlevant la dewar d’azote liquide du microscope.
  18. Placez quelque chose pour absorber l’humidité sur le stand où la dewar s’est assise pour attraper la condensation des bobines de cuivre du microscope.
  19. Activez le mode Cryo Cycle et assurez-vous que la pompe turbo est éteinte.

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Representative Results

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À l’aide des procédures présentées ici, des échantillons de type sauvage E. coli AcrB et de mutant e. coli AcrB-P223G ont été purifiés. Les échantillons ont ensuite été adsorbés à des grilles de microscopie électronique tache négative de carbone et tachés à l’aide d’acétate d’uranyle avec la méthode de ballonnementlatéral 22. Des images négatives de tache ont été rassemblées utilisant la microscopie électronique de transmission. L’image de tache négative pour l’échantillon de type sauvage AcrB purifié avec DDM révèle une solution homogène de particules monodispersées avec la protéine affichant une structure quarténaire trimerique bien définie (Figure 1A). Ces structures trimériques correspondent au chromatogramme d’exclusion de taille observé lorsqu’elles sont purifiées(figure supplémentaire 1). En comparaison, en regardant l’image de tache négative pour le mutant AcrB-P223G, également purifié avec DDM, on peut observer une solution hétérogène de nanoparticules polydispersées avec une propension à l’agrégation, mais pas de trimers indigènes observables (Figure 1B). Ces résultats sont également étayés par le profil d’élitution observé lors de l’exécution de la chromatographie d’exclusion de taille (Figure supplémentaire 1). Pour déterminer si le manque de protéines d’état trimériques pour le mutant était dû au traitement par détergent ou uniquement causé par la mutation déstabilisatrice de P223G les protéines ont également été purifiées utilisant NCMNP1-1, l’un des polymères actifs de membrane dans la bibliothèque de NCMNs. L’image de tache négative pour l’échantillon de type sauvage AcrB purifié avec NCMNP1-1, encore une fois, révèle une solution homogène de particules monopersées avec la protéine affichant une structure quartenary trimeric bien définie (figure 1C). Et tout comme avec la purification DDM, lorsque le mutant AcrB-P223G est purifié avec NCMNP1-1 l’image de tache négative montre une solution hétérogène de nanoparticules polydispersées avec une propension à l’agrégation, mais pas de trimers indigènes observables (Figure 1D). Pour confirmer en outre que la mutation P223G perturbe le trimer AcrB sur la membrane cellulaire, un polymère différent (NCMNP5-2) a été sélectionné à partir de la bibliothèque exclusive de polymères actifs de la membrane NCMNs. NCMNP5-2 peut former des nanoparticules de membrane cellulaire indigène dans des tailles beaucoup plus grandes, permettant ainsi à plusieurs trimers AcrB d’être photographiés dans une seule particule de membrane cellulaire indigène. Par conséquent, on a observé que plusieurs trimers AcrB de type sauvage étaient contenus dans des particules simples (figure 1E); cependant, aucune particule de trimer AcrB-P223G comme celles formées par le type sauvage AcrB n’a été observée, même en regardant les grandes plaques de bicouche de membrane cellulaire indigène (figure 1F). Ceci suggère AcrB-P223G n’existe pas en tant que trimer sur la membrane cellulaire commeprécédemment suggéré 21 et offre une explication logique quant à pourquoi AcrB-P223G montre un déclin dramatique de l’activité une fois asséché16. Pour confirmer la pureté des échantillons et la présence de la protéine correcte, des gels d’électrophoresis ont été exécutés pour tous les échantillons purifiés de protéine. Les taches résultantes ont confirmé la présence d’AcrB dans tous les échantillons avec >95% de pureté et l’emplacement de la tache correspondait au poids moléculaire prévu de l’AcrB (Figure 1G). Les résultats de notre étude sont incompatibles avec l’analyse fret précédemment décrite en ce qui concerne la détermination de l’état oligomérique de la protéine membranaire AcrB-P223G16. En utilisant les polymères actifs membranaires et la microscopie électronique décrite dans le protocole, l’état oligomérique indigène de la protéine était directement observable. Une détermination plus précise de la façon dont les monomères de la protéine interagissent les uns avec les autres exigera la détermination des structures cryo-EM à haute résolution.

Figure 1
Figure 1 : Images négatives en gel de tache et d’électrophorèse des constructions purifiées d’AcrB. (A) Image de tache négative prise pour le type sauvage AcrB purifié avec DDM. (B) Image de tache négative prise pour la construction de protéine AcrB-P223G purifiée avec DDM. (C) Image de tache négative prise pour le type sauvage AcrB purifié avec NCMNP1-1. (D) Image de tache négative prise pour la construction AcrB-P223G purifiée avec NCMNP1-1. (E) Image de tache négative prise pour le type sauvage AcrB purifié avec NCMNP5-2 (la boîte rouge met en évidence certaines des nanoparticules trimer observées dans l’image). (F) Image de tache négative prise pour AcrB-P223G purifiée avec NCMNP5-2 (la boîte verte met en évidence une partie des taches lipidiques capturées par NCMNP5-2 observées dans l’image). (G) Gel SDS-PAGE exécuter en utilisant les produits finaux de la purifications de AcrB-P223G avec DDM (Lane 1), NCMNP1-1 (lane2), (H) SDS-PAGE gel exécuter en utilisant les produits finaux des purifications de AcrB-P223G avec NCMNP5-2. (I) Zoom avant des fonctionnalités surlignées de la figure 1E. (J) Zoom dans les fonctionnalités surlignées de F. Toutes les images de taches négatives de la figure 1 ont la même barre d’échelle de 50 nm. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Tampons de purification DDM Tampons de purification des polymères Tampons Gel Electrophoresis
Tampon A 50 mM HEPES, pH 7,8 Tampon NCMN A 50 mM HEPES, pH 8,4 Tampon TAE Base tris de 40 mM
300 mM NaCl 500 mM NaCl 1 mM EDTA
5% Glycérol 5% Glycérol 20 mM d’acide acétique
Imidazole de 20 mM Imidazole de 20 mM
1 mM MgCl2-6 H2O 0,1 mM TCEP
0,1 mM TCEP
Tampon B 50 mM HEPES, pH 7,8 Tampon B du NCMN 25 mM HEPES, pH 7,8 Tampon de destaining 40% Méthanol
300 mM NaCl 500 mM NaCl 10% acide acétique
5% Glycérol 5% Glycérol
Imidazole 40 mM Imidazole 40 mM
1 mM MgCl2-6 H2O 0,1 mM TCEP
0,1 mM TCEP
Tampon C 50 mM HEPES, pH 7,8 Tampon NCMN C 25 mM HEPES, pH 7,8 Gel d’empilage 1,5 M Tris pH 8,8 (0,63 ml)
300 mM NaCl 500 mM NaCl 30% Acrylamide/Bis (0,43 ml)
5% Glycérol 5% Glycérol 10% SDS (0.025 ml)
75 mM d’Imidazole 75 mM d’Imidazole 10% APS (0,025 ml)
1 mM MgCl2-6 H2O 0,1 mM TCEP TEMED (4 μl)
0,1 mM TCEP H2O (1,39 ml)
Tampon D 50 mM HEPES, pH 7,8 Tampon NCMN D 25 mM HEPES, pH 7,8 12% Gel séparant 1,5 M Tris pH 8,8 (1,3 ml)
300 mM NaCl 500 mM NaCl 30% Acrylamide/Bis (2 ml)
5% Glycérol 5% Glycérol 10% SDS (0,05 ml)
Imidazole 300 mM Imidazole 300 mM 10% APS (0,05 ml)
1 mM MgCl2-6 H2O 0,1 mM TCEP TEMED (5 μl)
0,1 mM TCEP H2O (1,6 ml)
Tampon E 40 mM HEPES, pH 7,8 Tampon NCMN E 40 mM HEPES, pH 7,8
200 mM NaCl 200 mM NaCl
0,1 mM TCEP 0,1 mM TCEP

Tableau 1 : Liste des tampons de purification utilisés pour la chromatographie des colonnes et l’électrophoresis gel.

Figure supplémentaire 1 : Profils d’élitution chromatographie d’exclusion de taille. (A) Graphique de superposition des deux profils d’élitution observés pour les expériences de chromatographie d’exclusion de taille réalisées lors de la purification avec DDM et type sauvage AcrB (orange) et avec DDM et le mutant AcrB-P223G (bleu). (B) Profil d’étalonnage de colonne pour la colonne d’exclusion de taille utilisée pour les expériences DDM.
1: Thyroglobuline (M. 669 000), 2: Ferritine (M. 440 000), 3: Aldolase (M. 158 000), 4: Conalbumin (M. 1 75 000), 5: Ovalbumin (M. 44 000), 6: Anhydrase carbonique (M. 29 000), 7: Ribonuclease A (M. 13 700). S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.

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Discussion

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Les interactions protéine-protéine sont importantes pour l’intégrité de la structure et de la fonction des protéines membranaires. De nombreuses approches ont été développées pour étudier les interactions protéines-protéines. Par rapport aux protéines solubles, les protéines membranaires et leurs IPP sont plus difficiles à étudier en raison des propriétés intrinsèques uniques des protéines membranaires. Cette difficulté provient principalement de l’exigence de protéines membranaires à intégrer dans un environnement de bicouche lipidique indigène pour la stabilité structurelle et la fonctionnalité. Cela devient problématique parce que pour déterminer les structures à haute résolution des protéines, elles doivent être extraites de la membrane cellulaire. FRET a été une technologie populaire pour étudier les interactions protéine-protéine sur la membrane cellulaire, cependant, la résolution est faible et produit fréquemment de faux positifs17,18,19,20. Ici, il est démontré, pour la première fois, que les NCMN peuvent être utilisés pour étudier les interactions protéine-protéine membranaire en analysant structurellement le trimer AcrB de type sauvage et le monomère AcrB-P223G sur la membrane cellulaire indigène et en comparant les résultats avec l’analyse précédente à l’aide du FRET. En comparant les images de microscopie électronique à particule unique de type sauvage AcrB et AcrB-P223G, il est suggéré que la majorité des AcrB-P223G ne forment pas de trimers sur la membrane cellulaire E.coli comme la protéine AcrB de type sauvage lorsqu’elles sont purifiées à l’aide de polymères actifs membranaires, comme NCMNP1-1 et NCMNP5-2. Nous proposons ici que les résultats de l’analyse fret puissent être un faux positif résultant de la limitation de résolution de l’approche FRET. Le lien de disulfide artificiel qui a stabilisé le trimer AcrB-P223G pourrait également être un artefact qui s’est produit dans la solution21. Les images négatives de tache suggèrent que la mutation de P223G a empêché la formation du trimer d’AcrB et que la forme monomère d’AcrB ne pourrait pas rester dans la même conformation observée quand dans sa forme trimeric. La boucle qui contient cette mutation s’est précédemment montrée absolument critique pour la formation du trimer par l’analyse mutagène et structurale, qui a montré sa signification structurale pour être due aux interactions que chaque boucle forme en enfouissant dans le monomère voisin d’AcrB23.

En utilisant le système de nanoparticules de membrane cellulaire indigène pour la détection et l’analyse de l’interaction protéine-protéine, on peut détecter directement l’état oligomérique d’une protéine en gardant la protéine membranaire dans un environnement de membrane cellulaire véritablement indigène, qui peut être utilisé pour obtenir des informations structurelles à haute résolution au niveau atomique grâce à une seule analyse cryo-EM des particules de l’échantillon. Le système NCMN permet d’éviter les faux positifs et faux négatifs fréquents observés dans la détection des IPP causés par le traitement d’échantillons avec des détergents24. Ces faux résultats surviennent généralement, en raison de l’agrégation, de la dénaturation de l’échantillon protéique, de la dissociation des interactions non covalentes et de la formation d’états oligomériques artificiels causés par les effets de délipidation des détergents. En outre, l’utilisation de l’analyse structurelle en collaboration avec les NCMN fournit des informations structurelles supplémentaires et permet l’observation directe des interactions moléculaires, qui sont à la fois essentielles à la compréhension des IPP et généralement perdues lors de l’utilisation de méthodes de détection d’IPP précédemment établies. Cette méthode a été utilisée avec succès pour des études structurelles de type sauvage AcrB et pourrait avoir une grande applicabilité à d’autres formes d’analyse structurelle, telles que la cristallographie aux rayons X et la RM à l’état solide, et de nombreuses protéines différentes utilisées dans d’autres recherches visant à déterminer les interactions affichées par de nouvelles cibles protéiques.

Afin d’obtenir des résultats reproductibles avec des rendements protéiques raisonnables de haute pureté, il y a plusieurs étapes critiques dans le processus de purification avec des polymères actifs membranaires qui doivent être suivis. La première étape critique est le processus d’isolement membranaire, il est donc essentiel de centrifugeuses de la cellule lysate à 15.000 x g et de suivre cette étape avec ultracentrifugation à 215.000 x g afin d’isoler vraiment la membrane cellulaire du reste de la cellule lysate. La prochaine étape critique consiste à solubiliser la fraction membranaire avec des polymères actifs membranaires à une concentration de 2,5% à température ambiante pendant deux heures. Des expériences d’optimisation de la purification ont été menées et l’utilisation de ces paramètres à cette étape a été démontrée pour s’assurer que la quantité optimale d’AcrB est extraite de la membrane et la formation appropriée des nanoparticules de membrane cellulaire indigène se produit. La dernière étape critique du processus de purification consiste à charger l’échantillon sur la colonne Ni-NTA à température ambiante. Cela est nécessaire, parce que les polymères actifs membranaires sont plus solubles à température ambiante qu’à 4 °C, de sorte que le chargement à température ambiante augmentera la quantité de protéine se liant sur la colonne d’affinité et évitera la haute pression causée par l’accumulation insoluble de polymère qui pourrait potentiellement endommager la colonne. Les étapes contenues dans la procédure de coloration négative mentionnée ci-dessus sont presque tout aussi importantes pour obtenir des informations structurelles exactes. Les aspects les plus critiques de cette procédure comprennent l’utilisation de grilles de carbone trouées de 10 nm d’épaisseur, des volumes d’eau et d’acétate d’uranyle, et la durée de l’adsorption et de la coloration de l’échantillon. L’utilisation de ces paramètres clés pendant la préparation de l’échantillon assurera des données structurelles de qualité qui peuvent être utilisées pour une évaluation précise des états oligomériques de l’échantillon en cours d’image. Des modifications au protocole de purification peuvent être nécessaires lors de l’utilisation de différentes protéines pour résoudre les problèmes qui peuvent survenir en raison des caractéristiques uniques de divers polypeptides. Les principaux facteurs à envisager de modifier lorsque vous avez de la difficulté à obtenir une quantité suffisante d’échantillon de protéines devraient être les paramètres utilisés pendant l’étape d’induction, la quantité de fraction membranaire utilisée dans l’étape de solubilisation, et la durée et la température pour le processus de solubilisation. S’il y a un problème de pureté, il peut être nécessaire d’utiliser d’autres colonnes d’affinité, comme une colonne d’affinité de biotine, au lieu d’utiliser la colonne Ni-NTA pour la purification. De même, si le maintien d’interactions protéine-protéine faibles/transitoires est nécessaire, l’échange de la colonne Ni-NTA contre une colonne d’affinité TAP-tag est bénéfique pour des résultats optimaux. Enfin, lors de l’étude des protéines mammifères, les systèmes d’expression des mammifères devraient être utilisés pour maintenir les véritables compositions lipidiques de la membrane cellulaire indigène nécessaires à la détermination précise de l’état oligomérique naturel de la protéine. Pour ce faire, il faudra revoir complètement les étapes d’expression protéique et de lyse cellulaire de ce protocole. Dans de tels cas, les protocoles précédemment établis pour l’expression des protéines et la lyse cellulaire qui correspondent au système d’expression nécessaire à la protéine cible d’intérêt devraient être suivis.

L’utilisation des NCMN avec microscopie électronique présente de grands avantages par rapport au FRET pour la détection des IPP. Comme le montrent les résultats de cette étude, les expériences fret précédemment réalisées étaient incompatibles avec l’analyse structurelle de la structure oligomérique de la protéine mutante AcrB21. Ceci a été clairement montré et directement confirmé par les images prises avec la microscopie électronique négative de tache, qui sont compatibles à la perte précédemment décrite d’activité pour le mutant AcrB-P223G16. Si AcrB-P223G ne former trimers in vivo le polymère NCMNP5-2 les aurait attrapés dans les grandes plaques de membrane cellulaire indigène qu’il extrait. Il est possible que l’analyse fret de mutant AcrB a abouti à un faux positif en raison de l’une des nombreuses limitations qui sont intrinsèques aux processus physiques de la technique repose sur et la technologie utilisée pour mesurer les transferts d’énergie de résonance fluorescente. Une limitation majeure du FRET est les limites de résolution de la microscopie confoccale, ce qui conduit à de graves limitations dans les distances intermoléculaires capables d’être résolues avec les analyses FRET19. En comparaison, l’utilisation de NCMN en conjonction avec la microscopie électronique n’est pas soumise à la limitation susmentionnée du FRET, avec des limites de résolution significativement plus élevées par rapport à celles de la microscopie confoccale. Sur la base de ces limitations ayant des effets potentiels sur les analyses fret précédemment décrites, nous postulons que la détection incorrecte d’un trimer AcrB-P223G in vivo résultait de la limitation de basse résolution de FRET21. Mis à part les avantages par rapport à fret juste souligné directement par cet article, l’utilisation de NCMNs en conjonction avec la microscopie électronique a l’avantage sur toutes les techniques actuelles d’interaction protéine-protéine, telles que le système Y2H et TAP-MS, en ce qu’il peut être utilisé pour observer les interactions protéine-protéine dans les environnements de membrane cellulaire indigène directement en haute résolution et a le potentiel d’être utilisé pour déterminer les structures protéiques au niveau atomique.

Les polymères actifs membranaires et la microscopie électronique ne sont pas non plus sans limites. À l’heure actuelle, le principal problème de purification du NCMN est sa faible efficacité d’extraction par rapport aux méthodes à base de détergent (les polymères de la bibliothèque NCMN affichent environ 70 % de l’efficacité d’extraction du DDM). Il a également des problèmes de compatibilité avec certaines colonnes d’affinité, telles que les colonnes de liaison maltose. En outre, la purification NCMN n’est toujours pas très réussie avec des protéines ou des complexes membranaires très dynamiques (données non publiées). L’utilisation de polymères actifs membranaires et de microscopie électronique pour des expériences de détermination de l’état oligomérique nécessite l’élimination des protéines de l’environnement cellulaire indigène, tandis que fret est effectué in vivo. Cependant, les nanoparticules formées par les polymères actifs membranaires permettent l’environnement le plus indigène possible lors de l’extraction des protéines des cellules, afin de réduire les inexactitudes potentielles dérivées expérimentalement connues pour être causées par l’extraction et la purification des protéines. En outre, alors que la question de la résolution et de la taille des particules comme limitation de la microscopie électronique de transmission a considérablement diminué au cours de la dernière décennie, les microscopes qui sont encore utilisés pour l’analyse négative des taches seront encore relativement limités à de plus grandes molécules ou complexes moléculaires (>200 kDa) car ils ont généralement une limite d’information d’environ 0,1-0,3 nm25. SMALP s’est également montré très flexible en termes d’applications, mais affiche des limites encore plus grandes que les NCMN. Les nanodisques formés par SMA ont un diamètre maximum d’environ 15 nm et sont donc généralement inefficaces pour extraire les protéines et les complexes protéiques qui sont plus de 400 kDa26. En plus de cette limitation, SMA est également incapable de travailler avec des protéines qui existent dans des environnements à faible pH ou d’utiliser des ions divalent à des fins structurelles et fonctionnelles. En raison du mécanisme d’action SMALPs dépendant du pH, il ne peut pas être utilisé avec de faibles conditions de pH et des ions divalent chelates. Alors que les méthodes SMILP et DIBMA ont offert des promesses en ce qui concerne le dépassement de ces limitations, leur applicabilité à divers ensembles de protéines est restéeinvisible 27,28. Les NCMN cherchent à surmonter ces limitations en utilisant l’analyse de la relation structure-activité (SAR) pour créer des polymères alternatifs qui peuvent former de plus grandes nanoparticules, fonctionnant dans de faibles conditions de pH, et éviter de chélating ions divalent. Un exemple de ces polymères qui ont été développés pour les NCMN est le polymère NCMNP5-2 qui affiche la capacité de créer de plus grandes nanoparticules comme démontré dans la figure 1E,F.

En plus des progrès précédemment décrits dans la technologie des nanoparticules, la direction future des NCMN est de développer des polymères actifs encore plus membranaires qui donneront à la bibliothèque de polymères NCMNs une efficacité d’extraction accrue et la capacité de travailler avec des protéines de toutes les différentes tailles de région transmembrane, qui fonctionnent à des niveaux de pH beaucoup plus larges, ou de compter sur n’importe quel type d’ion pour le maintien de leur structure et fonction. Cela permettra à tous les chercheurs en protéines membranaires d’utiliser cette technologie dans leurs expériences et d’avoir accès à des résultats plus précis et biologiquement pertinents. En apportant les avantages des nanoparticules polymères à une plus grande variété de protéines, l’espoir est que cela conduira à résoudre les structures à haute résolution des complexes protéiques membranaires indigènes au niveau atomique et ainsi déterminer les interactions atomiques intramoléculaires qui entrent dans le maintien de ces complexes. De telles avancées permettraient également de nombreuses nouvelles possibilités en termes de découverte et de développement de médicaments protéiques membranaires grâce à des efforts de conception de médicaments basés sur la structure. L’utilisation de techniques de conception de médicaments à base de structure pour les protéines membranaires serait un énorme avantage pour l’industrie médicale, car cela augmenterait la spécificité et l’efficacité de liaison médicamenteuse afin de réduire les effets secondaires indésirables et la quantité de composés nécessaires pour obtenir les effets thérapeutiques souhaités, rendant ainsi les médicaments qui ciblent les protéines membranaires beaucoup plus sûrs et plus efficaces. Le système de nanoparticules de membrane cellulaire indigène en est encore à ses stades de développement, mais il s’est déjà avéré incroyablement puissant en permettant pour la première fois l’étude des protéines membranaires dans leurs états véritablement indigènes et en élucidant les interactions protéine-protéine indigènes qui se produisent sur la membrane cellulaire.

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Disclosures

Y.G est répertorié comme inventeur du polymère actif membranaire NCMNP5-2 et du système NCMN.

Acknowledgments

Cette recherche a été soutenue par le fonds de démarrage VCU (à Y.G.) et l’Institut national des sciences médicales générales des National Institutes of Health sous le numéro de prix R01GM132329 (à Y.G.) Le contenu est uniquement de la responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles des Instituts nationaux de la santé. Nous remercions Montserrat Samso et Kevin McRoberts pour leur généreux soutien à l’enregistrement vidéo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
30% Acrylamide/BIS SOL (37.5:1) Bio-Rad 161-0158
4x Laemmli Sample Buffer (Loading Buffer) Bio-Rad 1610747
Acetic Acid Glacial ThermoFisher Scientific A38S-212
Ammonium Persulfate (APS) Bio-Rad 161-0700
Chloramphenicol Goldbio C-105-5
Coomassie Brilliant Blue R-250 protein stain powder Bio-Rad 161-0400
DTT (Dithiothreitol) (> 99% pure) Protease free Goldbio DTT10
Glycerol ThermoFisher Scientific G33-4
HEPES ThermoFisher Scientific BP310-1
Imidazole Affymetrix 17525 1 KG
IPTG Goldbio I2481C100
Kanamycin Goldbio K-120-25
Magnesium chloride hexahydrate ThermoFisher Scientific AA3622636
Methanol ThermoFisher Scientific A412-4
N,N-dimethylethylenediamine (EDTA) Merck 8.03779.0100
NCMNS-P5-2 Not commercially available yet Submit request for obtaining to corresponding author
Precision Plus Protein Dual Color Standard Bio-Rad 161-0374
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) Bio-Rad 161-0301
SMA2000 Cray Valley Submit request for obtaining to corresponding author
Sodium Chloride ThermoFisher Scientific S271-10
TCEP-HCl Goldbio TCEP25
TEMED Bio-Rad 161-0800
Terrific Broth Media Affymetrix 75856 1 KG
Tris Base Bio-Rad 161-0719
Uranyl Acetate Ambinter Amb22348393
Equipment
Avanti J-26S XPI Beckman Coulter B14538
Avanti JXN-30 Beckman Coulter B34193
Carbon Electron Microscope Grids (10 nm) Electron Microscopy Sciences CF300-Cu-TH
Con-Torque Tissue Homogenizer Eberbach E7265
Corning LSE Mini Microcentrifuge ThermoFisher Scientific 07-203-954
EmulsiFlex-C3 Avestin
Fraction Collector F9-R GE Healthcare Life Sciences 29003875
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell Bio-Rad 165-8004
NanoDrop 2000 Spectrophotometer ThermoFisher Scientific ND-2000
Optima L-90K Ultracentrifuge Beckman Coulter PN LL-IM-12AB
PELCO easiGlow Glow Discharge Cleaning System Ted Pella 91000S-230
Potter-Elvehjem Safe Grind Tissue Grinder Wheaton 358013
PowerPac Basic Power Supply Bio-Rad 164-5050
Razel R99-E Variable Speed Syringe Pump Razel Scientific Instruments
Superdex 200 Increase 10/300 GL GE Healthcare Life Sciences 28990944
Tecnai F20 200kV FEI
Type 70 Ti Fixed-Angle Rotor Beckman Coulter
General Materials
1.5 ml Microcentrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 05-408-129
4 ml Amicon Ultra-4 30 kDa Millipore Sigma UFC803024
AKTA pure 25 L1 FPLC GE Healthcare Life Sciences 29018225
BL21(DE3)pLysS Cells ThermoFisher Scientific C606003
Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tube ThermoFisher Scientific 14-959-49A
HisTrap HP 5 ml Column GE Healthcare Life Sciences 17524802
pET-24a EMD Biosciences 69749-3

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Système de nanoparticules de membrane cellulaire indigène pour l’analyse d’interaction protéine-protéine de membrane
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Kroeck, K. G., Qiu, W., Catalano, C., Trinh, T. K. H., Guo, Y. Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis. J. Vis. Exp. (161), e61298, doi:10.3791/61298 (2020).More

Kroeck, K. G., Qiu, W., Catalano, C., Trinh, T. K. H., Guo, Y. Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis. J. Vis. Exp. (161), e61298, doi:10.3791/61298 (2020).

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