Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Måling af Post-Stroke Cerebral Ødem, Infarct Zone og Blod-Brain Barrier Opdeling i et enkelt sæt gnaver Hjerne Prøver

doi: 10.3791/61309 Published: October 23, 2020
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokol beskriver en ny teknik til måling af de tre vigtigste parametre for iskæmisk hjerneskade på samme sæt gnaver hjerneprøver. Det er meget fordelagtigt kun at bruge én hjerneprøve med hensyn til etiske og økonomiske omkostninger.

Abstract

En af de mest almindelige årsager til sygelighed og dødelighed på verdensplan er iskæmisk slagtilfælde. Historisk set, et dyr model, der anvendes til at stimulere iskæmisk slagtilfælde indebærer midten cerebral arterie okklusion (MCAO). Infarkt zone, hjerneødem og blod-hjerne barriere (BBB) opdeling måles som parametre, der afspejler omfanget af hjerneskade efter MCAO. En væsentlig begrænsning af denne metode er, at disse målinger normalt opnås i forskellige rottehjerneprøver, hvilket fører til etiske og økonomiske byrder på grund af det store antal rotter, der skal aflives for en passende prøvestørrelse. Her præsenterer vi en metode til præcist at vurdere hjerneskade efter MCAO ved at måle infarkt zone, hjerneødem og BBB permeabilitet i samme sæt rottehjerner. Denne nye teknik giver en mere effektiv måde at evaluere patofysiologi af slagtilfælde.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

En af de mest almindelige årsager til sygelighed og dødelighed på verdensplan er slagtilfælde. Globalt repræsenterer iskæmisk slagtilfælde 68% af alle slagtilfælde tilfælde, mens der i USA iskæmisk slagtilfælde tegner sig for 87% af slagtilfælde tilfælde1,2. Det anslås , at den økonomiske byrde ved slagtilfælde når op på34 mia. Dyremodeller af slagtilfælde er nødvendige for at studere sin patofysiologi, udvikle nye metoder til evaluering og foreslå nye terapeutiske muligheder4.

Iskæmisk slagtilfælde opstår med okklusion af en større cerebral arterie, normalt den midterste cerebral arterie eller en af dens grene5. Således modeller af iskæmisk slagtilfælde har historisk involveret midten cerebral arterie okklusion (MCAO)6,7,8,9,10,11,12. Efter MCAO, neurologisk skade vurderes oftest ved at måle infarktzone (IZ) ved hjælp af en farvningsmetode på 2,3,5-triphenylenrazoliumchlorid (TTC)13, hjerneødem (BE) ved hjælp af tørring eller beregning af halvkugleformet volumen14,15,16og bbb-permeabilitet (blood brain barrier) ved hjælp af en spektrometriteknik ved hjælp af Evans blå farvning17,18,19.

Den traditionelle MCAO-metode bruger separate sæt hjerner til hver af de tre hjernemålinger. For en stor stikprøvestørrelse resulterer dette i et betydeligt antal aflivede dyr med yderligere etiske og økonomiske overvejelser. En alternativ metode til at lette disse omkostninger ville indebære målinger af alle tre parametre i et enkelt sæt af post-MCAO gnaver hjerner.

Tidligere forsøg er blevet gjort for at måle kombinationer af parametre i samme hjerneprøve. Samtidige immunfluorescerende farvningsmetoder20 samt andre molekylære og biokemiske analyser21 er blevet beskrevet efter TTC-farvning i samme hjerneprøve. Vi har tidligere beregnet hjernehalvdel mængder til at vurdere hjernen ødem og udført TTC farvning til at beregne infarkt zone i samme hjerne sæt15.

I denne protokol præsenterer vi en modificeret MCAO-teknik, der måler iskæmisk hjerneskade ved at bestemme IZ, BE og BBB permeabilitet i det samme sæt gnaverhjerner. IZ måles ved TTC-farvning, BE bestemmes ved beregning af halvkugleformet volumen, og BBB-permeabilitet opnås ved spektrometrimetoder19. I denne protokol brugte vi en modificeret MCAO-model, baseret på direkte indsættelse og fiksering af monofilamentkateteret i den indre halspulsåre (ICA) og yderligere blokering af blodgennemstrømningen til den midterste cerebral arterie (MCA)22. Denne ændrede metode viser en nedsat dødelighed og sygelighed sammenlignet med den traditionelle MCAO-metode16,22.

Denne nye tilgang giver en økonomisk sund og etisk model til måling af neurologiske skader efter MCAO. Denne vurdering af de vigtigste parametre for iskæmisk hjerneskade vil bidrage til en omfattende undersøgelse af dens patofysiologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Følgende procedurer blev gennemført i overensstemmelse med henstillingerne i Helsingfors- og Tokyo-erklæringen og retningslinjerne for anvendelse af forsøgsdyr i Det Europæiske Fællesskab. Forsøgene blev også godkendt af Animal Care Committee på Ben-Gurion University of the Negev.

1. Forberedelse af rotter til forsøgsproceduren

  1. Vælg voksne mandlige Sprague-Dawley rotter uden åbenlys patologi, der hver vejer mellem 300 og 350 g.
  2. Alle rotter skal opbevares ved stuetemperatur ved 22 °C med 12 timers lys og mørke cyklusser før forsøget.
  3. Sørg for, at mad og vand er tilgængelige ad libitum.
  4. Udfør alle procedurer mellem 6:00.m. og 14:00.m.

2. Forberedelse af rotter til operation

  1. Bedøve rotterne i 30 minutter med isofluran (4% for induktion og 2% for vedligeholdelse) og 24% ilt (1,5 L/min).
    1. Test anæstesiniveauet hos rotterne ved at sikre, at de ikke har en pedaludtræksrefleks.
  2. Sæt det 24-gauge kateter i halen vene.
    BEMÆRK: Haleopvarmning til vasodilation udføres ikke.
    1. Placer rotterne på bordet i liggende stilling. Brug medicinsk tape til at anbringe alle fire rotters lemmer.
  3. Placer sonden til temperaturmåling i rotte endetarmen før operationen.
  4. Under proceduren skal du vedligeholde en varmeplade til at understøtte en 37 °C kernehustemperatur.
  5. Tilsæt salve i begge rottens øjne for beskyttelse.
  6. Barber det kirurgiske område og desinficer med tre anvendelser af 10% povidone-jod efterfulgt af 70% isopropylalkohol.

3. Højre side midt cerebral arterie okklusion

BEMÆRK: MCAO udføres ved hjælp af en modificeret teknik, som tidligere beskrevet16,22,23, ved hjælp af instrumenter beskrevet af McGarry et al.24 og Uluç et al.25.

  1. Disseker huden og overfladisk fascia ved den ventrale midterlinje i nakken med kirurgisk pincet og saks med buede knive.
  2. Identificer muskeltrekanten, der består af ICA, ekstern halspulsåre (ECA) og almindelig halspulsåre (CCA).
  3. Adskil forsigtigt den rigtige CCA og ICA fra vagusnerven med mikroforceps til vaskulær kirurgi.
  4. Udsæt den rigtige CCA og ICA. Bloker blodgennemstrømningen, der kommer fra CCA til ICA ved hjælp af enten mikro-klip eller særlige årepresser til vaskulær kirurgi. Lav et snit (ca. 1 mm) på ICA ved hjælp af mikroscissorer til vaskulær kirurgi.
  5. Indsæt et monofilamentkateter (4-0 nylon) direkte gennem ICA, ca. 18,5-19 mm fra bifurcationspunktet i højre CCA i Willis-cirklen, indtil der opnås en mild modstand, for at okkludere MCA26.
  6. Ligate omkring ICA over bifurcation af CCA.
  7. For den sham-opererede kontrolgruppe skal du udføre en indsættelse af nylontråd i stedet for trin 3.5 og 3.616,22.
  8. Der gives 5 mL 0,9% natriumchlorid ved intraperitoneal injektion.
  9. Luk såret ved sutur og tag rotten til et genopretningsområde.
    BEMÆRK: Et par minutter efter afslutningen af anæstesi vågner rotten op og bevæger sig uafhængigt rundt i buret.
  10. Ved 23 timer efter MCAO injiceres 2% Evans blå i saltvand (4 mL/kg)23,26 i haleåren for begge drevne grupper via en kanyle27.
    BEMÆRK: Dette bruges som en blod-hjerne permeabilitet sporstof. Lad det cirkulere i 60 minutter.

4. Bestemmelse af infarkt zone

  1. Foranstaltning IZ ved 24 timer efter MCAO som beskrevet tidligere9,15,18,19,26.
    BEMÆRK: Rotter, der mistede mere end 20% af deres vægt eller udviklede anfald eller hemiplegi, er udelukket fra forsøget.
  2. Aflive rotten ved at erstatte den inspirerede gasblanding med 20% ilt og 80% kuldioxid, indtil rotten ophører med at trække vejret spontant.
  3. Åbn brystet med et 5-6 cm lateralt snit gennem bugvæggen under brystkassen ved hjælp af saks og kirurgiske pincet.
  4. Udfør et diafragmatisk snit langs hele længden af brystkassen med saks og kirurgiske pincet.
  5. Forskyde forsigtigt lungerne, skær gennem brystkassen op til kravebenet på højre og venstre side28.
  6. Perfuse med 200 mL normal saltvand gennem venstre hjertekammer i hjertet.
  7. Punktere eller incise højre atrium i hjertet med en saks.
  8. Udfør halshugning ved hjælp af en guillotine og indsamle hjernevæv.
  9. Brug iris saks, skåret fra foramen magnum til distal kanten af den bageste kraniet overflade på begge sider.
  10. Adskil de olfaktoriske pærer, nervøse forbindelser langs den ventrale overflade og kraniets dorsale overflade fra hjernen.
  11. Fjern hjernen fra hovedet.
  12. Fremstil 6 hjerneskiver ved at skabe 2 mm tykke vandrette sektioner med et .009" rustfrit stål, ubestrøget barberblad med en enkelt kant.
  13. Inkuber i 30 min ved 37 °C i 0,05% TTC.
  14. Placer hjernevævet på mikroskopdiasene, og udfør optisk scanning af disse 6 hjerneskiver med en opløsning på 1600x1600 dpi (se f.eks. tillæg 1).
  15. Tilføj et blåt filter med en fotoeditor (f.eks. Adobe Photoshop CS2) ved hjælp af funktionen Kanalmixer (Billede > Justeringer > Kanalmixer), og gem billedet som et JPEG-filformat.
    BEMÆRK: Når det blå filter er anvendt, vises billedet i gråtoneskala.
  16. Åbn det gemte billede i ImageJ 1.37v29,30.
    BEMÆRK: Dette computerprogram bruger en tærskelfunktion til at isolere og beregne de pixel, der enten er sorte eller hvide (se figur 1).
  17. For hver af de 6 hjerneskiver i billedet skal du vælge og gemme hver halvkugle (højre skadet ipsilateral og venstre uskadt kontralateral) som en separat billedfil ved hjælp af værktøjet "polygonvalg" fra hovedmenuen.
  18. Indstil cut-off til bestemmelse af IZ ved hjælp af en automatisk tærskelfunktion i hovedmenuen i ImageJ-softwaren ved at vælge Billede > Juster > Tærskel, og mål antallet af pixel på hver halvkugle i et enkelt hjernesæt.
    BEMÆRK: Makroer kan bruges til dette trin i ImageJ-software (se tillæg 2 for koden). Afskæringen er en kritisk parameter til bestemmelse af, hvilke pixel der skal konverteres til hvid, og hvilke der skal konverteres til sort afhængigt af gråtonen (se Tillæg 3 og Tillæg 4 som eksempler). ImageJ sammenligner derefter hvide og sorte pixel for at bestemme IZ. Baseret på farvningsprotokollen og scannerindstillingerne brugte vi en konstant afskæringsværdi på 0,220.
  19. Udfør måling af IZ korrigere for væv hævelse ved hjælp af forholdet mellem Ipsilateral og contralateral Cerebral halvkugler (RICH) metode13,23 (se eksempel i tillæg 5).
    Equation 1
    BEMÆRK: Infarkt størrelse vurderes som en procentdel af den kontralaterale halvkugle.

5. Bestemmelse af hjerneødem31

BEMÆRK: Brug ImageJ 1.37v til måling af BE32,33.

  1. Foranstaltning BE 24 timer efter MCAO. Til beregning af BE skal du bruge dataene fra venstre og højre halvkuglevolumen (i enheder).
  2. Udfør optisk scanning med en opløsning på 1600x1600 dpi (se f.eks. tillæg 1).
  3. Vælg hjernehalvdele, og sæt cut-off til bestemmelse af BE med ImageJ 1.37v, som beskrevet ovenfor i afsnit 4.17-4.19.
  4. Udtrykke BE-området som en procentdel af standardområderne på den upåvirkede kontralaterale halvkugle, beregnet ved hjælp af RICH-metoden ved hjælp af følgende ligning (se eksempel i tillæg 5)23,34.
    Equation 2
    BEMÆRK: Omfanget af BE vurderes som en procentdel af den kontralaterale halvkugle.

6. Bestemmelse af BBB-forstyrrelser

  1. Foranstaltning BBB forstyrrelser 24 timer efter MCAO.
  2. Del højre og venstre hjernehalvdel i seks skiver og læg hver enkelt i et mikrocentrifugerør.
  3. Homogenisere hver skive af hjernevævet i trichloreddikesyre, baseret på beregningen af 1 g hjernevæv i 4 ml 50% trichloreddikesyre.
  4. Centrifuge ved 10.000 x g i 20 min.
  5. Fortyndet supernatant væske 1:3 med 96% ethanol.
  6. Udfør luminescensspektrofotometri ved hjælp af spektrofotometrisoftware, installation af pladen og udførelse af en prøveaflæsning ved hjælp af følgende parametre: Fluorescensintensitet excitationsbølgelængde på 620 nm (båndbredde 10 nm) og en emissionsbølgelængde på 680 nm (båndbredde 10 nm)23,35 ; Mod toppen; Antal Kød 25; Håndbog 100; Ryster 1 sek., 1 mm.
    BEMÆRK: Brug en excitationsbølgelængde på 620 nm (båndbredde 10 nm) og en emissionsbølgelængde på 680 nm (båndbredde 10 nm). 23,35

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Måling af infarkt zone

En uafhængig prøve t-test viste, at 19 rotter, der gennemgik permanent MCAO, udviste en betydelig stigning i hjernens infarktvolumen sammenlignet med de 16 sham-opererede rotter (MCAO = 7,49% ± 3,57 vs. Sham = 0,31% ± 1,9, t(28,49) = 7,56, p < 0,01 (se figur 2A)). Dataene udtrykkes som en gennemsnitlig procentdel af den kontralaterale halvkugle ± SD.

Måling af hjerneødem

En uafhængig prøve t-test viste, at 19 rotter, der gennemgik permanent MCAO, udviste en betydelig stigning i omfanget af hjerneødem efter 24 timer sammenlignet med de 16 sham-opererede rotter (MCAO = 12,31% ± 8,6 vs. Sham = 0,64% ± 10,2, t(29,37) = 3,61, p = 0,01, d = 1,23 (se figur 2B)). Dataene udtrykkes som en gennemsnitlig procentdel af den kontralaterale halvkugle ± SD.

Permeabilitet i blodhjernebarrieren

En uafhængig prøve t-test viste, at 19 rotter, der gennemgik permanent MCAO, udviste en betydelig stigning i omfanget af BBB-nedbrydning efter 24 timer sammenlignet med de 16 sham-opererede rotter (MCAO= 2235 ng/g ± 1101 vs. Sham = 94 ng/g ± 36, t(18,05) = 8,47 p < 0,01, d = 2,7 (se figur 2C)). Dataene måles i ng/g hjernevæv og præsenteres som middel ± SD.

Gruppe Tidspunkt Procedurer
Sham opereret (16 rotter) 0 Induktion af MCAO og indsættelse af glødetråd til sham-opereret gruppe
MCAO (19 rotter)
Sham opereret (16 rotter) 13.000 Injektion af Evans blå
MCAO (19 rotter)
Sham opereret (16 rotter) 14.000 Hjernesamling til målinger af IZ-, BE- og BBB-forstyrrelser
MCAO (19 rotter)

Tabel 1: Protokoltidslinje. På 23 timer efter MCAO, evans blå opløsning blev injiceret. En time senere (24 timer efter MCAO) blev hjerneindsamling udført, og IZ, BE og BBB permeabilitet blev målt i alle grupper.

Figure 1
Figur 1: Repræsentative hjerneskiver af sham-operated og MCAO rotter.
(A-B) Originalt scannet billede. (C-D) Transformation til gråtoner. (E-G) Tærskelfunktion. (G-H) Anvendelse af et blåt filter. (I-J) Tærskelfunktion efter blå filterapplikation. (K-L) Brug af tærskelfunktion til at vurdere hjernens ødem. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Histologiske resultater af MCAO-rotter sammenlignet med sham-opererede rotter.
(A)Infarkt zone. Den infarkt zone volumen i 19 rotter efter MCAO blev signifikant øget i forhold til de 16 fingeret-opererede rotter 24 timer efter operationen (* p < 0,01). (b)Hjerneødem. Hjernen ødem volumen i 19 rotter efter MCAO blev signifikant øget i forhold til de 16 sham-opererede rotter 24 timer efter operationen (* p < 0,01). (C)Blodhjernebarrieren er gennemtrængelighed. Blodhjernebarrieren permeabilitet hos 19 rotter efter MCAO blev signifikant øget sammenlignet med de 16 sham-opererede rotter 24 timer efter operationen (* p < 0,01). Værdier blev udtrykt som en gennemsnitlig procentdel af den kontralaterale halvkugle ± SD og betyder Evans blå ekstravasation indeks i ng / g hjernevæv ± SD i henhold til uafhængige prøver t-test. Resultaterne blev betragtet som statistisk signifikante, når p< 0,05, og meget betydelige, når p < 0,01. Dette tal er blevet ændret fra Kuts et al.23Klik her for at se en større version af dette tal.

Tillæg 1: Eksempel på scanning af hjerneskiver. Klik her for at downloade dette tal.

Tillæg 2: Makroer, der kan bruges i ImageJ-software til den automatiske tærskelfunktion og målepixel. Klik her for at hente denne fil.

Tillæg 3: Eksempel på automatisk tærskel. Klik her for at downloade dette tal.

Tillæg 4: Eksempel på målte pixel på hver halvkugle. Klik her for at downloade dette tal.

Tillæg 5: Stikprøveanalyse. Klik her for at downloade dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hovedformålet med denne protokol var at påvise konsekvente målinger af tre hovedparametre for iskæmisk skade: IZ, BE og BBB permeabilitet. Tidligere undersøgelser på dette område har vist muligheden for at udføre en eller to af disse parametre sammen i samme stikprøve. Ud over den omkostningsreduktion, som denne tredelte metode tilbyder, giver den også en mere ønskelig bioetisk model, der begrænser antallet af dyr, der skal opereres på og efterfølgende aflives. Som i alle histologiske teknikker er metoden begrænset af den manglende evne til at observere iskæmiske skader dynamisk.

Der blev brugt fire computerprogrammer i billedanalysen: ImageJ 1.37v, Adobe Photoshop CS2, Microsoft Excel 365 og og IBM SPSS Statistics 22. ImageJ blev brugt til at måle udvidelsen af infarkt zone og hjerneødem. Adobe Photoshop blev brugt til at begrænse effekten af Evans blå på hjernevæv, da en blå farve indikerer BBB opdeling. Før du beregner infarktzonen, er det nødvendigt at fjerne den blå farve fra billedet, da farven ikke giver mulighed for nøjagtige målinger af infarktzonen (se figur 1B, 1D, 1F). Excel og SPSS blev brugt til databehandling.

Teknikken til vurdering af en infarkt zone med ImageJ computersoftware er baseret på en sammenligning af sorte og hvide pixels i en sund halvkugle til pixels i en infarkt halvkugle. På den infarkte halvkugle er infarktzonen ikke plettet med TTC; Den er derfor angivet med et hvidt område i figur 1B, der måles. For at programmet kan beregne infarktzonen korrekt, er det nødvendigt at konvertere pixel til nuancer af varierende intensiteter af grå farver (se figur 1F, 1J). Den blå farve, som er forårsaget af Evans blå (se figur 1B), kan påvirke vurderingen af infarktzonen (se figur 1F). Derfor er det første trin at fjerne den blå farve ved hjælp af et blåt filter og derefter konvertere billedet til et sort-hvidt billede (se Figur 1J). Vi brugte Adobe Photoshop, men andre computerprogrammer kan også bruges til dette formål, såsom RawTherapeePortable.

Derefter etablerede vi ensartede parametre til beregning af infarktzonen i alle 6 skiver af et hjernesæt ved hjælp af ImageJ for at standardisere måleproceduren. Dette er nødvendigt, fordi alle 6 udsnit fra hvert sæt blev farvet og scannet under de samme betingelser og kræver en samlet skæringsparameter. Afskæringen er en kritisk parameter til bestemmelse af, hvilke pixel der skal konverteres til hvid, og hvilke der skal konverteres til sort afhængigt af gråtonen (se figur 1D, 1H). Vi brugte funktionen Tærskel fra hovedmenuen til dette formål. Det sidste skridt i billedanalysen var beregningen af infarktzonen og hjerneødem.

Den infarkt zone måling kan udføres ved hjælp af forskellige teknikker, herunder histologiske farvning eller radiologiske teknikker såsom en computertomograf36, positron emission tomografi, og magnetisk resonans imaging23,36. Tidligere undersøgelser i laboratoriet har vist , at der er foretaget en vurdering af mængden af infarkt ved hjælp af farvning med TTC15,26. Denne metode er baseret på en kemisk reaktion mellem TTC og mitokondrie dehydrogenaser af neuroner. Det sunde væv, rig på dehydrogenaser, er farvet med rødt med denne farvning. Men i nekrotiske celler opstår denne farveændring ikke på grund af skade i systemet, der deltager i oxidationen af organiske forbindelser37. I vores tidligere undersøgelser demonstrerede vi en høj korrelation mellem denne histologiske teknik og resultater fra hjernebilledscanning af dette område23.

Målinger af cerebral ødem kan vurderes både in vivo og in vitro. Cerebral ødem skyldes patologiske ændringer i aktiviteterne i natrium- og calciumionkanaler og transportører, der fører til en stigning i intracellulært vand38,39,40,41. Alternativt kan hævelse forekomme ved BBB-skader, der øger ekstracellulært vand. 42 I tidligere undersøgelser blev cerebral ødem bestemt på grundlag af våde og tørre teknikker efterfulgt af beregningen af indholdet af vævsvand43. En fordel ved den metode, vi præsenterer i denne protokol, er dens enkelhed og nøjagtighed sammenlignet med andre eksisterende teknikker23,44,45.

Den mest nyttige metode til registrering af BBB-nedbrud er luminescensspektroskopi efter Evans blå injektion. Målingen af BBB permeabilitet er baseret på injektionen af Evans blå, som binder sig til albumin. Til gengæld er den molekylære masse af albumin 66 kDa og meget mere signifikant end den molekylære vægt af Evans blå 961 Da. Målingen af BBB-permeabiliteten bestemmes således præcist af den molekylære masse af albumin, der trænger gennem den beskadigede BBB og derved overfører Evans blå. Ud over de teknikker, der er beskrevet ovenfor, er der andre teknikker, især dem, der er baseret på en kombination af forskellige dextrans og radioaktive molekyler, som tilsammen giver mere nøjagtige resultater. Måling af BBB opdeling af luminescens spektrometri er billigere og lettere at bruge, sammenlignet med mere præcise, men dyrere teknikker. Vi brugte denne metode til evalueringer af BBB-forstyrrelser sammen med målinger af infarkt zone og hjerneødem. Injektion af Evans blå til vurdering af BBB-permeabilitet forud for induktion af MCAO påvirker ikke nøjagtigheden af målingen af disse to parametre23.

Denne protokol præsenterer en ny teknik til måling af de tre vigtigste determinanter for iskæmisk hjerneskade på samme hjerneprøve. Denne metode kan også anvendes på modeller af andre hjerneskader. Denne protokol vil bidrage til studiet af patofysiologien af iskæmisk skade.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker Maryna Kuscheriava, Maksym Kryvonosov, Daryna Yakumenko og Evgenia Goncharyk fra Institut for Fysiologi, Det Biologiske Fakultet, Økologi og Medicin, Oles Honchar, Dnipro University, Dnipro, Ukraine for deres støtte og nyttige bidrag til vores drøftelser. De indhentede data er en del af Ruslan Kuts' ph.d.-afhandling.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2 mL Syringe Braun 4606027V
2% chlorhexidine in 70% alcohol solution Sigma-Aldrich 500 cc Provides general antisepsis of the skin in the operatory field
27 G Needle with Syringe Braun 305620
3-0 Silk sutures Henry Schein 1007842
4-0 Nylon suture 4-00
Brain & Tissue Matrices Sigma-Aldrich 15013
Cannula Venflon 22 G KD-FIX 183603985447
Centrifuge Sigma 2-16P Sigma-Aldrich Sigma 2-16P
Compact Analytical Balances Sigma-Aldrich HR-AZ/HR-A
Digital weighing scale Sigma-Aldrich Rs 4,000
Dissecting scissors Sigma-Aldrich Z265969
Eppendorf pipette Sigma-Aldrich Z683884
Eppendorf tube Sigma-Aldrich EP0030119460
Fluorescence detector Tecan, Männedorf Switzerland Model: Infinite 200 PRO multimode reader Optional.
Fluorescence detector Molecular Devices LLC VWR cat. # 10822 512 SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader Base Instrument Optional.
Gauze sponges Fisher 22-362-178
Heater with thermometer Heatingpad-1 Model: HEATINGPAD-1/2
Hemostatic microclips Sigma-Aldrich
Horizon-XL Mennen Medical Ltd
Infusion cuff ABN IC-500
Micro forceps Sigma-Aldrich
Micro scissors Sigma-Aldrich
Multiset Teva Medical 998702
Olympus BX 40 microscope Olympus
Operating forceps Sigma-Aldrich
Operating scissors Sigma-Aldrich
Optical scanner Canon Cano Scan 4200F Resolution 3200 x 6400 dpi
Petri dishes Sigma-Aldrich P5606
Purina Chow Purina 5001 Rodent laboratory chow given to rats, mice and hamster is a life-cycle nutrition that has been used in biomedical research for over 5 decades. Provided to rats ad libitum in this experiment.
Rat cages Techniplast 2000P Conventional housing for rodents. Cages were used for housing rats throughout the experiment
Scalpel blades #11 Sigma-Aldrich S2771
Software
Adobe Photoshop CS2 for Windows Adobe
ImageJ 1.37v NIH The source code is freely available. The author, Wayne Rasband (wayne@codon.nih.gov), is at the Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA
SPSS Statistics 22 IBM
Office 365 ProPlus Microsoft - Microsoft Office Excel
Windows 10 Microsoft
Reagents
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride Sigma-Aldrich 298-96-4
50% trichloroacetic acid Sigma-Aldrich 76-03-9
Ethanol 96 % Romical Flammable liquid
Evans blue 2% Sigma-Aldrich 314-13-6
Isoflurane, USP 100% Piramamal Critical Care, Inc NDC 66794-017

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Krishnamurthi, R. V., et al. Global and regional burden of first-ever ischaemic and haemorrhagic stroke during 1990-2010: findings from the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet Global Health. 1, 259-281 (2013).
  2. Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135, 146 (2017).
  3. Wilkins, E., et al. European cardiovascular disease statistics 2017. (2017).
  4. Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Design, Development and Therapy. 9, 3445-3454 (2015).
  5. Lloyd-Jones, D., et al. Heart disease and stroke statistics--2009 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 119, 480-486 (2009).
  6. Shigeno, T., McCulloch, J., Graham, D. I., Mendelow, A. D., Teasdale, G. M. Pure cortical ischemia versus striatal ischemia. Circulatory, metabolic, and neuropathologic consequences. Surgical Neurology. 24, 47-51 (1985).
  7. Albanese, V., Tommasino, C., Spadaro, A., Tomasello, F. A transbasisphenoidal approach for selective occlusion of the middle cerebral artery in rats. Experientia. 36, 1302-1304 (1980).
  8. Hudgins, W. R., Garcia, J. H. Transorbital approach to the middle cerebral artery of the squirrel monkey: a technique for experimental cerebral infarction applicable to ultrastructural studies. Stroke. 1, 107-111 (1970).
  9. Waltz, A. G., Sundt, T. M., Owen, C. A. Effect of middle cerebral artery occlusion on cortical blood flow in animals. Neurology. 16, 1185-1190 (1966).
  10. Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 1, 53-60 (1981).
  11. Aspey, B. S., Cohen, S., Patel, Y., Terruli, M., Harrison, M. J. Middle cerebral artery occlusion in the rat: consistent protocol for a model of stroke. Neuropathology and Applied Neurobiology. 24, 487-497 (1998).
  12. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20, 84-91 (1989).
  13. O'Brien, M. D., Jordan, M. M., Waltz, A. G. Ischemic cerebral edema and the blood-brain barrier. Distributions of pertechnetate, albumin, sodium, and antipyrine in brains of cats after occlusion of the middle cerebral artery. Archives of Neurology. 30, 461-465 (1974).
  14. Chen, C. H., Toung, T. J., Sapirstein, A., Bhardwaj, A. Effect of duration of osmotherapy on blood-brain barrier disruption and regional cerebral edema after experimental stroke. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 26, 951-958 (2006).
  15. Boyko, M., et al. Establishment of Novel Technical Methods for Evaluating Brain Edema and Lesion Volume in Stroked Rats: a Standardization of Measurement Procedures. Brain Research. (2019).
  16. Boyko, M., et al. An experimental model of focal ischemia using an internal carotid artery approach. Journal of Neuroscience Methods. 193, 246-253 (2010).
  17. Sifat, A. E., Vaidya, B., Abbruscato, T. J. Blood-Brain Barrier Protection as a Therapeutic Strategy for Acute Ischemic Stroke. AAPS Journal. 19, 957-972 (2017).
  18. Jiang, X., et al. Blood-brain barrier dysfunction and recovery after ischemic stroke. Progress in Neurobiology. 163-164, 144-171 (2018).
  19. Belayev, L., Busto, R., Zhao, W., Ginsberg, M. D. Quantitative evaluation of blood-brain barrier permeability following middle cerebral artery occlusion in rats. Brain Research. 739, 88-96 (1996).
  20. Li, L., Yu, Q., Liang, W. Use of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride-stained brain tissues for immunofluorescence analyses after focal cerebral ischemia in rats. Pathology - Research and Practice. 214, 174-179 (2018).
  21. Kramer, M., et al. TTC staining of damaged brain areas after MCA occlusion in the rat does not constrict quantitative gene and protein analyses. Journal of Neuroscience Methods. 187, 84-89 (2010).
  22. Kuts, R., et al. A middle cerebral artery occlusion technique for inducing post-stroke depression in rats. Journal of Visualized Experiments. e58875 (2019).
  23. Kuts, R., et al. A Novel Method for Assessing Cerebral Edema, Infarcted Zone and Blood-Brain Barrier Breakdown in a Single Post-stroke Rodent Brain. Frontiers in Neuroscience. 13, 1105 (2019).
  24. McGarry, B. L., Jokivarsi, K. T., Knight, M. J., Grohn, O. H. J., Kauppinen, R. A. A Magnetic Resonance Imaging Protocol for Stroke Onset Time Estimation in Permanent Cerebral Ischemia. Journal of Visualized Experiments. e55277 (2017).
  25. Uluc, K., Miranpuri, A., Kujoth, G. C., Akture, E., Baskaya, M. K. Focal cerebral ischemia model by endovascular suture occlusion of the middle cerebral artery in the rat. Journal of Visualized Experiments. e1978 (2011).
  26. Boyko, M., et al. The effect of blood glutamate scavengers oxaloacetate and pyruvate on neurological outcome in a rat model of subarachnoid hemorrhage. Neurotherapeutics. 9, 649-657 (2012).
  27. Kuts, R., et al. A Middle Cerebral Artery Occlusion Technique for Inducing Post-stroke Depression in Rats. Journal of Visualized Experiments. e58875 (2019).
  28. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. e3564 (2012).
  29. Poinsatte, K., et al. Quantification of neurovascular protection following repetitive hypoxic preconditioning and transient middle cerebral artery occlusion in mice. Journal of Visualized Experiments. e52675 (2015).
  30. Rasband, W. S. ImageJ, U. S. National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Available from: https://imagej.nih.gov/ij (2018).
  31. Boyko, M., et al. Pyruvate's blood glutamate scavenging activity contributes to the spectrum of its neuroprotective mechanisms in a rat model of stroke. European Journal of Neuroscience. 34, 1432-1441 (2011).
  32. Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43, 25-30 (2007).
  33. Rasband, W. S. ImageJ, U. S. National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Available from: https://imagej.nih.gov/ij (1997).
  34. Kaplan, B., et al. Temporal thresholds for neocortical infarction in rats subjected to reversible focal cerebral ischemia. Stroke. 22, 1032-1039 (1991).
  35. Kumai, Y., et al. Postischemic gene transfer of soluble Flt-1 protects against brain ischemia with marked attenuation of blood-brain barrier permeability. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 27, 1152-1160 (2007).
  36. Schuleri, K. H., et al. Characterization of peri-infarct zone heterogeneity by contrast-enhanced multidetector computed tomography: a comparison with magnetic resonance imaging. Journal of the American College of Cardiology. 53, 1699-1707 (2009).
  37. Singh, A., Kukreti, R., Saso, L., Kukreti, S. Oxidative Stress: A Key Modulator in Neurodegenerative Diseases. Molecules. 24, (2019).
  38. Di Napoli, M. Caplan's Stroke: A Clinical Approach. Journal of the American Medical Association. 302, 2600-2601 (2009).
  39. Deb, P., Sharma, S., Hassan, K. M. Pathophysiologic mechanisms of acute ischemic stroke: An overview with emphasis on therapeutic significance beyond thrombolysis. Pathophysiology. 17, 197-218 (2010).
  40. Simard, J. M., Kent, T. A., Chen, M., Tarasov, K. V., Gerzanich, V. Brain oedema in focal ischaemia: molecular pathophysiology and theoretical implications. Lancet Neurology. 6, 258-268 (2007).
  41. Klatzo, I. Pathophysiological aspects of brain edema. Acta Neuropathology. 72, 236-239 (1987).
  42. Yang, Y., Rosenberg, G. A. Blood-brain barrier breakdown in acute and chronic cerebrovascular disease. Stroke. 42, 3323-3328 (2011).
  43. Lin, T. N., He, Y. Y., Wu, G., Khan, M., Hsu, C. Y. Effect of brain edema on infarct volume in a focal cerebral ischemia model in rats. Stroke. 24, 117-121 (1993).
  44. Liu, C., et al. Increased blood-brain barrier permeability in contralateral hemisphere predicts worse outcome in acute ischemic stroke after reperfusion therapy. Journal of NeuroInterventional Surgery. 10, 937-941 (2018).
  45. Boyko, M., et al. Establishment of novel technical methods for evaluating brain edema and lesion volume in stroked rats: A standardization of measurement procedures. Brain Research. 1718, 12-21 (2019).
Måling af Post-Stroke Cerebral Ødem, Infarct Zone og Blod-Brain Barrier Opdeling i et enkelt sæt gnaver Hjerne Prøver
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Frank, D., Gruenbaum, B. F., Grinshpun, J., Melamed, I., Severynovska, O., Kuts, R., Semyonov, M., Brotfain, E., Zlotnik, A., Boyko, M. Measuring Post-Stroke Cerebral Edema, Infarct Zone and Blood-Brain Barrier Breakdown in a Single Set of Rodent Brain Samples. J. Vis. Exp. (164), e61309, doi:10.3791/61309 (2020).More

Frank, D., Gruenbaum, B. F., Grinshpun, J., Melamed, I., Severynovska, O., Kuts, R., Semyonov, M., Brotfain, E., Zlotnik, A., Boyko, M. Measuring Post-Stroke Cerebral Edema, Infarct Zone and Blood-Brain Barrier Breakdown in a Single Set of Rodent Brain Samples. J. Vis. Exp. (164), e61309, doi:10.3791/61309 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter