Summary
Ici, nous décrivons la préparation des tranches organotypiques rhinal de cortex-hippocampe. Sous une privation progressive et commandée de sérum, ces tranches dépeignent l’évolution épileptique-comme des événements et peuvent être considérées un modèle ex vivo d’épileptogenèse. Ce système représente un excellent outil pour surveiller la dynamique de l’activité spontanée, ainsi que pour évaluer la progression des caractéristiques neuro-inflammatoires tout au long de l’épileptogenèse.
Abstract
Les cultures de tranches organotypiques ont été largement utilisées pour modéliser les troubles cérébraux et sont considérées comme d’excellentes plateformes pour évaluer le potentiel neuroprotecteur et thérapeutique d’un médicament. Les tranches organotypiques sont préparées à partir de tissus explantés et représentent un environnement ex vivo multicellulaire complexe. Ils préservent la cytoarchitecture tridimensionnelle et l’environnement local des cellules cérébrales, maintiennent la connectivité neuronale et l’interaction réciproque neurone-glie. Des tranches organotypiques hippocampal sont considérées appropriées pour explorer les mécanismes de base de l’épileptogenèse, mais la recherche clinique et les modèles animaux de l’épilepsie ont suggéré que le cortex rhinal, composé des cortex perirhinal et entorhinal, jouent un rôle approprié dans la génération de saisie.
Ici, nous décrivons la préparation des tranches organotypiques rhinal de cortex-hippocampe. Les enregistrements de l’activité spontanée du secteur CA3 sous perfusion avec le milieu de croissance complet, à la température physiologique et en l’absence des manipulations pharmacologiques, ont prouvé que ces tranches dépeignent l’évolution épileptique-comme des événements tout au long du temps dans la culture. On a également observé la mort cellulaire accrue, par l’analyse de prise d’iodure de propidium, et le gliosis, évalué avec immunohistochemistry fluorescence-couplé, . L’approche expérimentale présentée met en évidence la valeur des cultures organotypiques rhinal de tranche de cortex-hippocampe comme plate-forme pour étudier la dynamique et la progression de l’épileptogenèse et pour examiner des cibles thérapeutiques potentielles pour cette pathologie de cerveau.
Introduction
L’épilepsie, l’un des désordres neurologiques les plus répandus dans le monde entier, est caractérisée par l’occurrence périodique et imprévisible de l’activité neuronale synchronisée et excessive dans le cerveau. En dépit des diverses drogues antiépileptiques (DEA) disponibles, un tiers de patients présentant l’épilepsie sont réfractaires à la thérapie1 et continuent à éprouver des saisies et le déclin cognitif. En outre, les DEA disponibles entravent la cognition en raison de leurs actions relativement généralisées sur l’activité neuronale. L’épileptogenèse est difficile à étudier chez l’homme, en raison des dommages epileptogenic multiples et hétérogènes, de longues périodes latentes durant des mois à des décennies, et des effets trompeurs du traitement d’anticonvulsivant après la première saisie spontanée.
L’identification d’agents thérapeutiques potentiels pour le traitement de l’épilepsie est devenue possible en raison de modèles animaux de l’épilepsie: 1) modèles génétiques, qui utilisent des animaux génétiquement prédisposés chez lesquels des crises se produisent spontanément ou en réponse à un stimulus sensoriel; 2) des modèles de crises induites par la stimulation électrique; et 3) des modèles pharmacologiques d’induction de crises qui utilisent la pilocarpine (un agoniste des récepteurs muscariniques), le kainate (un agoniste des récepteurs kainate) ou la 4-aminopyridine (un bloqueur des canaux potassiques), entre autres. Ces modèles ont été cruciaux dans la compréhension des changements de comportement, ainsi que des mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents à l’épilepsie, et ils ont conduit à la découverte de nombreux DEA2.
Les préparations ex vivo sont également un outil puissant pour explorer les mécanismes sous-jacents à l’épileptogenèse et à l’ictogenèse. Les tranches aiguës de l’hippocampe, qui permettent des études électrophysiologiques des cellules vivantes sur une période de 6 à 12 h, et les tranches organotypiques de l’hippocampe qui peuvent être conservées dans un incubateur sur une période de jours ou de semaines ont été largement utilisées dans les études de l’activité épileptiforme3.
Les tranches de cerveau organotypiques sont préparées à partir de tissu explanté et représentent un modèle physiologique tridimensionnel du cerveau. Ces tranches préservent la cytoarchitecture de la région d’intérêt et comprennent toutes les cellules du cerveau et leur communication intercellulaire4. La région la plus utilisée pour les cultures organotypiques à long terme est l’hippocampe, car cette région est affectée par la perte neuronale dans de multiples conditions neurodégénératives. Ils ont été largement utilisés pour modéliser les troubles cérébraux et sont considérés comme d’excellents outils pour évaluer le potentiel neuroprotecteur et thérapeutique d’un médicament5,6. Des modèles d’épileptogenèse, d’ACCIDENT VASCULAIRE CÉRÉBRAL et de toxicité induite par l’Aβ ont été décrits dans des tranches organotypiques hippocampiques7,8,9,10. La maladie de Parkinson a été explorée dans le mesencephalon ventral et le striatum, aussi bien que le cortex-corpus callosum-striatum-substantia nigra, tranches organotypiques11. Les cultures organotypiques de tranches cérébellaires imitent de nombreux aspects de la myélinisation axone et des fonctions cérébelleuses et constituent un modèle répandu pour l’étude de nouvelles stratégies thérapeutiques dans la sclérose en plaques12.
Cependant, la recherche clinique et les modèles animaux de l’épilepsie ont suggéré que le cortex rhinal, composé de cortex perirhinal et entorhinal, joue un rôle dans la génération de saisie13. Ainsi, un modèle d’épileptogenèse dans les tranches organotypiques rhinales cortex-hippocampe a été établi14. Sous une privation progressive et commandée de sérum, les tranches organotypiques rhinal de cortex-hippocampe dépeignent l’évolution épileptique-comme des événements, à la différence des tranches analogues toujours maintenues dans un milieu sérum-contenant.
Dans l’épilepsie, comme dans beaucoup de maladies aiguës et chroniques du système nerveux central, la vision neurocentric ne parvient pas à élucider les mécanismes étant à la base de l’apparition et de la progression de la maladie. Les preuves cliniques et expérimentales indiquent que l’inflammation du cerveau, dans laquelle la microglie et les astrocytes jouent un rôle pertinent, comme l’un des principaux acteurs contribuant au processus épileptique. Des expériences pharmacologiques dans des modèles animaux d’épilepsie suggèrent que des effets antiepileptogenic peuvent être obtenus en ciblant des voies pro-inflammatoires, et de nos jours neuroinflammation est considéré comme une option nouvelle pour le développement d’approches thérapeutiques pour l’épilepsie15.
Ici, nous décrivons complètement la préparation des cultures organotypiques rhinal de tranche de cortex-hippocampe, aussi bien que les détails pour enregistrer l’activité épileptiforme spontanée d’eux. Nous soulignons que ce système imite plusieurs aspects neuroinflammatory de l’épilepsie, étant ainsi approprié pour explorer le rôle des cellules glial et du neuroinflammation dans cette pathologie. En outre, il représente une plate-forme facile à utiliser pour le dépistage des approches thérapeutiques potentielles pour l’épilepsie.
Protocol
La législation portugaise et les lignes directrices de l’Union européenne (2010/63/UE) ont été respectées dans toutes les procédures relatives à la protection des animaux à des fins scientifiques. Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par l’organisme institutionnel de protection des animaux (ORBEA-iMM) de l’iMM et l’autorité nationale compétente (DGAV – Direção Geral de Alimentação e Veterinária).
1. Préparation des tranches de cortex-hippocampe rhinal
REMARQUE: La préparation des tranches de cortex rhinal-hippocampe utilise des rats P6-7 Sprague-Dawley.
- Installation de la culture et préparation du milieu
- La veille de la culture, préparez les supports requis et placez-les à 4 °C.
- Préparer le milieu de dissection : 25 mM de glucose dans la solution saline équilibrée (SGBD) de Gey.
- Milieu de culture préparé : 50 % d’Opti-MEM, 25 % de SHSH, 25 % de sérum de cheval (SH), 25 mM de glucose, 30 μg/mL de gentamycine.
- Préparer le milieu d’entretien : Neurobasal-A (NBA), 2 % de B27, 1 mM de L-glutamine, 30 μg/mL de gentamycine, HS (15 %, 10 %, 5 % et 0 %).
- Récolte du cerveau
- Juste avant de commencer la culture, ajouter 1,1 mL de milieu de culture à chaque puits de la plaque de 6 puits avec une pipette P1000 et la placer à 37 °C.
- Placez tout l’équipement (microscope de dissection, hachoir à tissus, lampe de dissection, outils de dissection, électrodes, plaques, inserts et papiers filtrants) à l’intérieur de l’armoire de sécurité biologique et stérilisez sous lumière UV pendant 15 minutes.
- Ajustez l’épaisseur de la tranche à 350 μm.
- Retirez le SGBD du réfrigérateur. Ajouter 5 mL de SGBD à six boîtes de Pétri. Six boîtes de Pétri seront nécessaires par animal.
- Euthanasier le chiot rat. Effectuez la décapitation à l’aide d’un ciseau tranchant à la base du tronc cérébral de l’animal.
- Lavez la tête de l’animal trois fois dans un SGBD froid et emportez-la à l’intérieur de l’armoire de sécurité.
- Isolement tissulaire et préparation de tranches
- Insérez fermement des pinces tranchantes dans les orbites pour maintenir la tête.
- À l’aide d’un mince ciseau, coupez la peau / le cuir chevelu le long de la ligne médiane à partir du foramen vertébral vers les lobes frontaux et mettez-le de côté.
- Couper de la même manière le crâne et le long de la fissure transversale cérébrale (espace entre le cerveau et le cervelet). Avec de longues pinces incurvées, séparez-la.
- Jetez les bulbes olfactifs avec une spatule. Retirez le cerveau de la tête et placez-le dans un SGBD glacé avec la surface dorsale vers le haut (Figure 1A).
- Insérez la pince fine dans le cervelet et suivez la ligne médiane avec la spatule ouvrant chaque hémisphère très soigneusement(Figure 1B).
- Avec une pince à courbe courte, retirez soigneusement l’excès de tissu qui recouvre l’hippocampe, sans toucher la structure de l’hippocampe. Puis avec une spatule, coupé sous chaque hippocampe (Figure 1C).
- Prenez un hémisphère et placez-le, avec l’hippocampe tourné vers le haut, sur un papier filtre. Répétez la procédure avec l’autre hémisphère et placez-la parallèlement au premier, dans le papier filtre. Placez le papier filtre sur le hachoir à tissus, les hémisphères perpendiculaires à la lame, et coupez les hémisphères en tranches de 350 μm(figure 1D).
- Placer le tissu tranché dans une boîte de Petri avec du SGBD froid(figure 1E).
- Séparez soigneusement les tranches à l’aide des électrodes de pointe rondes(Figure 1F). Ne conservez que les tranches avec un cortex rhinal et un hippocampe structurellement intacts. Les zones DG et CA doivent être parfaitement définies, ainsi que le cortex entorhinal et perirhinal (Figure 1G).
- Placez chaque tranche sur l’insert(figure 1H-I),à l’aide d’une spatule et d’une électrode à pointe ronde. Enlevez l’excès de milieu de dissection autour de chaque tranche à l’aide d’une pipette P20(figure 1J). Quatre tranches de cortex-hippocampe rhinal peuvent être cultivées en un seul insert(figure 1K).
- Maintien de la culture
- Changez le support tous les deux jours.
- Réchauffer le milieu à 37 °C.
- Prenez les assiettes de l’incubateur. Ramassez chaque insert en maintenant le bord en plastique avec une pince(Figure 1L).
- Utilisez une main libre pour aspirer le milieu à partir du puits. Replacer l’insert dans le puits et ajouter 1 mL, à l’aide d’une pipette P1000, de milieu frais chauffé(figure 1M). Répétez l’opération pour toutes les insertions. Assurez-vous qu’aucune bulle d’air n’est emprisonnée entre la membrane et le milieu.
REMARQUE: Les tranches de type épileptique subissent une privation progressive et contrôlée de sérum dans le milieu. À partir de 9 jours in vitro (DIV), les tranches sont maintenues en NBA sans HS14.
Ill. 1 : Procédure détaillée pour la préparation de tranches organotypiques cortex-hippocampe rhinal. (A) Retirez le cerveau de la tête et placez-le dans un SGBD glacé avec la surface dorsale vers le haut. (B) Insérez la pince dans le cervelet. Ouvrez le cerveau par la ligne médiane et retirez l’excès de tissu au-dessus de l’hippocampe. (C) Avec une spatule coupée sous l’hippocampe, comme indiqué par les flèches. (D) Placez les deux hippocampes face vers le haut et parallèles l’un à l’autre sur le papier filtre et coupez des tranches de 350 μm sur le hachoir à tissus. (E) Placer l’hippocampe tranché dans un SGBD glacé. (F) Séparer les tranches à l’aide d’électrodes de verre à bout rond. (G) Choisissez uniquement les tranches qui représentent un cortex rhinal et un hippocampe intacts. (H, I) À l’aide d’une électrode de verre à bout rond, poussez chaque tranche vers la spatule et placez-la sur l’insert. (J) Supprimez le SGBD entourant la tranche. (K) Placez quatre tranches par insert. (L) Pour changer le milieu, soulevez l’insert et aspirez le milieu avec une pipette en verre. (M) Ajouter un milieu frais en plaçant la pipette entre l’insert et les parois de la plaque de 6 puits. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air sous les tranches. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
2. Enregistrements électrophysiologiques
REMARQUE: Des enregistrements électrophysiologiques ont été exécutés dans les tranches organotypiques rhinal de cortex-hippocampe à 7, 14 et 21 DIV dans une chambre d’interface-type. Les enregistrements ont été obtenus avec un amplificateur, numérisés et analysés avec un logiciel. Tous les enregistrements ont été filtrés par passe-bande (filtre de Bessel à huit pôles à 60 Hz et filtre gaussien à 600 Hz).
- Préparation de l’installation
- Préparer 50 mL de milieu NBA avec 1 mL de B27 et 250 μL de L-Glutamine. Réchauffer à 37 °C.
- Réglez la configuration d’électrophysiologie en circuit étroit. Vérifiez si le débit est de 2 mL/min.
- Ouvrez la vanne de la boîte à voiture(5%de CO 2 / 95% O2)et vérifiez le niveau d’eau dans le système.
- Placez le papier filtre dans la chambre d’enregistrement de l’interface pour drainer l’excès de support et le papier de nettoyage de la lentille sous le cadre pour fournir du support à la tranche.
- Allumez le régulateur de température, les amplificateurs et le micromanipulateur.
- Laissez la température dans la chambre d’interface se stabiliser à 37 °C avant de commencer les enregistrements.
- Préparer du liquide céphalorachidien artificiel (aCSF : NaCl 124 mM, KCl 3mM, 1,2 mM NaH2PO4, 25 mM NaHCO3, 10 mM de glucose, 2 mM CaCl2, 1 mM MgSO4 avec pH 7,4) et l’utiliser pour remplir l’électrode de verre avec une seringue. Placez-le dans l’électrode de réception.
- Enregistrements d’activité spontanée
- Une fois la température stable, retirez la plaque de l’incubateur et coupez une tranche de l’insert avec une lame très tranchante. Placez-le dans une plaque de 60 mm avec une goutte de milieu. Amenez-le à la chambre d’enregistrement de l’interface.
- Placez la tranche dans la chambre d’interface avec l’hippocampe en bas à droite. Placez l’électrode réceptrice dans la couche de cellules pyramidales CA3.
- Passez au protocole d’acquisition continue et enregistrez pendant 30 min.
3. Essai d’absorption de PI
REMARQUE : La mort cellulaire a été évaluée en surveillant l’absorption cellulaire de l’iodure de propidium (IP), colorant fluorescent. PI est un composé polaire, qui pénètre dans les cellules avec des membranes cellulaires endommagées et interagit avec l’ADN émettant la fluorescence rouge (absorbance 493 nm, émission 630 nm). Puisque l’IP n’est pas perméant aux cellules vivantes, il est employé pour détecter des cellules mortes dans une population.
- Incubation de l’IP
- Préparer, dans un milieu de culture, une dilution fraîche de 1:10 du stock d’IP.
- Pour le test d’absorption PI, retirez la plaque de l’incubateur et soulevez soigneusement l’insert. Ajouter 13 μL de PI au milieu, à l’aide d’une pipette P20, en obtenant une concentration finale de 2 μM. Agitez lentement la plaque avant de remettre l’insert en place. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles sous les tranches.
- Remettez les tranches dans l’incubateur à 37 °C pendant 2 h.
- Procédez avec le protocole immunohistochemistry, comme décrit dans la section suivante. Couvrez les plaques d’aluminium, car PI est sensible à la lumière.
4. Immunohistochimie
REMARQUE: En immunohistochimie, un anticorps spécifique au neurone, ainsi que des anticorps capables de distinguer les phénotypes au repos et réactifs des microglies et des astrocytes, ont été utilisés pour évaluer l’extension de la mort neuronale et de la gliose dans les tranches rhinales cortex-hippocampus épileptique-comme organotypiques.
- Fixation tissulaire
- Retirez la plaque de l’incubateur et aspirez le milieu. Fixer les tranches avec du paraformaldéhyde à 4% (PFA) pendant 1 h à TA, en ajoutant 1 mL de PFA sous et au-dessus des tranches, avec une pipette P1000.
- Retirez le PFA et ajoutez 1 mL de PBS. Ajoutez également pbs sous et au-dessus des tranches.
- Conserver les tranches à 4 °C, dans du PBS, jusqu’à une utilisation ultérieure. Mettez toujours du parafilm autour des plaques pour éviter le séchage.
- Étapes d’immunomarquage
- Laver deux fois, 10 min à chaque fois, avec 1 mL de PBS.
- Préparer une solution de perméabilisation/blocage contenant 1 % de Triton-X100, 10 % de SH et 10 % de BSA dans du PBS. Préparez une solution BSA à 5%.
- Dessinez deux rectangles avec le stylo hydrophobe (Figure 2A). Coupez les tranches de l’insert(Figure 2B)à l’aide d’une lame très tranchante. Mettre deux tranches par lame(figure 2C)et ajouter 140 μL de solution de perméabilisation/blocage sur le dessus de chaque tranche, à l’aide d’une pipette P200. Incuber pendant 3 h à TA.
- Diluer les anticorps primaires à la dilution de travail dans 5% BSA dans PBS. Incuber avec les anticorps primaires pendant la nuit à 4 °C.
- Incuber avec les anticorps secondaires pendant 4 h à droite. À partir de cette étape, protégez la plaque de la lumière puisque les fluorophores sont travaillés avec.
- Placer une goutte de 50 μL de solution de Hoechst sur le dessus de chaque tranche et incuber pendant 20 min à RT.
- Laver entre les incubations. Toujours laver trois fois, pendant 10 min à chaque fois, avec PBS-T.
- Retirer Hoechst et laver comme recommandé.
- Ajouter 50 μL de support de montage sur le dessus de chaque tranche. Couvrir avec une lamelle de couverture en verre et entourer de vernis à ongles (Figure 2D).
- Laissez sécher à RT pendant 24 h.
- Visualisez l’immunomarquage sous un microscope confocal. Conservez les tranches colorées à -20 °C.
Ill. 2 : Procédure spécifique pour l’essai d’immunohistochimie. (A) Avec le stylo hydrophobe, dessinez deux carrés dans la diapositive. (B) Couper le morceau d’insert qui contient la tranche. (C) Placez chaque tranche dans les carrés dessinés avec le stylo hydrophobe et commencez l’étape de perméabilisation/blocage. (D) Après avoir conclu le protocole, terminer en montant les tranches dans un milieu de montage, en recouvrant d’une lamelle de couverture en verre et en l’entourant de vernis à ongles. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Representative Results
Basé sur des descriptions précédentes de l’analyse de signal épileptique dans des tranches organotypiques d’hippocampe, les décharges épileptiformes interictal sont ici définies comme des décharges paroxystiques qui sont clairement distinguées de l’activité de fond, avec un changement brusque de polarité et se produisant à basse fréquence (<2 Hz). Les décharges paroxysmatiques durant plus de 10 s et se produisant à une fréquence plus élevée (≥2 Hz) sont caractérisées comme activité épileptiforme ictale. Si un événement ictal se produit dans les 10 s suivant le précédent, ces deux événements sont considérés comme un seul événement ictal.
Les tranches organotypiques cortex-hippocampe rhinal à 7 DIV(figure 3A)représentent une activité mixte interictale et ictale. À 14 DIV(figure 3B),l’activité spontanée est caractérisée par des décharges ictales, qui évoluent vers une activité ictale écrasante à 21 DIV, avec des événements ictaux d’une durée de >1 min(figure 3C).
Ill. 3 : Activité épileptiforme spontanée des tranches organotypiques du cortex rhinal-hippocampe. Les événements électrographiques représentatifs de type saisie, enregistrés de la zone CA3 dans une chambre de type interface, après (A) 7 DIV, (B) 14 DIV et (C) 21 DIV. Les détails de saisie sont affichés dans les traces inférieures. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Analyse de prise de PI suivie d’immunohistochemistry contre le marqueur neuronal NeuN visant à identifier la mort neuronale. L’absorption de PI par les neurones granulaires et pyramidaux a été observée dans 7 tranches div (flèches dans la figure 4A),mais le nombre de pi+ neurones a augmenté à 14 DIV (flèches dans la figure 4B),corroborant une mort neuronale accrue avec progression d’épileptogenèse.
Ill. 4 : Images représentatives de tranches organotypiques du cortex rhinal-hippocampe colorées par NeuN et PI. Des images de NeuN ont souillé des neurones mûrs et des cellules PI-positives ont été acquises à (A) 7 DIV et (B) 14 DIV, sur un microscope confocal de laser avec un objectif 20x. Des images agrandies des zones pointillées sont affichées. Les flèches pointent vers les neurones de la mort (en orange). Barre d’échelle, 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Une double souillure d’Iba1, ainsi que CD68, a été employée pour évaluer le phénotype de microglia. Iba1 est un marqueur de microglie/macrophages, tandis que CD68 est une protéine lysosomamal exprimée en niveaux élevés par la microglie réactive et en niveaux bas par microglie au repos. A 7 tranches DIV, les microglies ramifiées à faible expression CD68 (flèches de la figure 5A)sont plus abondantes que les microglies Iba1+/CD68+ réactives (pointes de flèches de la figure 5A),tandis qu’à 14 DIV, dans toutes les zones de l’hippocampe, la microglie M1 Iba1+/CD68+ touffue/amiboïde M1 (pointes de flèches de la figure 5B)dépasse la microglie avec une faible expression CD68 (flèches de la figure 5B). A 14 DIV certaines cellules Iba1+/CD68+ avec un aspect d’hyper-ramification peuvent être repérées (pointes de flèche ouvertes sur la figure 5B),ce qui pourrait suggérer l’apparition du phénotype anti-inflammatoire M2 de la microglie. Toutefois, cette question doit faire l’objet d’une étude plus approfondie.
Des études récentes ont démontré que différentes lésions initiatiques du SNC peuvent provoquer au moins deux types d’astrocytes réactifs, A1 et A2, les astrocytes A1 étant neurotoxiques16. Le sous-type A1 des astrocytes est caractérisé par une expression accrue du complément C316,17,18. Le complément C3, qui joue un rôle central dans l’activation du système du complément, génère C3b, qui est encore dégradé en iC3b, C3dg et C3d19. Ainsi, une double souillure de GFAP et de C3d a été employée pour évaluer l’astrogliosis. A 7 DIV l’expression de C3d est à peine détectable(figure 6A),tandis que dans 14 div tranches hypertrophiques GFAP+/C3d+ astrocytes peuvent être observés (pointes de flèches sur la figure 6B),ce qui suggère une activation progressive des astrocytes A1.
Les résultats démontrent une activation progressive de microglia et d’astrocytes tout au long de l’epileptogenesis, imitant les événements décrits dans les patients présentant l’épilepsie et dans les modèles animaux de cette pathologie.
Ill. 5 : Images représentatives de tranches organotypiques Iba1 et CD68 colorées du cortex rhinal-hippocampe. Des images d’Iba1 et de CD68 ont souillé la microglie, et les noyaux souillés de Hoechst, ont été acquises à(A)7 DIV et(B)14 DIV, sur un microscope laser confocal avec un objectif 20x. Des images agrandies des zones pointillées sont affichées. Les flèches pointent vers Iba1+/CD68- microglie au repos, les pointes de flèche indiquent Iba1+/CD68+ microglie touffue /amiboïde et les pointes de flèche ouvertes révèlent Iba1+/CD68+ microglie hyper-ramifiée. Barre d’échelle, 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Ill. 6 : Images représentatives de tranches organotypiques colorées du cortex rhinal et de l’hippocampe de GFAP et de C3d. Des images des astrocytes souillés par GFAP et C3d, et des noyaux souillés par Hoechst, ont été acquises à(A)7 DIV et(B)14 DIV, sur un microscope laser confocal avec un objectif 20x. Des images agrandies des zones pointillées sont affichées. Les pointes de flèche pointent vers GFAP+/C3d+ astrocytes A1 réactifs (en jaune). Barre d’échelle, 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Discussion
Les modèles animaux de l’épilepsie ont été cruciaux pour la découverte de beaucoup d’AEDs, cependant ils exigent beaucoup d’animaux et la plupart d’entre eux prennent du temps en raison de la période latente pour l’apparition de saisie. L’induction de bas-magnésium de l’activité épileptiforme dans les tranches aiguës hippocampal a été également complètement révisée dans la littérature3,mais les tranches aiguës ont une viabilité de 6-12 h rendant impossible d’évaluer les changements à long terme. Les tranches organotypiques peuvent être maintenus en culture de jours à quelques semaines, permettant de surmonter le court temps de viabilité des tranches aiguës, et des modèles d’épileptogenèse dans les tranches organotypiques de l’hippocampe ont été proposés 3,7,8.
Nous décrivons ici la préparation de tranches organotypiques, comprenant le cortex rhinal et l’hippocampe. Ces tranches prennent 15-20 minutes à préparer par animal, à partir du sacrifice animal jusqu’à ce que le placement des tranches sur les inserts, et 6-8 tranches par hémisphère peuvent être obtenues. Des précautions supplémentaires doivent être prises lors de l’ouverture de l’hémisphère pour exposer l’hippocampe et lors du retrait du tissu du papier filtre après le tranchage. L’excès de tissu au-dessus de l’hippocampe peut également compromettre l’intégrité de la tranche pendant le tranchage.
Les tranches organotypiques rhinales de cortex-hippocampe dépeignent un épileptique-comme l’activité évoluante ressemblant à l’épilepsie in vivo. Après une semaine en culture, la plupart des tranches représentent une activité mixte interictale et ictale, qui progresse vers des événements uniquement de type ictal avec du temps dans la culture. Jusqu’à présent, nous avons enregistré peu de décharges interictales en tranches avec 2-3 semaines. Dans ce système, l’activité épileptique semble se développer plus rapidement que dans les tranches organotypiques de l’hippocampe. Ceci pourrait être attribué à la présence du cortex rhinal, qui préserve la plupart de l’entrée fonctionnelle au hippocampe. Pour résoudre pleinement ce problème, une caractérisation complète des signaux épileptiques affichés par ces tranches à travers le temps dans la culture, tels que le nombre et la durée des événements ictaux, ainsi que leur amplitude et leur fréquence, est actuellement en cours d’exécution.
Ce système peut être maintenu en culture pendant plus de trois semaines, et imite de nombreux corrélats moléculaires de l’épilepsie, tels que la mort neuronale, l’activation de la microglie et des astrocytes et l’augmentation de la production de cytokines pro-inflammatoires14,permettant une caractérisation à long terme de ces aspects. Il représente également une plate-forme de dépistage facile à utiliser, où des interventions pharmacologiques ciblant des voies cellulaires spécifiques peuvent être mises en œuvre et des cibles thérapeutiques potentielles peuvent être testées. Sans aucun doute, le système présenté ici peut aider à éclairer davantage les mécanismes de l’épileptogenèse.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier l’Unité de bioimagerie de l’Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes, pour toutes les suggestions concernant l’acquisition d’images.
Ce projet a reçu un financement du programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne dans le cadre de la convention de subvention Nº 952455, Fundação para a Ciênciae Tecnologia (FCT) dans le cadre du projet PTDC/MEDFAR/30933/2017 et faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL Centrifuge Tube, Conical Bottom | Corning | 430829 | |
| 70% Ethanol | Manuel Vieira, Lda | UN1170 | |
| Amplifier | Axon Instruments | Axoclamp 900A | |
| Amplifier | Axon Instruments | Digidata 1440A | |
| Anti-C3d (goat) | R&D Systems | AF2655 | Dilute at a ratio 1:1000 |
| Anti-CD68 (mouse) | Abcam | ab31630-125ug | Dilute at a ratio 1:250 |
| Anti-GFAP (mouse) | Millipore SAS | MAB360 | Dilute at a ratio 1:500 |
| Anti-Iba1 (rabbit) | Abcam | ab108539 | Dilute at a ratio 1:600 |
| Anti-NeuN (rabbit) | Werfen | 16712943S | Dilute at a ratio 1:500 |
| Artificial cerebrospinal fluid (aCSF) | Homemade | ||
| B-27™ Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| Blades for scalpel handle | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | NZYTech | MB04602 | 5% BSA is used to dilute the primary antibodies. Add 0.5g BSA in 10 mL PBS. |
| Brain/Tissue Slice Chamber System | Warner Instruments | ||
| Calcium chloride dihydrate | Merck Millipore | 1.02382.0500 | |
| Cell culture inserts, 30 mm, hydrophilic PTFE | Millipore SAS | PICM03050 | |
| Cold light source | SCHOTT | KL 300 LED | |
| Confocal laser microscope | Zeiss | LSM 710 | |
| Conventional incubator | Thermo Scientific Heraeus | BB15, Function Line | Set to 37 °C and 5% CO2 |
| D(+)-Glucose monohydrate | Merck Millipore | 1.08342.1000 | |
| D-(+)-Glucose solution, 45% in water | Sigma | G8769 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate | Merck Milipore | 1.06580.1000 | |
| Dissecting microscope/magnifier | MEIJI TECHNO CO. LTD | 122285 | |
| Donkey anti-goat IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11057 | Dilute at a ratio 1:200 |
| Donkey anti-mouse IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21202 | Dilute at a ratio 1:200 |
| Donkey anti-mouse IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10037 | Dilute at a ratio 1:200 |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | Dilute at a ratio 1:500 |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | Dilute at a ratio 1:500 |
| Dumont #5 Fine Forceps Biologie Inox | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5 Forceps Standard Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Dumont #7 Forceps Standard Dumoxel | Fine Science Tools | 11271-30 | |
| Dumont Medical #7S Forceps Short Curve Inox | Fine Science Tools | 11273-22 | |
| Gentamycin stock solution, 50 mg/mL | Thermo Fisher Scientific | 15750-037 | |
| Gey’s Balanced Salt Solution (GBSS) | Biological Industries | 01-919-1A | |
| Glass Electrodes | Science Products | GB150F-10 | Round tips homemade |
| Glass Pasteur pipettes, 230 mm | VWR International | 612-1702 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 24020-091 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | Stock solution at 2 mg/mL in PBS |
| Horse Serum, Heat Inactivated (HS) | Thermo Fisher Scientific | 26050-088 | |
| Hydrochloric acid | Merck Milipore | 1.09057.1000 | |
| Hydrophobic Pen | Dako | S200230-2 | |
| INCU-Line IL10 | VWR | 390-0384 | |
| Interface chamber | Warner Instruments | BSC-HT Haas Top | |
| Iris Spatula Curved | Fine Science Tools | 10092-12 | |
| Labculture Class II Biological Safety Cabinet | HERASafe | HS 12 | |
| Lens Cleaning Paper | TIFFEN | ||
| L-Glutamine solution 200 mM (Q) | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Merck Millipore | 1.05886.0500 | |
| Micro tube 0.5 mL, PP | SARSTEDT | 72,699 | |
| Micro tube 1.5 mL, PP | SARSTEDT | 72.690.001 | |
| Micro tube 2.0 mL, PP | SARSTEDT | 72.691 | |
| Micromanipulators | Sutter Instrument | MP-285 | |
| Miroscope Cover Glasses, 24 mm x 60 mm | Marienfeld | 102242 | |
| Nail polish | Cliché | ||
| Neurobasal-A Medium (NBA) | Thermo Fisher Scientific | 10888-022 | |
| Opti-MEM® I Reduced-Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985-047 | |
| Paraformaldehyde, powder | VWR Chemicals | 2,87,94,295 | |
| Peristaltic pump | Gilson | M312 | |
| Phosphate saline buffer (PBS) | Homemade. PBS with 0.5% Tween-20 (PBS-T) is used to wash slices during the immunohistochemistry assay. | ||
| Phosphate standard solutions, PO43- in water | BDH ARISTAR | 452232C | |
| Pipette set | Gilson | P2, P10, P20, P100, P200, P1000 | |
| Platinum 5 blades | Gillette | ||
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405-250g | |
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170-25MG | Stock solution at 1 mg/mL in water. |
| Qualitative Filter Paper, Cellulose, Grade 1, 55 mm | Whatman | 1001-055 | Medium retention 11µm |
| Qualitative Filter Paper, Cellulose, Grade 1, 90 mm | Whatman | 1001-090 | Medium retention 11µm |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Slip Tip Insulin Syringe without Needle 1 mL | SOL-M | 161000 | |
| Sodium chloride | VWR Chemicals | 27800.360 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Merck Millipore | 1.06346.1000 | |
| Sodium hydrogen carbonate | Merck Millipore | 1.06329.1000 | |
| Sodium Hydroxide | Merck Milipore | 535C549998 | |
| Stimulator | Astro Med Inc GRASS Product Group | S48 Stimulator | |
| Student Scissors Straight SharpSharp 12cm | Fine Science Tools | 91402-12 | |
| SuperFrost Plus™ Adhesion slides | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| TC-Treated Sterile 60 x 15mm Tissue Culture Dish | Corning | CORN430166 | |
| TC-Treated Sterile 6-Wells Plates | Corning | CORN3516 | |
| Temperatue controller | MEDICAL SYSTEMS CORP. | TC-102 | |
| Tissue Chopper | The Mickle Laboratory Engineering CO. LTD. | MTC/2 | Set to 350 μm |
| Triton X-100 | BDH | 14630 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287 |
References
- Fisher, R. S., et al. Electrical stimulation of the anterior nucleus of thalamus for treatment of refractory epilepsy. Epilepsia. 51, 899-908 (2010).
- Loscher, W. Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure. 20, 359-368 (2011).
- Heinemann, U., Kann, O., Schuma, S. An overview of in vitro seizure models in acute and organotypic slices. Models of seizures and epilepsy. Pitkänen, A., Schwartzkroin, P. A., Moshé, S. L. , Elsevier Academic Press. Cambridge. 35-44 (2006).
- Sundstrom, L., Morrison, B., Bradley, M., Pringle, A. Organotypic cultures as tools for functional screening in the CNS. Drug Discovery Today: Targets. 10, 993-1000 (2005).
- Holopainen, I. E. Organotypic hippocampal slice cultures: a model system to study basic cellular and molecular mechanisms of neuronal cell death, neuroprotection, and synaptic plasticity. Neurochemical Research. 30, 1521-1528 (2005).
- Noraberg, J., et al. Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair. CNS Neurological Disorders Drug Targets. 4, 435-452 (2005).
- Dyhrfjeld-Johnsen, J., Berdichevsky, Y., Swiercz, W., Sabolek, H., Staley, K. J. Interictal spikes precede ictal discharges in an organotypic hippocampal slice culture model of epileptogenesis. Journal of Clinical Neurophysiology. 27, 418-424 (2010).
- Chong, S. A., et al. Intrinsic Inflammation Is a Potential Anti-Epileptogenic Target in the Organotypic Hippocampal Slice Model. Neurotherapeutics. 15, 470-488 (2018).
- Li, Q., Han, X., Wang, J. Organotypic hippocampal slices as models for stroke and traumatic brain injury. Molecular Neurobiology. 53 (6), 4226-4237 (2016).
- Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. R. Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Current Neuropharmacology. 5, 19-33 (2007).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: a review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Doussau, F., Dupont, J. L., Neel, D., Schneider, A., Poulain, B., Bossu, J. L. Organotypic cultures of cerebellar slices as a model to investigate demyelinating disorders. Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (10), 1011-1022 (2017).
- Vismer, M. S., Forcelli, P. A., Skopin, M. D., Gale, K., Koubeissi, M. Z. The piriform, perirhinal, and entorhinal cortex in seizure generation. Frontiers in Neural Circuits. 9, 27 (2015).
- Magalhães, D. M., Pereira, N., Rombo, D. M., Beltrão-Cavacas, C., Sebastião, A. M., Valente, C. A. Ex vivo model of epilepsy in organotypic slices - a new tool for drug screening. Journal of Neuroinflammation. 15, 203 (2018).
- Ravizza, T., Balosso, S., Vezzani, A.
- Liddelow, S. A., et al. Neurotoxic reactive astrocytes are induced by activated microglia. Nature. 541, 481-487 (2017).
- Wu, T. Complement C3 is activated in human AD brain and is required for neurodegeneration in mouse models of amyloidosis and tauopathy. Cell Reports. 28 (8), 2111-2123 (2019).
- Hartmann, K., et al. Complement 3+-astrocytes are highly abundant in prion diseases, but their abolishment led to an accelerated disease course and early dysregulation of microglia. Acta Neuropathologica Communications. 7, 83 (2019).
- Nilsson, U. R., Funke, L., Nilsson, B., Ekdahl, K. N. Two conformational forms of target-bound iC3b that distinctively bind complement receptors 1 and 2 and two specific monoclonal antibodies. Upsala Journal of Medical Sciences. 116, 26-33 (2011).
