Summary
Questo protocollo descrive una nuova tecnica di misurazione dei tre parametri più importanti della lesione cerebrale ischemica sullo stesso set di campioni cerebrali di roditori. L'uso di un solo campione cerebrale è altamente vantaggioso in termini di costi etici ed economici.
Abstract
Una delle cause più comuni di morbilità e mortalità in tutto il mondo è l'ictus ischemico. Storicamente, un modello animale utilizzato per stimolare l'ictus ischemico coinvolge l'occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO). Zona infarct, edema cerebrale e rottura della barriera ematico-encefalica (BBB) sono misurati come parametri che riflettono l'entità della lesione cerebrale dopo MCAO. Una limitazione significativa a questo metodo è che queste misurazioni sono normalmente ottenute in diversi campioni di cervello di ratto, portando a oneri etici e finanziari dovuti al gran numero di ratti che devono essere eutanasiati per una dimensione del campione appropriata. Qui presentiamo un metodo per valutare con precisione le lesioni cerebrali dopo MCAO misurando la zona infarct, l'edema cerebrale e la permeabilità BBB nello stesso set di cervelli di ratto. Questa nuova tecnica fornisce un modo più efficiente per valutare la fisiopatologia dell'ictus.
Introduction
Una delle cause più comuni di morbilità e mortalità in tutto il mondo è l'ictus. A livello globale, l'ictus ischemico rappresenta il 68% di tutti i casi di ictus, mentre negli Stati Uniti l'ictus ischemico rappresenta l'87% dei casidi ictus 1,2. Si stima che l'onere economico dell'ictus raggiunga i 34 miliardi di dollari negli StatiUniti 2 e 45 miliardi di euro nell'Unione europea3. I modelli animali di ictus sono necessari per studiarne la fisiopatologia, sviluppare nuovi metodi di valutazione e proporre nuove opzioni terapeutiche4.
L'ictus ischemico si verifica con occlusione di una grande arteria cerebrale, di solito l'arteria cerebrale centrale o uno dei suoi rami5. Così, i modelli di ictus ischemico hanno storicamente coinvolto l'occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO)6,7,8,9,10,11,12. Dopo MCAO, lesione neurologica è più comunemente valutata misurando la zona infar bene (IZ) utilizzando un metodo di colorazione 2,3,5-tripfeniltetrazolo (TTC)13, edema cerebrale (BE) utilizzando essiccazione o calcolo dei volumi emisferici14,15,16e permeabilità alla barriera epatica (BBB) con una tecnica di spettrometria che utilizza la colorazione blu Evans17,18,19.
Il tradizionale metodo MCAO utilizza insiemi separati di cervelli per ciascuna delle tre misurazioni cerebrali. Per un campione di grandi dimensioni, ciò si traduce in un numero significativo di animali eutanasiati, con considerazioni etiche e finanziarie aggiuntive. Un metodo alternativo per alleviare questi costi comporterebbe misurazioni di tutti e tre i parametri in un unico insieme di cervelli di roditori post-MCAO.
Precedenti tentativi sono stati fatti per misurare combinazioni di parametri nello stesso campione cerebrale. Metodi simultanei di colorazione immunofluorescente20 e altre analisi molecolari ebiochimiche 21 sono stati descritti dopo la colorazione TTC nello stesso campione cerebrale. In precedenza abbiamo calcolato i volumi dell'emisfero cerebrale per valutare l'edema cerebrale ed eseguito la colorazione TTC per calcolare la zona infarct nello stesso set cerebrale15.
Nel presente protocollo, presentiamo una tecnica MCAO modificata che misura le lesioni cerebrali ischemiche attraverso la determinazione della permeabilità IZ, BE e BBB nello stesso set di cervelli di roditori. IZ è misurato dalla colorazione TTC, BE è determinato calcolando il volume emisferico e la permeabilità BBB è ottenuta con metodi di spettrometria19. In questo protocollo, abbiamo utilizzato un modello MCAO modificato, basato sull'inserimento diretto e la fissazione del catetere monofilamento nell'arteria carotide interna (ICA) e sull'ulteriore blocco del flusso sanguigno verso l'arteria cerebrale media (MCA)22. Questo metodo modificato mostra una diminuzione del tasso di mortalità e morbilità rispetto al metodo tradizionale MCAO16,22.
Questo nuovo approccio fornisce un modello finanziario ed etico per misurare le lesioni neurologiche dopo l'MCAO. Questa valutazione dei principali parametri della lesione cerebrale ischemica aiuterà a indagare in modo completo la sua fisiopatologia.
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Protocol
Secondo le raccomandazioni della dichiarazione di Helsinki e di Tokyo e degli orientamenti per l'impiego di animali da esperimento della Comunità europea, sono state condotte le seguenti procedure. Gli esperimenti sono stati approvati anche dal Comitato per la cura degli animali dell'Università Ben-Gurion del Negev.
1. Preparazione dei ratti alla procedura sperimentale
- Selezionare ratti maschi adulti Sprague-Dawley senza patologia troppo grave, ognuno del peso compreso tra 300 e 350 g.
- Mantenere tutti i ratti a temperatura ambiente a 22 °C, con 12 ore di cicli di luce e buio prima dell'esperimento.
- Assicurarsi che cibo e acqua siano disponibili ad libitum.
- Eseguire tutte le procedure tra le 6:00 .m e le 14:00.m.
2. Preparare i ratti per l'intervento chirurgico
- Anestetizzare i ratti per 30 min con isoflurane (4% per l'induzione e 2% per la manutenzione) e 24% ossigeno (1,5 L/min).
- Testare il livello di anestesia nei ratti assicurandosi che non abbiano un riflesso di prelievo del pedale.
- Inserire il catetere calibro 24 nella vena di coda.
NOTA: Il riscaldamento della coda per la vasodilatazione non viene eseguito.- Posizionare i ratti sul tavolo in posizione supina. Usa il nastro medico per apporre tutti e quattro gli arti dei topi.
- Posizionare la sonda per la misurazione della temperatura nel retto del ratto prima dell'intervento chirurgico.
- Durante la procedura, mantenere una piastra di riscaldamento per sostenere una temperatura corporea interna di 37 °C.
- Aggiungere un unguento in entrambi gli occhi del topo per la protezione.
- Radere l'area chirurgica e disinfettare con tre applicazioni del 10% di povidone-iodio seguito dal 70% di alcol isopropile.
3. Occlusione dell'arteria cerebrale centrale laterale destra
NOTA: MCAO è eseguito con una tecnica modificata, comeprecedentemente descritto 16,22,23, con l'uso di strumenti descritti da McGarry etal.
- Sezionare la pelle e la fascia superficiale alla linea mediana ventrale del collo con pinzette chirurgiche e forbici con lame curve.
- Identificare il triangolo muscolare, costituito dall'ICA, dall'arteria carotide esterna (ECA) e dall'arteria carotide comune (CCA).
- Separare accuratamente il CCA e l'ICA giusti dal nervo vascolare con microforza per la chirurgia vascolare.
- Esponi il CCA giusto e l'ICA. Bloccare il flusso sanguigno proveniente dal CCA all'ICA utilizzando micro-clip o speciali laccio emostatici per la chirurgia vascolare. Effettuare un'incisione (circa 1 mm) sull'ICA utilizzando microscissori per la chirurgia vascolare.
- Inserire un catetere monofilamento (4-0 nylon) direttamente attraverso l'ICA, a circa 18,5-19 mm dal punto di biforcazione del CCA destro nel cerchio di Willis fino a raggiungere una lieve resistenza, per occludere l'MCA26.
- Ligate intorno all'ICA sopra la biforcazione del CCA.
- Per il gruppo di controllo gestito da sham, eseguire un inserimento di filo di nylon invece dei passaggi 3.5 e 3.616,22.
- Somministrare 5 mL di cloruro di sodio 0,9% per iniezione intraperitoneale.
- Chiudere la ferita per sutura e portare il topo in un'area di recupero.
NOTA: Pochi minuti dopo la fine dell'anestesia, il topo si sveglierà e si muoverà in modo indipendente intorno alla gabbia. - A 23 ore dopo MCAO, iniettare il 2% di Evans blu in soluzione salina (4 mL/kg)23,26 nella vena di coda per entrambi i gruppi azionati tramite una cannula27.
NOTA: Questo è usato come tracciante permeabilità sangue-cervello. Lasciare circolare per 60 minuti.
4. Determinazione della zona infaritta
- Misurare IZ a 24 ore dopo MCAO come descritto inprecedenza 9,15,18,19,26.
NOTA: I ratti che hanno perso più del 20% del loro peso o sviluppato convulsioni o emiplegia sono esclusi dall'esperimento. - Eutanasia del ratto sostituendo la miscela di gas ispirata con il 20% di ossigeno e l'80% di anidride carbonica fino a quando il topo non smette di respirare spontaneamente.
- Aprire il torace con un'incisione laterale di 5-6 cm attraverso la parete addominale sotto la gabbia toracica usando forbici e forcep chirurgiche.
- Eseguire un'incisione diaframmatica lungo l'intera lunghezza della gabbia toracica con forbici e forceli chirurgici.
- Spostare con cura i polmoni, tagliare attraverso la gabbia toracica fino alla clavicola sui lati destro e sinistro28.
- Perfondere con 200 mL di soluzione salina normale attraverso il ventricolo sinistro del cuore.
- Forare o incidere l'atrio destro del cuore con le forbici.
- Eseguire la decapitazione usando una ghigliottina e raccogliere il tessuto cerebrale.
- Usando le forbici dell'iride, tagliate dal forame magnum al bordo distale della superficie posteriore del cranio su entrambi i lati.
- Separare i bulbi olfattivi, le connessioni nervose lungo la superficie ventrale e la superficie dorsale del cranio dal cervello.
- Rimuovi il cervello dalla testa.
- Produci 6 fette cerebrali creando sezioni orizzontali spesse 2 mm con una lama in acciaio inossidabile .009", non patinato e a bordo singolo.
- Incubare per 30 min a 37 °C nello 0,05% di TTC.
- Posizionare il tessuto cerebrale sulle diapositive del microscopio ed eseguire la scansione ottica di queste 6 fette cerebrali con una risoluzione di 1600x1600 dpi (vedi supplemento 1 per esempio).
- Aggiungete un filtro blu con un editor di foto (ad esempio Adobe Photoshop CS2) utilizzando la funzione Mixer canale (Image > Adjustments > Channel Mixer) e salvate l'immagine come formato di file JPEG.
NOTA: dopo aver applicato il filtro blu, l'immagine apparirà in scala di grigi. - Aprire l'immagine salvata in ImageJ 1.37v29,30.
NOTA: questo programma per computer utilizza una funzione di soglia per isolare e calcolare i pixel in bianco o nero (vedere figura 1). - Per ciascuna delle 6 fette cerebrali dell'immagine, selezionare e salvare ogni emisfero (ipsilaterale ferito a destra e contralaterale sinistro illeso) come file di immagine separato utilizzando lo strumento "selezione poligonale" dal menu principale.
- Impostare il cut-off per determinare IZ utilizzando una funzione di soglia automatica dal menu principale del software ImageJ selezionando Immagine > Regola > Sogliae misurare il numero di pixel in ogni emisfero di un singolo insieme cerebrale.
NOTA: le macro possono essere utilizzate per questo passaggio nel software ImageJ (vedere il Supplemento 2 per il codice). Il cut off è un parametro critico per determinare quali pixel convertire in bianco e quali convertire in nero a seconda della tonalità di grigio (vedi Supplemento 3 e Supplemento 4 come esempi). ImageJ confronta quindi i pixel bianchi e neri per determinare IZ. In base al protocollo di colorazione e alle impostazioni dello scanner, abbiamo utilizzato un valore di cut-off costante di 0,220. - Eseguire la misurazione della correzione IZ per il gonfiore dei tessuti utilizzando il metodo RICH (Ratios of Ipsilateral and Contralateral Cerebral Hemispheres)13,23 (vedere esempio nel Supplemento 5).
NOTA: La dimensione infarct è valutata come percentuale dell'emisfero contralaterale.
5. Determinazione dell'edema cerebrale31
NOTA: Utilizzare ImageJ 1.37v per la misurazione di BE32,33.
- Misurare BE 24 ore dopo MCAO. Per il calcolo di BE, utilizzare i dati del volume dell'emisfero sinistro e destro (in unità).
- Eseguire la scansione ottica con una risoluzione di 1600x1600 dpi (vedere ad esempio il Supplemento 1).
- Selezionare gli emisferi cerebrali e impostare il cut-off per determinare BE con ImageJ 1.37v, come descritto sopra nelle sezioni 4.17-4.19.
- Esprimere l'area BE come percentuale delle aree standard dell'emisfero contralaterale non influenzato, calcolata con il metodo RICH utilizzando l'equazione seguente (vedere l'esempio nel Supplemento 5)23,34.
NOTA: L'estensione di BE è valutata come percentuale dell'emisfero contralaterale.
6. Determinazione dell'interruzione della BBB
- Misurare l'interruzione della BBB 24 ore dopo MCAO.
- Dividere gli emisferi destro e sinistro in sei fette e metterli in un tubo di microcentrifugo.
- Omogeneizzare ogni fetta del tessuto cerebrale in acido tricloroacetico, sulla base del calcolo di 1 g di tessuto cerebrale in 4 mL di acido tricloroacetico al 50%.
- Centrifuga a 10.000 x g per 20 min.
- Diluire il liquido supernatante 1:3 con il 96% di etanolo.
- Eseguire la spettrofotometria a luminescenza utilizzando il software di spettrofotometria, installando la piastra ed eseguendo una lettura del campione utilizzando i seguenti parametri: lunghezza d'onda di eccitazione dell'intensità di fluorescenza di 620 nm (larghezza di banda 10 nm) e lunghezza d'onda di emissione di 680 nm (larghezza di banda 10 nm)23,35 ; Mod top; Numero Carne 25; Manuale 100; Tremante 1 sec, 1 mm.
NOTA: utilizzare una lunghezza d'onda di eccitazione di 620 nm (larghezza di banda 10 nm) e una lunghezza d'onda di emissione di 680 nm (larghezza di banda 10 nm). 23di35 anni
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Representative Results
Misurazione della zona infarto
Un test t a campione indipendente ha indicato che 19 ratti sottoposti a MCAO permanente hanno dimostrato un aumento significativo del volume di infarto cerebrale rispetto ai 16 ratti sottoposti a sham (MCAO =7,49% ± 3,57 vs. Sham = 0,31% ± 1,9, t(28,49) = 7,56, p < 0,01 (cfr. figura 2A)). I dati sono espressi come percentuale media dell'emisfero ± SD.
Misurazione dell'edema cerebrale
Un test t a campione indipendente ha indicato che 19 ratti sottoposti a MCAO permanente hanno dimostrato un aumento significativo dell'entità dell'edema cerebrale dopo 24 ore rispetto ai 16 ratti sottoposti a sham (MCAO =12,31% ± 8,6 vs. Sham = 0,64% ± 10,2, t(29,37) = 3,61, p = 0,01, d = 1,23 (vedi figura 2B)). I dati sono espressi come percentuale media dell'emisfero ± SD.
Permeabilità alla barriera emiencefalica
Un test t a campione indipendente ha indicato che 19 ratti sottoposti a MCAO permanente hanno dimostrato un aumento significativo dell'entità della degradazione della BBB dopo 24 ore rispetto ai 16 ratti sottoposti a sham (MCAO=2235 ng/g ± 1101 vs. Sham = 94 ng/g ± 36, t(18.05) = 8.47 p < 0.01, d = 2.7 (vedi Figura 2C)). I dati sono misurati in ng/g del tessuto cerebrale e presentati come ± SD.
| Gruppo | Ore | Procedure |
| Sham operato (16 ratti) | 0 | Induzione di MCAO e inserimento di filamenti per gruppo azionato da finto |
| MCAO (19 ratti) | ||
| Sham operato (16 ratti) | 23 ore su 23 | Iniezione di blu Evans |
| MCAO (19 ratti) | ||
| Sham operato (16 ratti) | 24 ore su 24 | Raccolta del cervello per le misurazioni delle interruzioni di IZ, BE e BBB |
| MCAO (19 ratti) |
Tabella 1: Calendario del protocollo. Alle 23 h dopo MCAO, la soluzione blu Evans è stata iniettata. Un'ora dopo (24 ore dopo MCAO), è stata eseguita la raccolta cerebrale e la permeabilità IZ, BE e BBB è stata misurata in tutti i gruppi.
Figura 1: Fette cerebrali rappresentative di ratti finti e MCAO.
(A-B) Immagine digitalizzata originale. (C-D) Trasformazione in scala di grigi. (E-G) Funzione soglia. (G-H) Applicazione di un filtro blu. (I-J) Funzione soglia dopo l'applicazione del filtro blu. (K-L) Utilizzo della funzione soglia per valutare l'edema cerebrale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Risultati istologici dei ratti MCAO rispetto ai ratti a farsa.
(A) Zona infarct. Il volume della zona infarto in 19 ratti dopo l'MCAO è stato significativamente aumentato rispetto ai 16 ratti a comando fittizio 24 ore dopo l'intervento chirurgico (*p < 0,01). (B) Edema cerebrale. Il volume di edema cerebrale in 19 ratti dopo MCAO è stato significativamente aumentato rispetto ai 16 ratti a funzionamento fittizio 24 ore dopo l'intervento chirurgico (*p < 0,01). (C) Permeabilità alla barriera emiencefalica. La permeabilità alla barriera epatica in 19 ratti dopo l'MCAO è stata significativamente aumentata rispetto ai 16 ratti a gestione fittizia 24 ore dopo l'intervento chirurgico (*p < 0,01). I valori sono stati espressi come percentuale media dell'emisfero contralaterale ± SD e indice di extravasazione blu evans in ng/g del tessuto cerebrale ± SD secondo il test t dei campioni indipendenti. I risultati sono stati considerati statisticamente significativi quando p< 0,05 e molto significativi quando p < 0,01. Questa cifra è stata modificata da Kuts etal.
Supplemento 1: Esempio di scansione delle fette cerebrali. Clicca qui per scaricare questa cifra.
Supplemento 2: Macro che possono essere utilizzate nel software ImageJ per la funzione di soglia automatica e la misurazione dei pixel. Clicca qui per scaricare questo file.
Supplemento 3: Esempio di soglia automatica. Clicca qui per scaricare questa cifra.
Supplemento 4: Esempio di pixel misurati su ogni emisfero. Clicca qui per scaricare questa cifra.
Supplemento 5: Analisi campiontica. Clicca qui per scaricare questa cifra.
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Discussion
L'obiettivo principale del presente protocollo era quello di dimostrare misurazioni coerenti di tre parametri principali della lesione ischemica: permeabilità IZ, BE e BBB. Studi precedenti in questo campo hanno dimostrato la possibilità di eseguire uno o due di questi parametri insieme nello stesso campione. Oltre alla riduzione dei costi offerta da questo metodo in tre parti, fornisce anche un modello bioetico più desiderabile che limita il numero di animali che devono essere utilizzati e successivamente eutanasiati. Come in tutte le tecniche istologiche, il metodo è limitato dall'incapacità di osservare dinamicamente le lesioni ischemiche.
Nell'analisi delle immagini sono stati utilizzati quattro programmi per computer: ImageJ 1.37v, Adobe Photoshop CS2, Microsoft Excel 365 e IBM SPSS Statistics 22. ImageJ è stato usato per misurare l'estensione della zona infarct e dell'edema cerebrale. Adobe Photoshop è stato utilizzato per limitare l'effetto del blu Evans sul tessuto cerebrale, poiché un colore blu indica la rottura della BBB. Prima di calcolare la zona infarct, è necessario rimuovere il colore blu dall'immagine, poiché il colore non consente misurazioni accurate della zona infarct (vedere figura 1B, 1D, 1F). Excel e SPSS sono stati utilizzati per l'elaborazione dei dati.
La tecnica per valutare una zona infarct con il software per computer ImageJ si basa su un confronto tra pixel in bianco e nero in un emisfero integro e pixel in un emisfero infarinato. Nell'emisfero infarto, la zona infarct non è macchiata di TTC; pertanto, è indicato da una regione bianca nella figura 1B che viene misurata. Affinché il programma calcoli correttamente la zona infarct, è necessario convertire i pixel in tonalità di intensità variabili di colori grigi (vedere figura 1F, 1J). Il colore blu, causato dal blu Evans (cfr. figura 1B), può influire sulla valutazione della zona infarct (vedere figura 1F). Pertanto, il primo passaggio consiste nel rimuovere il colore blu utilizzando un filtro blu e quindi convertire l'immagine in un'immagine in bianco e nero (vedere figura 1J). Abbiamo usato Adobe Photoshop, ma anche altri programmi per computer possono essere utilizzati per questo scopo, come RawTherapeePortable.
Abbiamo quindi stabilito parametri uniformi per calcolare la zona infarct in tutte e 6 le fette di un set cerebrale usando ImageJ al fine di standardizzare la procedura di misurazione. Ciò è necessario perché tutte e 6 le sezioni di ogni set sono state macchiate e scansionate nelle stesse condizioni e richiedono un parametro di cut-off unificato. Il cut off è un parametro critico per determinare quali pixel convertire in bianco e quali convertire in nero a seconda della tonalità di grigio (vedere figura 1D, 1H). Abbiamo usato la funzione Soglia dal menu principale per questo scopo. Il passo finale nell'analisi dell'immagine è stato il calcolo della zona infarct e dell'edema cerebrale.
La misurazione della zona infarct può essere eseguita con varie tecniche, tra cui la colorazione istologica o tecniche radiologiche come un tomografocalcolato 36,tomografia ad emissione di positroni e risonanza magnetica23,36. Studi precedenti in laboratorio hanno dimostrato la valutazione del volume infarto utilizzando la colorazione con TTC15,26. Questo metodo si basa su una reazione chimica tra TTC e deidrogenasi mitocondriali dei neuroni. I tessuti sani, ricchi di deidrogenasi, sono colorati di rosso con questa colorazione. Tuttavia, nelle cellule necrotiche, questo cambiamento di colore non si verifica a causa di danni nel sistema che partecipa all'ossidazione di composti organici37. Nei nostri studi precedenti, abbiamo dimostrato un'alta correlazione tra questa tecnica istologica e i risultati della scansione dell'immagine cerebrale di quest'area23.
Le misurazioni dell'edema cerebrale possono essere valutate sia in vivo che in vitro. L'edema cerebrale deriva da cambiamenti patologici nelle attività dei canali ionici di sodio e calcio e dei trasportatori che portano ad un aumento dell'acquaintracellulare 38,39,40,41. In alternativa, il gonfiore può verificarsi a causa di danni da BBB che aumentano l'acqua extracellulare. 42 In studi precedenti, l'edema cerebrale è stato determinato sulla base di tecniche umide e secche seguite dal calcolo del contenuto di acquatissutale 43. Un vantaggio del metodo che presentiamo in questo protocollo è la sua semplicità e precisione rispetto ad altre tecnicheesistenti 23,44,45.
Il metodo più utile per il rilevamento dei guasti BBB è la spettroscopia a luminescenza dopo l'iniezione blu di Evans. La misurazione della permeabilità BBB si basa sull'iniezione di blu Evans, che si lega all'albumina. A sua volta, la massa molecolare dell'albumina è di 66 kDa e molto più significativa del peso molecolare di Evans blue 961 Da. Pertanto, la misurazione della permeabilità BBB è determinata precisamente dalla massa molecolare dell'albumina che penetra attraverso la BBB danneggiata, trasferendo così il blu di Evans. Oltre alle tecniche sopra descritte, esistono altre tecniche, in particolare quelle basate su una combinazione di varie molecole di dextrans e radioattive, che insieme danno risultati più accurati. La misurazione della rottura della BBB per spettrometria a luminescenza è più economica e più facile da usare, rispetto a tecniche più accurate ma più costose. Abbiamo utilizzato questo metodo per le valutazioni dell'interruzione della BBB insieme alle misurazioni della zona infarct e dell'edema cerebrale. L'iniezione di blu Evans per la valutazione della permeabilità BBB prima dell'induzione dell'MCAO non influisce sull'accuratezza della misurazione di questi dueparametri 23.
Il presente protocollo presenta una nuova tecnica per misurare i tre più importanti determinanti della lesione cerebrale ischemica sullo stesso campione cerebrale. Questo metodo può essere applicato anche a modelli di altre lesioni cerebrali. Questo protocollo contribuirà allo studio della fisiopatologia delle lesioni ischemiche.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Maryna Kuscheriava, Maksym Kryvonosov, Daryna Yakumenko ed Evgenia Goncharyk del Dipartimento di Fisiologia, Facoltà di Biologia, Ecologia e Medicina, Oles Honchar, Università Dnipro, Dnipro, Ucraina per il loro sostegno e contributi utili alle nostre discussioni. I dati ottenuti fanno parte della tesi di dottorato di Ruslan Kuts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mL Syringe | Braun | 4606027V | |
| 2% chlorhexidine in 70% alcohol solution | Sigma-Aldrich | 500 cc | Provides general antisepsis of the skin in the operatory field |
| 27 G Needle with Syringe | Braun | 305620 | |
| 3-0 Silk sutures | Henry Schein | 1007842 | |
| 4-0 Nylon suture | 4-00 | ||
| Brain & Tissue Matrices | Sigma-Aldrich | 15013 | |
| Cannula Venflon 22 G | KD-FIX | 183603985447 | |
| Centrifuge Sigma 2-16P | Sigma-Aldrich | Sigma 2-16P | |
| Compact Analytical Balances | Sigma-Aldrich | HR-AZ/HR-A | |
| Digital weighing scale | Sigma-Aldrich | Rs 4,000 | |
| Dissecting scissors | Sigma-Aldrich | Z265969 | |
| Eppendorf pipette | Sigma-Aldrich | Z683884 | |
| Eppendorf tube | Sigma-Aldrich | EP0030119460 | |
| Fluorescence detector | Tecan, Männedorf Switzerland | Model: Infinite 200 PRO multimode reader | Optional. |
| Fluorescence detector | Molecular Devices LLC | VWR cat. # 10822 512 SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader Base Instrument | Optional. |
| Gauze sponges | Fisher | 22-362-178 | |
| Heater with thermometer | Heatingpad-1 | Model: HEATINGPAD-1/2 | |
| Hemostatic microclips | Sigma-Aldrich | ||
| Horizon-XL | Mennen Medical Ltd | ||
| Infusion cuff | ABN | IC-500 | |
| Micro forceps | Sigma-Aldrich | ||
| Micro scissors | Sigma-Aldrich | ||
| Multiset | Teva Medical | 998702 | |
| Olympus BX 40 microscope | Olympus | ||
| Operating forceps | Sigma-Aldrich | ||
| Operating scissors | Sigma-Aldrich | ||
| Optical scanner | Canon | Cano Scan 4200F | Resolution 3200 x 6400 dpi |
| Petri dishes | Sigma-Aldrich | P5606 | |
| Purina Chow | Purina | 5001 | Rodent laboratory chow given to rats, mice and hamster is a life-cycle nutrition that has been used in biomedical research for over 5 decades. Provided to rats ad libitum in this experiment. |
| Rat cages | Techniplast | 2000P | Conventional housing for rodents. Cages were used for housing rats throughout the experiment |
| Scalpel blades #11 | Sigma-Aldrich | S2771 | |
| Software | |||
| Adobe Photoshop CS2 for Windows | Adobe | ||
| ImageJ 1.37v | NIH | The source code is freely available. The author, Wayne Rasband (wayne@codon.nih.gov), is at the Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA | |
| SPSS Statistics 22 | IBM | ||
| Office 365 ProPlus | Microsoft | - | Microsoft Office Excel |
| Windows 10 | Microsoft | ||
| Reagents | |||
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | Sigma-Aldrich | 298-96-4 | |
| 50% trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | 76-03-9 | |
| Ethanol 96 % | Romical | Flammable liquid | |
| Evans blue 2% | Sigma-Aldrich | 314-13-6 | |
| Isoflurane, USP 100% | Piramamal Critical Care, Inc | NDC 66794-017 |
References
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