Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

En modell av epileptogenese i Rhinal Cortex-Hippocampus organotypiske skiver kulturer

Published: March 18, 2021 doi: 10.3791/61330
* These authors contributed equally

Summary

Her beskriver vi utarbeidelsen av rhinal cortex-hippocampus organotypiske skiver. Under en gradvis og kontrollert deprivasjon av serum skildrer disse skivene utviklende epileptiske hendelser og kan betraktes som en ex vivo-modell av epileptogenese. Dette systemet representerer et utmerket verktøy for å overvåke dynamikken i spontan aktivitet, samt for å vurdere utviklingen av nevroinflammatoriske egenskaper gjennom hele epileptogenesen.

Abstract

Organotypiske skivekulturer har blitt mye brukt til å modellere hjernesykdommer og regnes som gode plattformer for å evaluere et legemiddels nevrobeskyttende og terapeutiske potensial. Organotypiske skiver fremstilles fra utplantet vev og representerer et komplekst multicellulært ex vivo-miljø. De bevarer den tredimensjonale cytoarkitturen og det lokale miljøet i hjerneceller, opprettholder nevronal tilkobling og nevron-glia gjensidig interaksjon. Hippocampal organotypiske skiver anses egnet til å utforske de grunnleggende mekanismene for epileptogenese, men klinisk forskning og dyremodeller av epilepsi har antydet at rhinal cortex, sammensatt av perirhinale og entorhinale kortikaler, spiller en relevant rolle i anfallsgenerering.

Her beskriver vi utarbeidelsen av rhinal cortex-hippocampus organotypiske skiver. Registreringer av spontan aktivitet fra CA3-området under perfusjon med komplett vekstmedium, ved fysiologisk temperatur og i fravær av farmakologiske manipulasjoner, viste at disse skivene skildrer utviklende epileptiske hendelser gjennom tidene i kulturen. Økt celledød, gjennom propidiumjoddopptaksanalyse, og gliose, vurdert med fluorescens-koblet immunhiistokjemi, ble også observert. Den eksperimentelle tilnærmingen som presenteres fremhever verdien av rhinal cortex-hippocampus organotypiske skivekulturer som en plattform for å studere dynamikken og progresjonen av epileptogenese og for å screene potensielle terapeutiske mål for denne hjernepatologien.

Introduction

Epilepsi, en av de mest utbredte nevrologiske lidelsene over hele verden, er preget av den periodiske og uforutsigbare forekomsten av synkronisert og overdreven nevronaktivitet i hjernen. Til tross for de ulike antiepileptiske legemidlene (AEDs) som er tilgjengelige, er en tredjedel av pasientene med epilepsi ildfaste mot terapi1 og fortsetter å oppleve anfall og kognitiv nedgang. Videre hemmer tilgjengelige AEDer kognisjon på grunn av deres relativt generaliserte handlinger på nevronaktivitet. Epileptogenese er vanskelig å studere hos mennesker, på grunn av de mange og heterogene epileptogene skadene, lange latente perioder som varer måneder til tiår, og de villedende effektene av antikonvulsiv behandling etter det første spontane anfallet.

Identifisering av potensielle terapeutiske midler for behandling av epilepsi har blitt mulig på grunn av dyremodeller av epilepsi: 1) genetiske modeller, som bruker genetisk disponerte dyr der anfall oppstår spontant eller som svar på en sensorisk stimulans; 2) modeller av elektriske stimuleringsinduserte anfall; og 3) farmakologiske modeller av anfallsinduksjon som bruker pilocarpin (en muskarinreseptoragonist), kainate (en kainatreseptoragonist) eller 4-aminopyridin (en kaliumkanalblokker), blant andre. Disse modellene var avgjørende i forståelsen av atferdsendringene, samt molekylære og cellulære mekanismer som ligger til grunn for epilepsi, og de har ført til oppdagelsen av mange AEDer2.

Ex vivo preparater er også et kraftig verktøy for å utforske mekanismene som ligger til grunn for epileptogenese og ictogenesis. Akutte hippocampale skiver, som muliggjør elektrofysiologiske studier av levende celler over en 6-12 timers periode, og organotypiske hippocampal skiver som kan bevares i en inkubator over en periode på dager eller uker, har blitt mye brukt i studier av epileptiform aktivitet3.

Organotypiske hjerneskiver fremstilles fra utplantet vev og representerer en fysiologisk tredimensjonal modell av hjernen. Disse skivene bevarer cytoarkitturen i interesseområdet og inkluderer alle hjerneceller og deres intercellulære kommunikasjon4.  Den mest brukte regionen for langsiktige organotypiske kulturer er hippocampus, da denne regionen påvirkes av nevronal tap i flere nevrodegenerative forhold. De har blitt mye brukt til å modellere hjernesykdommer og regnes som gode verktøy for å vurdere et legemiddels nevrobeskyttende og terapeutiske potensial5,6. Modeller av epileptogenese, hjerneslag og Aβ-indusert toksisitet ble beskrevet i hippocampale organotypiske skiver7,8,9,10. Parkinsons sykdom ble utforsket i ventral mesencephalon og striatum, samt cortex-corpus callosum-striatum-substantia nigra, organotypiske skiver11. Organotypiske cerebellar skiver kulturer etterligner mange aspekter av axon myelinasjon og cerebellar funksjoner og er en utbredt modell for å undersøke nye terapeutiske strategier i multippel sklerose12.

Imidlertid har klinisk forskning og dyremodeller av epilepsi antydet at rhinal cortex, sammensatt av perirhinale og entorhinale kortikaler, spiller en rolle i anfallsgenerering13. Dermed ble en modell av epileptogenese i rhinal cortex-hippocampus organotypiske skiver etablert14. Under en gradvis og kontrollert deprivasjon av serum skildrer rhinal cortex-hippocampus organotypiske skiver utviklende epileptiske hendelser, i motsetning til analoge skiver som alltid holdes i et serumholdig medium.

Ved epilepsi, som i mange akutte og kroniske sykdommer i sentralnervesystemet, klarer nevrosentrisk syn ikke å belyse mekanismene som ligger til grunn for sykdomsde begynnelse og progresjon. Kliniske og eksperimentelle bevis peker på hjernebetennelse, der mikroglia og astrocytter spiller en relevant rolle, som en av de viktigste aktørene som bidrar til den epileptiske prosessen. Farmakologiske eksperimenter i dyremodeller av epilepsi antyder at antiepileptogene effekter kan oppnås ved å målrette proinflammatoriske veier, og i dag anses nevroinflammasjon som et nytt alternativ for utvikling av terapeutiske tilnærminger for epilepsi15.

Her beskriver vi grundig utarbeidelsen av rhinal cortex-hippocampus organotypiske skivekulturer, samt detaljene for registrering av spontan epileptiform aktivitet fra dem. Vi fremhever at dette systemet etterligner flere nevroinflammatoriske aspekter ved epilepsi, og er dermed egnet til å utforske rollen som glialceller og nevroinflammasjon i denne patologien. Videre representerer det en brukervennlig plattform for screening av potensielle terapeutiske tilnærminger for epilepsi.

Protocol

Den portugisiske loven og EUs retningslinjer (2010/63/EU) ble respektert i alle prosedyrer angående beskyttelse av dyr til vitenskapelige formål. Alle metodene som er beskrevet her ble godkjent av iMM's Institutional Animal Welfare Body (ORBEA-iMM) og den nasjonale kompetente myndigheten (DGAV – Direção Geral de Alimentação e Veterinária).

1. Forberedelse av rhinal cortex-hippocampus skiver

MERK: Tilberedningen av rhinal cortex-hippocampus skiver bruker P6-7 Sprague-Dawley rotter.

  1. Kulturoppsett og middels forberedelse
    1. På dagen før kulturen, forberede de nødvendige mediene og plassere dem ved 4 °C.
    2. Forbered disseksjonsmedium: 25 mM glukose i Geys balanserte saltoppløsning (GBSS).
    3. Forbered kulturmedium: 50% Opti-MEM, 25% HBSS, 25% hesteserum (HS), 25 mM glukose, 30 μg / ml gentamycin.
    4. Forbered vedlikeholdsmedium: Neurobasal-A (NBA), 2% B27, 1 mM L-glutamin, 30 μg/ml Gentamycin, HS (15%, 10%, 5% og 0%).
  2. Hjernehøsting
    1. Rett før du starter kulturen, legg til 1,1 ml kulturmedium til hver brønn av 6-brønnsplaten med en P1000 pipette og plasser den ved 37 °C.
    2. Plasser alt utstyret (disseksjonsmikroskop, vevshelikopter, dissekeringslampe, dissekeringsverktøy, elektroder, plater, innsatser og filterpapir) inne i det biologiske sikkerhetsskapet og steriliser under UV-lys i 15 minutter.
    3. Juster stykketykkelsen til 350 μm.
    4. Trekk GBSS ut av kjøleskapet. Tilsett 5 ml GBSS til seks Petri-retter. Seks Petri-retter vil være nødvendig per dyr.
    5. Euthanize rotte valpen. Utfør halshugging ved å bruke en skarp saks ved foten av hjernestammen til dyret.
    6. Vask dyrehodet tre ganger i kaldt GBSS og ta det inn i sikkerhetsskapet.
  3. Vevisolasjon og tilberedning av skiver
    1. Sett skarpe tang godt inn i øyekontaktene for å holde hodet.
    2. Ved hjelp av en tynn saks kutt huden / hodebunnen langs midtlinjen fra vertebrale foramen mot frontal lobes og legg den til side.
    3. Klipp på samme måte skallen og langs cerebral tverrgående sprekk (plass mellom hjerne og cerebellum). Med buede lange tang, flytt den fra hverandre.
    4. Kast de olfaktoriske pærene med en slikkepott. Fjern hjernen fra hodet og plasser den i iskald GBSS med dorsaloverflaten vendt opp (Figur 1A).
    5. Sett de fine tangene inn i cerebellum og gå langs midtlinjen med slikkepottåpningen hver halvkule svært nøye (Figur 1B).
    6. Med korte kurve tang, fjern forsiktig overflødig vev som dekker hippocampi, uten å berøre hippocampal strukturen. Deretter med en slikkepott, kutt under hver hippocampus (Figur 1C).
    7. Plukk opp en halvkule og plasser den, med hippocampus vendt opp, på et filterpapir. Gjenta prosedyren med den andre halvkule og plasser den parallelt med den første, i filterpapiret. Legg filterpapiret på vevshelikopteret, med halvkule vinkelrett på bladet, og kutt halvkulene i 350 μm skiver (Figur 1D).
    8. Legg det skiver vevet i en Petri-tallerken med kaldt GBSS (Figur 1E).
    9. Separer skivene forsiktig ved hjelp av rundspisselektrodene (Figur 1F). Hold bare skivene med en strukturelt intakt rhinal cortex og hippocampus. DG- og CA-områder bør være perfekt definert, samt entorhinal og perirhinal cortex (Figur 1G).
    10. Plasser hver skive på innsatsen (Figur 1H-I), med en slikkepott og en rund tuppelektrode. Fjern overflødig disseksjonsmedium rundt hver skive med en P20-pipette (figur 1J). Fire rhinal cortex-hippocampus skiver kan dyrkes i en enkelt innsats (Figur 1K).
  4. Vedlikehold av kultur
    1. Endre mediet annenhver dag.
    2. Varm opp mediet ved 37 °C.
    3. Ta platene fra inkubatoren. Plukk opp hver innsats ved å holde plastkanten med tang (Figur 1L).
    4. Bruk en fri hånd for å aspirere mediet fra brønnen. Sett innsatsen tilbake i brønnen og tilsett 1 ml, med en P1000 pipette, av friskt oppvarmet medium (Figur 1M). Gjenta dette for alle innleggene. Pass på at ingen luftbobler er fanget mellom membranen og mediet.

MERK: Epileptiske skiver gjennomgår en gradvis og kontrollert deprivasjon av serum i mediet. Fra 9 Dager In Vitro (DIV) på, skiver opprettholdes i NBA uten HS14.

Figure 1
Figur 1: Detaljert prosedyre for fremstilling av rhinal cortex-hippocampus organotypiske skiver. (A) Fjern hjernen fra hodet og plasser den i iskald GBSS med dorsaloverflaten vendt opp. (B) Sett tangene inn i cerebellum. Åpne hjernen gjennom midtlinjen og fjern overflødig vev over hippocampus. (C) Med en spatel kuttet under hippocampus, som angitt av pilene. (D) Plasser både hippocampi vendt opp og parallelt med hverandre på filterpapiret og kutt 350 μm skiver på vevshelikopteret. (E) Plasser den skiver hippocampus i iskald GBSS. (F) Skill skivene ved hjelp av runde glasselektroder. (G) Velg bare skivene som viser en intakt rhinal cortex og hippocampus. (H, I) Ved hjelp av en rund tippet glasselektrode skyver du hver skive til slikkepotten og legger den på innsatsen. (J) Fjern GBSS rundt stykket. (K) Plasser fire stykker per innsats. (L) For å skifte medium, løft innsatsen og aspirer mediet med en glasspipette. (M) Tilsett friskt medium ved å plassere pipetten mellom innsatsen og veggene på 6-brønnsplaten. Pass på at det ikke er luftbobler under skivene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

2. Elektrofysiologiske opptak

MERK: Elektrofysiologiske opptak ble utført i rhinal cortex-hippocampus organotypiske skiver ved 7, 14 og 21 DIV i et grensesnitt-type kammer. Opptak ble oppnådd med en forsterker, digitalisert og analysert med programvare. Alle innspillinger ble båndpassfiltrert (åtte-polet Bessel-filter ved 60 Hz og gaussisk filter ved 600 Hz).

  1. Klargjøring av oppsett
    1. Forbered 50 ml NBA-medium med 1 ml B27 og 250 μL L-glutamin. Varm opp ved 37 °C.
    2. Sett elektrofysiologioppsettet i lukkekretsen. Kontroller om strømningshastigheten er 2 ml/min.
    3. Åpne kar esken (5% CO2/ 95% O2) ventilen og kontroller vannstanden i systemet.
    4. Sett filterpapiret i grensesnittopptakskammeret for å tømme overflødig medium og linserengjøringspapiret under rammen for å levere medium til skiven.
    5. Slå på temperaturregulatoren, forsterkerne og mikromanipulatoren.
    6. La temperaturen i grensesnittkammeret stabilisere seg ved 37 °C før du starter opptakene.
    7. Forbered kunstig cerebrospinalvæske (aCSF: 124 mM NaCl, 3mM KCl, 1,2 mM NaH2PO4,25 mM NaHCO3,10 mM glukose, 2 mM CaCl2,1 mM MgSO4 med pH 7,4) og bruk den til å fylle glasselektroden med en sprøyte. Plasser den i mottakselektroden.
  2. Opptak av spontan aktivitet
    1. Når temperaturen er stabil, fjern platen fra inkubatoren og kutt en skive fra innsatsen med et svært skarpt blad. Plasser den i en 60 mm plate med en dråpe medium. Ta det til grensesnittopptakskammeret.
    2. Plasser stykket i grensesnittkammeret med hippocampus nederst til høyre. Plasser mottakselektroden i CA3 pyramidecellelaget.
    3. Fortsett til den kontinuerlige anskaffelsesprotokollen og registrer i 30 min.

3. PI opptak analyse

MERK: Celledød ble vurdert ved å overvåke det cellulære opptaket av fluorescerende fargestoffpropidiumjodid (PI). PI er en polar forbindelse, som kommer inn i celler med skadede cellemembraner og samhandler med DNA som avgir rød fluorescens (absorbans 493 nm, utslipp 630 nm). Siden PI ikke er gjennomsyret av levende celler, brukes den til å oppdage døde celler i en populasjon.

  1. PI inkubasjon
    1. Forbered, i kulturmediet, en frisk 1:10 fortynning av PI-lager.
    2. For PI-opptaksanalyse fjern platen fra inkubatoren og løft innsatsen forsiktig. Tilsett 13 μL PI til mediet, med en P20 pipette, og oppnå en endelig konsentrasjon på 2 μM.  Rør langsomt platen før innsatsen settes på plass igjen. Pass på at det ikke er noen bobler under skivene.
    3. Sett skivene tilbake i inkubatoren på 37 °C i 2 timer.
    4. Fortsett med immunhiistokjemiprotokollen, som beskrevet i neste avsnitt. Dekk platene med aluminium, siden PI er lysfølsom.

4. Immunohistokjemi

MERK: I immunhiistokjemi ble et nevronspesifikt antistoff, samt antistoffer i stand til å diskriminere hvilende og reaktive fenotyper av mikroglia og astrocytter, brukt til å evaluere utvidelsen av nevronal død og gliose i rhinal cortex-hippocampus epileptisk-lignende organotypiske skiver.

  1. Vev fiksering
    1. Fjern platen fra inkubatoren og aspirer mediet. Fest skivene med 4% paraformaldehyd (PFA) i 1 time ved RT, ved å legge til 1 ml PFA under og over skivene, med en P1000 pipette.
    2. Fjern PFA og tilsett 1 ml PBS. Legg også til PBS under og over sektorene.
    3. Hold skivene ved 4 °C, i PBS, til videre bruk. Legg alltid parafilm rundt platene for å unngå tørking.
  2. Immunstaining trinn
    1. Vask to ganger, 10 min hver gang, med 1 ml PBS.
    2. Forbered permeabiliserings-/blokkeringsløsning som inneholder 1% Triton-X100, 10% HS og 10% BSA i PBS. Forbered 5% BSA-løsning.
    3. Tegn to rektangler med den hydrofobe pennen (Figur 2A). Klipp skivene fra innsatsen (Figur 2B) med et svært skarpt blad. Sett to skiver per lysbilde (figur 2C) og tilsett 140 μL permeabiliserings-/blokkeringsløsning på toppen av hver skive ved hjelp av en P200-pipette. Inkuber i 3 timer ved RT.
    4. Fortynn de primære antistoffene mot arbeidsfortynning i 5% BSA i PBS. Inkuber med de primære antistoffene over natten ved 4 °C.
    5. Inkuber med sekundære antistoffer i 4 timer ved RT. Fra dette trinnet beskytter du platen mot lys siden fluoroforer jobbes med.
    6. Plasser en 50 μL dråpe Hoechst-oppløsning på toppen av hver skive og inkuber i 20 min på RT.
    7. Vask mellom inkubasjoner. Vask alltid tre ganger, i 10 minutter hver gang, med PBS-T.
    8. Fjern Hoechst og vask som anbefalt.
    9. Tilsett 50 μL monteringsmedium på toppen av hver skive. Dekk med glassdeksler og omgi med neglelakk (Figur 2D).
    10. La det tørke ved RT i 24 timer.
    11. Visualiser immunostaining under et konfokalt mikroskop. Hold de fargede skivene ved -20 °C.

Figure 2
Figur 2: Spesifikk prosedyre for immunhiistokjemianalysen. (A) Når den hydrofobe pennen tegner to firkanter i lysbildet. (B) Klipp inn innsatsen som inneholder stykket. (C) Plasser hvert stykke i firkantene som tegnes med den hydrofobe pennen, og start permeabiliserings-/blokkeringstrinnet. (D) Etter at protokollen er avsluttet, avslutter du den ved å montere skivene i monteringsmediet, dekke med et glassdeksler og omgi det med neglelakk. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Representative Results

Basert på tidligere beskrivelser av epileptisk signalanalyse i organotypiske hippocampale skiver, er interictal epileptiform utslipp her definert som paroksysmale utslipp som tydelig skiller seg fra bakgrunnsaktivitet, med en brå endring i polaritet og forekommer ved lav frekvens (<2 Hz). Paroksysmale utslipp som varer mer enn 10 s og forekommer ved høyere frekvens (≥2 Hz) karakteriseres som iktal epileptiform aktivitet. Hvis en iktalhendelse inntreffer innen 10 s etter den forrige, regnes disse to hendelsene som bare én iktalhendelse.

Rhinal cortex-hippocampus organotypiske skiver ved 7 DIV (Figur 3A) skildrer blandet interictal og ictal-lignende aktivitet. Ved 14 DIV (Figur 3B) er spontan aktivitet preget av iktalutslipp, som utvikler seg til en overveldende iktal aktivitet ved 21 DIV, med ictal hendelser som varer >1 min (Figur 3C).

Figure 3
Figur 3: Spontan epileptiform aktivitet av rhinal cortex-hippocampus organotypiske skiver. Representative elektrografiske beslaglignende hendelser, registrert fra CA3-området i et grensesnitt-type kammer, etter (A) 7 DIV, (B) 14 DIV og (C) 21 DIV. Anfallsdetaljer vises i nedre spor. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

PI-opptaksanalyse etterfulgt av immunhiistokjemi mot nevronmarkøren NeuN med sikte på å identifisere nevronal død. PI-opptak av granulære og pyramidale nevroner ble observert i 7 DIV-skiver (piler i figur 4A), men antall PI+ nevroner økte ved 14 DIV (piler i figur 4B), noe som bekrefter en økt nevronal død med epileptogeneseprogresjon.

Figure 4
Figur 4: Representative bilder av NeuN og PI farget rhinal cortex-hippocampus organotypiske skiver. Bilder av NeuN farget modne nevroner og PI-positive celler ble anskaffet ved (A) 7 DIV og (B) 14 DIV, på et konfokalt lasermikroskop med et 20x mål. Forstørrede bilder av de stiplede områdene vises. Piler peker på dødsnevroner (i oransje). Skala-bar, 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

En dobbel farging av Iba1, sammen med CD68, ble brukt til å evaluere mikroglia fenotype. Iba1 er en mikroglia/makrofagmarkør, mens CD68 er et lysosomalt protein uttrykt i høye nivåer av reaktiv mikroglia og i lave nivåer ved å hvile mikroglia. Ved 7 DIV-skiver er ramifisert mikroglia med lavt CD68-uttrykk (piler i figur 5A) rikere enn Iba1+/CD68+ reaktiv mikroglia (pilspisser i figur 5A), mens ved 14 DIV, I alle områder av hippocampus overskrider Iba1+/CD68+ bushy/amoeboid M1 microglia (pilspisser i figur 5B) mikroglia med lavt CD68-uttrykk (piler i figur 5B). Ved 14 DIV kan noen Iba1+/ CD68+ celler med hyper-ramification utseende bli identifisert (åpne pilspisser i figur 5B), noe som kan tyde på forekomsten av M2 antiinflammatorisk fenotype mikroglia. Denne saken krever imidlertid videre studier.

Nyere studier viste at forskjellige initierende CNS-skader kan fremkalle minst to typer reaktive astrocytter, A1 og A2, med A1 astrocytter som nevrotoksiske16. A1-undertype astrocytter er preget av et økt uttrykk for Komplement C316,17,18. Komplement C3, som spiller en sentral rolle i aktiveringen av komplementsystemet, genererer C3b, som videre degraderes til iC3b, C3dg og C3d19. Dermed ble det brukt en dobbel farging av GFAP og C3d for å vurdere astrogliose. Ved 7 DIV er uttrykket for C3d knapt detekterbart (Figur 6A), mens i 14 DIV-stykker kan hypertrofiske GFAP+/C3d+ astrocytter observeres (pilspisser i figur 6B), noe som tyder på en progressiv aktivering av A1 astrocytter.

Resultatene viser en progressiv aktivering av mikroglia og astrocytter gjennom hele epileptogenese, etterligner hendelsene beskrevet hos pasienter med epilepsi og i dyremodeller av denne patologien.

Figure 5
Figur 5: Representative bilder av Iba1 og CD68 fargede rhinal cortex-hippocampus organotypiske skiver. Bilder av Iba1 og CD68 farget mikroglia, og Hoechst farget kjerner, ble anskaffet på (A) 7 DIV og (B) 14 DIV, på en konfokal lasermikroskop med et 20x mål. Forstørrede bilder av de stiplede områdene vises. Piler peker på Iba1+/ CD68- hvilende mikroglia, pilspisser indikerer Iba1+/ CD68+ buskete / amoeboid mikroglia og åpne pilspisser avslører Iba1+/ CD68+ hyper-ramified mikroglia. Skala-bar, 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Representative bilder av GFAP og C3d farget rhinal cortex-hippocampus organotypiske skiver. Bilder av GFAP og C3d fargede astrocytter, og Hoechst farget kjerner, ble anskaffet ved (A) 7 DIV og (B) 14 DIV, på et konfokalt lasermikroskop med et 20x mål. Forstørrede bilder av de stiplede områdene vises. Pilspisser peker på GFAP+/C3d+ reaktive A1-astrocytter (i gult). Skala-bar, 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Dyremodeller av epilepsi har vært avgjørende for oppdagelsen av mange AEDer, men de krever mange dyr, og de fleste av dem er tidkrevende på grunn av latent periode for anfallsde begynnelse. Lav-magnesium induksjon av epileptiform aktivitet i hippocampal akutte skiver har også blitt grundig revidert i litteraturen3, men akutte skiver har en 6-12 h levedyktighet som gjør det umulig å vurdere langsiktige endringer. Organotypiske skiver kan opprettholdes i kultur fra dager til uker, slik at man kan overvinne den korte levedyktighetstiden for akutte skiver, og modeller av epileptogenese i organotypiske hippocampal skiver har blitt foreslått3,7,8.

Her beskriver vi utarbeidelsen av organotypiske skiver, bestående av rhinal cortex og hippocampus. Disse skivene tar 15-20 min å forberede per dyr, fra dyreoffer til plassering av skiver på innsatsene, og 6-8 skiver per halvkule kan oppnås. Ekstra forsiktighet må tas når du åpner halvkule for å eksponere hippocampus og når du fjerner vevet fra filterpapiret etter kutting. Overflødig vev over hippocampus kan også kompromittere skiveintegriteten under kutting.

Rhinal cortex-hippocampus organotypiske skiver skildrer en epileptisk-lignende aktivitet som ligner in vivo epilepsi. Etter en uke i kulturen skildrer de fleste skiver blandet interictal og ictal-lignende aktivitet, som utvikler seg til utelukkende ictal-lignende hendelser med tid i kulturen. Så langt har vi registrert få interictal utslipp i skiver med 2-3 uker. I dette systemet ser epileptisk-lignende aktivitet ut til å utvikle seg raskere enn i organotypiske hippocampal skiver. Dette kan tilskrives tilstedeværelsen av rhinal cortex, som bevarer det meste av funksjonelle innspill til hippocampus. For å løse dette problemet fullt ut, utføres en fullstendig karakterisering av epileptiske signaler som vises av disse stykkene gjennom tidene i kulturen, for eksempel antall og varighet av ictal-hendelser, sammen med amplitude og frekvens.

Dette systemet kan opprettholdes i kultur i mer enn tre uker, og etterligner mange molekylære korrelasjoner av epilepsi, som nevronal død, aktivering av mikroglia og astrocytter og økt produksjon av proinflammatoriske cytokiner14, noe som gir en langsiktig karakterisering av disse aspektene. Det representerer også en brukervennlig screeningplattform, der farmakologiske intervensjoner rettet mot spesifikke cellulære veier kan implementeres og potensielle terapeutiske mål kan testes. Utvilsomt kan systemet heri presentert bidra til å ytterligere opplyse mekanismene for epileptogenese.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å anerkjenne Bioimaging Unit of Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes, for alle forslagene om bildeinnhenting.

Dette prosjektet har fått støtte fra EUs forsknings- og innovasjonsprogram Horizon 2020 under tilskuddsavtale Nº 952455, Fundação para a Ciênciae Tecnologia (FCT) gjennom Project PTDC/MEDFAR/30933/2017 og Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50 mL Centrifuge Tube, Conical Bottom Corning 430829
70% Ethanol Manuel Vieira, Lda UN1170
Amplifier Axon Instruments Axoclamp 900A
Amplifier Axon Instruments Digidata 1440A
Anti-C3d (goat) R&D Systems AF2655 Dilute at a ratio 1:1000
Anti-CD68 (mouse) Abcam ab31630-125ug Dilute at a ratio 1:250
Anti-GFAP (mouse) Millipore SAS MAB360 Dilute at a ratio 1:500
Anti-Iba1 (rabbit) Abcam ab108539 Dilute at a ratio 1:600
Anti-NeuN (rabbit) Werfen 16712943S Dilute at a ratio 1:500
Artificial cerebrospinal fluid (aCSF) Homemade
B-27™ Supplement (50X), serum free Thermo Fisher Scientific 17504-044
Blades for scalpel handle Fine Science Tools 10011-00
Bovine Serum Albumin (BSA) NZYTech MB04602 5% BSA is used to dilute the primary antibodies. Add 0.5g BSA in 10 mL PBS.
Brain/Tissue Slice Chamber System Warner Instruments
Calcium chloride dihydrate Merck Millipore 1.02382.0500
Cell culture inserts, 30 mm, hydrophilic PTFE Millipore SAS PICM03050
Cold light source SCHOTT KL 300 LED
Confocal laser microscope Zeiss LSM 710
Conventional incubator Thermo Scientific Heraeus BB15, Function Line Set to 37 °C and 5% CO2
D(+)-Glucose monohydrate Merck Millipore 1.08342.1000
D-(+)-Glucose solution, 45% in water Sigma G8769
di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate Merck Milipore 1.06580.1000
Dissecting microscope/magnifier MEIJI TECHNO CO. LTD 122285
Donkey anti-goat IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 568 Invitrogen A11057 Dilute at a ratio 1:200
Donkey anti-mouse IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 488 Invitrogen A21202 Dilute at a ratio 1:200
Donkey anti-mouse IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 568 Invitrogen A10037 Dilute at a ratio 1:200
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 488 Invitrogen A21206 Dilute at a ratio 1:500
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 568 Invitrogen A10042 Dilute at a ratio 1:500
Dumont #5 Fine Forceps Biologie Inox Fine Science Tools 11254-20
Dumont #5 Forceps Standard Inox Fine Science Tools 11251-20
Dumont #7 Forceps Standard Dumoxel Fine Science Tools 11271-30
Dumont Medical #7S Forceps Short Curve Inox Fine Science Tools 11273-22
Gentamycin stock solution, 50 mg/mL Thermo Fisher Scientific 15750-037
Gey’s Balanced Salt Solution (GBSS) Biological Industries 01-919-1A
Glass Electrodes Science Products GB150F-10 Round tips homemade
Glass Pasteur pipettes, 230 mm VWR International 612-1702
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) Thermo Fisher Scientific 24020-091
Hoechst 33342 Invitrogen H1399 Stock solution at 2 mg/mL in PBS
Horse Serum, Heat Inactivated (HS) Thermo Fisher Scientific 26050-088
Hydrochloric acid Merck Milipore 1.09057.1000
Hydrophobic Pen Dako S200230-2
INCU-Line IL10 VWR 390-0384
Interface chamber Warner Instruments BSC-HT Haas Top
Iris Spatula Curved Fine Science Tools 10092-12
Labculture Class II Biological Safety Cabinet HERASafe HS 12
Lens Cleaning Paper TIFFEN
L-Glutamine solution 200 mM (Q) Thermo Fisher Scientific 25030-024
Magnesium sulfate heptahydrate Merck Millipore 1.05886.0500
Micro tube 0.5 mL, PP SARSTEDT 72,699
Micro tube 1.5 mL, PP SARSTEDT 72.690.001
Micro tube 2.0 mL, PP SARSTEDT 72.691
Micromanipulators Sutter Instrument MP-285
Miroscope Cover Glasses, 24 mm x 60 mm Marienfeld 102242
Nail polish Cliché
Neurobasal-A Medium (NBA) Thermo Fisher Scientific 10888-022
Opti-MEM® I Reduced-Serum Medium Thermo Fisher Scientific 31985-047
Paraformaldehyde, powder VWR Chemicals 2,87,94,295
Peristaltic pump Gilson M312
Phosphate saline buffer (PBS) Homemade. PBS with 0.5% Tween-20 (PBS-T) is used to wash slices during the immunohistochemistry assay.
Phosphate standard solutions, PO43- in water BDH ARISTAR 452232C
Pipette set Gilson P2, P10, P20, P100, P200, P1000
Platinum 5 blades Gillette
Potassium chloride Sigma-Aldrich P5405-250g
Propidium iodide (PI) Sigma-Aldrich P4170-25MG Stock solution at 1 mg/mL in water.
Qualitative Filter Paper, Cellulose, Grade 1, 55 mm Whatman 1001-055 Medium retention 11µm
Qualitative Filter Paper, Cellulose, Grade 1, 90 mm Whatman 1001-090 Medium retention 11µm
Scalpel handle Fine Science Tools 91003-12
Slip Tip Insulin Syringe without Needle 1 mL SOL-M 161000
Sodium chloride VWR Chemicals 27800.360
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate Merck Millipore 1.06346.1000
Sodium hydrogen carbonate Merck Millipore 1.06329.1000
Sodium Hydroxide‎ Merck Milipore 535C549998
Stimulator Astro Med Inc GRASS Product Group S48 Stimulator
Student Scissors Straight SharpSharp 12cm Fine Science Tools 91402-12
SuperFrost Plus™ Adhesion slides Thermo Fisher Scientific J1800AMNZ
TC-Treated Sterile 60 x 15mm Tissue Culture Dish Corning CORN430166
TC-Treated Sterile 6-Wells Plates Corning CORN3516
Temperatue controller MEDICAL SYSTEMS CORP. TC-102
Tissue Chopper The Mickle Laboratory Engineering CO. LTD. MTC/2 Set to 350 μm
Triton X-100 BDH 14630
Tween-20 Sigma P2287

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fisher, R. S., et al. Electrical stimulation of the anterior nucleus of thalamus for treatment of refractory epilepsy. Epilepsia. 51, 899-908 (2010).
  2. Loscher, W. Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure. 20, 359-368 (2011).
  3. Heinemann, U., Kann, O., Schuma, S. An overview of in vitro seizure models in acute and organotypic slices. Models of seizures and epilepsy. Pitkänen, A., Schwartzkroin, P. A., Moshé, S. L. , Elsevier Academic Press. Cambridge. 35-44 (2006).
  4. Sundstrom, L., Morrison, B., Bradley, M., Pringle, A. Organotypic cultures as tools for functional screening in the CNS. Drug Discovery Today: Targets. 10, 993-1000 (2005).
  5. Holopainen, I. E. Organotypic hippocampal slice cultures: a model system to study basic cellular and molecular mechanisms of neuronal cell death, neuroprotection, and synaptic plasticity. Neurochemical Research. 30, 1521-1528 (2005).
  6. Noraberg, J., et al. Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair. CNS Neurological Disorders Drug Targets. 4, 435-452 (2005).
  7. Dyhrfjeld-Johnsen, J., Berdichevsky, Y., Swiercz, W., Sabolek, H., Staley, K. J. Interictal spikes precede ictal discharges in an organotypic hippocampal slice culture model of epileptogenesis. Journal of Clinical Neurophysiology. 27, 418-424 (2010).
  8. Chong, S. A., et al. Intrinsic Inflammation Is a Potential Anti-Epileptogenic Target in the Organotypic Hippocampal Slice Model. Neurotherapeutics. 15, 470-488 (2018).
  9. Li, Q., Han, X., Wang, J. Organotypic hippocampal slices as models for stroke and traumatic brain injury. Molecular Neurobiology. 53 (6), 4226-4237 (2016).
  10. Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. R. Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Current Neuropharmacology. 5, 19-33 (2007).
  11. Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: a review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
  12. Doussau, F., Dupont, J. L., Neel, D., Schneider, A., Poulain, B., Bossu, J. L. Organotypic cultures of cerebellar slices as a model to investigate demyelinating disorders. Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (10), 1011-1022 (2017).
  13. Vismer, M. S., Forcelli, P. A., Skopin, M. D., Gale, K., Koubeissi, M. Z. The piriform, perirhinal, and entorhinal cortex in seizure generation. Frontiers in Neural Circuits. 9, 27 (2015).
  14. Magalhães, D. M., Pereira, N., Rombo, D. M., Beltrão-Cavacas, C., Sebastião, A. M., Valente, C. A. Ex vivo model of epilepsy in organotypic slices - a new tool for drug screening. Journal of Neuroinflammation. 15, 203 (2018).
  15. Ravizza, T., Balosso, S., Vezzani, A. Inflammation and prevention of epileptogenesis. Neuroscience Letters. 497 (3), 223-230 (2011).
  16. Liddelow, S. A., et al. Neurotoxic reactive astrocytes are induced by activated microglia. Nature. 541, 481-487 (2017).
  17. Wu, T. Complement C3 is activated in human AD brain and is required for neurodegeneration in mouse models of amyloidosis and tauopathy. Cell Reports. 28 (8), 2111-2123 (2019).
  18. Hartmann, K., et al. Complement 3+-astrocytes are highly abundant in prion diseases, but their abolishment led to an accelerated disease course and early dysregulation of microglia. Acta Neuropathologica Communications. 7, 83 (2019).
  19. Nilsson, U. R., Funke, L., Nilsson, B., Ekdahl, K. N. Two conformational forms of target-bound iC3b that distinctively bind complement receptors 1 and 2 and two specific monoclonal antibodies. Upsala Journal of Medical Sciences. 116, 26-33 (2011).

Tags

Nevrovitenskap Utgave 169 Organotypiske skiver epileptogenese propidiumjodid gliose CD68 C3d
En modell av epileptogenese i Rhinal Cortex-Hippocampus organotypiske skiver kulturer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Valente, C. A., Meda, F. J.,More

Valente, C. A., Meda, F. J., Carvalho, M., Sebastião, A. M. A Model of Epileptogenesis in Rhinal Cortex-Hippocampus Organotypic Slice Cultures. J. Vis. Exp. (169), e61330, doi:10.3791/61330 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter